CN104630097B - 一种嗜酸硫酸盐还原菌菌株及其应用 - Google Patents
一种嗜酸硫酸盐还原菌菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种嗜酸硫酸盐还原菌菌株FKB及其用于酸化控制的方法。所述嗜酸硫酸盐还原菌菌株FKB，为脱硫弯曲孢菌Desulfospor nosinus sp.，已于2014年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.10072。将该菌株经发酵培养后制成液态菌剂，在对土壤用石灰、鸡粪、磷肥等进行简单改良后与植物稳定技术联合使用，可有效对矿业废弃地如排土场、尾矿库土壤进行酸化控制，达到遏制酸化、生态复绿、矿山复垦的目的。
Description
技术领域
本发明属于微生物的筛选和应用领域，具体的涉及一种嗜酸硫酸盐还原菌菌株，及其用于酸化控制的方法。
背景技术
有色金属矿业废弃地的土壤酸化问题在全世界范围内都广泛存在。中国作为传统的矿业大国，目前拥有10万余座矿山，不间断的采矿活动产生了面积巨大的矿业废弃地，而其中大多数矿业废弃地并未得到妥善处理，严重的土壤酸化问题对整个生态环境造成了巨大的破坏，酸化区域寸草不生，有毒重金属酸水排放严重。这些矿业废弃地酸化的主要成因是：大多数有色金属矿地层都有各种类型的金属硫化物(主要为FeS2)，而这些金属硫化物随着开采活动的进行被暴露在空气中，就会立即被空气中的氧气氧化生成大量的硫酸。矿业废弃地的土壤酸化会带来一系列的社会环境问题，包括重度的重金属毒害、污染邻近耕田土壤及附近水体从而对人们的健康造成严重的威胁等等。因此，矿业废弃地酸化问题是整个矿山开采行业亟需解决的重要难题。
目前来说，矿业废弃地的酸化控制技术主要包括物理隔离技术、化学中和技术、植物稳定技术以及微生物处理技术等。传统的酸化控制技术如物理隔离技术、化学中和技术只能在有限的范围内减缓酸化过程的进行，并不能达到治本的效果，并且成本很高，耗费巨大；同时，在治理之后往往限制了这些矿业废弃地土地资源的有效利用，浪费了宝贵的土壤资源。植物稳定技术是目前使用较广的酸化控制技术，它通过快速建立植被，在表土形成耗氧层，减少氧气向更深层土壤扩散，阻碍金属硫化物的氧化，从而达到控制酸化的目的。但由于矿山废弃地的土壤往往缺乏植物生长所需的各种营养元素，并且大部分植物都不能在强酸条件下生长，所以这种植物修复技术往往要配合其他措施如化学中和、添加各类营养元素等才能取得较好的酸化控制效果。
微生物处理技术相对于其他几种技术而言，具有成本低、无二次污染并且能从源头上达到控制土壤酸化等优点，在过往的研究和应用中多采用铁还原细菌(FRB)和硫酸盐还原菌(SRB)来处理酸化问题。FRB和SRB能够通过铁锰还原作用、硫酸盐还原作用、甲烷生成作用以及反硝化作用消耗弱碱性物质生成强碱，从而进一步中和土壤中的酸性物质，达到控制酸化的效果；并且，SRB还能通过硫酸盐还原作用，将SO4 2-还原生成H2S，并可通过进一步反应生成单质S或者同其他重金属离子如Cu2+等结合而沉淀下来，同时，硫酸盐还原反应过程中也会消耗体系中存在的H+，这样就从源头上达到控制酸化的目的。
SRB是一类形态各异、营养类型多样，在厌氧或微氧环境中能氧化有机底物或H2，并还原硫酸盐或其他硫氧化物生成H2S的细菌或古菌。它广泛存在于土壤、水稻土、动物肠道、热泉、海洋、矿山酸性废水、石油管道和天然气井中。SRB利用SO4 2-作为最终的电子受体来降解一些简单的有机物，并且在代谢过程中消耗体系中存在的H+，产生高浓度的H2S和CO2，从而控制酸化。目前，已发现的SRB达60多个属、220余种，通过数据库中16S rRNA基因序列的分子进化分析，可以将SRB分为4个主要的类群：革兰氏阴性嗜温硫酸盐还原菌、革兰氏阳性产芽孢硫酸盐还原菌、嗜热硫酸盐还原细菌和嗜热硫酸盐还原古菌。然而，自然界中绝大多数SRB都是嗜中性的，最适宜的pH在6～8左右，且在pH<5时生长受到抑制，这样就限制了硫酸盐还原菌在控制酸化中的应用。但研究人员发现硫酸盐还原过程也能发生在酸性环境中，这就表明存在一类能够在低pH条件下实现硫酸盐还原作用的微生物，即嗜酸硫酸盐还原菌(aSRB)。但是，一直以来，分离培养纯的嗜酸(或耐酸)的SRB都是以失败告终，直到1999年，Sen&Johnson才分离出三株形态特征上比较接近Desulfotomaculun属的革兰氏阳性菌。然而，直到现在，发表的嗜酸(耐酸)的SRB也不过十余株，经过全基因组测序了解其功能的仅有2株。
