CN103173371A - 酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂的生产 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物制剂，具体的说是一种酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂的生产方法，将浓缩的含酿酒酵母≥50亿个/ml的酿酒酵母菌母液与高浓度的含嗜酸乳杆菌≥100亿个/ml的嗜酸乳杆菌母液，按1∶1同体积比例混合，生产出含有酿酒酵母≥25亿个/ml、嗜酸乳杆菌≥50亿个/ml的饲料用复合微生物制剂产品。本发明以葡萄糖、蔗糖、蔗糖蜜、玉米浆等为主要发酵原料，在30℃～34℃条件下进行发酵培养，产品的菌数高、品质好，ph值5.0～6.6，保质期18个月。本发明生产工艺简单，产品应用效果好，并可以净化养殖环境，可广泛应用于水产、畜禽等养殖行业中。

Description

酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂的生产

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，也是面包酵母或叫出芽酵母，是与人类关系最广泛的一种酵母。传统上用于制作面包及酿酒，现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物。酿酒酵母的细胞形态为球形或者卵球形，直径510μm。繁殖的方式为出芽生殖，其碳源氮源利用广泛，能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、***糖、甘露醇、琥珀酸、柠檬酸、木糖、山梨醇、果糖、乙醇和甘油；不能利用鼠李糖、淀粉、纤维二糖、海藻糖、核糖醇、肌醇、赤藓醇、蜜二糖。

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)属于乳杆菌属，革兰氏阳性杆菌，杆的末端呈圆形，主要存在小肠中。能分泌乳酸、乙酸和肽类抗菌素。嗜酸乳杆菌主要用于调整肠道菌群平衡，抑制肠道不良微生物的增殖，对致病微生物有拮抗作用。特别是对胃肠功能失调和服用抗菌素而引起胃肠功能失调等症状有特效，可以迅速使肠道内的菌群恢复正常平衡，抑制腐败菌的增殖，具有很好的营养保健作用。

在以往研究中，科技工作者对酿酒酵母和嗜酸乳杆菌的分类学地位、生理生化特征、发酵条件及其调控等方面均有较为深入的研究。对酿酒酵母和嗜酸乳杆菌的应用研究也获得很大的进展。但对酿酒酵母和嗜酸乳杆菌两者之间的交互作用的研究和应用报道的并不多。酿酒酵母和嗜酸乳杆菌，两者具有共同的特点是：生长繁殖速度快、容易培养、菌体及代谢产物营养丰富等。所以，近年来，酿酒酵母和嗜酸乳杆菌其产品广泛用于食品工业、饲料工业、水产养殖、环境保护和保健医药等诸多方面；因此，愈来愈受到科技工作者和企业界人士重视。

酿酒酵母和嗜酸乳杆菌的菌体及其分泌物中含有丰富的蛋白质、氨基酸、有机酸、维生素、不饱和脂肪酸和肽类抗生素等生物活性物质。因此，在畜禽养殖和水产养殖中均有较高的应用价值。

目前，在畜禽养殖和水产养殖中，面对生产者和消费者有两大问题也是两大难题：1.蛋白质利用率不高；2.抗生素使用过量。而本发明恰恰是针对解决上述两个问题和难题所提出来的。

本发明产品功能是：1.提高饲料利用率，让动物吃发酵制品；2.用生物制剂处理养殖动物的肠胃，调整菌群平衡，杀灭有害菌，减少抗生素的使用量；3.使用本产品可以明显的改善养殖环境。

本发明生产工艺简单，产品应用效果好，可广泛应用于水产、畜禽等养殖行业中。

酿酒酵母和嗜酸乳杆菌在水产、畜禽等养殖行业中应用，可以提高养殖动物的繁殖能力和存活能力，可以促进个体生长、增强免疫力、抗病力和皮肤肌肉色泽，可以促进营养消化吸收。还可以净化养殖环境，净化水质、分解有机物、硫化氢、氨化物等污染物。无毒、无害、无任何副作用，利国利民，是一种绿色的生物饵料添加剂。具有广阔的市场前景。

