CN111513202A - 一种微生态制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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胡金华
张泽宇
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Abstract

本发明提供了一种微生态制剂及其制备方法和应用。所述制剂含有：包含酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的益生菌；包含L‑精氨酸和谷氨酰胺的氨基酸；选自由甘露寡糖、海带酶解物、果糖、红糖、菊粉组成的组的益生元；葡萄糖载体。本发明还提供了制备所述微生态制剂的方法以及所述微生态制剂作为饲料尤其是犬例如宠物犬用饲料的添加剂或补充剂的应用。本发明的微生态制剂中的益生菌能够相互促进，生长良好，而且配方简单，物美价廉，更为重要的是安全可靠，能在促进动物健康生长的同时使其具有漂亮的被毛，在动物健康尤其是宠物犬健康领域具有巨大的市场前景。

Description

一种微生态制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生态制剂技术领域，具体涉及一种微生态制剂及其制备方法和应用。
背景技术
随着人们生活水平的提高，宠物已经成为了许多家庭必不可少的生活伴侣，尤其是善解人意的宠物犬。
宠物犬是单胃动物，日粮以肉食为主，与人类一起生活。肉食为主的日粮中蛋白质含量高，需要宠物犬肠道健康，不然，很容易引起以腹泻为主要症状的肠道问题。与人类一起生活的宠物犬，生活环境非常卫生，且形成了经常洗澡的生活***衡，这已经是业界共识。保持肠道菌群平衡是疾病防治的最重要的技术手段，也是动物健康的最重要保证。
目前解决肠道微生态菌群失衡问题主要是通过益生菌制剂来补充，但当前这类产品的共同点是只提供了乳酸菌等一类有益菌，菌种类别比较单一。实际上，健康的肠道菌群是一个复杂的生态***，菌种数量庞大。另外，额外补充益生菌只是解决肠道菌群失衡的措施之一，为肠道菌群提供生长繁殖所需的营养物质也是非常值得重视的方面。当前产品的共同点是只提供低聚糖一类益生元，如低聚果糖。但微生物生长所需的氨基酸通常被忽视或轻视。本发明中提供了多种益生菌，且不仅提供低聚糖，还提供了多种氨基酸，以保证宠物犬肠道健康，并辅助病犬迅速恢复肠道菌群平衡。
发明内容
为了解决现有技术中的一个或者多个上述技术问题，本发明在第一方面提供了一种微生态制剂，其中，所述制剂包含：
(1)益生菌，所述益生菌包含酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌；
(2)氨基酸，所述氨基酸包含L-精氨酸和谷氨酰胺；
(3)益生元，所述益生元选自由甘露寡糖、海带酶解物、果糖、红糖、菊粉组成的组；
(4)载体，所述载体为葡萄糖。
在一些优选的实施方式中，所述制剂还包括诱食剂和/或复合维生素；诱食剂可以促进进食，复合维生素可以使毛发更加顺滑。
在另一些优选的实施方式中，所述制剂中的各组分以重量份计的含量如下：
Figure BDA0002514452730000021
本发明的酿酒酵母为好氧微生物，一般不会单独地与作为厌氧微生物的嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌形成三种复合在一起作为微生态制剂的复合益生菌。但这种组合明显符合动物的消化道结构。动物消化道的上段，如口腔、胃是好氧环境，而消化道下段，如回肠、结肠为严格的厌氧环境。因此，由酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌复合而成的微生态制剂可在动物消化道内互相配合，相得益彰。
另外，本发明人发现，菊粉原来多用于人用益生菌的益生元，但是却特别有利于嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的生长。于是，在另一些优选的实施方式中，所述益生元为菊粉；更优选的是，所述菊粉为0.1-0.3重量份，例如为0.2重量份。
在另一些优选的实施方式中，所述诱食剂为酵母诱食剂。