在以往发表的专利中，大多数是将硫酸盐还原菌用于含重金属废水处理领域(CN101628773A、CN101195859A等)，偶见一些专利使用硫酸盐还原细菌用于矿业废弃地酸化控制修复，但这些技术方案往往存在着使用的菌群结构不明、菌株不耐酸性、修复效果不稳定，大多停留在实验室阶段、不能很好适应实际的大规模修复等一系列问题。例如，专利CN101037268A公开了“一种修复矿山生态环境的方法”，将硫酸盐还原细菌用于尾矿库的酸化治理，其技术方案是把矿山开发中产生的尾矿、废石、冶炼渣、选矿废水、冶炼废水、酸性矿坑水和矿石堆场淋滤水等集中到尾矿库中,同时投加污泥和能被微生物降解的有机物，在尾矿库中人为营造一个厌氧环境,在微生物和硫酸盐还原菌的作用下，产生硫离子并使尾矿库中水的pH值上升，硫离子沉淀固化各种重金属离子以防止其迁移。但这种方法使用的硫酸盐还原菌来源于污泥的自然筛选，存在上面所说的菌群结构不明、菌株不耐酸性、修复效果不稳定问题；专利发明人也仅在室内模拟了相关实验，并未将其放大到实际的尾矿库中进行验证，无法保证实际应用中的效果；同时，该方法需要堆积处理，不能很好地适宜已经闭库的尾矿库，也容易造成尾矿库结构不稳定，容易有泥石流的风险；最后，该技术方案也无法实现生态复绿、土地复垦的效果，在后续阶段无法巩固之前酸化控制取得的成果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术成本过高，使用的菌群结构不明、菌株不耐酸性、修复效果不稳定，大多停留在实验室阶段、不能很好适应实际的大规模修复，不能从源头控制矿山土壤酸化等缺点，提供一种新型的嗜酸硫酸盐还原菌菌株。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下的技术方案实现。
本发明公开了一种嗜酸硫酸盐还原菌菌株FKB，为脱硫弯曲孢菌Desulfospornosinus sp.，已于2014年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.10072。
本发明还公开了一种含有所述的嗜酸硫酸盐还原菌菌株FKB的液态菌剂的制作方法，包括以下步骤：
1)将FKB菌种接种到富集培养基中进行培养，氮吹20min后放置于30℃培养箱静置培养至培养液由澄清变为墨汁色；
2)将培养好的菌液按5％接种量接种至10L种子发酵罐中，通氮气20min，30℃培养至培养液由澄清变为墨汁色；
3)将种子发酵罐中的发酵液按15％的接种量接种至发酵罐中，通氮气30min，发酵条件为：，发酵至培养液变为墨汁色；
4)发酵完成后，将发酵液装袋制成液体菌剂，保证装袋过程不引入空气。
进一步的，所述步骤1)中的富集培养基配方为：(NH4)2SO40.45g，KCl0.05g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.05g，Ca(NO3)2·4H2O 0.014g，酵母提取物0.2g，甘油0.92g，蒸馏水1000mL，用1M H2SO4调节pH至3.5，121℃高压灭菌20min，冷却后再加入经过过滤除菌的FeSO4·7H2O 0.5g，抗坏血酸0.02g，巯基乙醇1g。
进一步的，所述步骤2)中的培养基配方(w/v)为：甘蔗糖蜜5％，酵母浸出液2％，葡萄糖0.5％，(NH4)2SO44.5％，MgSO4·7H2O 5％，KCl 0.5％，KH2PO40.5％，Ca(NO3)2·4H2O0.14％，FeSO4·7H2O 5％，抗坏血酸0.5％，pH 5.2。
