TWI551682B - 新穎衣藻及其應用 - Google Patents

Description

新穎衣藻及其應用

本發明係提供一種改良之產油衣藻，其具有可用海水培養、含油量高、低黏附力、重力沉降、可戶外培養之特性，可應用於能源生產技術，詳言之，係有關可生產油脂之新穎衣藻。

由於世界性油價飛漲、環境污染和溫室效應等議題，新一代的生質燃料『微藻』，吸引了全世界的目光。微藻具多樣化且易培養的特性，使其商業利用性極高，不僅可用於製藥、保健食品、農業肥料、養殖漁業飼料、化妝品，還可用來生產生質柴油等生質燃料與生質化學品。

科學家從海洋和湖泊中分離到微藻，其油脂组成與一般油料植物相似，以C16、C18系脂肪酸為主；高等植物種子的脂肪酸含量僅為乾重的15%~20%左右，而微藻的脂肪酸含量在氮元素缺乏時可高達細胞乾重的70-80%(Spolaore et al,2006)。微藻生質柴油單位產量優於其他產油植物約高出10~20倍，是優質生質柴油料源，被視為第三代生質燃料(Chisti,2007；Chisti,2008)。研究指出，若直接利用微藻生產生質柴油替代現今50%的運輸燃料，約僅需要美國目前總農作土地的3%，加上微藻之生長乃利用二氧化碳為其碳源進行光合作用，故可同時解決當今更嚴重的溫室效應問題(Fu et al,2009)。利用微藻生產生質柴油具有無毒、環保且不占耕地等優點，並可減少二氧化碳以及硫氧化物的排放。歐盟(EU)的目標是在2020年時，所有燃料消耗的10%來自生質燃料，航空燃油與柴油都必須添加10%的 生質燃料，故在可預見的未來，生質柴油的供應有很大的需求，因此，尋找與開發生質柴油來源將是世界各國目前刻不容緩的議題。2007年Nature期刊文章標題為『Algae bloom again』的專欄報導，顯示藻類生質能在再生能源領域之重要性(Haag,2007)，這也間接說明不論從環保角度、能源角度、與國家經濟的角度，藻類在國家能源政策中，絕對會扮演舉足輕重的角色。如何以高經濟效益且環保的方式提升不同藻體的固碳效率與附加價值，是近年來各先進國家致力研究發展的重點。

1公斤(乾重)自營性微藻約可吸收1.8公斤二氧化碳轉化成生物質量，微藻成長時可同時減少溫室氣體二氧化碳排放大氣中(Wang et al,2008)。此外，培養微藻需要的氮與磷來源可來自於生活廢水或養殖廢水，養殖時可淨化廢水，達到廢水處理的功效。微藻生質燃料最大的瓶頸在於生產成本過高，遠高於石化燃料，根據美國能源局2012年分析微藻藻油售價約在每加侖9.28美元，同時期石化柴油售價為每加侖3.61美元，美國能源局在2013年8月宣布投入2.2千萬美元在藻類生質燃料發展，預計在2019年達到微藻生質燃料成本減半與大規模商業化之目標，預計將微藻藻油售價降至每加侖2.27美元，降低成本策略之一，就是藉由基因改良方式提升藻種生產效率，隨著生物技術的突破，以人工誘導突變方式改良為藻，可提升微藻生長密度，提升養殖環境耐受性，創造出極具商業價值的超級微藻。

人工誘導突變為促使物種演化重要的機制，自然情況下即會發生，機率約為百萬分之一到十萬分之一，做法為以人工的方式誘發突變產生，如放射線、紫外光、烷化劑、亞硝基化合物等，在此以紫外線突變為例，照射紫外線會使DNA分子形成嘧啶二聚體，阻礙染色體上基因正確配對，引起微藻基因突變或死亡，通常此種方式可得到數以百計的突變株， 接著藉由性狀篩選，如希望得到產油的超級微藻，便針對微藻油脂含量作篩選，大規模篩選出優良的產油微藻藻種。

