CN104152373B - 一种可高效降解二甲戊乐灵的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种可高效降解二甲戊乐灵的菌株，命名为耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)Y‑1‑4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年2月27日，保藏号为CGMCC No.8823。本发明从长期种植蔬菜的土壤中分离获得一株高效分解二甲戊乐灵的耐盐短杆菌Y‑1‑4，该耐盐短杆菌Y‑1‑4具有高效降解二甲戊乐灵的能力，能够降解土壤及蔬菜中残留的二甲戊乐灵，具有降解特性良好，降解速率快，降解效率高等优点。

Description

一种可高效降解二甲戊乐灵的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种农药降解微生物，尤其涉及一种可高效降解二甲戊乐灵的菌株，属于环境微生物领域。

背景技术

二甲戊乐灵是一种选择性苗前二硝基苯胺类除草剂，主要抑制分生组织细胞***，不影响种子的萌发，其选择性为生理和位差选择，由于其低残留高活性的特征，而在农产品中应用广泛。但美国环保署(EPA)研究发现二甲戊乐灵属于三级毒性类物质，对人类有致癌作用。由于在农产品中的广泛应用，其在环境中的残留也日益严重，因此，研究环境中二甲戊乐灵残留的去除问题已迫在眉睫。

二甲戊乐灵的去除方法主要有物理、化学和生物的方法。传统的物理方法(包裹、焚烧和掩埋)和化学方法(包括氧化、还原和水解)成本高，可能产生新的污染物，且作用相对较慢。利用生物或生物制品来降解污染物的生物修复方法具有无毒、无残留、无二次污染等优点，是消除和解毒高浓度的农药残留的一种安全、有效、廉价的方法。微生物具有种类多、变异快和基因容易操作等特点，是环境生物修复的重要生物资源。用微生物或无细胞酶制品来消减农药污染的生物修复技术显示出广阔的应用前景。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种耐盐短杆菌并将该菌用于降解二甲戊乐灵，改善受二甲戊乐灵污染的土壤和农产品的品质。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种高效降解二甲戊乐灵农药的降解菌，命名为耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)Y-1-4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市昭阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年2月27日，保藏号为CGMCCNo.8823。

本发明的降解菌Y-1-4经形态、生理生化特性分析和16SrDNA基因序列同源性分析，鉴定为耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)。

Y-1-4菌株在LB固体平板上，菌落大，边缘不规则，白色，不透明，表面光滑，老化后呈浅棕黄色。革兰氏染色阳性，杆状，不具有芽孢。

优选的，耐盐短杆菌Y-1-4的培养条件为：将耐盐短杆菌Y-1-4接种到基础培养基，25-36℃培养18-24h，培养的pH值范围为5-8；所述基础培养基的组成和配比为：NH₄NO₃1.0g，MgSO₄0.5g，(NH₄)₂SO₄0.5g，KH₂PO₄,0.5g，K₂HPO₄1.5g，NaCl 0.5g，酵母膏0.05g，121℃灭菌30min。固体培养基则加入2％琼脂。

更优选的，耐盐短杆菌Y-1-4的培养条件为：将耐盐短杆菌Y-1-4接种到基础培养基，36℃培养24h，培养的pH值范围为7.0±1。

Y-1-4在pH5-pH8，温度25-36℃生长、降解特性良好，能以二甲戊乐灵为唯一碳源生长。

本发明第二方面公开了前述高效降解二甲戊乐灵农药的降解菌(耐盐短杆菌Y-1-4)在降解二甲戊乐灵农药残留中的应用。

通过气相色谱-质谱分析Y-1-4菌株对二甲戊乐灵的降解率可知：在初始菌的OD650nm为0.02时，Y-1-4菌株可在72h内将100mg·L^-l的二甲戊乐灵降解97.3％。