根据权利要求2所述的液态菌剂的制作方法，其特征在于，所述步骤3)中所述发酵条件为：30℃，不搅拌，pH 5.2，罐压0.05～0.07Mpa；发酵罐培养基配方(w/v)为：甘蔗糖蜜10％，酵母浸出液2％，(NH4)2SO44.5％，MgSO4·7H2O 5％，KCl 0.5％，KH2PO40.5％，Ca(NO3)2·4H2O 0.14％，FeSO4·7H2O 6％，抗坏血酸0.5％，pH 5.2。
本发明的内容还包括所述嗜酸硫酸盐还原菌菌株FKB，在控制土壤酸化中的应用。
进一步的，所述应用为：将所述的嗜酸硫酸盐还原菌菌株FKB制成液态菌剂，在对土壤用石灰、鸡粪、磷肥等进行简单改良后与植物稳定技术联合使用。其具体步骤为：
1)在土壤表面开挖条沟；
2)按顺序添加石灰、鸡粪、磷肥对土壤基质进行改良，所述磷肥添加量为30g/m2，人工均匀播撒至表面，两侧土回填，保留条沟20cm左右的深度，保持1个月；
3)按照每亩15kg的FKB菌剂用量添加到条沟内，用两侧土回填稍压实，作用14天；
4)条沟间隙采用鱼鳞坑梅花点布置种植穴，种植植物营养袋苗，另外播撒植物种子和土壤种子库，覆盖厚度4cm左右稻草，保证有良好的通气环境；
5)抚育：种植期间共需抚育三次，第一次主要内容包括检查成活率，培土，并进行补植；第二次内容包括松土、扩穴、加石灰、施NPK复合肥，发现死株立即补植；第三次抚育，主要内容包括加石灰、松土、扩穴、培土、杀虫，每穴施追肥NPK复合肥100g，配合松土、培土，把肥料浅埋土内，如若长时间不下雨，适当浇水。
进一步的，所述步骤2)中，所用石灰为熟石灰；所用鸡粪为带谷壳鸡粪，使用前进行杀菌；所用磷肥为过磷酸钙。
本发明的嗜酸硫酸盐还原细菌株FKB，保藏编号CGMCC No.10072，由凡口铅锌矿尾矿库底泥样品中分离纯化而来，通过16S rRNA基因序列比对得出，它属于Firmicutes门下的Desulfosporosinus属。通过采用常规的革兰氏染色、芽孢染色与扫描电镜观察，结果表明FKB菌落边缘不整齐，杆状、属于产芽孢的革兰氏阴性菌，大小为3.0～6.5×0.4～0.7μm。随后的生理生化实验检测表明，FKB的生理生化特性如下：生长温度范围为10～40℃，最适宜的生长温度为30～35℃；生长的pH范围为3.6～6.0，最适宜生长的pH为5.2；生长的NaCl浓度范围为0～1.8％(w/v)，最适宜生长的NaCl浓度为0.6％。FKB能利用硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐和单质硫作为唯一硫源和电子受体，发生还原反应或歧化反应生成H2S并产生能量供菌体生长。FKB还能利用砷酸盐作为电子受体，将As(V)还原为As(III)，而As(III)能在特异性转运蛋白作用下被排出细胞，从而起到降低细胞内毒性的作用。硝酸盐也能作为电子受体为FKB提供生长所需的能量。我们进一步通过全基因组测序技术对该细菌的硫代谢以及对低pH、高重金属离子等环境的胁迫响应机制等一系列酸化控制相关的重要功能进行了研究和了解，借此，我们能够更好地将其用于矿业废弃地土壤的酸化控制。
所述的嗜酸硫酸盐还原细菌株FKB，通过以下步骤筛选分离所得：
从尾矿库采集底泥样品，样品采集后，首先采用特制的富集培养基进行富集培养，富集培养aSRB的培养基参考Sen与Johnson(1999)培养硫酸盐还原菌所用的培养基，并根据实际情况做相应改良，富集过程如下：取1g待分离样品置于预先灭菌的150mL的厌氧瓶中，加入120mL富集培养基，用高纯度氮气吹脱20min以除去培养基的O2，鼓气完毕后将培养物置于30℃恒温培养箱中避光静置培养，直到培养液由澄清变为墨汁色，取5％的培养液转接至新鲜的富集培养基中，转培10次以除去大部分的异养细菌；
样品经富集培养后，采用改良的分离培养基进行分离纯化，筛选出新的嗜酸硫酸盐还原菌菌株，分离纯化过程如下：配置分离培养基，灭菌后保温在50℃左右，将富集培养后的菌液稀释成10-2～10-6浓度的菌悬液，分别取50μL不同稀释度的菌液于培养皿中，立即倒入分离培养基并轻轻晃动培养皿，趁热将菌液与培养基混合均匀，待琼脂凝固后再倒入相同的培养基，然后将培养皿放入加有厌氧产气袋(日本三菱)的保鲜盒中于30℃进行厌氧培养，大约2周左右，培养皿中长出外表黑色的菌落，挑取单菌落转入液体培养基中厌氧培养，重复上述步骤直到培养皿中长出的菌落形态一致，即可对分离得到的SRB进行鉴定、保存。