衣藻屬(Chlamydomonas)，是綠藻門(Chlorophyta)/綠藻科(Chlorophyceae)下的一個屬，為帶有鞭毛的單細胞生物，直徑約為10微米。衣藻與藍綠藻為微藻界真核與原核藻最具代表的模式生物，就如同果蠅對於遺傳學學術研究上的貢獻，衣藻自1945年開始長期作為分子生物學與基因工程學研究材料，研究核酸和蛋白質等生物大分子的功能、形態結構特徵、功能性和規律性。衣藻在學術研究上為重要研究工具，Chlamydomonas reinhardtii 137C是最常使用的藻種，衣藻在生質燃料相關研究起始於1952年，Frenkel發現衣藻和其他一些綠藻可以在特定情況下，可以產生氫氣，開始相關研究，然而因產氫機制未明，效率難以控制，有待進一步研究突破瓶頸。

衣藻C.reinhardtii 137c為產油脂方面研究的模式藻種，因衣藻三個帶有遺傳物質之細胞核、葉綠體、立線體的染色體基因已解序完成，建立開放式資料庫供研究人員使用，進一步發展出前述三個系統的轉形工具(Grossman,2000)，產油研究主要集中於利用基因改良技術對模式衣藻進行改造，對衣藻C.reinhardtii 137c進行人工誘導突變或產油相關基因工程改造，研究產油性狀的改變。之前研究顯示已發現的衣藻大部分生長在淡水環境，且其油脂含量低(10~15%)，與其它產油微藻(>30%)相比，並不適合用於大規模養殖(Siaut et al,2011)。商業生產中最常被用來生產油脂的藻種為小球藻(Chlorella vulgalis)，油脂產率約在50~100mg/L/d，生長在淡水環境，爭議的是小球藻淡水培養時採用大量的飲用水，競爭了水資源的使用，因此許多科學家，開始以尋找以海水或鹹水培養的藻種(Rodolfi et al,2009)。因此，若能取得可以海水養殖，且具有高脂肪含量，高生物質產 量之微藻，可做為生產生質燃料之潛力藻種。就如同本發明為可生產油脂之新穎衣藻，具有可用海水培養、含油量高、低黏附力、重力沉降、可戶外培養之特性，可應用於能源生產技術，並且有不消耗飲用水之優點。

(參考資料)

Chisti Y (2007) Biodiesel from microalgae. Biotechnol Adv 25: 294-306

Chisti Y (2008) Biodiesel from microalgae beats bioethanol. Trends in biotechnology 26: 126-131

Fu Z, Yang F, An Y, Xue Y (2009) Characteristics of nitrite and nitrate in situ denitrification in landfill bioreactors. Bioresour Technol 100: 3015-3021

Grossman AR (2000) Chlamydomonas reinhardtii and photosynthesis: genetics to genomics. Current opinion in plant biology 3: 132-137

Haag AL (2007) Algae bloom again. Nature 447: 520-521

Rodolfi L, Chini Zittelli G, Bassi N, Padovani G, Biondi N, Bonini G, Tredici MR (2009) Microalgae for oil: strain selection, induction of lipid synthesis and outdoor mass cultivation in a low-cost photobioreactor. Biotechnology and bioengineering 102: 100-112

Siaut M, Cuine S, Cagnon C, Fessler B, Nguyen M, Carrier P, Beyly A, Beisson F, Triantaphylides C, Li-Beisson Y, Peltier G (2011) Oil accumulation in the model green alga Chlamydomonas reinhardtii: characterization, variability between common laboratory strains and relationship with starch reserves. BMC biotechnology 11: 7

Spolaore P, Joannis-Cassan C, Duran E, Isambert A (2006) Commercial applications of microalgae. Journal of bioscience and bioengineering 101: 87-96

Wang B, Li Y, Wu N, Lan CQ (2008) CO(2) bio-mitigation using microalgae.

