CN102321548B - 根瘤杆菌t3及其在微生物降解硫化氢中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种根瘤杆菌T3(Rhizobium sp.T3)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2011年4月2日，保藏编号CCTCC No.M2011105，保藏地址：中国·武汉·武汉大学；以硫化氢为唯一硫源和能源，对根瘤菌T3扩大培养获得的菌液进行选择性培养，在密闭情况下，25～40℃，pH值4.0～9.0条件下培养2～3d，使硫化氢分解，所述的菌液细胞浓度为200～300mg/L；所述的硫化氢初始浓度为150～600ppm；本发明菌株具有高效、耐受力强的硫化氢降解能力，且能够适应复杂的实际条件，具有广阔的应用前景。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一株可降解硫化氢的新菌株——根瘤杆菌T3，及其在微生物降解硫化氢中的应用。
(二)背景技术
硫化氢(H2S)为无色气体，具有刺激性和窒息性的臭鸡蛋气味，人体吸入硫化氢可引起急性中毒和慢性损害，其作用机制是H2S进入血液后，与血红蛋白结合，生成不可还原的硫化血红蛋白，发生中毒的症状。长期接触低浓度H2S会出现头痛、疲倦无力、记忆力减退、失眠、胸痛、咳嗽、恶心和腹泻等症状，还会出现点状角膜炎。H2S浓度大于200×10-6g/m3时属于危险值，能使嗅觉神经完全麻痹。浓度大于(700～1000)×10-6g/m3时，人会立即发生昏迷和因呼吸麻痹而迅速死亡。硫化氢污染源分布极广，自然界、生活和工业生产过程中均可能产生。自然界的新陈代谢会产生一些天然的恶臭源，例如沼泽地的腐败气息、活火山产生的含硫气体、山林瘴气等；人类在自然界生产、生活增加了恶臭污染源，例如腐败的食物、生活垃圾、人类***物及其家禽家畜的代谢产物；采矿、硫石油的开采和提炼、造纸厂、印刷厂、养殖厂、肉食品加工厂、生活垃圾处理场和污水处理厂等大约70多个行业的生产过程中都会产生硫化氢。
经济的高速发展，城市化进程的不断加快，原有的由于城市规划、工业结构和工业布局不尽合理，造成了城市功能区划分不明显，引发的恶臭污染事件日益增多，国内外举报投诉的恶臭污染占环境污染投诉的比例越来越高，所以，对城市恶臭污染的主要成分H2S气体的治理变得势在必行。微生物降解H2S等硫系恶臭气体，与传统物化治理方法相比，具有成本低、脱硫选择性高、无二次污染、不需要化学催化剂、投资与运行费用低和设备简单等优点，成为大气污染控制领域的研究热点，
迄今为止，国内外研究者对H2S的生物降解菌已开展了大量的研究工作，国内外已分离到一些在好氧或厌氧条件下降解H2S的细菌，主要有硫杆菌(Thiobacillus)，黄单胞菌(Xanthomonas)，芽孢杆菌(Bacillus)，硫光合细菌(Rhodobacter)，节杆菌(Arthrobacter)，绿脓杆菌(Pseudomonas)，人苍白杆菌(Ochrobactrum)等。大量研究表明从环境中分离筛选高效的H2S降解菌，仍然是消除环境中H2S污染的重要环节。
本发明中的根瘤杆菌(Rhizobium sp.)是一种常见的杆菌，经检索专利和其他相关文献，尚未发现利用根瘤杆菌(Rhizobium sp.)降解H2S的报道，该降解菌的发现对工业废气中H2S的高效净化具有重要意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株可降解硫化氢的新菌株——根瘤杆菌T3(Rhizobiumsp.T3)，及其在微生物降解硫化氢中的应用。
本发明采用的技术方案是：
根瘤杆菌T3(Rhizobium sp.T3)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2011年4月2日，保藏编号CCTCC M 2011105，保藏地址：中国·武汉·武汉大学。
本发明所提供的硫化氢降解菌为自行分离筛选所获得，命名T3，鉴定为根瘤杆菌(Rhizobium sp.)，目前尚无根瘤杆菌以硫化氢为唯一硫源进行生物降解的报道。
本发明菌株的获得：从浙江华海制药厂废水处理站中取水样，通过样品驯化，初筛，复筛，获得具有硫化氢降解能力的纯培养物，对该纯培养物进行形态和生理生化鉴定，并对其16S rDNA基因同源性作了分析，将其鉴定为根瘤杆菌(Rhizobium sp.)。
本发明样品的驯化步骤为：将废水样品以10％的接种量接种于含硫代硫酸钠的无机盐培养基中，30℃，160rpm恒温振荡培养24h，获得培养液，每间隔6h检测培养液中pH、硫酸根离子、硫代硫酸根离子、OD值的变化，随着时间的推移，接种了水样的培养液逐渐变浑浊，pH随硫代硫酸根往硫酸根的转化而迅速降低，每间隔3天从上一批驯化良好的培养液中取出部分培养液，以10％的接种量接种至新的含硫代硫酸钠的无机盐培养基中，确保筛选的菌株良好生长且具有降解效果，驯化培养一个月左右，在琼脂平板上多次划线分离直至获得可降解硫化氢的单菌落。
菌株的鉴定：