在另一些优选的实施方式中，所述复合维生素成分包含如下组分：维生素A乙酸酯≥5,000,000IU/kg、维生素D3≥500,000IU/kg、生育酚乙酸酯≥50,000IU/kg、维生素B1≥1,600mg/kg、维生素B2≥2,200mg/kg、维生素B6≥1,600mg/kg、维生素B12≥30mg/kg、烟酰胺≥13,000mg/kg、D-泛酸钙≥8,000mg/kg、叶酸≥180mg/kg、生物素≥50mg/kg。
在另一些优选的实施方式中，所述复合维生素成分的含量为0.5-1.0重量份，例如为0.75重量份。
在另一些优选的实施方式中，所述诱食剂的含量为0.8-1.2重量份，例如1.0重量份。
葡萄糖主要是作为载体存在，同时还作为能量物质存在；在一些实施方式中，葡萄糖的量为所述微生态制剂除了所列成分之外的余量。换言之，所述微生态制剂除了包含所列的其他组分之外，还包含余量的葡萄糖。
在另一些优选的实施方式中，所述微生态制剂的施用量可以如下：按犬体重计算用量，日常保健用量为0.2g/kg体重；特殊情况，如腹泻时，用量可为0.4g-0.5g/kg体重。
本发明在第二方面提供了一种制备本发明第一方面所述的制剂的方法，其中，所述方法包括：
(1)分别提供酿酒酵母菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉和干酪乳杆菌菊粉；
(2)在无菌状态下将所述菌粉与其他组分混匀，制得复合微生态制剂。
在一些优选的实施方式中，所述酿酒酵母菌粉采用如下方式进行：(1)菌种活化：将酿酒酵母菌接种于液体培养基中进行摇床培养，培养温度为26-32℃(例如30℃)，振荡参数为100-200rpm(例如150rpm)，培养时间为1.5-2.5h(例如2h)，获得活化菌液；(2)发酵：将所述活化菌液接种于发酵罐培养基中进行培养，培养温度为26-32℃(例如30℃)，通气量0.5-1.6vvm(例如1.0vvm)，搅拌机功率为每立方米1-2kwh(例如1.5kwh)，培养时间为7-9h(例如8h)，得到酿酒酵母发酵液；(3)冻干：将酿酒酵母发酵液离心，弃去上清液，将沉淀物冻干，得到酿酒酵母菌粉。
在另一些优选的实施方式中，所述嗜酸乳杆菌菌粉和所述干酪乳杆菌菌粉独立地采用如下方式进行：(1)菌种活化：将菌种接入所述MRS培养基中，在36-38℃(例如37℃)，静置厌氧培养18-30h(例如24h)，作为第一次活化菌液；将第一次活化菌液接种至MRS液体培养基中，在36-38℃(例如37℃)，静置厌氧培养18-30h(例如24h)，得到种子液；(2)发酵：将所述种子液按4体积％接种量接种于发酵罐培养基中，36-38℃(例如37℃)，100rpm，恒温厌氧培养66-78h(例如72h)，得到发酵液；(3)冻干：将发酵液离心，弃去上清液，将沉淀物冻干，得到相应的菌粉。
在另一些优选的实施方式中，所述酿酒酵母菌粉的活菌含量为150-250亿CFU/g(200亿CFU/g)。所述嗜酸乳杆菌菌粉的活菌含量为400-600亿CFU/g(例如500亿CFU/g)；和/或所述干酪乳杆菌菌粉的活菌含量为800-1200亿CFU/g(1000亿CFU/g)。
在另一些优选的实施方式中，所述液体培养基由1质量％酵母浸提物、2质量％蛋白胨和2质量％麦芽糖配制。
在另一些优选的实施方式中，所述发酵罐培养基由0.25质量％酵母浸提物、0.2质量％麦芽糖、0.02质量％氯化钠、0.82质量％醋酸钠制得。
在另一些优选的实施方式中，所述发酵罐培养基组成为：蛋白胨1-3％、牛肉膏1-3％、酵母膏1-3％、葡萄糖6-8％、柠檬酸二铵0.3％、K2HPO4·7H2O 0.2％、MgSO4·7H2O0.09％、MnSO4·4H2O 0.025％、NaAc·3H2O 0.3％、吐温-80 0.1％。
本发明在第三方面提供了本发明第一方面所述的微生态制剂或者本发明第二方面所述的方法制得的微生态制剂作为饲料尤其是犬例如宠物犬用饲料的添加剂或补充剂的应用。
本发明相对于现有技术具有如下技术优势：
(1)益生菌能够相互促进。本发明的微生态制剂中的益生菌酿酒酵母与嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌能够共生并且相得益彰，从而很好地共同发挥作为益生菌的作用。
(2)益生菌生长良好。本发明的一些优选的微生态制剂包含菊粉，菊粉能够显著促进嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的生长。
(3)配方简单，物美价廉。本发明的微生态制剂的组分相对较少，原料价格相对较低。
(4)促进动物健康生长。本发明的微生态制剂特别能够促进动物的生长，因此可以作为饲料添加剂或者补充剂。