目前，中国科学院沈阳应用生态研究所从海洋中已经分离、纯化、鉴定出多株酿酒酵母和嗜酸乳杆菌，经过驯化、培育、提高得到多株产物含量高、活性好、生长速度快的酿酒酵母和嗜酸乳杆菌菌种，经过我们生产应用，其应用效果非常好，已在辽宁的沈阳、大连地区，河北和河南等地区广泛应用，取得了很好的经济效益，我们已将产品实现了商品化生产。

发明内容

本发明目的在于是提供一种酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂的生产方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明采用菌种为常规的酿酒酵母菌和嗜酸乳杆菌，并以葡萄糖、蔗糖、蔗糖蜜、玉米浆等为主要发酵原料，将常规的酿酒酵母菌和嗜酸乳杆菌菌种在30℃～34℃有氧条件下，分离、纯化、培养制种，经固体一级种子培养，液体二级发酵培养，再将酿酒酵母菌母液与嗜酸乳杆菌母液，按1∶1同体积比例混合生产出含有酿酒酵母(cfu)≥25亿个/ml与嗜酸乳杆菌(cfu)≥50亿个活菌/ml的饲料用复合微生物制剂产品。产品的菌数高、品质好，ph值5.0～6.6，保质期18个月。

一种酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂的生产方法，包括如下步骤：

1)单菌落分离与优选：将经活化的酿酒酵母斜面菌种，在新配置的酵母菌培养基的培养皿上涂布，经培养，得到酿酒酵母单菌落种子。将经活化的嗜酸乳杆菌斜面菌种，在新配置的乳酸菌培养基的培养皿上涂布，经培养，得到嗜酸乳杆菌单菌落种子；

2)固体一级种子培养：将步骤1)中分别得到的酿酒酵母单菌落种子和酿酒酵母单菌落种子，分别接种到酵母菌和乳酸菌一级固体种子培养基中，固体种子培养瓶为200ml茄形扁瓶，经培养，分别得到酿酒酵母一级固体种子和嗜酸乳杆菌一级固体种子；

3)液体二级发酵培养：将步骤2)中分别得到的一级固体种子(茄形扁瓶)分别接种到二级发酵罐液体培养基中。一级固体种子(茄形扁瓶)与二级发酵罐液体种子培养液的接种量为：一级固体种子(茄形扁瓶)与液体重量比为1瓶∶100公斤，经培养，分别得到二级液体发酵母液；

4)酿酒酵母菌(经离心机离心)母液浓度(cfu)≥50个/ml。

5)嗜酸乳杆菌母液浓度(cfu)≥100亿个/ml。

步骤1)和2)所采用的酿酒酵母菌种子培养基的重量组成为：葡萄糖2.0～3.0％、蛋白胨0.8.～1.2％、酵母膏0.8.～1.2％、氯化钠0.03～0.07％、硫酸镁0.03～0.07％、磷酸二氢钾0.03～0.07％、磷酸氢二钾0.05～0.15％、余量为纯净水、PH6.0～6.8、琼脂1.5～2.2％；

灭菌条件：0.08MPa、105℃、18min；

培养条件：26℃～32℃、时间48～72h。

步骤3)所采用的酿酒酵母菌发酵培养基的重量组成为：蔗糖1.5～2.5％、蔗糖蜜1.5～2.5％、蛋白胨0.2～0.8％、酵母粉0.2～0.8％、玉米浆2.0～4.0％、氯化钠0.03～0.07％、硫酸镁0.03～0.07％、磷酸二氢钾0.03～0.07％、磷酸氢二钾0.05～0.15％、余量为纯净水、PH6.0～6.8；

灭菌条件：0.08MPa、105℃、20min；

发酵培养条件：罐压0.01-0.10Mpa、风量100∶10～120vvm、转速220-260rpm、温度26℃～32℃、时间48～72h。

步骤1)和2)所采用的嗜酸乳杆菌种子培养基的重量组成为：葡萄糖0.5～1.5％、蛋白胨0.8～1.2％、牛肉膏0.8～1.2％、酵母膏0.3～0.7g、氯化钠0.03～0.07％、硫酸镁0.03～0.07％、磷酸氢二钾0.05～0.15％、碳酸钙0.5～1.5％、番茄汁1～10％、余量为纯净水、PH5.6～6.8、琼脂1.5～2.2％；