1)菌株形态：杆状，大小为0.5～0.7μm×1.2～1.5μm，侧生鞭毛，革兰氏染色为阴性，在固体平板培养基30℃培养24h后，菌落呈乳白润泽，较大，圆形，表面白色透明，边缘光滑湿润，易挑起；透射电镜照片如图1所示；所述的固体平板培养基终浓度组成为：琼脂1.5～2.0％，葡萄糖0.2g/L，KH2PO4 1.2g/L，K2HPO4 1.2g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，柠檬酸铁0.01g/L，溶剂为水，pH 7.0，121℃灭菌20min；
2)菌株的生理生化特征：氧化酶阳性，接触酶阳性，吲哚试验阴性，淀粉水解阳性，明胶液化阴性，葡萄糖发酵产酸，硝酸盐还原产气，硫化氢试验阳性。
3)菌株16S rDNA序列测定与***发育树分析：采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(V2.2上海申能***生物科技有限公司)对菌种T3进行提取和纯化，选用细菌通用引物BSF8/20和BSR1541/20进行PCR扩增，引物序列分别为：
BSF8/20：5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′
BSR1541/20：5′-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3′
PCR反应程序设定为：先94℃预变性4min；然后94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环35个周期；然后72℃延伸10min；最后4℃保持10min。将PCR产物进行测序，测序得到SEQ ID No.1的序列。
利用BLAST将所测得序列与GenBank数据库中的16S rDNA基因序列进行同源性比较分析，选取1400bp左右的长度进行比对[Clustelx(1.81)]，采用邻位连接(Neighbour Joining，NJ)法进行***学分析(MEGA)，确定了菌株T3与其它几株Rhizobium菌株的***发育树，如图2所示，结果显示菌种T3的16S rDNA基因序列均与GenBank中许多根瘤杆菌(Rhizobium sp.)的16S rDNA基因序列的同源性在99％以上，所以将菌种T3命名为根瘤杆菌T3(Rhizobium sp.)。
4)菌种T3(Rhizobium sp.T3)的Biolog***鉴定：利用Biolog全自动微生物鉴定仪，通过将目标微生物与数据库的相关菌的特征数据进行比对，对分析的微生物进行最大限度的匹配，可以在瞬间得到鉴定结果，确定所分析的微生物的属名或种名，具体步骤如下：
(1)碳源板的确定：革兰氏染色确定菌株的阴阳性以及芽孢染色，菌株T3是革兰氏阴性，用GN碳源板(Biolog)；
(2)BUG+B培养基及菌株培养：取一个三角瓶，加5.7g BUG琼脂培养基，95mL纯净水，煮沸溶解(冷却后pH一般为7.3+0.1)，121℃灭菌15min，冷却至45～50℃后，加5mL新鲜的脱纤羊血，倒平板，在平板冷却后，接种待鉴定的菌株，30℃培养12h；
(3)浊度调整：用无菌的棉签挑取步骤(2)已经培养好的菌落，无菌状态下缓慢接种到浊度管中，先用空白调至100％，然后再用对应的碳源板的菌液标准管调节到相应的浊度，调节期间可以用空白不断调整浊度的大小，以达到2度标准浊度值；
(4)碳源板上样：将步骤(3)已经调整好浊度的菌液，用微量加样器(排枪)接种到GN碳源板(Biolog)上，放置于样品袋中，加入湿润的棉花以保持一定的湿度，在30℃培养箱中培养；
(5)数据读取：步骤(4)接种后的碳源板在30℃培养箱中培养，分别在培养4～6h、16～24h后，通过Biolog鉴定仪对菌株进行鉴定。
本发明所述的根瘤杆菌T3的16S rDNA序列：
atgcaagtcg aacgcatcgc aagatgagtg gcagacgggt gagtaacgcg tgggaacata 60
ccctttcctg cggaatagct ccgggaaact ggaattaata ccgcatacgc cctacggggg 120
aaagatttat cggggaagga ttggcccgcg ttggattagc tagttggtgg ggtaaaggcc 180
taccaaggcg acgatccata gctggtctga gaggatgatc agccacattg ggactgagac 240
acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg cgcaagcctg 300
atccagccat gcccgtgagt gatgaakgcc ttagggttgt aaagctcttt caccgatgaa 360
gataatgacg gtagtcggag aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat 420
acgaaggggg ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag gcggatattt 480
