CN105543099A - 一株油球藻Graesiella sp.WBG-1及分离筛选方法和应用 - Google Patents

一株油球藻Graesiella sp.WBG-1及分离筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株油球藻<i>Graesiella</i>？sp.？WBG-1及分离筛选方法和应用。该藻株生长快、对pH变化适应性强，还具有细胞大、易沉降、抵抗原生动物吞食等适合进行大规模培养的特性。所述油球藻<i>Graesiella</i>？sp.？WBG-1在低氮培养条件下细胞中积累大量油脂，可以作为微藻生物柴油原料，在高氮培养条件下细胞中积累大量蛋白质，可用于微藻蛋白质的生产，在较高pH条件下培养，能够高效率地固定外源二氧化碳，可以应用于烟道气二氧化碳的生物固定。

Description

一株油球藻Graesiella sp.WBG-1及分离筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及微藻资源、能源及环保领域，更具体地涉及一株油球藻Graesiellasp.WBG-1，同时还涉及一株油球藻Graesiellasp.WBG-1的分离筛选方法，还涉及一株油球藻Graesiellasp.WBG-1在微藻生物柴油原料、微藻蛋白质生产、微藻固定外源二氧化碳方面的用途。
背景技术
微藻在自然界分布广泛，种类繁多，可以生产多种多样的代谢产物。分离、筛选优良藻种，研发微藻的新用途和生产的新工艺，是微藻生物技术研究的主要任务。20世纪60年代，日本实现了小球藻(Chlorella)的大规模培养生产(TsukadaandKawahara,1977,BiologicalSolarEnergyConversion363–365)。到目前，螺旋藻Spirulina(Shimamatsu,2003,Hydrobiologia512:39-44)、杜氏盐藻Dunaliella(Oren,2005,AquaticBiosystems1(1):2-15)、红球藻Haematococcus(BoussibaandVonshak,1991,Plant&CellPhysiology32(7):1077-1082；Gómez,Inostrozaetal.,2013,AobPlants5(1):026-038.)等微藻均实现商业化生产，微藻生物技术已初具规模，并显示出巨大的应用潜力(Richmond,2004,Handbookofmicroalgalculture)。在食品领域，微藻可为人类提供优质藻源蛋白、不饱和脂肪酸、类胡萝卜素等营养物质(BoussibaandVonshak,1991,Plant&CellPhysiology32(7):1077-1082；Belay,Otaetal.,1993,AppliedPhycology5(2):235-241)；在医药卫生领域，科学家正从丰富的微藻资源中寻找新的抗生素、抗癌等药物(李健,张学成等,2012,科学通报1(1):23-31；Kim,Lietal.,2013,BmbReports47(8):433-438；Talero,Garcia-Maurinoetal.,2015,Marinedrugs13(10):6152-6209)。微藻是一类光合自养生物，微藻每年固定的CO2大约占全球净光合产量的40％(BrownandZeiler,1993,EnergyConversionandManagement34(9-11):1005-1013；JanssonandNorthen,2010,CurrentOpinioninBiotechnology21(3):365-371)，在能量转化和碳元素循环中起到举足轻重的作用，这使得微藻在二氧化碳减排和工业废水预处理领域具有广泛的应用前景(HuntleyandRedalje,2007,Mitigationandadaptationstrategiesforglobalchange12(4):573-608)。近年来，由于全球范围内大量使用不可再生的化石燃料，使化石燃料储存量急剧下降，能源危机正在步步逼近；同时温室气体CO2的过度排放引发的全球气候变化问题日益严重。在这种背景下，生物质可再生能源的研究得到了世界各国的重视。在这一领域，微藻有望成为继粮食作物生物乙醇、纤维素生物乙醇之后的新一代生物质能源原材料(Chisti,2008,TrendsinBiotechnology26(3):126-131；Waltz,2009,NatureBiotechnology27(1):15-18；WijffelsandBarbosa,2010,Science329(5993):796-799.)。
