CN103468577B - 一株拟微绿球藻突变株及其应用 - Google Patents

一株拟微绿球藻突变株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株拟微绿球藻(Nannochloropsis？sp)及其应用，本发明的拟微绿球藻具有环境适应能力强，高温耐受能力强，油脂尤其是二十碳五烯酸含量高，对CO2的处理能力强的更加适于工业应用等优点，可用于生物柴油生产，食品、保健品、饲料、水产品饵料、药物的生产并可用于高温养殖。

Description

一株拟微绿球藻突变株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种拟微绿球藻突变株ENN11-3(Nannochloropsis sp)及其应用。
背景技术
随着世界化石燃料储备量的逐步耗竭，二氧化碳排放量的不断增加以及全球气候的日益趋暖，人类的生存和发展状况已经面临前所未有的挑战。因此，因此，世界各国都在积极寻找能够替代石油产品的可再生能源，其中，生物柴油就是一种重要的生物能源，然而，常见的油料作物例如玉米和大豆等培育周期较长，占用农田较多，会产生“与人争粮，与粮争地”问题，从而导致“解决了能源危机，却出现粮食危机”的尴尬结果。
微藻是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富，生长周期短，光合利用度高的以光合自养产生能量的低等植物，是自然界起源最早、分布最广、种类和数量最大的生物质资源。在一定条件下许多微藻能够在细胞中大量积累储藏性三酰甘油（微藻油）（类似于植物油），其最高含量可达到细胞干重的50%以上。与高等陆生油料作物相比，微藻的单位面积油产量是油料植物油产量的数十倍，经过生物冶炼可以生产生物柴油等多种生物燃料，被认为是最有可能最有潜力成为石油替代品的生物质资源。
除了油产量非常高之外，微藻还富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、各种氨基酸、维生素、抗生素、高不饱和脂肪酸以及其它多种生物活性物质，因此，在保健食品、医药和饲料等领域也同样具有很好的开发前景，例如，用于食料和医药业（人和动物的营养补充物：维生素、蛋白质、脂肪酸、多糖等）；提取化工产业如化妆品、精细化工产品等；作为能源产生沼气、燃料；用于饵料和饲料业（鱼虾、甲壳动物等水产动物的饵料（CN1742570）、家禽饲料等）；农业上作为土壤调节剂、肥料等。
拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.)是一种重要的海产经济微藻,其生长速度快，抗逆性强，脂肪酸组成简单,富含EPA，是一种非常有潜力的藻种。拟微绿球藻的最适生长温度为25℃～30℃，当温度超过35℃时，其生长完全被抑制，藻细胞会逐渐死亡。我国大部分地区夏季炎热高温，拟微绿球藻难以在夏季进行大规模养殖。如果能通过诱变获得耐受高温的藻株，将扩大该藻的应用范围，对我国拟微绿球藻养殖具有重要意义。
目前拟微绿球藻的研究和筛选工作已经展开，Ratnesh Chaturvedi和YujiFujita（A Isolation of enhanced eicosapentaenoic acid producing mutants ofNannochloropsis oculata ST-6using ethyl methane sulfonate induced mutagenesistechniques and their characterization at mRNA transcript level，PhycologicalResearch54:208–219,2006.）针对拟微绿球藻藻株的脂肪酸含量进行了筛选，但所筛选出来的藻株的高温耐受能力并没有显著提高，而且这一藻株是否能推广至室外培养也有待验证。杨官品等人（温度逆境处理提高拟微球藻(Nannochloropsis oculata)研究了温度逆境处理条件下拟微绿球藻藻株的脂肪酸含量变化，并没有得到高温耐受能力提升的藻株。