本发明第三方面公开了一种二甲戊乐灵降解菌剂，含有前述耐盐短杆菌Y-1-4。

优选的，所述二甲戊乐灵降解菌剂中，耐盐短杆菌Y-1-4的菌体数量达到10¹⁰CFU ml^-1以上。

本发明第四方面公开了一种降解土壤中残留二甲戊乐灵的方法，为向土壤中施入前述耐盐短杆菌Y-1-4。

进一步，所述施入的方式可以为喷洒。

本发明的有益效果是：从长期种植蔬菜的土壤中分离获得一株高效降解二甲戊乐灵的耐盐短杆菌Y-1-4，该耐盐短杆菌Y-1-4培养方法简单，具有高效降解二甲戊乐灵的能力。可在pH5-pH8、25℃-36℃的条件下生长良好，并在pH5-pH8、25℃-42℃的条件下保持65％以上的农药降解能力。能够加快降解土壤及蔬菜中残留的二甲戊乐灵，在一定条件下，将土壤中二甲戊乐灵的半衰期由24d缩短至9d，具有降解特性良好，降解速率快，降解效率高等优点。

附图说明

图1为Y-1-4菌株在LB固体平板上的培养形态及特征图；

图2为初始pH对Y-1-4降解效率的影响；

图3为培养温度对Y-1-4降解效率的影响；

图4为Y-1-4生长曲线和培养液中二甲戊乐灵浓度变化曲线；

图5为青梗菜中二甲戊乐灵降解动态变化图；

图6为土壤中二甲戊乐灵降解动态变化图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1可高效降解二甲戊乐灵农药降解菌的筛选

1.土样来源

土样：采自山东莱阳蔬菜种植基地。

2.降解菌的富集和分离：

采集的土壤样品以5％的量接种到含二甲戊乐灵100mg·L^-l的二甲戊乐灵培养液中进行富集培养，36℃振荡培养48h，取适量富集液接种于含二甲戊乐灵200mg·L^-l的二甲戊乐灵培养液中培养。如此转接并不断提高二甲戊乐灵培养液中二甲戊乐灵的浓度，直到二甲戊乐灵的浓度提高到1000mg·L^-1。取最后的培养液转接到含二甲戊乐灵100mg·L^-l的二甲戊乐灵固体培养基上纯化，连续转接且不断提高二甲戊乐灵的浓度最终达到1000mg·L^-1。选取生长速度最快的一株菌株命名为Y-1-4；该降解菌的分类命名为：耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)，于2014年2月17日保存于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCCNo.8823。

所述二甲戊乐灵培养液是通过向基础培养基中添加二甲戊乐灵获得。所述基础培养基的组成和配比为每升培养基：NH₄NO₃1.0g，MgSO₄0.5g，(NH₄)₂SO₄0.5g，KH₂PO₄0.5g，K₂HPO₄1.5g，NaCl 0.5g，酵母膏0.05g，pH7.2-7.3。固体培养基则加入2％琼脂。培养基配好后121℃灭菌30min。

二甲戊乐灵的添加：取33％施田补乳油1.0ml，加入32.0ml无菌水得到1mg·ml^-1二甲戊乐灵的水溶液，按照不同的比例加入灭菌的基础培养基中，得到不同二甲戊乐灵浓度的二甲戊乐灵培养液(或固体培养基)，并分装于灭菌试管。

3.降解菌的鉴定与属性：

1)形态与生理生化特征：

Y-1-4菌株在LB固体平板上，菌落大，边缘不规则，白色，不透明，表面光滑，老化后呈浅棕黄色。革兰氏染色阳性，杆状，不具有芽孢，参见附图1。吲哚实验阴性，酪素水解阳性，具体特征见表1。

表1 农药降解菌Y-1-4的生理、生化特性

注：“+”表示反应阳性，“-”表示反应阴性

2)菌株Y-1-4的16S rDNA序列同源性分析

用BLAST软件将Y-1-4菌株的16S rDNA序列(SEQ ID NO：1所示)提交到Genbank中进行核苷酸序列同源性比对，结果发现，Y-1-4菌株和已提交的多株耐盐短杆菌序列高度相似，同源性较高，说明该菌在分子发育上属于耐盐短杆菌，经16SrDNA的测序并比较同源性后，依据同源性在***发育中的分类原则并结合形态、生理生化特征，参考《Bergey’s mannual ofdeterminative bacteriology》第九版，最终将菌株Y-1-4归类于耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)。