aagtcagggg tgaaatcccg cagctcaact gcggaactgc ctttgatact gggtatcttg 540
agtatggaag aggtaagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga tattcggagg 600
aacaccagtg gcgaaggcgg cttactggtc cattactgac gctgaggtgc gaaagcgtgg 660
ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat gttagccgtc 720
gggcagtata ctgttcggtg gcgcagctaa cgcattaaac attccgcctg gggagtacgg 780
tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 840
ttaattcgaa gcaacgcgca gaaccttacc agctcttgac attcggggta tgggcattgg 900
agacgatgtc cttcagttag gctggcccca gaacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc 960
gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgccct tagttgccag 1020
catttagttg ggcactctaa ggggactgcc ggtgataagc cgagaggaag tgggatgacg 1080
tcaagtgtcc tcatggccct tacgggctgg gctacacacg tgctacaatg gtggtgacag 1140
tgggcagcga gacagcgatg tcgagctaat ctccaaaagc catctcagtt cggattgcac 1200
tctgcaactc gagtgcatga agttggaatc gctagtaatc gcagatcagc atgctgcggt 1260
gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg gttttacccg 1320
aaggtagtgc gctaaccgca aggaggcagc taaccacggt agggtcagcg actggggtga 1380
tagtcg 1386
菌株T3的生长特性：
培养条件：取配制好的根瘤杆菌T3菌悬液2.5mL接种于含50mL选择性培养基的厌氧瓶中，调整pH值至最适pH值8.0，在最适温度为30℃、转速为160r/min的摇床中培养。
菌种的保藏：-4℃冰箱中冷冻保藏。
本发明所述的根瘤杆菌T3在微生物降解硫化氢中的应用。
进一步，本发明所述根瘤杆菌T3在微生物降解硫化氢中的应用为：对根瘤杆菌T3进行扩大培养，以培养所获得的含菌体细胞的菌液为酶源，使含硫化氢废气中硫化氢降解。
进一步，所述根瘤杆菌T3在微生物降解硫化氢中的应用为：以硫化氢为唯一硫源和能源，对根瘤菌T3进行厌氧扩大培养，获得的含菌体细胞的菌液进行选择性培养，在密闭情况下，25～40℃，pH值4.0～9.0条件下培养2～3d，使硫化氢降解；所述的菌液中菌体的浓度为200～300mg/L，即菌液OD值为0.48～0.71，所述的硫化氢初始浓度为150～600ppm。
本发明所述的菌液中菌体的浓度以菌体干重计，所述的菌体干重测量方法为：将根瘤杆菌T3培养液用722型紫外分光光度计测定OD420值，将培养液置于烘箱中105℃烘至恒重，以OD420值为横坐标，以菌体干重为纵坐标，绘制标准曲线，试验中所需菌体浓度根据标准曲线来推算菌体干重，进而得出所需菌体浓度。
本发明所述的含菌体细胞菌悬液按如下方法制备：(1)将根瘤菌T3接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得斜面菌体；所述的斜面培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH值7.0～7.2，121℃灭菌15min；(2)用接种环从斜面菌体取一接种环菌体接种至种子培养基，30℃，160r/min培养1～2d，获得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH值7.0～7.2，121℃灭菌15min；(3)将种子液12000r/min离心5～10min，弃去上清液，用不含硫化物的无菌无机盐液体培养基洗涤，然后12000r/min离心10min，弃去上清液，重复洗涤3次，将得到的菌体用漩涡混合器打散，再用不含硫化物的无菌无机盐培养基将菌体稀释，获得含菌细胞菌悬液；所述的无机盐培养基终浓度组成为：硫代硫酸钠8.0g/L，葡萄糖0.2g/L，KH2PO4 1.2g/L，K2HPO4 1.2g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，柠檬酸铁0.01g/L，溶剂为水，初始pH 7.0。