灭菌条件：0.08MPa、105℃、18min；

培养条件：温度28℃～34℃、时间48～72h。

步骤3)所采用的嗜酸乳杆菌发酵培养基的重量组成为：葡萄糖0.5～1.5％、蔗糖蜜0.5～1.5％、蛋白胨0.2～0.8％、酵母粉0.2～0.8％、玉米浆0.5～1.5％、氯化钠0.03～0.07％、硫酸镁0.03～0.07％、磷酸二氢钾0.03～0.07％、磷酸氢二钾0.05～0.15％、碳酸钙0.5～1.5％、番茄汁0～10％、余量为纯净水、PH5.6～6.8；

灭菌条件：0.08MPa、105℃、18min；

发酵培养条件为：罐压0.01-0.10Mpa、风量100∶0～100vvm、转速0-100rpm、温度30℃～38℃、时间为48～72h。

较佳方案如下：

所采用的酿酒酵母菌种子培养基的重量组成为：葡萄糖2.5％、蛋白胨1.0％、酵母膏1.0％、氯化钠0.05％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸氢二钾0.1％、余量为纯净水、PH6.8；

灭菌条件：0.08MPa、105℃、18min；

培养条件：温度30℃、时间64h.。

所采用的嗜酸乳杆菌种子培养基的重量组成为：葡萄糖1.0％、蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5g、氯化钠0.05％、硫酸镁0.05％、磷酸氢二钾0.1％、碳酸钙1.0％、番茄汁5％、余量为纯净水、PH6.8、琼脂2.0％；

灭菌条件：0.08MPa、105℃、18min；

培养温度为34℃，时间为64h。

所采用的酿酒酵母菌发酵培养基的重量组成为：蔗糖2.0％、蔗糖蜜2.0％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、玉米浆3.0％、氯化钠0.05％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸氢二钾0.10％、余量为纯净水、PH6.8；

灭菌条件：0.08MPa、105℃、20min；

发酵培养条件为：罐压0.05Mpa、风量100∶100vvm、转速220rpm、温度30℃、时间为64h。

所采用的嗜酸乳杆菌发酵培养基的重量组成为：葡萄糖1.0％、蔗糖蜜1.0％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、玉米浆1.0％、氯化钠0.05％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸氢二钾0.10％、碳酸钙1.0％、番茄汁5.0％、余量为纯净水、PH6.8。

灭菌条件：0.08MPa、105℃、18min；

发酵培养条件为：罐压0.05Mpa、风量100∶50vvm、转速50r pm、培养温度34℃、时间为64h。

采用平板计数法检查酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂产品，含有酿酒酵母(cfu)≥25亿个/ml与嗜酸乳杆菌(cfu)≥50亿个活菌/ml。

所述的一种酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂的产品，可广泛应用于水产、畜禽等养殖行业中。

本发明提供的生产工艺简单，生产的产品质量高，产品应用效果好，产品在水产、畜禽等养殖中应用，可以增强免疫力，提高成活率，促进生长发育，提升品质，可以改善和净化养殖环境。

本发明具有如下优点：

1.菌种好，酿酒酵母与嗜酸乳杆菌都具有自身的特点，1)营养丰富，能分泌和代谢各种蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等酶类产物，各种氨基酸，乳酸、乙酸、各种有机酸和肽类抗生素。2)这两个菌种繁殖速度快，对培养基和发酵条件要求不苛刻。3)都在酸性条件下能够很好的存活，易于保藏。

2.本发明采用的酿酒酵母与嗜酸乳杆菌种为常规用菌种，并以葡萄糖、蔗糖蜜、玉米浆等为主要发酵原料，在30℃～34℃，好氧条件下进行发酵培养，在相同生长条件下，应用本发明培养方法，能使酿酒酵母与嗜酸乳杆菌繁殖速度较一般通用培养基快1-2天，菌浓度提高30％以上。

3.培养基原料组成简单、来源广泛、成本低。本发明采用的酿酒酵母与嗜酸乳杆菌培养原料简单普遍，大批量生产时，还可以采用城市工业产品下脚料、农副产品次级产品，经综合处理，培养后可制成饲料用酿酒酵母与嗜酸乳杆菌产品。

