CN103146582A - 一种富油微藻的高通量筛选方法 - Google Patents
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Abstract
一种富油微藻的高通量筛选方法，它涉及微藻生物能源领域。本发明要解决现有微藻有机溶剂提取法存在耗时费力、所需试剂和样品量大、毒性试剂会对人体和环境造成危害，难以满足微藻筛选中高通量测定油脂含量的需要的问题。本发明的方法如下：一、取微藻富集培养，培养7～14天；二、重复2～3次；三、接种后，培养7～14天；四、进行稀释后涂布，培养至出现藻落；五、挑取生长较快、较大的单藻落，培养7～14天；六、重复步骤四至步骤五3～4次；八、超声波进行破碎后加入尼罗红溶液，选择荧光强度最高的藻株，即得到高油脂含量的藻株；本发明避免了冗繁的传统油脂检测步骤，克服了藻种大规模筛选缺乏快速、高通量筛选方法的瓶颈问题。
Description
技术领域
本发明涉及微藻生物能源领域。
背景技术
近几年，随着化石燃料储量日益降低，化石燃料的枯竭和不可再生性及其燃烧导致的全球变暖、环境污染等问题，迫使世界各国寻找可以替代化石燃料的绿色、可持续发展的新能源。生物质能可以利用光合作用将太阳能以化学能的形式储存在生物体内，是地球上最普遍的环保型可再生能源。在众多的生物质能中，生物柴油已为了世界上发展最快、应用最广的绿色新能源，受到了广泛的关注。
生物柴油的主要成份是脂肪酸甲酯，有着与石化柴油相近的性能，且具有优良的燃烧性能、环保性和可再生性。其主要原料来源于植物油脂（大豆油、菜籽油、玉米油、麻风树油、棕榈油和花生油等）、动物油脂（动物脂肪酸）和废弃食用油（地沟油）。然而，现有生物柴油发展的瓶颈在于原料价格高、供应严重不足，且加大生物柴油的生产势必会与其他农作物争夺土地，导致粮食供应问题。因此，亟需寻求低成本、大规模、可持续供应的油脂原料来源。
与其他生物柴油的原料相比，以微藻油脂生产生物柴油有着明显的优势。微藻的含油量高、生长周期短、油脂产率要远高于普通的产油作物。微藻培养不与农业生产冲突，可以在盐碱地、滩涂、荒漠地区及盐碱水、海水和废水等非农用水中进行规模化生产。微藻除了用于提取油脂外，还可开发高附加值产品（活性蛋白、活性多糖、天然色素、沼气、饲料、表面活化剂等），用以降低微藻生物柴油的成本。
微藻生物柴油规模化生产的首要任务是筛选油脂含量高、生长迅速和抗逆性强的藻株，而微藻的培养方式在富油藻种的选育中起到重要的作用。微藻的培养方式主要分为自养、异养和混合培养三种方式。自养培养是以无机碳化合物为碳源，利用微藻的光合作用将化学能转化为生物能的营养方式。其操作简单、成本较低，但得到的细胞密度低、光合效率低，规模培养时微藻收获困难，难以满足规模化生产的需要。异养培养是在无光照条件下利用有机碳源作为能源和碳源，可以进行藻类的高密度培养并大大提高微藻的油脂产率，这相应的降低了采收的难度和提取成本，但异养培养生产成本和能耗均较高。混合培养是指微藻利用无机物和有机物作为碳源的培养方式，能同时利用藻类光能自养和异养生长的能力，据报道其比生长速率约等于自养和异养培养的总和，可以实现自养培养和异养培养的优势互补，故混合培养是一种比较适合的培养方式。此外，传统的有机溶剂提取法测定微藻油脂含量存在耗时费力、所需试剂和样品量大、毒性试剂会对人体和环境造成危害等问题，难以满足富油微藻筛选过程中高通量测定油脂含量的需要。
发明内容
本发明的目的是为了筛选能进行混合培养的富油藻种，并解决现有微藻有机溶剂提取法存在耗时费力、所需试剂和样品量大、毒性试剂会对人体和环境造成危害，难以满足微藻筛选中高通量测定油脂含量的需要的问题，而提供一种富油微藻的高通量筛选方法。
本发明的一种富油微藻的高通量筛选方法，是通过以下步骤实现：
一、取微藻样品加入到培养基A中富集培养15～30天，得藻液；二、取步骤一得到的藻液，按体积百分含量为10%的接种量接种于培养基A中，在温度为25℃的光照培养箱中培养7～14天；三、重复步骤二2～3次，得藻液A；四、取步骤三得到的藻液A，按体积百分含量为10%的接种量接种于培养基B中，在温度为25℃的培养箱中培养7～14天，得藻液B；五、取步骤四得到的藻液B以无菌水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的倍数进行稀释，将10-5～10-6倍数稀释后的藻液均匀涂布于固体培养基C平板上，在25℃培养箱中培养至出现藻落；六、在无菌环境中，挑取单藻落，转入到培养基B中，在温度为25℃的培养箱中培养7～14天；七、重复步骤五至步骤六3～4次，即完成藻株的分离，得到微藻液；八、取3～10mL步骤七得到的微藻液，用超声波进行破碎，在破碎后的藻液中加入尼罗红溶液，混匀后，测定藻液的荧光强度，选择荧光强度最高的藻株，即得到高油脂含量的藻株；