(5)具有被毛美容作用。被毛漂亮对宠物犬尤其重要，本发明的微生态制剂使得被毛更加的柔顺有光泽。
(6)安全可靠。经过试验验证，本发明的微生态制剂是安全可靠的。
附图说明
图1是乳酸菌生长曲线。1、2、3和4仅表示本图内图例的序号(下同)，即，1号曲线表示干酪4％，2号曲线表示干酪3％，3号曲线表示嗜酸4％，4号曲线表示嗜酸3％。
图2是乳酸菌培养基pH曲线。
图3是不同pH的生长曲线。图例序号为先编第一行图例(图a至c)，然后再编第二行图例(d至f号)。
图4是不同培养基培养两种乳杆菌效果的比较图。同一组内的柱状条按照图例所示排列(下同)。
图5是两种乳杆菌共培养的OD 600值。
图6是干酪乳杆菌与嗜酸乳杆菌共培养后经美兰染色的活菌图(如图6所示)。
图7是共培养培养基的选择结果图。
图8是干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌的产酸特性图。
图9是菊粉与海带酶解物对嗜酸乳杆菌生长的影响。
图10是菊粉与海带酶解物对干酪乳杆菌生长的影响(柱状条顺序为前边为菌湿重，后边为菌干重)。
图11显示了菊粉对嗜酸乳杆菌生长(干重)的影响。
图12显示了菊粉对干酪乳杆菌生长(干重)的影响。
图13为试验期内不同时间各组犬的被毛情况对比图。
具体实施方式
下文将以实施例的形式对本发明进行进一步的说明，但是本发明请求保护的范围不限于这些实施例。实施例中使用到的原料除非另有说明，否则都是可以商购得到的常规原料。
实施例中使用的主要材料来源如下表所示。
表1.实施例中使用的主要材料来源
成分 来源
酿酒酵母 安琪酵母有限公司
嗜酸乳杆菌 大连亚芯生物科技有限公司
干酪乳杆菌 大连亚芯生物科技有限公司
L-精氨酸 江苏和全食品配料有限公司
谷氨酰胺 江苏和全食品配料有限公司
菊粉 河北丰宁平安高科实业有限公司
酵母诱食剂 福建洛东生物技术有限公司
葡萄糖(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司
实施例1
经过初筛试验，本发明人以干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌作为候选益生菌，并对这两种益生菌进行进一步试验。试验步骤如下：
(1)取干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌菌粉分别纯化3次作为菌种，并经革兰氏染色确定活化菌种为革兰氏阳性杆菌，且为纯菌。
(2)进行菌体生长曲线预实验：分别将干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌按3％、4％接种于初始pH为5.9的MRS培养基中，绘制生长曲线。
从结果可以看出：干酪乳杆菌14h菌体生物量达到最大值后进入平台期，嗜酸乳杆菌16h菌体生物量达到最大值后进入平台期(参见图1)。
(3)由于嗜酸乳杆菌生长缓慢，推测其可能对氧气浓度更为敏感，将这两株乳酸杆菌分别接种MRS培养基中并用石蜡油液封后，发现嗜酸乳杆菌生长变快，而干酪乳杆菌生长变慢，说明嗜酸乳杆菌对厌氧条件要求更严格，干酪乳杆菌对氧气更耐受。
(4)测定乳酸菌产酸特性，结果如图2所示。从图中可以看出，两种乳酸杆菌pH一直在缓慢降低，持续20h。
(5)乳酸菌培养基成分的简化及培养pH优化实验：将简单培养基(葡萄糖2％、蛋白粉1％、酵母膏1％)的pH调节至pH 3、pH 4、pH 5后分别接种3％的干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌，每2个小时取样测OD 600值和pH，同时冻存试管测乳酸含量。实验结果发现，两株乳酸菌在该培养条件下生长缓慢(如图3所示)。
(6)将MRS作为对照培养基，分别在简单培养基(葡萄糖2％、蛋白粉1％、酵母膏1％)的基础上配制2X、3X培养基，接种3％干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌过夜培养后，于4h、11h、24h和32h测定OD 600。从图4中可以看出，在干酪乳杆菌在1X培养基、嗜酸乳杆菌在3X培养基下生长较快，但是与MRS培养基相比整体生长速率慢，说明两株乳酸菌不适合在该培养基下生长。
(7)干酪乳杆菌与嗜酸乳杆菌的共培养：将干酪乳杆菌与嗜酸乳杆菌共培养后生长变快(如图5所示)，且经美兰染色验证为活菌数的增加(如图6所示)。