4.酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂的产品质量好。以酿酒酵母与嗜酸乳杆菌为种源，制成的发酵母液，菌体数量多，代谢产物多。经过固体一级种子培养、液体二级种子发酵、离心机离心，1；1混合，等生产出的酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂的产品的生产工艺，操作简便，周期短，产品质量好，应用效果好

应用本发明生产的酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂的产品，经过在水产、畜禽养殖中的应用试验，表现出可以增强动物机体的免疫力，可以提高成活率，促进生长，提高品质；可改善养殖环境，净化水质，对环境友好。深受水产、畜禽等养殖用户的欢迎，易于推广应用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

一种酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂的生产方法，可按下列步骤具体操作：

实施例1：

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(产生蛋白酶、氨基酸、维生素、生物素)单菌落純化、固体一级种子培养、液体二级发酵培养、菌数的检查及其确定，具体操作步骤如下：

1)单菌落分离与优选：将经活化的酿酒酵母斜面菌种，在新配置的酵母菌培养基的培养皿上涂布，经培养，得到酿酒酵母单菌落种子。

酿酒酵母单菌落純化与优选培养基组成为：20％马铃薯(土豆)浸出液1000mL、蔗糖20g、琼脂18g、PH6.8；也可以用酿酒酵母一级固体种子培养基。

2)固体一级种子培养：将上步骤1)中得到的酿酒酵母单菌落种子，接种到酵母菌一级固体种子培养基中，固体种子培养瓶为200ml茄形扁瓶，经培养，得到酿酒酵母一级固体种子；

3)液体二级发酵培养(选择培养基和发酵条件试验)：采取深层发酵法生产发酵液，将培养好的茄形扁瓶酿酒酵母一级固体种子，用200mL无菌水洗入至500mL无菌的三角瓶中，用火焰接种法或压差接种到发酵罐中，(发酵罐可以是500立升、1吨、2吨)，装液量不超过70％，通气发酵培养。培养成熟时，菌液有一种酒香味，显微镜下检查酿酒酵母菌菌体健壮，无杂菌污染等异常现象，即可供离心和与混合用母液。

酿酒酵母菌种子培养基选择试验

试验设计为7因素3水平，试验设计和试验结果如下表1：

表1.酿酒酵母菌(三角瓶)培养基配方组合试验

通过表1的试验结果，确定的培养基为：葡萄糖25g、蛋白胨10g、酵母膏10g、氯化钠0.5g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钾1g、1000ml纯净水、PH6.8；0.08MPa、105℃灭菌18min；培养条件：温度30℃，时间64h。

酿酒酵母菌发酵罐培养基选择试验

发酵罐培养基试验设计为6因素3水平，试验设计和试验结果如下表2：

表2.酿酒酵母菌发酵罐培养基配方组合试验

通过表2的试验结果，确定的酿酒酵母菌发酵罐培养基是：蔗糖20g、蔗糖蜜20g、蛋白胨5g、酵母粉5g、玉米浆30g、氯化钠0.5g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钾1g、1000ml纯净水；0.08MPa、105℃灭菌20分钟.

酿酒酵母菌发酵培养条件试验

发酵罐发酵条件试验设计为5因素3水平，试验设计和试验结果如下表3：

表3.酿酒酵母菌罐发酵培养条件试验

通过表3试验结果，发酵罐的发酵条件确定为：罐压0.05Mpa、风量100∶100vvm、转速220rpm、温度30℃、时间64h。

4)酿酒酵母菌显微镜检查：酵母细胞形态大小约为2-5×5-30μm酵母多数为单细胞微生物，常呈卵圆形或者圆柱形。

5)酿酒酵母菌培养皿检查：平板培养基上的酵母菌落呈白色粒状凸起，有酒香味。

6)酿酒酵母菌摇瓶条件为：转速为150r/mil 温度30℃。

实施例2：

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，(产生乳酸、乙酸和各种有机酸、乳酸菌素、肽类抗生素、蛋白酶、维生素等)单菌落純化与优选、固体一级种子培养、液体二级发酵培养具体操作步骤如下：

