CN104611228B - 一种富含油脂的单针藻及其培养应用 - Google Patents

一种富含油脂的单针藻及其培养应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种富含油脂的单针藻及其培养应用，藻株为SS‑B1，其分类命名为单针藻（Monoraphidium sp），已于2013年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC No. 7479。该藻株能够耐受高浓度的CO2和SO2，可以利用含CO2和SO2的废气或烟气进行光照自养生长获取富含油脂的生物质，固碳效率高，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上，能够进行生物柴油的生产。

Description

一种富含油脂的单针藻及其培养应用
技术领域
本发明属于生物技术和生物能源领域，具体涉及一种耐受CO2和SO2的富含油脂的单针藻及其培养应用。
背景技术
由于化石能源的日趋减少和使用化石能源造成温室效应的增加，越来越多的科研工作者把目光集中到可再生能源的开发和利用上。生物质能作为地球上最重要的可再生能源，它包括林业生物质、农作物、水生植物、农业废弃物等。在诸多的生物质能源中，微藻是重要的可再生资源。它们具有分布广泛、生物量大、光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物量产量高等特点。其细胞中含独特的初级或次级代谢产物，化学成分复杂。微藻的太阳能转化效率可达到3.5%，是生产药品、精细化工品和新型燃料的潜在资源，从微藻中得到的脂肪酸可转化成脂肪酸甲脂，即生物柴油。
随着世界经济的发展，大量的化石能源的使用和消耗，导致能源的短缺和环境的日益恶化，特别是CO2的急剧增加引起的温室效应越来越严重，除此之外来自石油和化工行业的工业废气中，除了含有高浓度CO2气体（15v%-30v%）外，SOx 、NOx 等酸性气体的浓度也很高。微藻的生长周期短、光合效率高，CO2固定效率高，一定条件下可达陆生植物的10 倍以上，不仅可以减少CO2排放，同时也降低了培养成本；除CO2外，废气中的一些SOx、NOx 等成分也随着微藻的代谢被净化处理，有效减少有害气体排放，因此利用微藻油脂作为原料生产的生物柴油是目前最有可能满足世界运输所需燃料的可再生能源。
但是实际应用中，当环境中CO2体积分数大于5v%时，大部分微藻的生长将受到抑制，影响固碳效率；而通入的化石燃料废气中含有高浓度的SOx、NOx 等气体也会抑制微藻生长和降低固碳效率。目前对于小球藻、栅藻等产油微藻研究的较多。CN20110144545.6公开了一株栅藻藻株，该藻株的生长可利用人工培养基或经适当处理的废水生长，其特点是油脂产率高于目前大多数分藻株，该藻株应用领域包括CO2的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸的生产。CN20120154470.4公开了一株富油海洋微藻微拟球藻(Nannochloropsis gaditana )藻株及其应用，该藻株可在pH=4.5的环境下正常生长，其油脂含量可达35%。CN20111019480.X公开了一株微藻藻株（Mychonases sp .）及其用于生产生物柴油的应用，利用该藻株可生产高附加值的多不饱和脂肪酸，包括亚麻酸 C18:3和神经酸C24:1，其在获得生物柴油的同时，获得高附加值的副产品。CN102703326A公开了一种高CO2耐受性和固定率的微藻及其选育方法，但该专利所提供的藻株并未涉及该菌株的油脂含量。
刘平怀等（有机碳源对单针藻细胞生长、油脂积累和光合作用的影响，生物工程,2012, 33(18): 224-246）介绍了利用有机碳源培养单针藻的一种生产方式，培养结束虽然生物量超过了10g/L，但该种方式为单针藻异养培养方式，培养过程中利用葡萄糖等有机碳源来实现细胞生长，这种培养方式没有利用CO2等无机碳源经济，而且有机碳源的加入，在培养过程易产生染菌问题，影响藻细胞的生长。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种富含油脂的单针藻及其培养应用。本发明的单针藻能够耐受高浓度的CO2和SO2，可利用含CO2和SO2的废气或烟气进行光照自养生长获取生物质，固碳效率高，所获取的生物质中富含油脂，能够进行生物柴油的生产。
本发明富含油脂的的藻株SS-B1，其分类命名为单针藻（Monoraphidium sp），已于2013年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 7479。
本发明富含油脂的单针藻的选育方法，包括如下步骤：
（1）获得纯化的出发藻株SS-1；
（2）通入含CO2气体对出发藻株进行驯化，CO2含量从5v%逐级提高至40v%；
（3）将步骤（2）中驯化培养的藻液采用平板划线的方式培养，获得纯藻株；
（4）将步骤（3）的纯藻株培养至对数生长期，通入含CO2和SO2的混合气进行驯化，CO2含量为20v%，SO2含量从50×10-6（v/v）逐级提高到450×10-6（v/v）；
（5）将步骤（4）驯化得到的藻液采用平板划线的方式进一步培养，获得目的藻株SS-B1。
本发明中，步骤（2）中CO2含量每次提高5v%。步骤（4）中SO2含量每两天提高100×10-6（v/v）。
本发明的单针藻在固定CO2中的应用。该藻株能够耐受高达40v%的CO2浓度，具有较高的CO2固定效率。
本发明的单针藻在生产微藻油脂中的应用。该单针藻在适宜的生长条件下，细胞总脂含量可占细胞干重的40%以上，能够进行生物柴油的生产。