更进一步，本发明所述根瘤杆菌T3在微生物降解硫化氢中的应用推荐按如下步骤进行：
(1)斜面培养：将根瘤菌T3接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得斜面菌体；所述的斜面培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH值7.0～7.2，121℃灭菌15min；
(2)种子培养：用接种环从斜面菌体取一接种环菌体接种至种子培养基，30℃，160r/min培养1～2d，获得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH值7.0～7.2，121℃灭菌15min；
(3)含菌细胞菌悬液的制备：将种子液12000r/min离心5～10min，弃去上清液，菌体用不含硫化物的无菌无机盐液体培养基洗涤，然后12000r/min离心10min，弃去上清液，重复洗涤3次，将菌体用漩涡混合器打散，再用不含硫化物的无菌无机盐培养基将菌体稀释，获得含菌细胞菌悬液；所述的无机盐培养基终浓度组成为：葡萄糖0.2g/L，KH2PO4 1.2g/L，K2HPO4 1.2g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，柠檬酸铁0.01g/L，溶剂为水，初始pH 7.0；所述含菌细胞菌悬液中菌体细胞浓度为200～300mg/L；
(4)硫化氢降解：将步骤(3)制备的含菌细胞菌悬液以5％的量接种至以硫化氢为唯一硫源的选择性培养基中，30℃，pH＝7.0，160rpm培养60h，跟踪检测硫化氢浓度及根瘤杆菌T3菌株的生长速度，绘制硫化氢降解率曲线及根瘤杆菌T3菌株生长曲线；所述的硫化氢初始浓度为150～600ppm；所述的选择性培养基终浓度组成为：葡萄糖0.2g/L，KH2PO4 1.2g/L，K2HPO4 1.2g/L，NH4Cl0.4g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，柠檬酸铁0.01g/L，溶剂为水，pH 7.0。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明菌株具有高效、耐受力强的硫化氢降解能力，且能够适应复杂的实际条件，具有广阔的应用前景。
(四)附图说明
图1根瘤杆菌T3的透射电镜照片；
图2根瘤杆菌T3的***发育树图；
图3根瘤杆菌T3的Biolog***鉴定图；
图4根瘤杆菌T3对H2S的降解曲线：a为根瘤杆菌T3对不同初始浓度H2S的降解曲线，其中横坐标为降解时间(h)，纵坐标为H2S浓度(ppm)；b为不同浓度H2S对根瘤杆菌T3生物量的影响，其中横坐标为反应时间(h)，纵坐标为根瘤杆菌T3生物量(mg/L)；
图5不同温度下根瘤杆菌T3对H2S的降解曲线；
图6不同pH值下根瘤杆菌T3菌对H2S的降解曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1 根瘤杆菌T3(Rhizobium sp.T3)的分离、纯化及其鉴定
本发明所述的无机盐培养基终浓度组成为：硫代硫酸钠8.0g/L，葡萄糖0.2g/L，KH2PO4 1.2g/L，K2HPO4 1.2g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，柠檬酸铁0.01g/L，溶剂为水，pH 7.0。
琼脂平板的配制：硫代硫酸钠8.0g/L，葡萄糖0.2g/L，KH2PO4 1.2g/L，K2HPO4 1.2g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，柠檬酸铁0.01g/L，溶剂为水，pH 7.0，加入15-20g的琼脂加热溶解。
1、菌种T3的分离及纯化
Rhizobium sp.T3是从浙江华海制药厂废水处理站的活性污泥水样中驯化、分离得到的一株革兰氏阴性菌，具体步骤如下：
取浙江华海制药厂废水处理站水样10mL(10％接种量)接种于100mL含8g/L硫代硫酸底物的无机盐培养基中，30℃，160rpm的恒温培养振荡器中培养8d，间隔2d测定培养液中pH、硫酸根离子、硫代硫酸根离子、OD值的变化，结果如表1所示；结果表明，随时间的推移，接种了水样的培养液逐渐变浑浊，pH随着硫代硫酸根往硫酸根的转化而迅速降低。
表1 培养液中pH、硫酸根离子、硫代硫酸根离子和OD值的变化值
每间隔3天从上一批驯化良好的培养液中取10mL(10％接种量)接种于100mL含8g/L硫代硫酸底物的无机盐培养基中，确保筛选的菌株良好生长且具有降解效果，30℃，160rpm摇床中驯化培养一个月(30d)以富集硫氧化菌。驯化结束以后，在琼脂平板上多次划线分离直到得到可降解H2S的单菌落T3，透射电镜照片如图1所示。
2、菌种T3的16S rDNA序列测定及***树发育分析