(8)探究共培养培养基的选择：为了验证共同培养对培养基的要求，将MRS作为对照培养基，分别在简单培养基(葡萄糖2％蛋白粉1％酵母膏1％)的基础上配置2X、3X培养基，接种3％干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌过夜培养后，于7h、20h、28h测定OD 600。从图7中可以看出，MRS作为共培养的培养基效果远远超过简化培养基。
(9)共培养产酸特性的研究：将MRS作为对照培养基，分别在简单培养基(葡萄糖2％蛋白粉1％酵母膏1％)的基础上配置2X、3X培养基，每种培养基中都做三种处理，即接种3％干酪乳杆菌、3％嗜酸乳杆菌、1.5％干酪乳杆菌和1.5％嗜酸乳杆菌的混合液，过夜培养，36h培养结束后测定培养基的pH，测试单独培养与共培养在不同培养基中的产酸性能。从图8中可以看出，除3X培养基外，其余培养基中，都是共培养的培养物中的pH最低，产酸最多。
实施例2
1试验名称：菊粉和海带酶分解物对乳酸菌生长的影响
2试验方法：
以MRS培养基为基准培养基，按不同比例在其中加入菊粉和海带酶分解物，通过比较乳酸菌生物量和产酸量确定菊粉和海带酶分解物对乳酸菌生长的影响。
3试验过程
3.1菊粉对乳酸菌生长的影响：4.83g MRS培养基加入100ml蒸馏水配制成液体培养基；其中，“代0.5g糖”指“用0.5g菊粉代替4.83g MRS培养基中0.5g葡萄糖配制成的液体培养基”，其余类推。
3.2海带酶分解物对乳酸菌生长的影响：4.83g MRS培养基加入100ml蒸馏水配制成液体培养基；按5％(体积比)的比例加入海带酶解物上清液(简称海带清)。
培养管用的是50mL橙色离心管，液体培养基50mL，放在离心管架上，静置，37℃培养48h。所有培养基中的接菌量都是相同的(200uL)。培养结束后，离心得菌湿重，65℃度烘干8h后得干重。奥豪斯公司ST3100pH计测pH，南京建成研究所的乳酸测试盒检测乳酸含量。
从图9中可以看出，用菊粉替代MRS培养基中的葡萄糖，0.5g和1.0g菊粉对嗜酸乳杆菌有良好的促生长效果，其中，0.5g菊粉的效果最好。5％海带清对嗜酸乳杆菌的促生长效果没看到。因此，海带酶解物与菊粉相比，菊粉对嗜酸乳杆菌的促生长效果更好。图10表明，代0.5g糖组、5％海带清组的菌湿重和干重两个指标都比MRS组高，即用0.5g菊粉替代MRS培养基中的等量葡萄糖，或在MRS培养基中加入5％海带酶解物上清液，对干酪乳杆菌有良好的促生长效果。
实施例3
试验名称：菊粉对乳酸菌生长的影响
试验方法：以MRS培养基为基准培养基，按不同比例在其中加入菊粉，通过比较乳酸菌产量(质量)确定菊粉对乳酸菌生长的影响。
试验过程：4.83g MRS培养基加入100ml蒸馏水配制成液体培养基；其中，“代0.5g糖”指“用0.5g菊粉代替4.83g MRS培养基中0.5g葡萄糖配制成的液体培养基”，其余类推；“加0.5g菊粉”指“0.5g菊粉+4.83g MRS培养基配制成的的液体培养基”；其余类推。所有培养基中的接菌量都是相同的。培养24h后结束，离心得菌湿重，55℃烘干8h后得干重。
结果：从图11可以看出，对嗜酸乳杆菌来说，菊粉无论是替代MRS培养基中的葡萄糖，还是直接加入MRS培养基中，都能促进菌群生长。其中，“代0.5g糖”的培养基产嗜酸乳杆菌干重最大。从图12可以看出，对于干酪乳杆菌来说，菊粉替代MRS培养基中的葡萄糖，及在MRS培养基中加入较多的菊粉，都能促进菌群生长。其中，“加1.5g菊粉”的培养基产干酪乳杆菌干重最大。
综上所述，菊粉替代MRS培养基中的葡萄糖对嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌生长有利，其中，干酪乳杆菌受的影响更大；且用菊粉替代葡萄糖比直接在培养基中加入菊粉效果更好。当菊粉替代1.0g葡萄糖时，干酪乳杆菌量(湿重)(0.93g)是MRS培养基中的菌量(0.35g)的2.6倍；而当菊粉替代0.5g葡萄糖时，嗜酸乳杆菌量(湿重)(0.5g)是MRS培养基中的菌量(0.35g)的1.4倍。
实施例4：不同多糖对发酵的影响
本实施例比较了红糖、果寡糖、菊粉、海带酶解颗粒物对发酵料的影响。
将2.5kg豆粕、2.5kg麦麸、2kg水混合作为发酵底料，再分别加入不同多糖各200g，混匀。再接种酵母菌液和嗜酸乳杆菌液和干酪乳杆菌液。然后分装在7个呼吸袋中，在30℃培养4天。
发酵结束后，采用奥豪斯公司ST3100pH计测pH，采用南京建成研究所的乳酸测试盒检测乳酸含量，并对乳酸菌进行计数。
3试验结果
表2.不同多糖对发酵的影响