因此，在本领域中需要具有高温耐受能力的拟微绿球藻藻株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对环境适应能力强，高温耐受能力强，油脂含量高，对CO2的处理能力强的更加适于工业应用的拟微绿球藻。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
在第一方面，本发明提供了一种拟微绿球藻ENN11-3(Nannochloropsissp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期为2012年9月5日，保藏编号为CGMCC No.6446。
本发明提供的拟微绿球藻ENN11-3的生长耐受最高温度为42℃。。
本发明提供的拟微绿球藻ENN11-3可以在25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃下生长。
在第二方面，本发明提供了如第一方面所述的拟微绿球藻ENN11-3的培养方法，包括将拟微绿球藻藻株ENN11-3绿色细胞接种在海水培养基中，其中光照强度50-500μmol/m2.s，优选100-450μmol/m2.s，更优选150-400μmol/m2.s，还更优选200-350μmol/m2.s，最优选250-300μmol/m2.s；pH值7-9，优选7.5-8.5，更优选8；温度25-42℃，优选30-38℃；且在培养期内，通过向培养液中通入二氧化碳体积分数为1.5-2%的空气。
在本发明的拟微绿球藻ENN11-3的培养方法中，光照强度可以为50μmol/m2.s、80μmol/m2.s、100μmol/m2.s、120μmol/m2.s、150μmol/m2.s、180μmol/m2.s、200μmol/m2.s、220μmol/m2.s、250μmol/m2.s、280μmol/m2.s、300μmol/m2.s、320μmol/m2.s、350μmol/m2.s、380μmol/m2.s、400μmol/m2.s、420μmol/m2.s、450μmol/m2.s、480μmol/m2.s或500μmol/m2.s；pH值可以为7、7.2、7.5、7.8、8、8.2、8.5、8.8或9；温度可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃。
在第三方面，本发明提供了如第一方面所述的拟微绿球藻ENN11-3在脂肪酸生产中的应用，优选地，所述脂肪酸是癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸，优选为二十碳五烯酸。
在第四方面，本发明提供了如第一方面所述的拟微绿球藻ENN11-3在生物燃料生产中的应用，优选地，所述生物燃料是生物柴油或生物乙醇。
在第五方面，本发明提供了如第一方面所述的拟微绿球藻ENN11-3在环境保护中的应用，优选地所述环境保护为CO2减排。
在第六方面，本发明提供了如第一方面所述的拟微绿球藻ENN11-3在拟微绿球藻高温养殖中的应用，其中所述高温为35-42℃。
在第七方面，本发明提供了如第一方面所述的拟微绿球藻ENN11-3在癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸的药物的制备中的用途，优选地在制备包含二十碳五烯酸的药物中的应用。
在第八方面，本发明提供了如第一方面所述的拟微绿球藻ENN11-3在包含癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸的食品、保健品、饲料和/或水产品饵料生产中的用途。
在本发明中，海水培养基为本领域中最常用的藻类培养基，其具体组分见下文。
本发明的有益技术效果为：
1、本藻种性能稳定、环境适应性强，高温耐受能力强，适合产业化推广
2、本藻种油脂积累快，含油量高，适合用来生产生物柴油
3、本藻种二十碳五烯酸含量较高，适合用来生产相关药物、食品、保健品、饲料、水产品饵料等。
附图说明
图1是在室内柱式反应器中培养本发明的拟微绿球藻ENN11-3的温度曲线图。
图2是在室内柱式反应器中培养本发明的拟微绿球藻ENN11-3的干重变化曲线。
图3是在室内柱式反应器中培养本发明的拟微绿球藻ENN11-3的脂肪酸含量（占藻粉）变化图。
图4是本发明的拟微绿球藻ENN11-3进行室外管式高温养殖的温度变化曲线。