所述的筛选分离方法，其使用的培养基配方为：
富集培养基：(NH4)2SO40.45g，KCl 0.05g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.05g，Ca(NO3)2·4H2O 0.014g，酵母提取物0.2g，甘油0.92g，蒸馏水1000mL，用1M H2SO4调节pH至3.5，121℃高压灭菌20min，冷却后再加入经过过滤除菌的FeSO4·7H2O 0.5g，抗坏血酸0.02g，巯基乙醇1g；
分离培养基：按富集培养基配方称取相应药品，溶于700mL蒸馏水中，用1M H2SO4调节pH至3.5；另称取1g琼脂溶于300mL蒸馏水中，分别于121℃灭菌20min，冷却至50℃左右，将两部分培养基混合均匀，再加入过滤除菌的FeSO4·7H2O 0.5g，抗坏血酸0.02g，巯基乙醇1g。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明筛选出的嗜酸硫酸盐还原细菌株FKB菌株，它属于嗜酸硫酸盐还原菌菌株，目前全世界分离出的aSRBs仅十余株，不仅克服了过往使用微生物菌群的不确定性，并且嗜酸性的特点也让该菌株更能够适应极端酸性环境，繁殖更快、代谢更旺、效果更好；同时，我们对FKB做了全基因组测序，深入了解了其代谢与功能，尤其是在硫酸盐还原和抗pH胁迫的机制这两方面，这能极大地帮助我们更好地培养和利用该菌株用于酸化控制。
2、本发明的控制土壤酸化技术，采用硫酸盐还原细菌进行酸化控制，从矿业废弃地酸化根源抑制酸化的发生，同时在对土壤用石灰、鸡粪、磷肥等进行简单改良后与植物稳定技术联合使用，避免了同类技术在修复后发生二次酸化的潜在威胁，免于再次修复所需的大量人力物力和资源浪费，同时也能达到生态复绿、矿山复垦的目的。
3、本发明的控制土壤酸化技术具有安全环保、环境友好的特点，无需对原有地貌进行大面积改造，也无需进行大面积的客土，避免了取土对周边山林生态环境的破坏。所有原材料和整个修复过程都不会对环境带来二次污染。
4、本发明的控制土壤酸化技术具有成本低廉、操作简单的特点，并已经在永平铜矿排土场、城门山铜矿尾矿库进行了大面积实际应用并取得了很好的效果，酸化现象得到明显控制，植被覆盖率均在90％以上，适合大面积的推广使用。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1是本发明的嗜酸硫酸盐还原细菌株FKB菌株的革兰氏染色(1,000倍光学显微镜)和扫描电镜观察形态图。
本发明的嗜酸硫酸盐还原菌菌株FKB，为脱硫弯曲孢菌Desulfospornosinus sp.，已于2014年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.10072。
具体实施方式
实施例1FKB菌株分离鉴定及功能解析
1)菌种筛选
自凡口铅锌矿1号尾矿库边缘采集的底泥样品，用无菌的50mL离心管收集，然后置于冰浴中运回实验室，立即保存在4℃冰箱。
样品采集后，首先采用特制的富集培养基进行富集培养，目的是让原本不占据优势地位的硫酸盐还原菌群得以大量繁殖，并去除大部分的异养细菌。富集培养aSRB的培养基参考Sen与Johnson(1999)培养硫酸盐还原菌所用的培养基，并根据实际情况做相应改良。富集培养基的成分为：(NH4)2SO40.45g；KCl0.05g；MgSO4·7H2O 0.5g；KH2PO40.05g；Ca(NO3)2·4H2O 0.014g；酵母提取物0.2g；甘油0.92g，蒸馏水1000mL，用1M H2SO4调节pH至3.5，121℃高压灭菌20min，冷却后再加入经过过滤除菌的FeSO4·7H2O 0.5g，抗坏血酸0.02g，巯基乙醇1g。富集过程如下：取1g待分离样品置于预先灭菌的150mL的厌氧瓶中，加入120mL富集培养基，用高纯度氮气吹脱20min以除去培养基的O2。鼓气完毕后将培养物置于30℃恒温培养箱中避光静置培养，直到培养液由澄清变为墨汁色，表明硫酸盐还原菌已大量繁殖。取5％的培养液转接至新鲜的富集培养基中，转培10次以除去大部分的异养细菌。