多糖类型 红糖 菊粉 果糖 海带
pH 6.12 6.03 6.05 5.43
乳酸/mmol/g 0.022 0.035 0.032 0.111
乳酸菌/CFU/g 3.40×10<sup>7</sup> 5.28×10<sup>7</sup> 5.28×10<sup>7</sup> 2.78×10<sup>8</sup>
从上表可以看到，红糖发酵料中的pH值最高，乳酸产量和乳酸菌数量最低。海带发酵料中的pH值最低，乳酸产量和乳酸菌数量最高。菊粉发酵料和果糖发酵料的各项数值相近。由此可见，海带酶解颗粒物对发酵料的促发酵效果最好，红糖最差。
制备例：微生态制剂的制备
酿酒酵母菌粉的制备：
菌种活化：按1％酵母浸提物、2％蛋白胨、2％麦芽糖的比例配制液体培养基，121℃高压灭菌30min，备用。无菌环境下，把酿酒酵母菌种接种于上述培养基中，置摇床培养，培养温度为26-32℃，振荡参数为100-200rpm，培养时间为2h，获得活化菌液。无菌环境中，从上述活化菌液中取样，进行美兰染色，镜检，确认为纯种。
发酵：将上述酿酒酵母的活化液按2-5％比例接种于发酵罐培养基中进行培养。发酵罐内培养基的体积不超过罐总体积的2/3，培养温度为26-32℃，通气量0.5-1.6vvm(每分钟通气量与培养基的体积比)，搅拌机功率为每立方米1-2kwh，培养时间为8h，得到酿酒酵母发酵液。发酵罐培养基的配方为：0.25％酵母浸提物、0.2％麦芽糖、0.02％氯化钠、0.82％醋酸钠，121℃高压灭菌30min。
冻干：将酿酒酵母发酵液离心，弃去上清液，于(-40℃)预冷冻5h以上，再放入真空冷冻干燥器中冻干，得到酿酒酵母菌粉。酿酒酵母活菌含量在200亿CFU/g。
嗜酸乳杆菌菌粉的制备：
(1)菌种活化：取MRS培养基(北京奥博星公司)48.3g，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，110℃高压灭菌15min，作为MRS液体培养基。无菌操作把嗜酸乳杆菌菌种接入上述培养中，在36-38℃，静置厌氧培养24h，作为第一次活化菌液。无菌环境中，从第一次活化的菌液中取样，进行革兰氏染色，镜检，确认为纯种。将第一次活化菌液接种至MRS液体培养基中，在36-38℃，静置厌氧培养24h，得到种子液。
(2)发酵：将制备的嗜酸乳杆菌种子液按4％接种量接种于发酵罐培养基中，36-38℃，100rpm，恒温厌氧培养72h，得到发酵液。其中发酵罐培养基组成为：蛋白胨1-3％、牛肉膏1-3％、酵母膏1-3％、葡萄糖6-8％、柠檬酸二铵0.3％、K2HPO4·7H2O 0.2％、MgSO4·7H2O0.09％、MnSO4·4H2O 0.025％、NaAc·3H2O0.3％、吐温-80 0.1％，溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌30min。
(3)冻干：将嗜酸乳杆菌发酵液离心，弃去上清液，在下层菌泥中加入复合保护剂并混匀，于(-40℃)预冷冻6h以上，再放入真空冷冻干燥器中冻干，得到嗜酸乳杆菌菌粉。嗜酸乳杆菌含量为500亿CFU/g。
干酪乳杆菌菌粉的制备：
采用与嗜酸乳杆菌菌粉完全相同的方式制备干酪乳杆菌菊粉，干酪乳杆菌含量为1000亿CFU/g。
微生态制剂成品的制备:
按照下表所示的比例，配制1kg的微生态制剂成品。配制方法如下：称取所述酿酒酵母菌粉、所述嗜酸乳杆菌菌粉，所述干酪乳杆菌菌粉以及表中所列的其他组分，在无菌状态下混匀装袋，得到微生态制剂成品。
表4.不同制剂的组成(重量份)
组分 制剂1 制剂2 制剂3 制剂4 制剂5 制剂6
酿酒酵母 0.1 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1
嗜酸乳杆菌 0.1 0.01 0.1 0.1 0.1 0.1
干酪乳杆菌 0.01 0.1 0.1 0.1 0.1 0.01
L-精氨酸 0.01 0.1 0.1 0.1 0.1 0.01
谷氨酰胺 0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.1
菊粉 0.1 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1
复合维生素成分 0.5 1 0 1 0 0.5
酵母诱食剂 0.6 1.2 0 0 1.2 0.6
葡萄糖(分析纯) 8.48 6.59 8.7 7.7 7.5 8.48