Applied microbiology and biotechnology 79: 707-718

本發明提供改良之微藻，在氮缺乏條件下其具有高脂質含量、可用海水與淡水培養、自然沉降、低附著力特性，可廣泛用於生質柴油生產、二氧化碳捕捉、食品及飼料生產。

本發明係將一株能夠累積大量油脂的原生藻種Chlamydomonas orbicularis CPC1，是一株從中臺灣河川出口篩選出的藻種，在實驗室的環境培養，油脂含量可達乾重的43%，而在戶外以50公升的光生物反應器培養，其平均油脂含量為20-30%。由於戶外培養具有不可控制之變因，例如光照不均、溫度過高、汙染等問題，造成油脂累積量減少、生長速度減緩，降低油脂產量，因此以紫外線突變策略來進行藻種改良。本專利主要是以紫外線輻射的方式針對CPC1藻種進行突變，再透過大量篩選的方式，找尋出提升油脂產量的突變藻種。紫外線輻射會對於生物體的DNA產生隨機性的突變，造成DNA斷裂或是形成胸腺嘧啶二聚体(thymine dimer)，使得DNA無法維持正常功能，改變基因的表現，進而影響生物體的代謝路徑與生理特性。由於突變藻種的數量龐大，為了要快速且準確的分析藻體油脂，本專利建立了Nile red螢光技術來進行油脂分析。Nile red是一種可以偵測脂質的螢光染劑，和中性脂質(neutral lipid)結合之後，會 被530nm的光激發，放射出580nm的螢光。相較於使用氣相層析儀(gas chromatography)分析藻體油脂，雖然Nile red的準確度較低，但其優點是操作迅速、低成本、前處理時間短、所需樣本體積小，因此適合用做為大規模的篩選與分析。

本發明提供一種微生物之生物培養物，其中該微生物為Chlamydomonas orbicularis CPC1215，使用1L光反應器養殖，採用Bold’s Basal Medium(BBM)培養液並添加人工海鹽培養，通入2% CO2，光源為TL5燈管光照強度150μmol/m2/s，其油脂含量最佳可達51.8%，油脂產率9天可達121.8mg/L/day；在高溫35℃誘導下，油脂產率可達140.8mg/L/day，此外CPC1215具有可使用新鮮海水或人工海水養殖，沉降速度快與低黏附力的特性，有利於大量養殖，可應用於植藻減碳與能源生產等方面。

本發明另提供一種油脂合成之方法，其包含前述之培養物之油脂。

本發明另提供一種生質柴油合成之方法，其包含前述之培養物之生質柴油。

本發明另提供一種食品，其包含前述之培養物。

本發明另提供一種飼料，其包含前述之培養物。

第1圖係藻株之篩選流程；第2圖係CPC1人工海水養殖對於CPC1之生物量影響；第3圖係藻體濃度(OD680)與Nile red螢光強度的線性關係；第4圖係CPC1與突變藻種之Nile red螢光強度比較(250ml光生物反應器培養)； 第5圖係CPC215突變藻種與野生型CPC1之生長速率比較；第6圖係CPC215突變藻種與野生型CPC1之油脂蓄積能力比較；第7圖係CPC1215突變藻種高溫培養之生長速率比較；第8圖係CPC1215突變藻種高溫培養之油脂蓄積能力比較；第9圖係CPC1215突變藻種外表型與Nile Red染色顯微鏡觀察結果；第10圖係CPC1215突變藻種黏附力較低之觀察結果；第11圖係CPC1215突變藻種較野生型CPC1沉降速度較快；

篩選具高油脂含量之本土微藻Chlamydomonas orbicularis CPC1

本專利從海水環境中所得到的藻種進行純化分離的步驟，如第1圖所示，其中分離純化的方法採用序列稀釋(serial dilution)之方式，得到純化藻株後利用18S rRNA與rbcL基因體序列進行藻種鑑定。18S DNA之PCR擴增引子正向為CCA TGC ATG TCT AAG TAT AAA CTG CT(SEQ ID NO：1)，反向為TAG GTG GGA GGGTTT AAT GAA CTT(SEQ ID NO：2)，將取得之序列在GenBank中比對序列比對結果如SEQ ID NO：5所示，登錄號KF383269。rbcL之PCR擴增引子正向為GTT CAA AGC CGG TGT AAA AGA C(SEQ ID NO：3)，反向為CAT ACG TGA ATA CCA CCA GAA GCA(SEQ ID NO：4)，將取得之序列在GenBank中比對序列比對結果如SEQ ID NO：6所示，綜合兩種基因在GenBank資料庫序列比對結果，與Chlamydomonas orbicularis SAG 11-19最相近，且外表型與Chlamydomonas相符，命名為Chlamydomonas orbicularis CPC1。

CPC1可使用淡水與海水培養

本研究首先利用淡水及海水(鹽度為3~3.5%)配置BBM培 養基並通以2%之CO2對CPC1進行培養，探討鹽度對其生物量及油脂累積之影響。如第2圖所示，於海水環境培養之CPC1生長天數為11天，生物量最高可達1.42g/L，而在淡水環境培養後生長天數為14天左右，生物量較海水更為良好，可達2.32g/L；如第1表所示另外在油脂累積方面，利用海水對CPC1進行培養所得到的含油率及產油率均較淡水養殖高，最高可達43.39%及64mg/L/d。此外，以人工海水、天然海水、新鮮海水(儲存時間低於1週)，均可成功培養CPC1，養殖量為50L。