其中，步骤一和步骤二中所述的培养基A按重量份数是由0.1～1.5份硝酸钠、0.018～0.09份硫酸镁、0.02～0.08份磷酸氢二钾、0.009～0.054份氯化钙、0.01～0.06份碳酸钠、0.003～0.012份柠檬酸、0.003～0.012份柠檬酸铁铵、0.0005～0.01份乙二胺四乙酸和0.005～0.01份微量元素组成的；
步骤四和步骤六中所述的培养基B按重量份数是由0.1～1.5份硝酸钠、0.018～0.09份硫酸镁、0.02～0.08份磷酸氢二钾、0.009～0.054份氯化钙、0.01～0.06份碳酸钠、0.003～0.012份柠檬酸、0.003～0.012份柠檬酸铁铵、0.0005～0.01份乙二胺四乙酸、0.005～0.01份微量元素和5～50份葡萄糖组成的；
步骤五中所述的固体培养基C按重量份数是由0.1～1.5份硝酸钠、0.018～0.09份硫酸镁、0.02～0.08份磷酸氢二钾、0.009～0.054份氯化钙、0.01～0.06份碳酸钠、0.003～0.012份柠檬酸、0.003～0.012份柠檬酸铁铵、0.0005～0.01份乙二胺四乙酸、0.005～0.01份微量元素、5～50份葡萄糖和5～20份琼脂组成的；
步骤八中所述的藻液与尼罗红溶液的体积比为3:1000。
本发明包含以下有益效果：
本发明采用一种荧光染色的方法，避免了冗繁的传统油脂检测步骤，克服了藻种大规模筛选缺乏快速、高通量的筛选方法的瓶颈问题。表1为有机溶剂提取法与荧光法的比较，由表可知，本发明的方法具有所需样品量小、测定快速、耗时少、对人和环境无毒性等优点。
表1有机溶剂提取法与荧光法比较表
附图说明
图1为89株微藻脂类含量的荧光染色筛选结果。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式的一种富油微藻的高通量筛选方法，是通过以下步骤实现：
一、取微藻样品加入到培养基A中富集培养15～30天，得藻液；二、取步骤一得到的藻液，按体积百分含量为10%的接种量接种于培养基A中，在温度为25℃的光照培养箱中培养7～14天；三、重复步骤二2～3次，得藻液A；四、取步骤三得到的藻液A，按体积百分含量为10%的接种量接种于培养基B中，在温度为25℃的培养箱中培养7～14天，得藻液B；五、取步骤四得到的藻液B以无菌水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的倍数进行稀释，将10-5～10-6倍数稀释后的藻液均匀涂布于固体培养基C平板上，在25℃培养箱中培养至出现藻落；六、在无菌环境中，挑取单藻落，转入到培养基B中，在温度为25℃的培养箱中培养7～14天；七、重复步骤五至步骤六3～4次，即完成藻株的分离，得到微藻液；八、取3～10mL步骤七得到的微藻液，用超声波进行破碎，在破碎后的藻液中加入尼罗红溶液，混匀后，测定藻液的荧光强度，选择荧光强度最高的藻株，即得到高油脂含量的藻株；
其中，步骤一和步骤二中所述的培养基A按重量份数是由0.1～1.5份硝酸钠、0.018～0.09份硫酸镁、0.02～0.08份磷酸氢二钾、0.009～0.054份氯化钙、0.01～0.06份碳酸钠、0.003～0.012份柠檬酸、0.003～0.012份柠檬酸铁铵、0.0005～0.01份乙二胺四乙酸和0.005～0.01份微量元素组成的；
步骤四和步骤六中所述的培养基B按重量份数是由0.1～1.5份硝酸钠、0.018～0.09份硫酸镁、0.02～0.08份磷酸氢二钾、0.009～0.054份氯化钙、0.01～0.06份碳酸钠、0.003～0.012份柠檬酸、0.003～0.012份柠檬酸铁铵、0.0005～0.01份乙二胺四乙酸、0.005～0.01份微量元素和5～50份葡萄糖组成的；
步骤五中所述的固体培养基C按重量份数是由0.1～1.5份硝酸钠、0.018～0.09份硫酸镁、0.02～0.08份磷酸氢二钾、0.009～0.054份氯化钙、0.01～0.06份碳酸钠、0.003～0.012份柠檬酸、0.003～0.012份柠檬酸铁铵、0.0005～0.01份乙二胺四乙酸、0.005～0.01份微量元素、5～50份葡萄糖和5～20份琼脂组成的；
步骤八中所述的藻液与尼罗红溶液的体积比为3:1000。