注：复合维生素成分的组成如下：维生素A乙酸酯为5,000,000IU/kg、维生素D3为500,000IU/kg、生育酚乙酸酯为50,000IU/kg、维生素B1为1,600mg/kg、维生素B2为2,200mg/kg、维生素B6为1,600mg/kg、维生素B12为30mg/kg、烟酰胺为13,000mg/kg、D-泛酸钙为8,000mg/kg、叶酸为180mg/kg、生物素为50mg/kg。
试验例
1.试验目的：本实施例验证本发明的微生态制剂的安全性和益生作用，采用动物为比格犬。
2.材料与方法
2.1益生菌制剂：采用制备例中制得的微生态制剂3(下文有时称为微生态制剂)作为例子进行说明；阳性对照品为麦德氏宠物营养补充剂(肠胃益生菌，下文有时称为麦德氏益生菌)(主要成分为乳酸片球菌、嗜酸乳杆菌、果寡糖、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、生育酚乙酸酯、维生素D3、维生素A乙酸酯、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酰胺、泛酸钙、生物素、叶酸、葡萄糖、丝兰粉)。
2.2实验动物：20只比格犬，含老年犬10只，幼年犬10只，每阶段犬公母各半，初始体重相近。
2.3试验设计：根据体重及性别比例相近的原则，试验分3组，空白对照组8只、试验组8只、阳性对照组4只。空白对照组饲喂基础全价犬粮，试验组饲喂基础全价犬粮+5g本发明微生态制剂，阳性对照组饲喂基础全价犬粮(ROYAL CANIN皇家狗粮)+4g麦德氏益生菌。见下表5。
表5.试验分组情况
Figure BDA0002514452730000101
注：按老年犬平均体重10kg、幼年犬平均体重5kg计算微生态制剂用量。
2.4饲养管理
试验在山西蓝灵生物技术有限公司里进行，该公司位于山西省和顺县义兴镇尧村。试验犬单笼饲养，每天定量采食，老犬一天喂食250g，幼犬一天喂食200g。上午、下午各喂1次，自由饮水。每天有运动时间。每天清粪。试验从2020年2月25日开始，持续30天。
2.5采样指标与方法
2.5.1体重：在试验开始的第0、7、14、21、30天称体重。
2.5.2采食量：每日每只犬共记录1次采食量。
2.5.3被毛情况：每日早上巡视时通过拍照的方式记录每只犬的毛发状况1次，照片要求能够清晰看到毛发的顺滑度和光泽度。
2.5.4皮肤状态：每日早上巡视时记录每只犬的皮肤状态1次，每次拨开犬背部、胸部、面部三处毛发观察皮肤有无红斑、红疹、皮屑等异常情况。
2.5.5排便情况：每日早上清粪时记录每只犬粪便情况共1次。
2.5.6精神状态：每日早晚巡视时记录每只犬精神状态共2次，打分记录。
3.结果
3.1体重
试验期间共记录试验犬体重五次，结果见表6。试验第7天、第14天、第21天、第30天相比试验开始前(D0)的体重变化情况见表7，试验每周的体重变化情况见表7。试验犬体重分析情况见表8、表9、表10。
表6.试验犬体重记录单位：kg
Figure BDA0002514452730000111
说明：D0：试验开始前一天；D7：试验开始第7天；D14：试验开始后第14天，依此类推。
表7.试验犬体重变化单位：kg
Figure BDA0002514452730000112
Figure BDA0002514452730000121
说明：D0：试验开始前一天；D7：试验开始第7天；D14：试验开始后第14天，依此类推。
表8.试验犬在不同试验阶段的平均体重单位：kg
组别 D0 D7 D14 D21 D30
空白对照组 8.02 7.96 7.97 8.24 8.69
试验组 7.67 7.94 8.11 8.35 8.84
阳性对照组 8.16 8.39 8.50 8.73 8.84
表9.与初始体重相比，试验犬在不同试验阶段的平均增重情况单位：kg
组别 D7-D0 D14-D0 D21-D0 D30-D0增重
空白对照组 -0.06 -0.05 0.22 0.68
试验组 0.27 0.44 0.68 1.17
阳性对照组 0.23 0.34 0.56 0.68
表10.试验犬每周平均增重情况单位：kg
组别 D7-D0 D14-D7 D21-14 D30-21
空白对照组 -0.06 0.01 0.27 0.46
试验组 0.27 0.16 0.24 0.49
阳性对照组 0.23 0.11 0.22 0.11