表2 菌株Y-1-416SrRNA基因序列BLAST比对结果

实施例2降解菌剂的制备

1)将试管种接种于基础培养液中，震荡培养至对数期，获得种子液；

2)将上述种子液按10％的接种量接种入10L发酵罐的基础培养基中进行发酵；

3)发酵过程中无菌空气的通气量为1：0.8，搅拌速度为150转/分，培养温度为36℃，全过程培养时间为60h。

发酵结束后菌体数量达到10¹⁰CFU ml^-1以上，发酵完成后培养液直接用包装瓶分装成液体剂，即为降解菌剂。

实施例3菌株Y-1-4降解特性

1.初始pH对Y-1-4降解特性影响

1.1试验方法

配制二甲戊乐灵培养液分装，调节培养液的pH值分别在5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，二甲戊乐灵的浓度为100mg·L^-1。按10％的接种量接种实施例2制备的降解菌Y-1-4种子液，36℃培养24h取样，测定二甲戊乐灵的降解率及细菌的生长量。细菌生长量的测定：测定培养液650nm下的OD值；降解率的计算公式如下：

$x\%=\frac{\mathrm{Cck}-\mathrm{Cx}}{\mathrm{Cck}}\×100\%$

式中：

x％：农药的生物降解率

Cx：接菌处理培养液培养液中农药浓度(mg·L^-1)

C_CK：未接菌对照培养液中农药的浓度(mg·L^-1)

1.2试验结果

培养液初始pH值对降解率和生长量的影响基本相同，均在pH为7时达到最大，降解率为80.7％。Y-1-4对pH值的要求不严格，适应范围较宽，在pH值5～8的范围内可以保持较高的降解率，实验结果见图2。

2.培养温度对Y-1-4降解特性的影响

2.1试验方法

配制二甲戊乐灵培养液分装，调节培养液的初始pH7.0，二甲戊乐灵的浓度为100mg·L^-1。按10％的接种量接种实施例2制备的Y-1-4种子液后于10℃、25℃、36℃、42℃、50℃下振荡培养，24h后取样测定二甲戊乐灵的降解和细菌的生长量。

2.2试验结果

实验结果见图3，培养温度对Y-1-4降解二甲戊乐灵的效率有较大影响，随温度升高降解率先增加，25℃-42℃范围内较优，在36℃达到最大，降解率为86.59％，随后降解率下降。

实施例4液体降解实验

菌株Y-1-4接种基础培养基36℃培养24h后，以10％的接种量接种到以二甲戊乐灵为唯一碳源且其浓度为100mg·L^-1的二甲戊乐灵液体培养基中，每隔3h取样测定培养基中二甲戊乐灵残留浓度和降解效率。

试验结果见图4，开始3h内二甲戊乐灵浓度下降很快，二甲戊乐灵降解率快速增加，然后减慢，至15～24h，二甲戊乐灵的浓度下降速度达到最大。分析二甲戊乐灵浓度变化曲线和微生物的生长曲线可以看出，从培养刚开始几个小时到Y-1-4达到稳定生长期的24h内，二甲戊乐灵降解速率较快。初始阶段，菌体数目增加慢但农药浓度下降快，这可能是菌体对农药的吸附造成的。接下来，Y-1-4达到了对数生长期，伴随着代谢活性的增大，二甲戊乐灵的浓度下降速度也加快。24h后Y-1-4对二甲戊乐灵的降解速率变慢，浓度下降速度减小，并逐渐趋于平稳，与此相对的是微生物的生长达到衰亡期，这是因为培养一定时间后，培养液中微生物可以利用的有效物质减少，而且本身产生的代谢产物抑制细菌的生长，所以菌体生长减慢，对农药的利用减少。