样品经富集培养后，采用改良的分离培养基进行分离纯化，筛选出新的嗜酸硫酸盐还原菌菌株。分离培养基的配方如下：按富集培养基配方称取相应药品，溶于700mL蒸馏水中，用1M H2SO4调节pH至3.5；另称取1g琼脂溶于300mL蒸馏水中，分别于121℃灭菌20min，冷却至50℃左右，将两部分培养基混合均匀，再加入过滤除菌的FeSO4·7H2O 0.5g，抗坏血酸0.02g，巯基乙醇1g。分离纯化过程如下：按照上述方法配置分离培养基，灭菌后保温在50℃左右，将富集培养后的菌液稀释成10-2～10-6浓度的菌悬液，分别取50μL不同稀释度的菌液于培养皿中，立即倒入分离培养基并轻轻晃动培养皿，趁热将菌液与培养基混合均匀，待琼脂凝固后再倒入相同的培养基，然后将培养皿放入加有厌氧产气袋(日本三菱)的保鲜盒中于30℃进行厌氧培养。大约2周左右，培养皿中长出外表黑色的菌落，挑取单菌落转入液体培养基中厌氧培养。重复上述步骤直到培养皿中长出的菌落形态一致，即可对分离得到的SRB进行鉴定、保存。
2)菌种鉴定及功能解析
分子生物学鉴定：分离得到FKB后，对其进行基因组DNA提取，采用27F/1492R扩增16s rRNA基因序列，pcr产物纯化后送至华大基因进行测序，获取其序列信息。利用NCBIBLAST将所测得的FKB菌株的16S rRNA序列信息与GenBank数据库序列进行同源性比较，结果表明FKB属于Clostridiales目、Peptococcaceae科、Desulfosporosinus属(该属中的微生物都具有硫酸盐还原功能)。
菌体形态特征鉴定及生理生化特性：菌体的形态采用常规的革兰氏染色、芽孢染色与扫描电镜观察。结果为：FKB菌落边缘不整齐，杆状、属于产芽孢的革兰氏阴性菌，大小为3.0～6.5×0.4～0.7μm。经检测，FKB的生理生化特性如下：生长温度范围为10～40℃，最适宜的生长温度为30～35℃；生长的pH范围为3.6～6.0，最适宜生长的pH为5.2；生长的NaCl浓度范围为0～1.8％(w/v)，最适宜生长的NaCl浓度为0.6％。FKB能利用硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐和单质硫作为唯一硫源和电子受体，发生还原反应或歧化反应生成H2S并产生能量供菌体生长。FKB还能利用砷酸盐作为电子受体，将As(V)还原为As(III)，而As(III)能在特异性转运蛋白作用下被排出细胞，从而起到降低细胞内毒性的作用。硝酸盐也能作为电子受体为FKB提供生长所需的能量。
全基因组测定：为了更清楚地了解FKB的酸化控制机制，我们对其进行了全基因组测序。首先提取FKB的基因组DNA，然后通过Covaris超声波破碎仪随机打断成长度为500和800bp的片段，经末端修复、加测序接头、纯化、PCR扩增完成文库的制备。构建好的文库利用IlluminaMiseq PE 250测序仪对其进行二代高通量测序。测序数据经过质量控制、序列拼接，然后将拼接所得的基因组草图通过Genemark进行基因预测，并使用BLASTx将得到的开放阅读框(ORF)与NCBI-nr(Non redundant)、KEGG、egg-NOG等功能数据库比对进行功能注释；同时，将预测基因上传KAAS进行功能注释，并通过对各菌株的基础代谢(C、N、P、S等代谢)以及抗性(包括重金属、pH抗性以及氧化胁迫等)响应机制构建其代谢通路。
FKB的基因组大小为5.1Mbp，由40个scaffold组成，G+C比例为41.8％；其16s rDNA序列如序列表Seq ID No.1所示。从16S rRNA***发育来看，与已测基因组菌株Desulfosporosinus acidiphilus SJ4较为相似，相似度为96％。在FKB中我们检测到了编码催化硫酸盐、亚硫酸盐和硫代硫酸盐代谢所需的全部基因。首先，进入细胞内的SO4 2经硫酸盐腺苷转移酶(sat,sulfate adenylyltransferase)催化形成APS；然后，由aprAB基因编码的腺苷硫酸还原酶(adenylylsulfate reductase)催化APS生成SO3 2-，最终通过dsrAB基因编码异化的硫酸盐还原酶(dissimilatory sulphate reductase)催化SO3 2-生成H2S。