对菌种T3的DNA进行PCR扩增以及16S rDNA基因鉴定后，利用BLAST在GenBank数据库中进行同源性检索，结果显示菌种T3的16S rDNA基因序列均与GenBank中许多根瘤杆菌(Rhizobium sp.)的16S rDNA基因序列的同源性在99％以上，所以将菌种T3鉴定为根瘤杆菌T3(Rhizobium sp.T3)具体步骤如下：
采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(V2.2，上海申能***生物科技有限公司)提取和纯化菌种T3的DNA，选用细菌通用引物BSF8/20和BSR1541/20进行PCR扩增，引物序列分别为：
BSF8/20：5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′
BSR1541/20：5′-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3′
PCR反应程序设定为：先94℃预变性4min；然后94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环35个周期；然后72℃延伸10min；最后4℃保持10min。将PCR产物进行测序(北京华大基因研究中心)，测序得到SEQ IDNo.1的序列。
利用BLAST将所测得序列与GenBank数据库中的16S rDNA基因序列进行同源性比较分析，选取1400bp左右的长度进行比对[Clustelx(1.81)]，采用邻位连接(Neighbour Joining，NJ)法进行***学分析(MEGA)，确定了菌株T3与其它几株Rhizobium菌株的***发育树，如图2所示。
3、菌种T3的Biolog***鉴定
利用Biolog全自动微生物鉴定仪(美国Biolog公司)，通过将目标微生物与数据库的相关菌的特征数据进行比对，对分析的微生物进行最大限度的匹配，可以在瞬间得到鉴定结果，确定所分析的微生物的属名或种名，具体步骤如下：
(1)碳源板的确定：革兰氏染色确定菌株T3为阴性，用GN碳源板(Biolog)；
(2)BUG+B培养基及菌株培养：取一个三角瓶，加5.7g BUG琼脂培养基(上海九日化工科技有限公司)，95mL纯净水，煮沸溶解，121℃灭菌15min，冷却至45～50℃后，加5mL新鲜的脱纤羊血，倒平板，在平板冷却后，接种待鉴定的菌株T3，30℃培养12h，获得单个菌落；
(3)浊度调整：用无菌的棉签挑取步骤(2)已经培养好的菌落，无菌状态下缓慢接种到浊度管中，先用无菌水作为空白调浊度至100％，然后再用对应步骤(1)培养的碳源板的菌液标准管调节到2度，调节期间可以用无菌水不断调整浊度的大小，以达到标准浊度值。
(4)碳源板上样：将步骤(3)已经调整好浊度的菌液，用微量加样器(排枪)接种到GN碳源板(Biolog)上，放置于样品袋(宜兴市江岸精细化工有限公司)中，加入湿润的棉花以保持一定的湿度，在30℃培养箱中培养24h；
(5)数据读取：步骤(4)接种后的GN碳源板在30℃培养箱中培养，分别在培养6h、24h后，用Biolog鉴定仪对菌株T3进行鉴定，结果显示，培养24h***显示结果为PROB(可能性)＝93％，SIM(相似性)＝0.55，DIS(位距)＝6.37，如图3所示。
实施例2 根瘤杆菌T3(Rhizobium sp.T3)对不同初始浓度H2S的降解性能检测
(1)斜面培养：将根瘤菌T3接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得斜面菌体；所述的斜面培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH值7.0，121℃灭菌15min；
(2)种子培养：用接种环从斜面菌体取一接种环菌体接种至种子培养基，30℃，160r/min培养2d，获得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH值7.0，121℃灭菌15min；
(3)含菌细胞菌悬液的制备：将种子液12000r/min离心10min，弃去上清液，菌体用不含硫化物的无菌无机盐液体培养基洗涤，然后12000r/min离心10min，弃去上清液，重复洗涤3次，将菌体用漩涡混合器打散，再用不含硫化物的无菌无机盐培养基将菌体稀释到OD600值为0.1，获得含菌细胞菌悬液；所述的无机盐培养基终浓度组成为：硫代硫酸钠8.0g/L，葡萄糖0.2g/L，KH2PO4 1.2g/L，K2HPO4 1.2g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，柠檬酸铁0.01g/L，溶剂为水，pH 7.0；所述含菌细胞菌悬液中菌体细胞浓度为35mg/L；
(4)硫化氢降解：分别将1mL步骤(3)制备的菌悬液接种至20mL以H2S为唯一硫源的选择性培养基中(接种量5％)，H2S初始浓度设置为150ppm、200ppm、250ppm、300ppm、400ppm、600ppm，在30℃，160rpm的摇床中厌氧培养60h，间隔6h取样，气相色谱检测厌氧瓶上部空间H2S的浓度，同时测定菌株生长浓度，绘制H2S去除率曲线图和菌株生长曲线图，结果见图4；