实施例5蔬菜降解实验

以青梗菜为供试植物，山东莱阳某蔬菜基地为试验田，设3个处理(仅喷洒二甲戊乐灵T1、喷二甲戊乐灵和降解菌T2、喷清水对照CK1)，3次重复。采用推荐浓度33％的二甲戊乐灵乳油每亩200mL，同时以每亩4000mL施用实施例2制备的降解菌剂(播后苗前施药)。青梗菜样品在施药的3d、5d、7d、9d、12d、15d、18d、21d、24d取样，于自封带内-20℃保存待测。

试验结果见图5。T1和T2两种处理方式下，二甲戊乐灵的残留浓度都随时间的延长而逐渐下降。在只施用二甲戊乐灵的T1处理中，经过24天的降解农药残留浓度仍然较高保持在4.0mgkg-1。在施用二甲戊乐灵和菌株Y-1-4的T2处理中，二甲戊乐灵的残留量下降速度很快，12d时T2处理组青梗菜中二甲戊乐灵残留量已经下降至2.7mgkg-1，说明50％以上的农药残留都已被降解。T1处理组的青梗菜样品中二甲戊乐灵残留量明显高于T2处理组。显然，菌株Y-1-4加快了青梗菜中二甲戊乐灵的降解，使青梗菜中二甲戊乐灵残留量在较短时间内降解到更低水平。

实施例6土壤降解实验

以青梗菜为供试植物，设3个处理(仅喷洒二甲戊乐灵T1、喷二甲戊乐灵和降解菌T2、喷清水对照CK1)，3次重复。采用推荐浓度33％的二甲戊乐灵乳油每亩200mL，同时以每亩4000mL施用实施例2制备的降解菌剂(播后苗前施药)。分别在施药的1d、2d、3d、5d、7d、9d、12d、15d、18d、21d，按5点取样法，采集土壤样品。于自封带内-20℃保存待测。

试验结果见图6。T1和T2两种处理条件下，土壤中二甲戊乐灵农药残留量两天之内残留浓度大体相同，第3天，随时间的延长开始逐渐下降。只喷施二甲戊乐灵农药的T1处理组下降速度较慢，到24d时，该组二甲戊乐灵的残留量还大致在30mgkg-1水平，基本降解至初始浓度的一半，也就是二甲戊乐灵的土壤中半衰期为24天，这一数值略低于前人报道的二甲戊乐灵土壤半衰期31.9天。在喷二甲戊乐灵和菌株Y-1-4的T2处理组中，二甲戊乐灵的残留量也在2d后逐渐下降，且下降速度较快，在第9天时，土壤样品中农药残留浓度已达到28.4mgkg-1，低于初始浓度的一半。也就说，二甲戊乐灵降解菌Y-1-4的同时喷施，使二甲戊乐灵的土壤半衰期降至不到9天时间。T1处理组的土壤中的二甲戊乐灵残留量明显高于T2处理组土壤样品。

与实施例5相比，在同一个处理的土壤样品和青梗菜样品中，二甲戊乐灵农药残留量明显不同。同一个处理中，土壤样品中二甲戊乐灵农药残留量要远远高于青梗菜中二甲戊乐灵农药残留的含量。这一原因可能与蔬菜接触阳光和空气充分，促进了农药降解菌对二甲戊乐灵的降解有关。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种降解二甲戊乐灵农药的降解菌，其特征在于，该菌命名为耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)Y-1-4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年2月27日，保藏号为CGMCC No.8823。

2.权利要求1所述降解二甲戊乐灵农药的降解菌在降解二甲戊乐灵农药残留中的应用。

3.一种二甲戊乐灵降解菌剂，含有权利要求1所述降解二甲戊乐灵农药的降解菌。

4.如权利要求3所述的二甲戊乐灵降解菌剂，其特征在于，所述二甲戊乐灵降解菌剂中，耐盐短杆菌Y-1-4的菌体数量达到10¹⁰CFU ml^-1以上。

5.一种降解土壤中残留二甲戊乐灵的方法，为向土壤中施入权利要求3或4任一权利要求所述二甲戊乐灵降解菌剂。

6.如权利要求5所述的降解土壤中残留二甲戊乐灵的方法，其特征在于，所述施入的方式为喷洒。