本实施方式采用一种荧光染色的方法，避免了冗繁的传统油脂检测步骤，克服了藻种大规模筛选缺乏快速、高通量的筛选方法的瓶颈问题。表1为有机溶剂提取法与荧光法的比较，由表可知，本实施方式的方法具有所需样品量小、测定快速、耗时少、对人和环境无毒性等优点。
表1有机溶剂提取法与荧光法比较表
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的微藻样品为小球藻、栅藻、硅藻、隐甲藻、扁藻、杜氏藻、螺旋藻、金藻中的一种或几种按任意比混合。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一和步骤二中所述的培养基A按重量份数是由1份硝酸钠、0.075份硫酸镁、0.04份磷酸氢二钾、0.036份氯化钙、0.02份碳酸钠、0.006份柠檬酸、0.006份柠檬酸铁铵、0.001份乙二胺四乙酸和0.00541份微量元素组成的。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤四和步骤六中所述的培养基B按重量份数是由0.5份硝酸钠、0.075份硫酸镁、0.04份磷酸氢二钾、0.036份氯化钙、0.02份碳酸钠、0.006份柠檬酸、0.006份柠檬酸铁铵、0.001份乙二胺四乙酸、0.00541份微量元素和10份葡萄糖组成的。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤五中所述的固体培养基C按重量份数是由0.5份硝酸钠、0.075份硫酸镁、0.04份磷酸氢二钾、0.036份氯化钙、0.02份碳酸钠、0.006份柠檬酸、0.006份柠檬酸铁铵、0.001份乙二胺四乙酸、0.00541份微量元素、10份葡萄糖和15份琼脂组成的。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：所述的微量元素为0.00286重量份的硼酸、0.00181重量份的氯化锰、0.00039重量份的钼酸钠、0.000222重量份的硫酸锌、0.000079重量份的硫酸铜和0.000049重量份的硝酸钴。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤一中所述的微藻样品来源于自然水体（淡水、海水和咸水等）或土壤。其它与具体实施方式一至六之一相同。
通过以下试验验证本发明的有益效果：
本试验富油微藻的高通量筛选方法按以下步骤实现：一、取微藻样品，加入到培养基A中富集培养15～30天；二、取步骤一得到的藻液，按体积百分含量为10%的接种量接种于培养基A中，在温度为25℃的光照培养箱中培养7～14天；三、重复步骤二2～3次，得藻液A；四、取步骤三得到的藻液A，按体积百分含量为10%的接种量接种于培养基B中，在温度为25℃的培养箱中培养7～14天，得藻液B；五、取步骤四得到的藻液B以无菌水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的倍数进行稀释，将10-5～10-6倍数稀释后的藻液均匀涂布于固体培养基C平板上，在25℃培养箱中培养至出现藻落；六、在无菌环境中，挑取生长较快、较大的单藻落，转入到培养基B中，在温度为25℃的培养箱中培养7～14天；七、重复步骤五至步骤六3～4次，即完成藻株的分离，得到微藻液；八、取步骤七得到的微藻液，用超声波进行破碎，在破碎后的藻液中加入尼罗红溶液，混匀染色后，测定藻液的荧光强度，选择荧光强度最高的藻株，即得到89株高油脂含量的藻株；
本试验步骤一和步骤二中所述的培养基A按重量分数是由1份硝酸钠、0.075份硫酸镁、0.04份磷酸氢二钾、0.036份氯化钙、0.02份碳酸钠、0.006份柠檬酸、0.006份柠檬酸铁铵、0.001份乙二胺四乙酸和0.00541份微量元素组成的；
步骤四和步骤六中所述的培养基B按重量分数是由0.5份硝酸钠、0.075份硫酸镁、0.04份磷酸氢二钾、0.036份氯化钙、0.02份碳酸钠、0.006份柠檬酸、0.006份柠檬酸铁铵、0.001份乙二胺四乙酸、0.00541份微量元素和10份葡萄糖组成的；
步骤五中所述的固体培养基C按重量分数是由0.5份硝酸钠、0.075份硫酸镁、0.04份磷酸氢二钾、0.036份氯化钙、0.02份碳酸钠、0.006份柠檬酸、0.006份柠檬酸铁铵、0.001份乙二胺四乙酸、0.00541份微量元素、10份葡萄糖和15份琼脂组成的；
步骤八中所述的藻液与尼罗红溶液的体积比为3:1000。