本发明的单针藻在利用含CO2和SO2的废气或烟气生产微藻油脂同时固定CO2中的应用。该藻株可以利用含CO2和SO2的废气或烟气进行光照自养生长获取富含油脂的生物质，废气或烟气中CO2含量不超过40v%，SO2含量不超过450×10-6（v/v）。该藻株可以利用BG11、SE等淡水培养基培养，培养的光照强度1500Lux-10000Lux，pH值为6-10，温度为15-40℃下培养，培养7天进入稳定期；培养结束后，收获的藻细胞经检测，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上。
与现有技术相比，本发明可以带来以下有益效果：
1、本发明选育的单针藻能够耐受高浓度的CO2和SO2，可以利用废气中的CO2进行自养生长，固定CO2，缓解目前工业社会带来的温室效应问题；同时能够耐受废气中的SO2，避免了微藻利用废气生长时高浓度的SO2对微藻光合作用的抑制，维持微藻的正常生长。
2、该藻株的生长速率快，生长周期短，仅为7天左右，所含的总脂含量高，适于生产生物柴油，可以解决生物柴油生产的油脂来源的问题。
3、该藻种培养稳定期后沉降迅速，12小时内，沉降基本完全，容易收集。
生物材料保藏说明
本发明提供的单针藻SS-B1（Monoraphidium sp）藻株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 7479；保藏日期：2013年4月15日。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。本发明中，v%为体积分数。
实施例1 分离和驯化筛选获得单针藻SS-B1
（1）出发藻株的获得：2011年10月从黑龙江杜博尔特蒙古族自治县寿山休闲度假村龙虎湖取回水样50mL，将水样接种到200mL的BG11培养基中进行富集培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为25℃，光暗周期为24h，光暗时间比为14:10，培养约半个月后，培养基呈现绿色。将富集培养的水样稀释至10-5倍，在无菌条件下涂布到BG11固体平板上培养，培养的光照强度为5000Lux，温度为25℃，培养约10天后平板上出现绿色的单藻落，挑取单藻落在摇瓶上培养，培养温度为25℃，光照强度为5000Lux，培养10天后，显微镜观察确定是否为纯藻种，若不是纯种，重复上述步骤，直到确定为纯培养藻株为止。经过反复培养，获得纯藻株编号为SS-1。
（2）CO2的驯化培养：将步骤（1）中的摇瓶培养的纯藻种接入微藻通气培养装置中进行驯化培养，光照强度为5000Lux，温度为25℃，通入的气体中CO2的含量从5v%逐级提高至40v%，每次提高5v%，培养10天后结束，反复驯化培养3次。
（3）将步骤（2）中驯化培养的藻液采用平板划线的方式培养获得纯藻种，培养步骤同（1）。
（4）SO2的驯化培养：将步骤（3）藻株的对数生长期的藻液通入CO2含量为20v%的混合气，培养光照为5000Lux，温度为25℃，混合气中注入SO2气体对藻种进行SO2的耐受性培养，培养过程中混合气中SO2的含量从50×10-6（v/v）逐级提高到450×10-6（v/v），培养过程中每两天提高100×10-6（v/v），培养10天结束，反复驯化培养3次，收获耐受SO2的藻液。
（5）将步骤（4）驯化得到的藻液采用平板划线的方式获得纯藻落，培养步骤同（1），培养结束后，挑选较大的藻落进行摇瓶培养，获得目的藻株命名为SS-B1。
实施例2 藻株的鉴定
获得的SS-B1藻细胞的DNA的提取采用CTAB法，并采用18S rDNA基因克隆，将得到的3个阳性克隆送至上海生工公司测序。18S rDNA基因测序分析结果见序列表。将18S rDNA序列登录到Genbank数据库进行Blast比对，结果显示与Monoraphidium sp.有最大的相似性，其BLASTn值为2586，Max index值为99%，可以确定SS-B1为单针藻（Monoraphidium sp.）。
单针藻SS-B1为一种淡水绿藻，藻细胞为长叶形，绿色，藻种长为10-20μm，宽2-4μm，内含色素。平板藻落形态为S形，深绿色。
实施例3 单针藻SS-B1的应用
将对数生长期的SS-B1的藻液接种在BG11培养基中进行培养，BG11培养基的配方见表2和表3，培养在实验室自制的柱式反应器（内径为40mm，高度为500mm）中进行，接种后的密度OD690为0.2。从反应器底部通入CO2含量为30v%的烟气，其中SO2含量为400×10-6（v/v）。培养过程中光照强度为5000Lux，培养温度为28℃，pH值控制在7-9之间，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为7天处于稳定期。结束培养，离心收集藻液，冻干后测量干重，计算生物质产量，并采用正己烷：乙酸乙酯法测得总脂含量。测得培养7天的SS-B1藻株的生物质产量为5.1346g/L，细胞总脂含量占细胞干重的 45.63%。
表2 BG11培养基。
*表3 表1中A5+Co solution的组成。
实施例4 SS-B1和SS-1的生长效果的比较
将对数生长期的SS-B1和SS-1的藻液分别接种在BG11培养基进行培养，培养在实验室自制的柱式反应器（内径为40mm，高度为500mm）中进行，接种后的密度调整为OD690为0.2。根据试验需要，组配不同含量的CO2和SO2混合气，然后从反应器底部通入。培养过程中光照强度为5000Lux，培养温度为28℃，pH值控制在7-9之间，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，培养时间为10天，培养结束后收集藻细胞，测定细胞干重，结果如下表4。从结果可以看出，经过驯化筛选的SS-B1比初始藻株SS-1对CO2和SO2有较好的耐受性。
实施例5 SS-B1沉降效果检测