1)单菌落純化与优选：将经活化的嗜酸乳杆菌斜面菌种，在新配置的乳酸菌培养基的培养皿上涂布，经培养，得到嗜酸乳杆菌单菌落种子。

2)固体一级种子培养：将上步骤1)中得到的嗜酸乳杆菌单菌落种子，接种到嗜酸乳杆菌一级固体种子培养基中，固体种子培养瓶为200ml茄形扁瓶，经培养，得到嗜酸乳杆菌一级固体种子；

3)液体二级发酵培养：其过程同本实施例1(2)；其不同之处培养温度为34℃，也可以达到上述技术指标，即可以作为母液用。

发酵罐接种与发酵培养：采取深层发酵法生产发酵液，将培养好的茄形扁瓶嗜酸乳杆菌一级固体种子，用200mL无菌水洗入至500mL无菌的三角瓶中，用火焰接种法或压差接种到发酵罐中，(发酵罐可以是500立升、1吨、2吨)，装液量不超过70％，通小气量发酵培养，温度为34℃，培养时间为64小时。显微镜下检查嗜酸乳杆菌菌体运动活泼，健壮，整齐，无杂菌，无异味，无污染等异常现象，镜检嗜酸乳杆菌活菌数可达100亿/ml(采用血球计数法计算菌数)，即可停止发酵，发酵液即可作为母液供混合用。

嗜酸乳杆菌种子培养基选择试验

嗜酸乳杆菌种子培养基选择试验，设计为7因素3水平，试验设计和试验结果如下表4：

表4.嗜酸乳杆菌(三角瓶)培养基配方组合试验

表4试验结果确定培养基是：葡萄糖10g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、氯化钠0.5g、硫酸镁0.5g、磷酸氢二钾1.0g、碳酸钙10g、番茄汁50g、1000ml纯净水、PH6.8；0.08MPa、105℃灭菌18min；培养条件为：温度34℃，时间64h。

嗜酸乳杆菌发酵罐培养基选择试验

嗜酸乳杆菌发酵罐培养基试验设计为7因素3水平，试验设计和试验结果如下表5：

表5.嗜酸乳杆菌发酵罐培养基配方组合试验

通过表5试验结果确定的嗜酸乳杆菌发酵罐种子培养基是：葡萄糖10g、蔗糖蜜10g、蛋白胨5g、酵母粉5g、玉米浆10g、氯化钠0.5g、硫酸镁0.5g、磷酸氢二钾1.0g、碳酸钙10g、番茄汁50g、1000ml纯净水、PH6.8；0.08MPa、105℃灭菌20mil；

嗜酸乳杆菌罐发酵培养条件试验

嗜酸乳杆菌罐发酵条件试验设计为5因素3水平，试验设计和试验结果如下表6：

表6.嗜酸乳杆菌发酵罐培养条件试验

通过表6试验结果确定的嗜酸乳杆菌发酵罐培养条件为：罐压0.05Mpa、风量100∶50vvm、转速50rpm、温度34℃、时间为64h。

乳杆菌种子培养基组成为：葡萄糖10g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、乙酸钠5g、柠檬酸二胺5g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾2g、碳酸钙20、1mL吐温80、水1000mL、琼脂20g、PH7.0

实施例3：

将酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂在幼参中进行应用试验，酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂对海参增重的影响见表7；

表7.酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂海参对海参增重的影响

*试验时间：2011年3月1日～2011年3月15日

*水体：长×宽×高＝1m×1m×1m＝1m³(立方米水体)

*试验组1和试验组2每天每个水体用5毫升复合微生物制剂；

所述复合微生物制剂是将下述二种母液按1∶1同体积比例混合而成；二种母液分别为：

实施例1步骤3)所获得酿酒酵母菌的二级液体发酵液经离心机离心浓缩，得酿酒酵母菌母液，酿酒酵母菌母液浓度(cfu)≥50个/ml；

实施例2步骤3)所获得而嗜酸乳杆菌的二级液体发酵液即为嗜酸乳杆菌母液，嗜酸乳杆菌母液浓度(cfu)≥100亿个/ml。

*对照组每天每个水体用5毫升海水；

*参池水温16℃；

通过表7可以看出，在水温16℃时，经过15天的喂养，试验组1平均增重率22.9，试验组2平均增重率21.5，对照组平均增重率17.7，试验结果表明，试验组的平均增重率明显高于对照组平均增重率，海参养殖中应添加复合微生物制剂效果明显。