CPC1紫外線突變技術

將CPC1經由BG-11固態培養基，挑選藻落將其轉入BBM培養液進行前培養，至指數生長期(exponential phase)之後，取5ml藻液移至無菌的培養皿，進行紫外線突變。本專利使用6W短波長(254nm)紫外線燈，燈源與藻液的距離為12.5公分，照射時間為兩分鐘。UV光照射完畢後，將藻液避光24小時，之後再將藻液稀釋1000倍並塗抹於BG-11固態培養基。

Nile red(尼羅紅)螢光染色技術檢測藻體油脂

將CPC1藻液培養7至12天，待其累積油脂之後，以20%乙醇稀釋至固定OD680濃度，總體積為1ml，再加入1μL的Nile red染劑(0.1 mg/ml、配製在丙酮當中)，在室溫以100rpm、10分鐘混合均勻。染色過程中全程以錫箔紙包覆樣品，以避免光線照射造成染劑失去活性。完成染色後，將樣品移至螢光光譜儀專用之石英管，以螢光光譜儀偵測螢光強度(excitation wavelength：530nm；emission wavelength：580nm)。第3圖係將CPC1藻液稀釋成不同濃度之後，以Nile red染色所測得之螢光結果，藻體的濃度與螢光強度呈線性關係，其R平方值(R square)為0.9998，顯示具有高度的線性相關。由於Nile red螢光是高敏感度的檢測技術，本專利發現，OD680若高於0.2，由於細胞濃度太高，會造成螢光數值不穩定，無法精確定量，經評估實驗皆以OD680=0.06~0.1的範圍來進行Nile red螢光測定。

微藻脂肪酸組成份、含油率與產油率分析方法

微藻脂肪酸組成之分析，首先取乾藻粉，加入0.5N氫氧化鉀(KOH)的甲醇(methanol)溶液，以超音波破碎機破碎藻細胞，再將破碎完全的藻液進行皂化反應，之後添加甲醇進行轉酯化反應，再將反應完全的產物(FAME)以氣相層析儀分析油脂總量與組成，進而推估藻體之油脂含量，以重量百分比表示為含油率。含油率(%)與生物質產率(g/L/day)相乘，計算出產油率為每天每公升培養液中可生產的油脂重量。檢量線之建立乃將脂肪酸甲酯標準品(包括C14：0、C16：0、C16：1、C18：0、C18：1、C18：2、C20：5以及C22：6等)以n-hexane混合，使用氣相層析儀分析得各脂肪酸甲酯滯留時間，藉以鑑定藻油之組成。

CPC1215突變藻種之篩選流程與產油率測定

紫外線突變藻種先以5ml BBM培養於玻璃試管中，在室溫下以60rpm旋轉，培養10-14天之後，以Nile red螢光技術檢測油脂含量，挑選螢光強度高於原生種之突變藻種共16株，進行第二階段的測試，以250ml之光生物反應器培養，以BBM加2%人工海鹽為培養液，培養7天之後， 以氣相層析儀分析其油脂含量，待確認其含油量高於野生型CPC1之後，再放大至1L的光生物反應器測試，培養液同樣為BBM添加2%海鹽。

250mL光生物反應器培養，以Nile red染色篩選出含油量較高的突變株五株後(第4圖)，經GC檢測FAME含量，挑選油脂含量最高的三株藻種(CPC1215/1218/1266)，進行1L光生物反應器的生長培育及油脂蓄積試驗結果如下敘述，第5圖顯示生長速率的比較結果，可看出CPC1215的生長速率最快，進入指數生長期後，其生物量(biomass)明顯高於野生型(CPC1)及其他突變藻種；在平原期也有同樣的情況，在第14天達到2.44g/L，比CPC1的2.24g/L增加8.9%。另外，CPC1218與CPC1266在平原期的生物量也高於野生型(CPC1)，在第14天分別為2.41與2.38g/L。CPC1215展現較佳的油脂蓄積能力的部分，不論是油脂蓄積的速率及總量，都高於野生型CPC1(第6圖)。在第9天的差異最為明顯，CPC1215的含油率為46.5%，相較於野生型CPC1含油率38.5%提升20.8%；第14天含油率突破50%，達到51.8%。由以上結果得知，CPC1215在生長速率及油脂含量皆比野生型CPC1有所提升。第2表是CPC1215產油率(lipid productivity)的計算結果，CPC1215的產油率明顯優於野生型(CPC1)與其他突變株(CPC1218/1266)，培養7天的產油率為118.8mg/L/day，比野生型CPC1提升35.3%；而在第9天可獲得最高的產油率，121.8mg/L/day，比野生型CPC1的93.2mg/L/day提升30.8%。CPC1215寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC980035。本發明使用CPC1215均與該寄存藻種相同。