图5是本发明的拟微绿球藻ENN11-3进行室外管式高温养殖的干重变化曲线。
图6是本发明的拟微绿球藻ENN11-3进行室内板式高温养殖的温度变化曲线。
图7是本发明的拟微绿球藻ENN11-3进行室内板式高温养殖的干重变化曲线。
图8是本发明的拟微绿球藻ENN11-3进行室外板式高温养殖的脂肪酸含量（占藻粉）图。
图9是本发明的拟微绿球藻ENN11-3进行室外板式废气养殖的温度变化曲线。
图10是本发明的拟微绿球藻ENN11-3进行室外板式废气养殖的OD750变化曲线。
图11是本发明的拟微绿球藻ENN11-3进行室外板式废气养殖的脂肪酸含量（占藻粉）图。
发明详述
发明人已将所述藻株ENN11-3于2012年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，简称CGMCC)，其保藏号为CGMCC No.6446。
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1ENN11-3藻株的诱变筛选、室内养殖及油脂积累
取对数期的拟微绿球藻的新鲜无菌藻液进行单功能烷化剂甲基硝基亚硝基胍（MNNG）诱变处理和室外高温压力处理，铺设平板，挑取个体较大的单藻落共30株进入高温初筛和高温复筛，获得ENN11-3藻株。
将处在对数生长期的ENN11-3绿色游动细胞接种在配制好的海水培养基（配方见表1）中，使细胞密度达到OD750为0.8-1.2之间，以野生型ENN11为对照。培养过程光照强度控制在50-500umol/m2.s，在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2%的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间。培养所使用的反应器为40mm内径、长度600mm的柱式反应器。冷暖水机控温，室温25℃培养4天后，第五天温度升至白天38℃8小时，夜间30℃；从第6天起温度升至白天42℃6小时，其余时间30℃（温度变化如图1所示）。培养过程中，定时取样测定干重，结果见图2。培养进行到第15天，将藻液收集，通过离心或自然沉降的方法获得藻泥，将藻泥再进行真空冷冻干燥。
表1
Fe-EDTA溶液：将2.76g FeCl3.6H2O溶于1000mL0.05M Na2EDTA溶液微量元素溶液
干燥完成后，测定其油脂组分含量如下表2，分析方法如下：
1）脂肪酸提取：
取50mg或100mg冻干藻粉放置在具Telfnon螺口瓶盖的体积为15-20ml的小玻璃瓶中,再放置一小磁力棒,加入2-4ml10%DMSO-Methanol溶液,40℃砂浴(盛砂的烧杯放置恒温加热磁力搅拌器上)5分钟;然后在4℃下磁力搅拌抽提30分钟,3500转离心,转移上清液到另一小瓶中。剩下藻渣再加入1:1的***、正己烷4-8ml4℃下磁力搅拌抽提1小时,3500转离心,转移上清液到上述一小瓶中。可重复上述过程直到藻渣变白。在上述合并抽提液中加入纯水使四者(水、DMSO-Methanol、***、正己烷)体积比例为1:1:1:1,震荡分相,移取有机相转移到另一小玻璃瓶中,在通风橱中用氮气吹至成浓缩液，然后转移到事先称重过的1.5ml塑料离心管中,再用氮气吹干至恒重。
2）脂肪酸分析：
照上面方法进行提取后，用正己烷溶解，使用Agilent6820气相色谱仪进行气相色谱分析（色谱条件为载气：氮气流量1ml/min、氢气流量30ml/min、空气流量300ml/min，进样口温度：280℃，检测器温度：280℃，检测器类型：FID，色谱柱：DB-5毛细管色谱柱（30m×0.25mm，0.25μm），分流比：4：1。分析方法：内标法（气相色谱用氮气作载气，相当于液相色谱的流动相）。
如图2所示，加高温后野生型对照株ENN11生长明显变缓，培养至第10天野生型对照株ENN11变黄死亡，而突变株ENN11-3虽生长也受到影响，但还能缓慢生长，没有死亡，表现出明显的耐高温优势。培养至第9天时，突变株ENN11-3的脂肪酸含量和EPA含量相比野生株都有一定程度的提高。之后野生对照株死亡，突变株ENN11-3的脂肪酸含量和EPA含量在高温逆境下积累虽然受到一定影响，但还能有效积累。培养第13天时突变株ENN11-3的总脂肪酸含量和EPA含量达到最高，第15天有所下降（图3）。