本发明具有生产工艺简单，易于操作、生产原料来源广泛，成本低易于推广、生产周期短发酵产物多，产品质量好，易于应用等特点。在畜禽和水产养殖中应用，可以提高免疫力和成活率，可以加快生长发育和提高产量，可以净化水质和改善养殖环境，是一种理想的优质微生物饲料添加剂。

实施例4

与实施例1-3不同之处在于，为提高产品质量，缩短生产周期，申请人还试用了中国科学院沈阳应用生态研究所分离、纯化并鉴定的高活性微生物菌株(如：酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和光合细菌混合用)其应用效果更佳。

Claims (10)

1.一种酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂的生产方法，其特征在于：

将酿酒酵母菌发酵培养液，经过离心制备出浓缩的含酿酒酵母(cfu)≥50亿个/ml的酿酒酵母菌母液；

高浓度的含嗜酸乳杆菌(cfu)≥100亿个/ml的嗜酸乳杆菌母液；

再将酿酒酵母菌母液与嗜酸乳杆菌母液，按1∶1同体积比例混合，生产出含有酿酒酵母(cfu)≥25亿个/ml、嗜酸乳杆菌(cfu)≥50亿个/ml的饲料用复合微微生物制剂产品。

2.按照权利要求1所述的生产方法，其特征在于：

所述酿酒酵母菌母液是：将酿酒酵母菌株，经过固体一级种子培养，液体二级发酵培养，经过离心浓缩获得的酿酒酵母菌母液；

所述嗜酸乳杆菌母液是：将嗜酸乳杆菌菌株，经过固体一级种子培养，液体二级发酵培养，获得的嗜酸乳杆菌母液；

上述酿酒酵母菌母液和嗜酸乳杆菌母液制备过程包括如下步骤：

1)单菌落分离与优选：将经活化的酿酒酵母菌斜面菌种，在酵母菌培养基的培养皿上涂布，经培养，得到酿酒酵母单菌落种子；将经活化的嗜酸乳杆菌斜面菌种，在乳酸菌培养基的培养皿上涂布，经培养，得到嗜酸乳杆菌单菌落种子；

2)固体一级种子培养：将步骤1)中分别得到的酿酒酵母单菌落种子和嗜酸乳杆菌单菌落种子，分别接种到酵母菌和乳酸菌固体一级种子培养基中，固体种子培养瓶为200ml茄形扁瓶，经培养，分别得到酿酒酵母一级固体种子和嗜酸乳杆菌一级固体种子；

3)液体二级发酵培养：将步骤2)中分别得到的一级固体种子(茄形扁瓶)分别接种到二级发酵罐液体培养基中；一级固体种子(茄形扁瓶)与二级发酵罐液体种子培养液的接种量为：一级固体种子(茄形扁瓶)与液体重量比为1瓶∶100公斤，经培养，分别得到二级液体发酵液；

4)酿酒酵母菌的二级液体发酵液经离心机离心浓缩，得酿酒酵母菌母液，酿酒酵母菌母液浓度(cfu)≥50个/ml；

而嗜酸乳杆菌的二级液体发酵液即为嗜酸乳杆菌母液，嗜酸乳杆菌母液浓度(cfu)≥100亿个/ml。

3.按照权利要求2所述的生产方法，其特征在于：

步骤1)和2)所采用的酿酒酵母菌种子培养基的重量组成为：葡萄糖2.0～3.0％、蛋白胨0.8.～1.2％、酵母膏0.8.～1.2％、氯化钠0.03～0.07％、硫酸镁0.03～0.07％、磷酸二氢钾0.03～0.07％、磷酸氢二钾0.05～0.15％、余量为纯净水、PH6.0～6.8、琼脂1.5～2.2％；灭菌条件：0.08MPa、105℃、18min；