从表8可以看出，空白对照组犬的体重在试验开始时大于试验组，但接下来的的2周体重不升反降，2周后开始增加，但试验结束时，该组平均体重是三组中最低的。表10表明，空白对照组犬的体重增长情况在最初的2周内都是最差的，甚至出现了负值，但第3周，该组犬的周增重最快，第4周的周增重低于试验组，但高过阳性对照组，从表9来看，整个试验期内，空白对照组和阳性对照组犬的平均增重是相同的
从体重数据来看，试验组的表现最好。表8表明，试验开始时，试验组犬的体重最低，但试验期结束时，该组值高过空白对照组，与阳性对照组相同。表9的数据表明，整个试验期内，试验组犬的体重不断增加，试验结束时，该组犬平均增重1.11kg/只，是三组中累积增重最高的。不仅如此，表10表明，试验组的周增重在三组中一直是最高的。这说明微生态制剂的益生效果是非常显著的。
3.2采食
从记录表来看，按一天一大犬日采食250g，幼犬日采食200g提供，每天都被采食干净，无剩余。
3.3被毛情况
见表11。各组犬都有轻微脱毛现象。此外，空白试验组在整个试验期内被毛出现异常的情况最多，阳性对照组只出现了1次被毛暗哑，试验组无任何异常出现。这充分说明本发明微生态制剂对比格犬无害。
试验开始时，各组犬的被毛平整，光亮、挺立，无脱毛现象。第4天开始，各组都出现了轻微脱毛现象，但空白对照组有4只犬的被毛蓬乱、暗哑、软塌，并持续了5天。第9天空白对照组只有2只犬的被毛不好，并持续到第17天。第23天，空白组和阳性对照组各有一只犬被毛暗哑。其它试验期内，各组犬被毛都无异常情况出现。据观察，自制微生态组的被毛最顺滑(参见图13)。
表11.试验犬被毛情况异常统计
Figure BDA0002514452730000131
注：一天一只犬的被毛状态记为1犬次。
3.4皮肤状态
从记录表来看，除了有脱毛外，皮肤无异常。说明本发明微生态制剂对犬无害，皮肤不会出现异常。
试验开始时，各组犬的皮肤无异常状态。从第4天开始，各组犬都表现出轻微脱毛的情况，但没有其它皮肤异常状态。这一情况持续到试验结束，即整个试验期内，除表现轻微脱毛外，各组试验犬皮肤都没有出现皮屑、红疹、红肿及其他异常。
3.5粪便情况
各组试验犬的粪便情况总结见表12，整个试验期内，空白对照组出现了7犬次硬便、4犬次褐色粪便，阳性对照组出现1犬次硬便、1犬次褐色粪便，试验组全程无异常。这表明，本发明微生态制剂对比格犬来说是安全、无害的。
表12.试验犬粪便异常状态统计
Figure BDA0002514452730000141
注：一天一只犬的粪便状态记为1犬次。
试验开始时，各组犬的粪便都是黄色软便。第22天，空白试验组出现3例硬便。第23天，空白试验组出现2例褐色硬便，并持续到第24天，第25天消失。第24天，阳性对照组出现1例褐色硬便，第25天消失。试验组没有出现稀便、软便或硬便、粪便颜色异常、粪便残留的情况。
3.6精神状态
见表13。空白试验组犬现出精神异常次数最多，其次是试验组，阳性对照组最低。这些精神异常现象都出现在试验开始后18天内，第19天至试验结束，各组都未出现精神异常。这说明本发明微生态制剂本发明微生态制剂对格犬无害。
表13.试验犬精神状态异常情况统计
Figure BDA0002514452730000142
具体地说，在试验开始时，各组犬都很活跃，即除眨眼外，吠叫、走步、摇尾、伸前爪、攀栏等活跃活动都有。第4天时，空白对照组有4只犬活跃度下降，不再攀栏、伸前爪，这种状态持续到第8天。第9天，空白对照组有2只犬活跃度低，并出现坐卧状态，而试验组和阳性对照组的活跃度无异常。第10天时空白对照组犬活泼度恢复；试验组和阳性对照组没有出现活跃度异常。此外，第15天时，空白对照组和阳性对照组各出现一例坐卧。这种情况持续到第17天。第18天开始，各组无异常。
从体重、采食、被毛、皮肤、粪便、精神情况来看，本发明微生态制剂对犬无害，可以长期食用。本发明微生态制剂的饲喂量可低于0.5g/kg体重，即比麦德氏益生菌的用量要少。从试验犬的增重来看，本发明微生态制剂的促生长效果是最好的。本发明微生态制剂配方中不只添加寡糖等益生元，还添加了促进肠道微生物生长的氨基酸。从被毛的顺滑度来看，本发明微生态制剂明显优于阳性对照组。总而言之，本发明微生态制剂对犬无害，持续饲喂30天，犬无异常表现，且增重效果好，毛的顺滑度有明显改善。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的主旨。

Claims (10)

1.一种微生态制剂，其特征在于，所述制剂包含：
(1)益生菌，所述益生菌包含酿酒酵母、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌；