H2S定量分析检测方法：采用岛津GC-14B气相色谱仪分析测定硫化氢浓度，色谱柱为HP-Innowax毛细管柱(30m×0.32mm×0.5μm)。汽化室、FPD(火焰光度检测器检测器)、柱温分别设置为25℃、88℃、48℃，柱流量1mL/min，进样量10μL，N2为载气，总流量为200mL/min，分流比为10∶1。氢气流量和空气流量均为50mL/min，此方法简便、快速、灵敏度高、重复性控制在5％以内，可以实现对10-6微量级的硫化氢的定量测定，硫化氢出峰时间为0.523min左右。
生物量测定：培养结束后，使用722型紫外分光光度计(上海精密仪器仪表有限公司)测出不同H2S初始浓度条件下培养液的OD420值，采用称干重法，将同体积的不同OD420菌液置于坩埚中在105℃烘箱中称得恒重，做出OD420值与干重的标准曲线，根据测定的OD420值和标准曲线得出菌种T3生物量。
图4-a为根瘤杆菌T3对不同初始浓度H2S的降解曲线，结果表明，菌种T3在H2S初始浓度不超过400ppm时，3d内可将其降解彻底，当H2S初始浓度达600ppm时，菌株对H2S在3d内的去除率约80％，降解效率有所下降。图4-b为不同浓度硫化氢对根瘤杆菌T3生物量的影响，结果表明，菌种T3在H2S初始浓度不超过400ppm时，菌种生长良好，当H2S初始浓度达600ppm时，菌种生长开始出现受抑制现象，可知菌种T3对硫化氢的最高耐受浓度达到600ppm。
实施例3 Rhizobium sp.T3菌株在不同温度下对H2S的降解特性
(1)斜面培养：将根瘤菌T3接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得斜面菌体；所述的斜面培养基终浓度组成为：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH值7.0，121℃灭菌15min；
(2)种子培养：用接种环从斜面菌体取一接种环菌体接种至种子培养基，30℃，160r/min培养2d，获得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH值7.0，121℃灭菌15min；
(3)含菌细胞菌悬液的制备：将种子液12000r/min离心10min，弃去上清液，菌体用不含H2S的无菌无机盐液体培养基洗涤，然后12000r/min离心10min，弃去上清液，重复洗涤3次，将菌体用漩涡混合器打散，再用不含底物的无菌无机盐培养基将菌体稀释到OD600值为0.1，获得含菌细胞菌悬液；所述含菌细胞菌悬液菌体细胞浓度为35mg/L；所述的无机盐培养基终浓度组成为：葡萄糖0.2g/L，KH2PO4 1.2g/L，K2HPO4 1.2g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，柠檬酸铁0.01g/L，溶剂为水，初始pH 7.0；
(4)硫化氢降解：分别将1mL步骤(3)制备的菌悬液接种至20mL以H2S为唯一硫源的选择性培养基中(接种量5％)，H2S初始浓度为200ppm，分别置于25℃、30℃、35℃、40℃，160rpm的摇床中厌氧培养48h；另外将未接菌种T3的培养基分别置于对应的温度同时培养，作为空白对照，间隔6h取样，气相色谱检测厌氧瓶上部空间H2S的浓度，绘制H2S去除率曲线图，结果见图5。
结果表明，在15～30℃之间，随着培养温度升高，由于菌种T3中的蛋白质和酶活性增强，生化反应加快，生长及降解速率提高；当温度继续升高到40℃，细胞中某些温度敏感的物质受到不可逆的破坏，生命活动受到抑制，降解速率下降。在30～35℃范围内，菌株T3对H2S都具有较好的降解效果，可以达到80％以上，这说明细菌适合的生长、降解温度处于30～35℃之间，菌株T3的最佳培养温度选择30℃，降解率可以达到90％以上。
实施例4 Rhizobium sp.T3菌株在不同pH值下对H2S的降解特性
(1)斜面培养：将根瘤菌T3接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得斜面菌体；所述的斜面培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH值7.0，121℃灭菌15min；
(2)种子培养：用接种环从斜面菌体取一接种环菌体接种至种子培养基，30℃，160r/min培养2d，获得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH值7.0，121℃灭菌15min；
(3)含菌细胞菌悬液的制备：将种子液12000r/min离心10min，弃去上清液，菌体用不含底物的无菌无机盐液体培养基洗涤，然后12000r/min离心10min，弃去上清液，重复洗涤3次，将菌体用漩涡混合器打散，再用不含底物的无菌无机盐培养基将菌体稀释到OD600值为0.1，获得含菌细胞菌悬液；所述含菌细胞菌悬液菌体细胞浓度为35mg/L；所述的无机盐培养基终浓度组成为：硫代硫酸钠8.0g/L，葡萄糖0.2g/L，KH2PO4 1.2g/L，K2HPO4 1.2g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，柠檬酸铁0.01g/L，溶剂为水，初始pH 7.0；