培养条件：26℃～32℃、时间48～72h。

4.按照权利要求3所述的生产方法，其特征在于：

所采用的酿酒酵母菌种子培养基的重量组成为：葡萄糖2.5％、蛋白胨1.0％、酵母膏1.0％、氯化钠0.05％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸氢二钾0.1％、余量为纯净水、PH6.8；

灭菌条件：0.08MPa、105℃、18min；

培养条件：温度30℃、时间64h.。

5.按照权利要求2所述的生产方法，其特征在于：

步骤3)所采用的酿酒酵母菌发酵培养基的重量组成为：蔗糖1.5～2.5％、蔗糖蜜1.5～2.5％、蛋白胨0.2～0.8％、酵母粉0.2～0.8％、玉米浆2.0～4.0％、氯化钠0.03～0.07％、硫酸镁0.03～0.07％、磷酸二氢钾0.03～0.07％、磷酸氢二钾0.05～0.15％、余量为纯净水、PH6.0～6.8；

灭菌条件：0.08MPa、105℃、20min；

发酵培养条件：罐压0.01-0.10Mpa、风量100∶10～120vvm、转速220-260rpm、温度26℃～32℃、时间48～72h。

6.按照权利要求5所述的生产方法，其特征在于：

所采用的酿酒酵母菌发酵培养基的重量组成为：蔗糖2.0％、蔗糖蜜2.0％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、玉米浆3.0％、氯化钠0.05％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸氢二钾0.10％、余量为纯净水、PH6.8；

灭菌条件：0.08MPa、105℃、20min；

发酵培养条件为：罐压0.05Mpa、风量100∶100vvm、转速220rpm、温度30℃、时间为64h。

7.按照权利要求2所述的生产方法，其特征在于：

步骤1)和2)所采用的嗜酸乳杆菌种子培养基的重量组成为：葡萄糖0.5～1.5％、蛋白胨0.8～1.2％、牛肉膏0.8～1.2％、酵母膏0.3～0.7g、氯化钠0.03～0.07％、硫酸镁0.03～0.07％、磷酸氢二钾0.05～0.15％、碳酸钙0.5～1.5％、番茄汁1～10％、余量为纯净水、PH5.6～6.8、琼脂1.5～2.2％；

灭菌条件：0.08MPa、105℃、18min；

培养条件：温度28℃～34℃、时间48～72h。

8.按照权利要求7所述的生产方法，其特征在于：

所采用的嗜酸乳杆菌种子培养基的重量组成为：葡萄糖1.0％、蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5g、氯化钠0.05％、硫酸镁0.05％、磷酸氢二钾0.1％、碳酸钙1.0％、番茄汁5％、余量为纯净水、PH6.8、琼脂2.0％；

灭菌条件：0.08MPa、105℃、18min；

培养温度为34℃，时间为64h。

9.按照权利要求2所述的生产方法，其特征在于：

步骤3)所采用的嗜酸乳杆菌发酵培养基的重量组成为：葡萄糖0.5～1.5％、蔗糖蜜0.5～1.5％、蛋白胨0.2～0.8％、酵母粉0.2～0.8％、玉米浆0.5～1.5％、氯化钠0.03～0.07％、硫酸镁0.03～0.07％、磷酸二氢钾0.03～0.07％、磷酸氢二钾0.05～0.15％、碳酸钙0.5～1.5％、番茄汁0～10％、余量为纯净水、PH5.6～6.8；

灭菌条件：0.08MPa、105℃、18min；

发酵培养条件为：罐压0.01-0.10Mpa、风量100∶0～100vvm、转速0-100rpm、温度30℃～38℃、时间为48～72h。

10.按照权利要求9所述的生产方法，其特征在于：

所采用的嗜酸乳杆菌发酵培养基的重量组成为：葡萄糖1.0％、蔗糖蜜1.0％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、玉米浆1.0％、氯化钠0.05％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸氢二钾0.10％、碳酸钙1.0％、番茄汁5.0％、余量为纯净水、PH6.8；

灭菌条件：0.08MPa、105℃、18min；

发酵培养条件为：罐压0.05Mpa、风量100∶50vvm、转速50rpm、培养温度34℃、时间为64h。