(2)氨基酸，所述氨基酸包含L-精氨酸和谷氨酰胺；
(3)益生元，所述益生元选自由甘露寡糖、海带酶解物、果糖、红糖、菊粉组成的组；
(4)载体，所述载体为葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于：
所述制剂还包括诱食剂和/或复合维生素。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述制剂中的各组分以重量份计的含量如下：
Figure FDA0002514452720000011
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制剂，其特征在于：
所述益生元为菊粉；优选的是，所述菊粉为0.1-0.3重量份。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的制剂，其特征在于：
所述诱食剂为酵母诱食剂；优选的是，所述诱食剂的含量为0.8-1.2重量份；
所述复合维生素成分包含如下组分：维生素A乙酸酯≥5,000,000IU/kg、维生素D3≥500,000IU/kg、生育酚乙酸酯≥50,000IU/kg、维生素B1≥1,600mg/kg、维生素B2≥2,200mg/kg、维生素B6≥1,600mg/kg、维生素B12≥30mg/kg、烟酰胺≥13,000mg/kg、D-泛酸钙≥8,000mg/kg、叶酸≥180mg/kg、生物素≥50mg/kg；优选的是，所述复合维生素成分的含量为0.5-1.0重量份。
6.一种制备权利要求1至5中任一项所述的制剂的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)分别提供酿酒酵母菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉和干酪乳杆菌菊粉；
(2)在无菌状态下将所述菌粉与其他组分混匀，制得复合微生态制剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述酿酒酵母菌粉采用如下方式进行：(1)菌种活化：将酿酒酵母菌接种于液体培养基中进行摇床培养，培养温度为26-32℃，振荡参数为100-200rpm，培养时间为1.5-2.5h，获得活化菌液；(2)发酵：将所述活化菌液接种于发酵罐培养基中进行培养，培养温度为26-32℃，通气量0.5-1.6vvm，搅拌机功率为每立方米1-2kwh，培养时间为7-9h，得到酿酒酵母发酵液；(3)冻干：将酿酒酵母发酵液离心，弃去上清液，将沉淀物冻干，得到酿酒酵母菌粉；
所述嗜酸乳杆菌菌粉和所述干酪乳杆菌菌粉独立地采用如下方式进行：(1)菌种活化：将菌种接入所述MRS培养基中，在36-38℃，静置厌氧培养18-30h，作为第一次活化菌液；将第一次活化菌液接种至MRS液体培养基中，在36-38℃，静置厌氧培养18-30h，得到种子液；(2)发酵：将所述种子液按4％接种量接种于发酵罐培养基中，36-38℃，100rpm，恒温厌氧培养66-78h，得到发酵液；(3)冻干：将发酵液离心，弃去上清液，将沉淀物冻干，得到相应的菌粉。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述酿酒酵母菊粉的活菌含量为150-250亿CFU/g；
所述嗜酸乳杆菌菌粉的活菌含量为400-600亿CFU/g；和/或
所述干酪乳杆菌菌粉的活菌含量为800-1200亿CFU/g。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：
所述液体培养基由1质量％酵母浸提物、2质量％蛋白胨和2质量％麦芽糖配制；
所述发酵罐培养基由0.25质量％酵母浸提物、0.2质量％麦芽糖、0.02质量％氯化钠、0.82质量％醋酸钠制得；和/或
所述发酵罐培养基组成为：蛋白胨1-3％、牛肉膏1-3％、酵母膏1-3％、葡萄糖6-8％、柠檬酸二铵0.3％、K2HPO4·7H2O 0.2％、MgSO4·7H2O 0.09％、MnSO4·4H2O 0.025％、NaAc·3H2O 0.3％、吐温-80 0.1％。
10.权利要求1至5中任一项所述的微生态制剂或者权利要求6至9中任一项所述的方法制得的微生态制剂作为饲料尤其是犬例如宠物犬用饲料的添加剂或补充剂的应用。
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