本试验得到的高油脂含量的藻株的微藻脂类含量的荧光染色筛选结果如图1所示，荧光强度高于600的藻株为2株栅藻，荧光强度为400～600的藻株有1株小球藻，3株栅藻，表明这些藻株有着较高的油脂含量和良好的开发利用前景。
Claims (6)
1.一种富油微藻的高通量筛选方法，其特征在于富油微藻的高通量筛选方法是通过以下步骤实现：一、取微藻样品加入到培养基A中富集培养15～30天，得藻液；二、取步骤一得到的藻液，按体积百分含量为10%的接种量接种于培养基A中，在温度为25℃的光照培养箱中培养7～14天；三、重复步骤二2～3次，得藻液A；四、取步骤三得到的藻液A，按体积百分含量为10%的接种量接种于培养基B中，在温度为25℃的培养箱中培养7～14天，得藻液B；五、取步骤四得到的藻液B以无菌水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的倍数进行稀释，将10-5～10-6倍数稀释后的藻液均匀涂布于固体培养基C平板上，在25℃培养箱中培养至出现藻落；六、在无菌环境中，挑取单藻落，转入到培养基B中，在温度为25℃的培养箱中培养7～14天；七、重复步骤五至步骤六3～4次，即完成藻株的分离，得到微藻液；八、取3～10mL步骤七得到的微藻液，用超声波进行破碎，在破碎后的藻液中加入尼罗红溶液，混匀后，测定藻液的荧光强度，选择荧光强度最高的藻株，即得到高油脂含量的藻株；
其中，步骤一和步骤二中所述的培养基A按重量份数是由0.1～1.5份硝酸钠、0.018～0.09份硫酸镁、0.02～0.08份磷酸氢二钾、0.009～0.054份氯化钙、0.01～0.06份碳酸钠、0.003～0.012份柠檬酸、0.003～0.012份柠檬酸铁铵、0.0005～0.01份乙二胺四乙酸和0.005～0.01份微量元素组成的；
步骤四和步骤六中所述的培养基B按重量份数是由0.1～1.5份硝酸钠、0.018～0.09份硫酸镁、0.02～0.08份磷酸氢二钾、0.009～0.054份氯化钙、0.01～0.06份碳酸钠、0.003～0.012份柠檬酸、0.003～0.012份柠檬酸铁铵、0.0005～0.01份乙二胺四乙酸、0.005～0.01份微量元素和5～50份葡萄糖组成的；
步骤五中所述的固体培养基C按重量份数是由0.1～1.5份硝酸钠、0.018～0.09份硫酸镁、0.02～0.08份磷酸氢二钾、0.009～0.054份氯化钙、0.01～0.06份碳酸钠、0.003～0.012份柠檬酸、0.003～0.012份柠檬酸铁铵、0.0005～0.01份乙二胺四乙酸、0.005～0.01份微量元素、5～50份葡萄糖和5～20份琼脂组成的；
步骤八中所述的藻液与尼罗红溶液的体积比为3:1000。
2.根据权利要求1所述的一种富油微藻的高通量筛选方法，其特征在于步骤一中所述的微藻样品为小球藻、栅藻、硅藻、隐甲藻、扁藻、杜氏藻、螺旋藻、金藻中的一种或几种按任意比混合。
3.根据权利要求1所述的一种富油微藻的高通量筛选方法，其特征在于步骤一和步骤二中所述的培养基A按重量份数是由1份硝酸钠、0.075份硫酸镁、0.04份磷酸氢二钾、0.036份氯化钙、0.02份碳酸钠、0.006份柠檬酸、0.006份柠檬酸铁铵、0.001份乙二胺四乙酸和0.00541份微量元素组成的。
4.根据权利要求1所述的一种富油微藻的高通量筛选方法，其特征在于步骤四和步骤六中所述的培养基B按重量份数是由0.5份硝酸钠、0.075份硫酸镁、0.04份磷酸氢二钾、0.036份氯化钙、0.02份碳酸钠、0.006份柠檬酸、0.006份柠檬酸铁铵、0.001份乙二胺四乙酸、0.00541份微量元素和10份葡萄糖组成的。
5.根据权利要求1所述的一种富油微藻的高通量筛选方法，其特征在于步骤五中所述的固体培养基C按重量份数是由0.5份硝酸钠、0.075份硫酸镁、0.04份磷酸氢二钾、0.036份氯化钙、0.02份碳酸钠、0.006份柠檬酸、0.006份柠檬酸铁铵、0.001份乙二胺四乙酸、0.00541份微量元素、10份葡萄糖和15份琼脂组成的。
6.根据权利要求1、3、4或5所述的一种富油微藻的高通量筛选方法，其特征在于所述的微量元素为0.00286重量份的硼酸、0.00181重量份的氯化锰、0.00039重量份的钼酸钠、0.000222重量份的硫酸锌、0.000079重量份的硫酸铜和0.000049重量份的硝酸钴。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Application publication date: 20130612 |