表2气相色谱测定的ENN11-3第13d收集样品的总脂组分：
脂肪酸组分分析显示，其油脂含量高达41.1%，其中约75.5%为C16-C18脂肪酸，65.3%为C16脂肪酸，10.2%为C18脂肪酸，不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的37.4%，可以作为生物柴油的生产原料。由此可见，本发明的藻株ENN11-3可用于生物柴油生产。
ENN11-3的不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的37.4%，多不饱和脂肪酸含量占脂肪酸总量的12.7%，其中EPA含量占脂肪酸总量的4.5%，不饱和脂肪酸含量丰富，可用于多不饱和脂肪酸的生产。
实施例2ENN11-3藻株的室外管式高温养殖
将处在对数生长期的藻种接种在60*5cm管式反应器中，使用海水培养基进行养殖，以野生型ENN11作对照，每藻株设置两个平行样，置于室外冷暖水机控温自然光照进行高温养殖。培养期间条件如下：培养前5天为自然温度，24小时温度变化范围主要在17-37℃之间。培养至第6天开始加高温，白天温度多维持在40℃左右，夜间温度基本也维持在25℃以上（图4）。9:00-17:00的光照变化范围阳面主要在300-800umol/m2/s之间，背光面基本小于200umol/m2/s。通入一定比例的CO2(纯度95%以上)，控制pH值在7-9之间。培养过程中间断取样测定干重（图5）。
培养至第10天，由于高温处理压力过大，两株藻株均变黄死亡。培养前5天两株藻干重相差不大，从第6天加高温开始，突变株ENN11-3的生物量明显高于野生株ENN11。加高温的第5-9天，突变株ENN11-3的平均干重增长速度为0.345g/(L*d)，而野生株ENN11为0.131g/(L*d)，突变株在高温下的生长速度是野生株的2.63倍，表现出较强的耐高温能力。
实施例3  ENN11-3拟微绿球藻的室内养殖及油脂积累
实施例3  ENN11-3藻株的室外板式高温养殖
将处在对数生长期的藻种接种在50*50*5cm板式反应器中，使用海水培养基进行养殖，以野生型ENN11作对照，置于夏季室外自然高温条件进行生长培养，培养期间条件如下：培养周期为11天，9:00-17:00的温度变化范围主要在35-40℃之间，夜间温度多在25℃左右（图6）。9:00-17:00的光照变化范围阳面主要在500-1000umol/m2/s之间，背光面光强基本在300umol/m2/s左右。通入一定比例的CO2(纯度95%以上)，控制pH值在7-9之间。培养过程中间断取样测定干重（图7）。培养第8天收集部分藻液，通过离心或自然沉降的方法获得藻泥，将藻泥再进行真空冷冻干燥，取适量藻粉进行气相色谱分析，方法同实施例1，脂肪酸在藻粉中含量见图8。
室外板式高温养殖藻液温度最高多维持在35℃左右，最高达到40℃，在此温度条件下，突变株ENN11-3较野生型ENN11的优势比较明显。突变株ENN11-3的平均干重增长速度为0.272g/(L*d)，而野生株ENN11为0.221g/(L*d)，ENN11-3板式平均生长速度比ENN11提高23.1%。培养8天ENN11-3的EPA百分含量为4.08%，总脂百分含量为12.66%，相比之下野生株ENN11分别为3.58%和11.99%。
本实施例中没有实施措施诱导脂肪酸的积累，如采取相应措施，脂肪酸含量会达到更高的水平。
实施例4  突变株ENN11-3高含CO2的废气养殖
将处在对数生长期的藻种接种在50*50*5cm板式反应器中，使用海水培养基进行养殖（不添加C源），置于室外自然条件进行生长培养，培养期间自然条件如下：实验过程中，9:00-17:00温度多维持在30-35℃之间，夜间多维持在20℃左右（图9）。9：00-17：00光照强度变化范围阳面主要在500-1000μmol/m2/s，背光面光强基本在300μmol/m2/s左右。通入一定比例的CO2(化工厂废气，纯度95%以上)，控制PH值在6.9-8.1之间。培养过程中间断取样测定生物量（图10）。培养第7天收集部分藻液，通过离心或自然沉降的方法获得藻泥，将藻泥在进行真空冷冻干燥，取适量藻粉进行气相色谱分析，方法同实施例1，脂肪酸在藻粉中含量见图11。
