CN102796671A - 一种降解辛硫磷的淡紫拟青霉菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明从福建省福州市闽侯县的番茄根际土壤中分离得到菌株，该淡紫拟青霉菌株FJAT-9041（Paecilomyces lilacinus），于2012年05月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO．6110，并揭露了利用该淡紫拟青霉菌株FJAT-9041（Paecilomyces lilacinus）制备辛硫磷的降解菌剂的方法。本发明的优点在于：提供一种淡紫拟青霉菌株FJAT-9041（Paecilomyces lilacinus），并利用该淡紫拟青霉菌株FJAT-9041制备辛硫磷的降解菌剂，获得的降解菌剂对辛硫磷的降解效率很高。

Description

一种降解辛硫磷的淡紫拟青霉菌株及其应用

【技术领域】

本发明涉及一种微生物及其应用，尤其涉及一种降解辛硫磷的淡紫拟青霉菌株及应用其制备辛硫磷的降解菌剂。

【背景技术】

随着农业经济发展，病虫害增多，农药用量增大，据统计，全世界每年通过植物保护方法增加的产量有80％依靠农药。有机磷农药一直是中国用量最大的农药种类，每年都在十万吨以上。但是农药在提高农产品品质，提高人们生活质量的同时，也给人类和动物带来了巨大的危害，同时还带来了很大的环境污染和食品安全问题。辛硫磷是一种常用的有机磷农药，主要用于防治地下害虫，在土壤中的残留时间较长，长期累积易造成环境污染。

生物修复法是利用微生物或植物或动物将土壤、地下水或海洋中的污染物降解、吸收或富集的生物工程技术。它主要可分为三种类型：植物修复技术、微生物修复技术和菌根修复技术。其中微生物修复技术是从污染土壤、水体中筛选出能降解污染物的真菌、细菌、放线菌、固氮菌、酵母菌和霉菌，通过实验室驯化、修饰来提高其降解能力，制成菌剂再放入被污染领域中，是目前研究较多的领域。

目前据公开资料报道过的辛硫磷的降解菌主要有邻单胞菌属(Plesiomonas sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、玫瑰单胞菌属(Rosemonassp.)、戴尔福特菌属（Delftia sp．）、不动杆菌属（Acinetobacter sp．）、沼泽红假单胞菌(Rhodopesudomonas plaustris)、芽孢杆菌属（Bacillus spp.）、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)，大部分处于理论研究阶段，还不足以进行生产应用。将淡紫拟青霉用于对辛硫磷的降解为发明人首次报道并制备成菌剂应用于田间。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题在于提供一种能够降解辛硫磷的淡紫拟青霉菌株，该菌株为淡紫拟青霉菌株FJAT-9041（Paecilomyces lilacinus），且该淡紫拟青霉菌株FJAT-9041于2012年05月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO．6110，并利用该菌株制备辛硫磷的降解菌剂。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

本申请人从福建省福州市闽侯县的番茄根际土壤中分离得到的菌株，通过对该菌株进行病原形态学鉴定和分子生物学鉴定，最终鉴定其为淡紫拟青霉的一个菌株。

进一步地，利用该菌株制备辛硫磷的降解菌剂，其制备方法的具体步骤如下：

（1）所述的淡紫拟青霉菌株FJAT-9041的活化：用接种环将所述的淡紫拟青霉菌株FJAT-9041划线接种于PDA平板培养基上，并于恒温培养箱中培养48h，培养温度设定为30℃；

（2）种子液的制备：将步骤（1）培养所获得的淡紫拟青霉菌株FJAT-9041的单菌落接种于种子培养基中，并将其置于恒温摇床振荡培养，转速200rpm，温度设定为30℃，振荡培养24h后即得种子液；

（3）降解菌剂的制备：将步骤（2）获得的种子液接种到已灭菌的发酵培养基中，接种量1％，通气量1∶1.2，温度设定为30℃；在发酵培养的过程中每隔一段时间取适量的发酵液测定其孢子浓度，当测定的孢子浓度值达到2.0×10⁸CFU/mL时则发酵完成；然后将发酵完成后的发酵液直接以包装瓶分装成液体剂型，或采用泥炭吸附剂吸附后用包装袋分装成固体菌剂剂型。

其中，所述步骤（1）中PDA培养基的组分为：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL；

所述步骤（2）中种子培养基与步骤（3）中发酵培养基均为PDB培养基，其组分为：马铃薯20%，葡萄糖2％，水余量；且该培养基组分中的百分比均为重量比。

本发明的有益效果在于：提供一种淡紫拟青霉菌株FJAT-9041（Paecilomyces lilacinus），并利用该淡紫拟青霉菌株FJAT-9041制备辛硫磷的降解菌剂，该降解菌剂对辛硫磷的降解效率很高，使用该降解菌剂可以在农作物的正常生产过程中正常使用有机磷农药辛硫磷进行病虫害防治而保证农产品中的农药残留量符合人体健康要求，另外，该降解菌剂的制备过程简单、成本低廉、且对环境及人体无害，可进行无害化生产。