并且，FKB基因组中检测到的phsA基因能编码硫代硫酸盐还原酶(thiosulfate reductase)，该酶能催化硫代硫酸盐还原生成H2S。重金属抗性上，FKB可通过三种方式去应对胁迫：一是ATP酶参与的离子泵来排除有害重金属离子，二是通过形成络合物以降低重金属毒性，三是重金属阳离子的氧化反应。另外，针对低pH胁迫，全基因组测序结果显示FKB通过以下四种方式进行响应：1、通过Na+/H+ATPase、K+/H+ATPase实现质子的交换排出；2、一系列的细胞质缓冲分子吸收渗透进入细胞的质子；3、催化鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸脱羧消耗质子；4、降解多种有机酸去除质子。正是由于以上硫酸盐还原机制、重金属抗性机制以及多种pH胁迫响应机制的存在，FKB才具有在低pH、高浓度重金属离子条件下存活并且拥有还原硫酸盐消耗H+控制酸化的功能。借此，我们在详细了解了FKB生活习性和功能的基础上能够更好地将其用于矿业废弃地土壤的酸化控制。
实施例2FKB液体菌剂制备
1)将FKB菌种接种到富集培养基中进行培养，使用100mL蓝盖玻璃瓶，接种后需氮吹20min除去空气，然后放置于30℃培养箱静置培养至培养液由澄清变为墨汁色；
2)将培养好的菌液按5％接种量接种至10L种子罐中，通氮气20min，30℃培养至培养液由澄清变为墨汁色，种子发酵罐装液量为70％，培养基配方(w/v)为：甘蔗糖蜜5％，酵母浸出液2％，葡萄糖0.5％，(NH4)2SO44.5％，MgSO4·7H2O 5％，KCl 0.5％，KH2PO40.5％，Ca(NO3)2·4H2O 0.14％，FeSO4·7H2O5％，抗坏血酸0.5％，pH 5.2；
3)将种子发酵罐中的发酵液按15％的接种量接种至发酵罐中，通氮气30min，发酵条件为：30℃，不搅拌，pH 5.2，罐压0.05～0.07Mpa，发酵至培养液变为墨汁色，发酵罐培养基配方(w/v)为：甘蔗糖蜜10％，酵母浸出液2％，(NH4)2SO44.5％，MgSO4·7H2O 5％，KCl0.5％，KH2PO40.5％，Ca(NO3)2·4H2O0.14％，FeSO4·7H2O 6％，抗坏血酸0.5％，pH 5.2；未说明部分按发酵通用操作进行；
4)发酵完成后，将发酵液装袋制成液体菌剂，保证装袋过程不引入空气。
实施例3FKB用于排土场酸化控制
地点为江西永平铜矿南部排土场，面积为16800平方米，分为顶部和边坡两大区域，边坡10000m2，顶部6800m2。该区域具有以下典型代表意义：
(1)边坡陡、落差大：根据测绘地形图，该区域顶部高程273.3m，坡脚高程185.5m，高差达87.8m，边坡坡度在1:1～1:1.25之间。基本可以代表排土场的地形边坡陡、落差大的情况。
(2)冲刷严重，漂石成堆：由于多年和冲刷，该区域边坡及坡脚占总面积60％以上基本为漂石，无土，对于植物的成活条件极差(现场未见任何植物生长)，属排土场植被恢复难度相对比较大的区域。
(3)边坡土质情况差：从现场条件可以看出，该区域虽然中间平台附近尚有些土，但鲜见植物生长，现场可见有酸化反应正剧烈进行中，产生热气外冒。
实验区土地平整之后，对整个实验区土壤进行取样分析，取样深度为0～20cm，共取得土壤样品96个。分析结果表明：该实验区属于强酸性，高酸化潜力，同时存在大量游离的酸性离子的土壤；并且实验区也存在十分严重的铜离子毒性危害，部分区域有较轻的铅毒性；土壤营养十分匮乏，远远满足不了植物萌发生长所必须的大量营养元素。具体分析数据见下表：
注：NAG单位为kg H2SO4/t，重金属指标单位均为ppm，营养元素指标单位均为g/kg。
根据以上土壤取样调查结果，确定鸡粪添加量为12.5kg/m2，熟石灰添加量为7kg/m2，磷肥添加量为30g/m2；通过前期托运的排土场土壤所做的室内实验筛选和实地勘察，确定植物种植方案如下：种植五节芒、马尾松、刺槐营养袋苗；直播高羊茅、狗牙根、百喜草、泡桐、田菁、虎杖、苣麻等种子；另加土壤种子库，土壤种子库取自当地废弃的农田。具体操作步骤为：