第2表：CPC215突變藻種與野生型CPC1之脂質生產率分析

CPC1215高溫培育增加油脂累積

將培養溫度由原先的25℃提升至35℃，使用Bold’s basal medium(BBM)培養基，培養體積為1L，1.0%海水鹽度，碳源的部份則是使用2%二氧化碳，起始植藻量為0.305g/L。結果如第7圖所示，使用CPC1215突變藻種之生長速率並沒有受到高溫的抑制，在第11天的操作期間，使用室溫以及高溫培養，藻體濃度分別達到2.46g/L與2.51g/L。在油脂蓄積效能的部分，如第8圖在35℃培養的CPC1215不論是油脂蓄積速度或油脂含量都較高，在第7天的差異最為明顯，高溫培養No.215的含油量為42.5%，與室溫培養(38.4%)相比，提高了10.7%，相較於原生種的35.2%，提升了20.7%；第11天的含油量就已經達到51.0%。產油率的結果如第3表所示，高溫培養的油脂生產速率明顯較好，培養7天的產油率為140.8mg/L/day。

CPC1215低黏附力與沉降快速特性

CPC1215在培養過程中展現其低黏附性之表徵，如，以顯微 鏡觀察其外表型(第9圖)，發現突變株CPC1215細胞型狀較野生型CPC1圓，且進行Nile Red染色，突變株CPC1215所染到的油滴較明顯且數目較多。收取藻體時發現，突變株CPC1215的培養器皿上藻體殘留較少(第10圖)，進行3次以上實驗發現，突變株CPC1215對器皿黏附性較低。CPC1215相較野生型容易沉降如第11圖所示，室溫靜置5分鐘後，CPC1215較野生型沉降速率快。綜合以上觀察與試驗，CPC1215較野生型CPC1展現大量養殖優勢，容易收集可使用自然沉降，與產油率高之特點，Chlamydomonas orbicularis CPC1215具有商業化潛力。

以上透過各種實施方式充分說明本發明之可實施性及實施後結果，然此些敘述只是本發明中較佳的實施例，不能視為本發明的限制條件，本發明的具體權利範圍以本發明的申請權利範圍中所記載者為依歸。

【生物材料寄存】 國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

財團法人食品工業研究所

2015年1月6日申請

BCRC980035

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

無

<110> 台灣中油股份有限公司

<120> 新穎衣藻及其應用

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<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 18S正向引子

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引子

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 1786

<212> DNA

<213> 衣藻(Chlamydomonas orbicularis)

<223> 18S

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<211> 1127

<212> DNA

<213> 衣藻(Chlamydomonas orbicularis)

<223> rbc_L

<400> 6

Claims (7)

1. 一種微生物之生物培養物，其中該生物培養物係為經由紫外光突變而篩選所得之衣藻Chlamydomonas orbicularis CPC1215，其中該衣藻CPC1215係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 980035。
2. 依據請求項1所述之生物培養物，該衣藻CPC1215係指其rbcL序列與本發明提供之序列(SEQ ID NO：6)相同者。
3. 依據請求項2所述之生物培養物，該衣藻CPC1215油脂含量可達30%以上，產油率可達100mg/L/day以上。
4. 一種提高衣藻培養物油脂率之方法，其包含使用下述步驟培養衣藻Chlamydomonas orbicularis CPC1215以生產油脂：使該衣藻CPC1215受氮飢餓處理，並於溫度35℃以及海水鹽度1~3%培養7~11天，以得到生物量1.5g/L以上之產量，其中該衣藻CPC1215係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 980035。
5. 一種生產生質柴油之方法，其包含使用請求項1之微生物之生物培養物生產生質柴油。
6. 一種食品，其包含根據請求項1之微生物之生物培養物。
7. 一種飼料，其包含根據請求項1之微生物之生物培養物。