【具体实施方式】

本发明中淡紫拟青霉菌株FJAT-9041（Paecilomyces lilacinus）是从福建省福州市闽侯县的番茄根际土壤中分离得到的菌株，并揭露了利用该淡紫拟青霉菌株FJAT-9041制备降解菌剂的方法。

一、该菌株FJAT-9041的分离

（1）样品的采集：取番茄根际土壤约1000g装入采集袋中，采集袋中装入标签并在标签上注明采集时间、地点、寄主等，同时在采样记录本上详细记录采集时间、地点、寄主、土壤类型等样品采集后，低温保存，在一个月内分离真菌，备用；

（2）分离菌株（采用选择性培养基法）：配置Czapek培养基与PDA培养基；取上述备用的土样5g并加至装有100mLCzapek培养基的三角瓶中，且往该三角瓶内添加辛硫磷至浓度为40μg/mL；然后将三角瓶置于28℃、110r/min条件下摇床培养5天；接着取1mL培养获得的菌液并转至新鲜的Czapek培养基中继续培养，并添加辛硫磷至该培养基中辛硫磷浓度为400μg/mL；之后取继续培养获得的菌液按10倍梯度稀释至10^-7，将稀释液涂布于辛硫磷浓度为800μg/mL的PDA平板培养基上，并28℃恒温培养，待PDA平板培养基长出菌落后，挑取单菌落上的菌丝体通过连续划线分离，得到纯化的菌株，并将该菌株保存于PDA培养基斜面。

其中，Czapek培养基的组分为：KCl 0.5g，K₂HPO₄1g，NaNO₃3g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，蔗糖30g，水1000mL；PDA培养基的组分为：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。

二、该菌株FJAT-9041的鉴定

1．初步鉴定——病原形态学鉴定：

病原形态学鉴定依据Booth（1971）的鉴定方法进行初步鉴定：测定上述保存于PDA培养基斜面上的菌株的单孢菌落的生长速度、孢子形态及产孢细胞，结果发现：菌落在PDA培养基上培养7d，直径可达约3.5cm，正面颜色呈淡紫色，突起，表面粉质，轮纹明显，背面无色或***；菌丝无色，有隔膜；分生孢子梗直立，轮状分枝，2~4个瓶梗轮状排列在孢子梗上；瓶梗基部膨大，顶端稍细长，约1μm长，瓶梗大小为7.5~12.5×2.5~3.0μm；分生孢子椭圆形至纺锤形，表面光滑，大小为2.5~4.0×2.0~2.5μm。依据Booth（1971）的鉴定结果，初步确定该菌株为淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）。

2．进一步鉴定——分子生物学鉴定：

（1）菌株菌丝体的培养和收集：供试菌株（即上述保存于PDA培养基斜面上的菌株）经单孢培养后，采用玻璃纸平板培养法收集菌丝。具体地，在直径为9cm培养皿中倒入PDA培养基约12mL，待凝固后，放入与培养皿等大的灭菌玻璃纸，该玻璃纸上接种3~5块直径为6mm的菌饼，28℃下培养72h，刮取菌丝，经真空冷冻干燥后置于-80℃冰箱保存备用；

（2）基因组DNA的提取：称取（1）中获得的干菌丝0.05g于预冷的无菌研钵中，并加入液氮研磨至细粉状，之后迅速转入1.5mL离心管中，参照Invitrogen公司的

Reagent（Cat.No.15596-018）说明书进行操作提取菌株的基因组DNA；

（3）菌株FJAT-9041的鉴定:

采用引物ITS4和ITS5（White，1990）进行rDNA-ITS序列的扩增。引物ITS4和ITS5委托生物工程（上海）有限公司利用DNA合成仪合成：引物序列分别为：

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；

ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’；

以提取所获得的菌株的基因组DNA为模板，上述引物（ITS4/ITS5）为引物对进行PCR扩增：

扩增反应体系（25μl体系）：DNA模板10-20ng，Ex Taq（5U/μL）0.125mL，10×PCR缓冲液2.5μL，Dntp（2.5mM）2mL，引物（10μM）各1μL，加无菌水至25μL；

扩增条件：94℃5min；接着94℃1min，54℃1min，72℃1min共35个循环；最后72℃10min。

PCR产物的测序与分析：将rDNA的PCR扩增产物直接送交上海英骏生物技术有限公司测序（测得的序列如SEQ ID NO.1所示）。序列分析的结果通过国际互连网进行核酸同源性检索，得到相似性最高的均为淡紫拟青霉，其中与基因库编码为AB124670的淡紫拟青霉ITS序列同源性最高，达到99%。

通过上述的鉴定，可确定该菌株为淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）。

三、辛硫磷降解菌剂的制备步骤

（1）淡紫拟青霉菌株FJAT-9041的活化：用接种环将淡紫拟青霉菌株FJAT-9041划线接种于PDA平板培养基上，并于恒温培养箱中培养48h，培养温度设定为30℃；