1)在土壤表面开挖条沟；
2)按顺序添加石灰、鸡粪、磷肥对土壤基质进行改良，所述磷肥添加量为30g/m2，人工均匀播撒至表面，两侧土回填，保留条沟20cm左右的深度，保持1个月；
3)按照每亩15kg的FKB菌剂用量添加到条沟内，用两侧土回填稍压实，作用14天；
4)条沟间隙采用鱼鳞坑梅花点布置种植穴，种植植物营养袋苗，另外播撒植物种子和土壤种子库，覆盖厚度4cm左右稻草，保证有良好的通气环境；
5)抚育：种植期间共需抚育三次，第一次主要内容包括检查成活率，培土，并进行补植；第二次内容包括松土、扩穴、加石灰、施NPK复合肥，发现死株立即补植；第三次抚育，主要内容包括加石灰、松土、扩穴、培土、杀虫，每穴施追肥NPK复合肥100g，配合松土、培土，把肥料浅埋土内，如若长时间不下雨，适当浇水。
实验区从2013年11月初进场施工，年前完成土地平整、基质改良以及添加菌剂工作，开春后天气回暖完成植物种植工作，2014年3月20日完成本项目的全部施工工作，转为后期的抚育工作。2014年6月9日，我们进行了实验区修复情况考察和植物调查工作。经实地考察发现，实验区的酸化情况已经得到极大地改善，没有看到正在进行的酸化反应，土壤营养条件明显提高，多种低矮草本植物占据优势地位，如百喜草、芒草、狗牙根等，原本的水土流失情况得到了有效遏制。植物调查结果显示实验区共有植物品种47种，涵盖草本、灌木、乔木，整体覆盖度达90％，整体平均高度为50cm，生长茂盛，长势良好。同年9月11日，我们进行了第二次现场考察和植物调查工作。结果表明，实验区酸化情况已明显好转，植被平均盖度为96％，整体高度为160cm，植物整体生长情况良好，原来占据优势地位的低矮草本已经被一些高大草本、灌木或者乔木所取代，如五节芒、酸模叶蓼、苎麻、田菁、台湾泡桐等，底下土质已经有了较为明显的变化，在保水性、肥力、稳定性等方面有了很大提高。整个实验区的生态环境已经得到明显提升。
实施例4FKB用于尾矿库酸化控制
地点为江西城门山铜矿凤爪沟尾矿库，面积为4000平方米。凤爪沟尾矿库2006年底已经停止使用，至今已将6～7年时间，尾矿库内尾砂干燥固结，表面龟裂，具有一定的地基承载力，尾矿库库区大部分已干枯，雨季时库中局部会积水。据现场踏勘，实验地表面平坦，表面为粉末白沙状，下层则密实粘连，板结现象非常严重；整个实验地范围无任何植物生长，表面温度高、缺水，土壤保水性差；土层柔软，人踩踏即可留下较深的痕迹，十分不利于大型工程器械的操作。前期进行了取样调查工作，取样深度为0～20cm，总样品数为50个，检测指标包括酸化指标、重金属指标和营养元素指标三大块。样品分析结果表明该尾矿库实验区土壤酸化十分严重，pH低达2.56，并且存在较高的酸化潜力，NAG达到21.5kg H2SO4/t，铜离子毒害严重，植物生长所需营养元素极度匮乏。具体分析结果见下表：
注：NAG单位为kg H2SO4/t，重金属指标单位均为ppm，营养元素指标单位均为g/kg。
根据以上土壤取样调查结果，确定鸡粪添加量为15kg/m2，熟石灰添加量为10kg/m2，磷肥添加量为30g/m2；按照实施例3所述技术方案操作。通过前期托运的尾矿库土壤所做的室内实验筛选和实地勘察，确定植物种植方案如下：种植铺地黍、苎麻、苍耳、刺槐营养袋苗；直播高羊茅、狗牙根、百喜草、田菁、酸模叶蓼等种子；另加土壤种子库，土壤种子库取自当地废弃的草地。
项目于2014年1月6日进场，2014年2月5日基本完成了实验项目的施工工作，同时转后施工后的抚育工作。2014年6月28日，我们对实验区进行了植物调查和土壤取样分析。植物调查结果表明实验区共有植物26种，已初步形成多种植物匹配互长的生长态势，植物平均株高达50cm、根系深度在10cm以上，豆科植物平均株高20cm、根系深度在20cm以上，豆科植物已形成了良好的根瘤菌，增强了植物固氮能力。植被盖度达85％以上，各品种根系已纵横交错、互补，已形成控制尾砂地表的根系网络，植物基质内微生物及植物根系共同作用，植被的建立促使尾砂成土趋势明显加快，实现控制酸化、生态复绿的目标。土壤取样分析结果表明，在修复约5个月后，实验地pH已上升至7.90，强酸性已经得到有效改善；NAG-pH为3.38，潜在产酸得到有力控制；EC值由2.34ms/cm降至0.95ms/cm，土壤中大量存在的游离毒害离子已经大大减少，整个实验地的酸化情况已经得到有效地改善。该项目目前已经通过顺利通过江西铜业股份有限公司验收。