(4)硫化氢降解：分别将1mL步骤(3)制备的菌悬液接种至20 mL以H2S为唯一硫源的选择性培养基中(接种量5％)，H2S初始浓度为200ppm，用1mol/LHCl或1mol/L NaOH溶液分别调节选择性培养基pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在30℃，160rpm的摇床中厌氧培养60h，间隔6h取样，气相色谱检测厌氧瓶上部空间H2S的浓度，绘制H2S去除率曲线图，结果见图6。
结果显示，不同pH条件下，菌株T3对H2S的降解效率不同，当pH＝8.0时，各时刻菌株T3对H2S去除率最高，48h和72h的去除率分别达到85.2％和94.7％。pH＝7.0及pH＝9.0的条件下，去除率有所下降，但仍可保持在80％左右的降解率，而当培养液呈酸性时，H2S的降解效率不断下降。
Claims (8)
1.根瘤杆菌T3(Rhizobium sp.T3)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2011年4月2日，保藏编号CCTCC M 2011105，保藏地址：中国·武汉·武汉大学。
2.如权利要求1所述的根瘤杆菌T3，其特征在于所述的根瘤杆菌T3菌落特征和生理生化特征为：杆状，大小为0.5～0.7μm×1.2～1.5μm，侧生鞭毛，革兰氏染色为阴性，在固体平板培养基30℃培养24 h后，菌落呈乳白润泽，较大，圆形，表面白色透明，边缘光滑湿润，易挑起；氧化酶阳性，接触酶阳性，吲哚试验阴性，淀粉水解阳性，明胶液化阴性，葡萄糖发酵产酸，硝酸盐还原产气，硫化氢试验阳性。
3.如权利要求1所述的根瘤杆菌T3，其特征在于所述的根瘤杆菌T3的16SrDNA序列为：
atgcaagtcg aacgcatcgc aagatgagtg gcagacgggt gagtaacgcg tgggaacata 60
ccctttcctg cggaatagct ccgggaaact ggaattaata ccgcatacgc cctacggggg 120
aaagatttat cggggaagga ttggcccgcg ttggattagc tagttggtgg ggtaaaggcc 180
taccaaggcg acgatccata gctggtctga gaggatgatc agccacattg ggactgagac 240
acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg cgcaagcctg 300
atccagccat gcccgtgagt gatgaakgcc ttagggttgt aaagctcttt caccgatgaa 360
gataatgacg gtagtcggag aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat 420
acgaaggggg ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag gcggatattt 480
aagtcagggg tgaaatcccg cagctcaact gcggaactgc ctttgatact gggtatcttg 540
agtatggaag aggtaagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga tattcggagg 600
aacaccagtg gcgaaggcgg cttactggtc cattactgac gctgaggtgc gaaagcgtgg 660
ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat gttagccgtc 720
gggcagtata ctgttcggtg gcgcagctaa cgcattaaac attccgcctg gggagtacgg 780
tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 840
ttaattcgaa gcaacgcgca gaaccttacc agctcttgac attcggggta tgggcattgg 900
agacgatgtc cttcagttag gctggcccca gaacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc 960
gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgccct tagttgccag 1020
catttagttg ggcactctaa ggggactgcc ggtgataagc cgagaggaag tgggatgacg 1080
tcaagtgtcc tcatggccct tacgggctgg gctacacacg tgctacaatg gtggtgacag 1140