（2）种子液的制备：将步骤（1）培养所获得的淡紫拟青霉菌株FJAT-9041的单菌落接种于种子培养基中，并将其置于恒温摇床振荡培养，转速200rpm，温度设定为30℃，振荡培养24h后即得种子液；

（3）降解菌剂的制备：将步骤（2）获得的种子液接种到已灭菌的发酵培养基中，接种量1％，通气量1∶1.2，温度设定为30℃；在发酵培养的过程中每隔一段时间取适量的发酵液测定其孢子浓度，当测定的孢子浓度值大袋2.0×10⁸CFU/mL时则发酵完成；然后将发酵完成后的发酵液直接以包装瓶分装成液体剂型，或采用泥炭吸附剂吸附后用包装袋分装成固体菌剂剂型。

其中，步骤（1）中PDA培养基的组分为：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL；步骤（2）中种子培养基与步骤（3）中发酵培养基均为PDB培养基，其组分为：马铃薯20%，葡萄糖2％，水余量；且该培养基组分中的百分比均为重量比。

四、降解菌剂对辛硫磷的降解试验

试验1降解菌剂对辛硫磷的室内降解试验

设置实验组与对照组，以上述所制备的降解菌剂作为处理组，以不接种淡紫拟青霉的空白液体培养基为空白对照，其余处理步骤完全相同；在实验组的样品中加入4%的辛硫磷乳液1ml，使辛硫磷在样品中的添加浓度达到400μg/ml，并于恒温摇床继续振荡培养5天，转速200rpm，温度设定为30℃；且实验组与对照组均设三个重复。取样检测实验组及对照组中的辛硫磷残留量，检测结果见下表1。

由表1可知，经降解菌剂处理5天后，辛硫磷的降解率均达到97%以上；而对照的自然降解率只有5.46%。

表1降解菌剂对辛硫磷的降解效果

试验2降解菌剂对土壤中辛硫磷残留的降解试验

土壤取自福建省农科院试验田，混匀，每个样品取10kg土壤。在各土壤样品中分别人为添加辛硫磷浓度至40μg/kg，将上述制备的降解菌剂用水稀释100倍施用在土壤样品上，并以施用清水的土壤样品作为对照。处理后20天测定各土壤样品中辛硫磷的含量。测定结果显示，对照土壤样品中辛硫磷的降解率只有37.01%，表明大部分辛硫磷仍残留在土壤中；而降解菌剂处理过的土壤样品中辛硫磷的浓度只有7.35μg/kg，降解率达到81.62％，表明降解菌剂极大加速了土壤中辛硫磷的降解速度。

综上，本发明利用淡紫拟青霉菌株FJAT-9041制备所得的辛硫磷的降解菌剂对辛硫磷具有很高的降解效率，且使用该降解菌剂可以在农作物的正常生产过程中正常使用有机磷农药辛硫磷进行病虫害防治而保证农产品中的农药残留量符合人体健康要求，另外，该降解菌剂的制备过程简单、成本低廉、且对环境及人体无害，可进行无害化生产。

Claims (3)

1.一种降解辛硫磷的淡紫拟青霉菌株，其特征在于：所述菌株为淡紫拟青霉菌株FJAT-9041（Paecilomyces lilacinus），于2012年05月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO．6110。

2.一种辛硫磷的降解菌剂，其特征在于：其制备方法的具体步骤如下：

（1）权利要求1中所述的淡紫拟青霉菌株FJAT-9041的活化：用接种环将权利要求1中所述的淡紫拟青霉菌株FJAT-9041划线接种于PDA平板培养基上，并于恒温培养箱中培养48h，培养温度设定为30℃；

（2）种子液的制备：将步骤（1）培养所获得的淡紫拟青霉菌株FJAT-9041的单菌落接种于种子培养基中，并将其置于恒温摇床振荡培养，转速200rpm，温度设定为30℃，振荡培养24h后即得种子液；

（3）降解菌剂的制备：将步骤（2）获得的种子液接种到已灭菌的发酵培养基中，接种量1％，通气量1∶1.2，温度设定为30℃；在发酵培养的过程中每隔一段时间取适量的发酵液测定其孢子浓度，当测定的孢子浓度值达到2.0×10⁸CFU/mL时则发酵完成；然后将发酵完成后的发酵液直接以包装瓶分装成液体剂型，或采用泥炭吸附剂吸附后用包装袋分装成固体菌剂剂型。

3.根据权利要求2所述的一种辛硫磷的降解菌剂，其特征在于：所述步骤（1）中PDA培养基的组分为：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL；

所述步骤（2）中种子培养基与步骤（3）中发酵培养基均为PDB培养基，其组分为：马铃薯20%，葡萄糖2％，水余量；且该培养基组分中的百分比均为重量比。