本实施例中没有实施措施诱导脂肪酸的积累，养殖7天脂肪酸含量达到15.462%，EPA含量达到3.611%。如采取相应措施，脂肪酸含量会更高。
本实施例中使用废气养殖13天，突变株ENN11-3养殖状况良好。在0-9天连续培养中，产量平均可达20.7g/m2/d。本实施例中微藻培养时培养基中没有添加C源，藻体生长固定的CO2来自培养过程中通入的一定比例的CO2(CO2来源于化工厂，纯度95%以上)，以每吨藻约可固定2吨CO2（黄英明,王伟良,李元广,谢静莉,范建华,陶黎明.微藻能源技术开发和产业化的发展思路与策略,生物工程学报,2010,26(7):907-913），本实施例中突变株ENN11-3可实现CO2减排41.4g/m2/d。
实施例5  突变株ENN11-3用于营养品、饲料、饵料的生产
本发明提供的藻株中的蛋白质含量为20～30%，脂肪含量为40～60%，其中不饱和脂肪酸的含量占总脂肪酸含量的35%-50%，是做营养品、饲料、饵料的最佳原料来源。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用条件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (17)

1.一种拟微绿球藻ENN11-3(Nannochloropsis sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2012年9月5日，保藏编号为CGMCC No.6446。
2.如权利要求1所述的拟微绿球藻ENN11-3的培养方法，所述方法包括将拟微绿球藻藻株ENN11-3绿色细胞接种在海水培养基中，其中光照强度50-500μmol/m2.s；pH值7-9；温度25-42℃；且在培养期内，通过向培养液中通入二氧化碳体积分数为1.5-2％的空气。
3.如权利要求2所述的拟微绿球藻ENN11-3的培养方法，其特征在于，所述的光照强度为100-450μmol/m2.s。
4.如权利要求3所述的拟微绿球藻ENN11-3的培养方法，其特征在于，所述的光照强度为150-400μmol/m2.s。
5.如权利要求4所述的拟微绿球藻ENN11-3的培养方法，其特征在于，所述的光照强度为200-350μmol/m2.s。
6.如权利要求5所述的拟微绿球藻ENN11-3的培养方法，其特征在于，所述的光照强度为250-300μmol/m2.s。
7.如权利要求2所述的拟微绿球藻ENN11-3的培养方法，其特征在于，pH值为7.5-8.5。
8.如权利要求7所述的拟微绿球藻ENN11-3的培养方法，其特征在于，pH值为8。
9.如权利要求2所述的拟微绿球藻ENN11-3的培养方法，其特征在于，温度为30-38℃。
10.如权利要求1所述的拟微绿球藻ENN11-3在脂肪酸生产中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述脂肪酸是癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸。
12.如权利要求1所述的拟微绿球藻ENN11-3在生物燃料生产中的应用。
13.如权利要求1所述的拟微绿球藻ENN11-3在环境保护中的应用。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述环境保护为CO2减排。
15.如权利要求1所述的拟微绿球藻ENN11-3在拟微绿球藻高温养殖中的应用，其中，所述高温为35-42℃。
16.如权利要求1所述的拟微绿球藻ENN11-3在制备包含癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸的药物中的应用。
17.如权利要求1所述的拟微绿球藻ENN11-3在包含癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸和/或二十碳五烯酸的食品、保健品、饲料和/或水产品饵料生产中的用途。
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