tgggcagcga gacagcgatg tcgagctaat ctccaaaagc catctcagtt cggattgcac 1200
tctgcaactc gagtgcatga agttggaatc gctagtaatc gcagatcagc atgctgcggt 1260
gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg gttttacccg 1320
aaggtagtgc gctaaccgca aggaggcagc taaccacggt agggtcagcg actggggtga 1380
tagtcg 1386。
4.如权利要求1所述的根瘤杆菌T3在微生物降解硫化氢中的应用。
5.如权利要求4所述根瘤杆菌T3在微生物降解硫化氢中的应用，其特征在于所述的应用为：对根瘤杆菌T3进行扩大培养，以培养所获得的菌液为酶源，使含硫化氢废气中的硫化氢降解。
6.如权利要求4所述根瘤杆菌T3在微生物降解硫化氢中的应用，其特征在于所述的应用为：以硫化氢为唯一硫源和能源，对根瘤菌T3扩大培养获得的菌液进行选择性培养，在密闭情况下，25～40℃，pH值4.0～9.0条件下培养2～3d，使硫化氢降解，所述的菌液中菌体的浓度为200～300mg/L，所述的硫化氢初始浓度为150～600ppm。
7.如权利要求6所述根瘤杆菌T3在微生物降解硫化氢中的应用，其特征在于所述的菌液为含菌细胞菌悬液，所述的含菌细胞菌悬液按如下方法制备：(1)将根瘤菌T3接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得斜面菌体；所述的斜面培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH值7.0～7.2，121℃灭菌15min；(2)用接种环从斜面菌体取一接种环菌体接种至种子培养基，30℃，160r/min培养1～2d，获得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH值7.0～7.2，121℃灭菌15min；(3)将种子液12000r/min离心5～10min，弃去上清液，用不含硫化物的无 菌无机盐液体培养基洗涤，然后12000r/min离心10min，弃去上清液，重复洗涤3次，将得到的菌体用漩涡混合器打散，再用不含硫化物的无菌无机盐培养基将菌体稀释，获得含菌细胞菌悬液；所述的无机盐培养基终浓度组成为：硫代硫酸钠8.0g/L，葡萄糖0.2g/L，KH2PO4 1.2g/L，K2HPO4 1.2g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，柠檬酸铁0.01g/L，溶剂为水，初始pH7.0。
8.如权利要求4所述根瘤杆菌T3在微生物降解硫化氢中的应用，其特征在于所述的应用按如下步骤进行：
(1)斜面培养：将根瘤菌T3接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得斜面菌体；所述的斜面培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH值7.0～7.2，121℃灭菌15min；
(2)种子培养：用接种环从斜面菌体取一接种环菌体接种至种子培养基，30℃，160r/min培养1～2d，获得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH值7.0～7.2，121℃灭菌15min；
(3)含菌细胞菌悬液的制备：将种子液12000r/min离心5～10min，弃去上清液，菌体用不含硫化物的无菌无机盐液体培养基洗涤，然后12000r/min离心10min，弃去上清液，重复洗涤3次，将菌体用漩涡混合器打散，再用不含硫化物的无菌无机盐培养基将菌体稀释，获得含菌细胞菌悬液；所述含菌细胞菌悬液中菌体细胞浓度为200～300mg/L；所述的无机盐培养基终浓度组成为：硫代硫酸钠8.0g/L，葡萄糖0.2g/L，KH2PO4 1.2g/L，K2HPO4 1.2g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，柠檬酸铁0.01g/L，溶剂为水，pH 7.0；
(4)硫化氢降解：将步骤(3)制备的含菌细胞菌悬液以5％的量接种至以硫化氢为唯一硫源的选择性培养基中，30℃，pH＝7.0，160rpm培养60h，跟踪检测硫化氢浓度及根瘤杆菌T3菌株的生长速度，绘制硫化氢降解率曲线及根瘤杆菌T3菌株生长曲线；所述的硫化氢初始浓度为150～600ppm；所述 的选择性培养基终浓度组成为：葡萄糖0.2g/L，KH2PO4 1.2g/L，K2HPO4 1.2g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，柠檬酸铁0.01g/L，溶剂为水，pH7.0。
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