将培养7天后处于稳定期的SS-B1藻液静置大约12小时，上清液清澈，基本上所有藻细胞都沉降到容器底部，说明SS-B1易于沉降，比较容易收集。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国石油化工股份有限公司
中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院
<120> 一种富含油脂的单针藻及其培养应用
<130> 新专利申请
<160> 1
<170> Patent In version 3.5
<210> 1
<211> 1412
<212> DNA
<213> Monoraphidium sp
<400> 1
gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataaa ctgcttatac 60
tgtgaaactg cgaatggctc attaaatcag ttatagttta tttgatggta cctctacacg 120
gataaccgta gtaattctag agctaatacg tgcgtaaatc ccgacttctg gaagggacgt 180
atttattaga taaaaggccg accgagcttt gctcgacccg cggtgaatca tgataacttc 240
acgaatcgca tagccttgtg ctggcgatgt ttcattcaaa tttctgccct atcaactttc 300
gatggtagga tagaggccta ccatggtggt aacgggtgac ggaggattag ggttcgattc 360
cggagaggga gcctgagaaa cggctaccac atccaaggaa ggcagcaggc gcgcaaatta 420
cccaatcctg atacggggag gtagtgacaa taaataacaa taccgggcat ttaatgtctg 480
gtaattggaa tgagtacaat ctaaatccct taacgaggat caattggagg gcaagtctgg 540
tgccagcagc cgcggtaatt ccagctccaa tagcgtatat ttaagttgtt gcagttaaaa 600
agctcgtagt tggatttcgg gtgggttcca gcggtccgcc tatggtgagt actgctgtgg 660
ccctcctttt tgtcggggac gggctcctgg gcttcattgt ccgggactcg gagccgacga 720
tgatactttg agtaaattag agtgttcaaa gcaagcctac gctctgaata ctttagcatg 780
gaatatcgcg ataggactct ggcctatctc gttggtctgt aggaccggag taatgattaa 840
gagggacagt cgggggcatt cgtatttcat tgtcagaggt gaaattcttg gatttatgaa 900
agacgaacta ctgcgaaagc atttgccaag gatgttttca ttaatcaaga acgaaagttg 960
ggggctcgaa gacgattaga taccgtcgta gtctcaacca taaacgatgc cgactaggga 1020
ttggaggatg ttcttttgat gacttctcca gcaccttatg agaaatcaaa gtttttgggt 1080
tccgggggga gtatggtcgc aaggctgaaa cttaaaggaa ttgacggaag ggcaccacca 1140
ggcgtggagc ctgcggctta atttgactca acacgggaaa acttaccagg tccagacata 1200
gtgaggattg acagattgag agctctttct tgattctatg ggtggtggtg catggccgtt 1260
cttagttggt gggttgcctt gtcaggttga ctccggtaac gaacgagacc tcggcctgct 1320
aaatatgtca cattcgcttt ttgcggatgg ccgacttctt agagggacta ttggcgttta 1380
gtcaatggaa gtatgaggca ataacaggtc tg 1412

Claims (6)

1.一种富含油脂的单针藻，藻株为SS-B1，其分类命名为单针藻（Monoraphidium sp），已于2013年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC No. 7479。
2.根据权利要求1所述的单针藻在固定CO2中的应用。
3.根据权利要求1所述的单针藻在生产微藻油脂中的应用。
4.根据权利要求1所述的单针藻在利用含CO2和SO2的废气或烟气中生产微藻油脂同时固定CO2中的应用。
5.根据权利要求1所述的单针藻的应用，其特征在于：该藻株可以利用含CO2和SO2的废气或烟气进行光照自养生长获取富含油脂的生物质，废气或烟气中CO2含量不超过40v%，其中v%为体积分数，SO2含量不超过450×10-6（v/v）。
6.根据权利要求5所述的单针藻的应用，其特征在于：该藻株可以利用BG11或SE淡水培养基培养，培养的光照强度1500Lux-10000Lux，pH值为6-10，温度为15-40℃下培养，培养7天进入稳定期；培养结束后，收获的藻细胞经检测，细胞总脂含量占细胞干重的40%以上。
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