Claims (9)
1.一种嗜酸硫酸盐还原菌菌株FKB，其特征在于：该菌株属于脱硫弯曲孢菌(Desulfosporosinus sp.)，其保藏编号为：CGMCC No.10072。
2.一种含有权利要求1所述的嗜酸硫酸盐还原菌菌株FKB的液态菌剂的制作方法，包括以下步骤：
1)将FKB菌种接种到富集培养基中进行培养，厌氧30℃静置培养至培养液由澄清变为墨汁色；
2)将培养好的菌液按5％接种量接种至种子发酵罐中，厌氧30℃静置培养至培养液由澄清变为墨汁色；
3)将种子发酵罐中的发酵液按15％的接种量接种至发酵罐中，厌氧30℃静置培养至培养液变为墨汁色；
4)发酵完成后，将发酵液装袋制成液态菌剂，保证装袋过程不引入空气。
3. 根据权利要求2所述的液态菌剂的制作方法，其特征在于：所述步骤1)中的富集培养基配方为：(NH4)2SO4 0.45g，KCl 0.05g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 0.05g，Ca(NO3)2·4H2O 0.014g，酵母提取物0.2g，甘油0.92g，蒸馏水1000mL，用1M H2SO4调节pH至3.5，121℃高压灭菌20min，冷却后再加入经过过滤除菌的FeSO4·7H2O 0.5g，抗坏血酸0.02g，巯基乙醇1g。
4. 根据权利要求2所述的液态菌剂的制作方法，其特征在于：所述步骤2)中的培养基配方为w/v：甘蔗糖蜜5％，酵母浸出液2％，葡萄糖0.5％，(NH4)2SO4 4.5％，MgSO4·7H2O5％，KCl 0.5％，KH2PO4 0.5％，Ca(NO3)2·4H2O 0.14％，FeSO4·7H2O 5％，抗坏血酸0.5％，pH 5.2。
5. 根据权利要求2所述的液态菌剂的制作方法，其特征在于：所述步骤3)中所述发酵条件为：30℃，不搅拌，pH 5.2，罐压0.05～0.07Mpa；发酵罐培养基配方为w/v：甘蔗糖蜜10％，酵母浸出液2％，(NH4)2SO4 4.5％， MgSO4·7H2O 5％，KCl 0.5％，KH2PO4 0.5％，Ca(NO3)2·4H2O 0.14％，FeSO4·7H2O 6％，抗坏血酸0.5％，pH 5.2。
6.权利要求1所述的嗜酸硫酸盐还原菌菌株FKB在控制土壤酸化中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：将权利要求1所述的嗜酸硫酸盐还原菌菌株FKB制成液态菌剂，在对土壤用石灰、鸡粪、磷肥进行改良后与植物稳定技术联合使用。
8.根据权利要求7所述的应用，其步骤为：
1)在土壤表面开挖条沟；
2)按顺序添加石灰、鸡粪、磷肥对土壤基质进行改良，所述磷肥添加量为30g/m2，人工均匀播撒至表面，两侧土回填，保留条沟20cm的深度，保持1个月；
3)按照每亩15kg的FKB菌剂用量添加到条沟内，用两侧土回填稍压实，作用14天；
4)条沟间隙采用鱼鳞坑梅花点布置种植穴，种植植物营养袋苗，另外播撒植物种子和土壤种子库，覆盖厚度4cm稻草，保证有良好的通气环境；
5)抚育：种植期间共需抚育三次，第一次主要内容包括检查成活率，培土，并进行补植；第二次内容包括松土、扩穴、加石灰、施NPK复合肥，发现死株立即补植；第三次抚育，主要内容包括加石灰、松土、扩穴、培土、杀虫，每穴施追肥NPK复合肥100g，配合松土、培土，把肥料浅埋土内，如若长时间不下雨，适当浇水。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤2)中，所用石灰为熟石灰；所用鸡粪为带谷壳鸡粪，使用前进行杀菌；所用磷肥为过磷酸钙。
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