微藻作为生物柴油原料的研究始于20世纪60年代，具有代表性的研究项目如美国水生生物种计划(ASP)、日本地球研究更新技术计划等(Hu,Sommerfeldetal.,2008,PlantJournal54(4):621-639；GouveiaandOliveira,2009,JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology36(2):269-274)。上述研究项目的开展，为微藻生物能源技术开发奠定了坚实的基础。2005年前后，全世界范围内再一次掀起由美国、日本等发达国家引领的微藻生物燃料研究热潮，全球的众多科研机构纷纷开始从事微藻生物技术方面的研究(Amigun,Sigamoneyetal.,2008,RenewableandSustainableEnergyReviews12(3):690-711；Hammond,Kalluetal.,2008,AppliedEnergy85(6):506-515；Schenk,Thomas-Halletal.,2008,BioenergyResearch1(1):20-43；SteenberghenandLópez,2008,JournalofCleanerProduction16(5):577-590；UmandKim,2009,JournalofIndustrialandEngineeringChemistry15(1):1-7)，我国也先后启动“863”、“973”和“十二五”重大专项等开展相关研究(李涛,李爱芬等,2011,中国生物工程杂志31(004):98-105；李健,张学成等,2012,科学通报1(1):23-31；梅洪等,2008,植物科学学报6(6):650-660)。
尽管如此，微藻生物质燃料到目前为止还没有商业化生产的成功案例(SteenberghenandLópez,2008,JournalofCleanerProduction16(5):577-590；Stephens,Rossetal.,2010,TrendsinPlantScience；WijffelsandBarbosa,2010,Science329(5993):796-799)，导致这一现状的瓶颈问题有三个方面：1、微藻生物柴油成本居高不下，严重阻碍了微藻生物燃料的商业化生产(Torzillo,Pushparajetal.,2003,BiotechnologyandBioprocessEngineering8(6):338-348)，2、对微藻油脂合成积累的遗传调控、生理调控基础认识不深，微藻规模化培养的工程技术基础薄弱等等(WijffelsandBarbosa,2010,Science329(5993):796-799；李健,张学成等,2012,科学通报1(1):23-31)；3、缺乏易培养、生长快、环境耐受度高、适合大规模培养的优质藻种(Beal,Smithetal.,2011,Bioenergyresearch4(1):36-60；Liu,Chenetal.,2011,ProgressinNaturalScience:MaterialsInternational21(4):269-276；李涛,李爱芬等,2011,中国生物工程杂志31(004):98-105；Li,Pribyletal.,2013,BiotechnologyandBioengineering110(1):97-107；Guccione,Biondietal.,2014,BiotechnologyforBiofuels7(1):84)。在微藻生物技术领域，优质藻种是一切后续研发工作的重要基础。全球微藻物种约有几十万种甚至更多,但其中为人类发现并记载的仅有3.5万种(Metting,1996,JournalofIndustrialMicrobiology17(5-6):477-489；Leliaert,Smithetal.,2012,CriticalReviewsinPlantSciences31(1):1-46)，而目前全球范围内实现商业化生产的微藻不超过10种。从丰富的自然微藻资源中寻找优质藻种，有望解决目前微藻大规模培养生产中遇到的产率低、易污染、采收能耗高、环境适应性差等问题，是降低微藻生物质生产成本的有效途径(Stephens,Rossetal.,2010,TrendsinPlantScience；WijffelsandBarbosa,2010,Science329(5993):796-799)。
利用工业废气中的CO2为碳源培养产油微藻，既能降低产油微藻的碳源成本，又能在生产微藻生物柴油的同时实现CO2的生物固定，是目前微藻生物柴油研发的重要指导思想之一。产油微藻吸收、利用CO2的第一步，是CO2与水反应，生成碳酸氢根离子(HCO3 -)和氢离子(H+)，HCO3 -离子进一步解离为碳酸根离子(CO3 2-)和氢离子(H+)，藻液中三种碳源形式CO2、HCO3 -和CO3 2-的相对数量关系由培养液pH决定(李夜光等，1996,生物工程学报.12(增刊):242-248)。藻液的pH值从两方面影响外源CO2的利用效率：(1)在其它条件相同的情况下，pH越低，藻液中CO2所占的比例越高，藻液对外源CO2的吸收率越低；pH越高，藻液中CO2所占的比例越低，藻液对外源CO2的吸收率越高(李夜光等，1996,武汉植物学研究.14(3):253-260)；(2)藻液的pH决定藻液中CO2所占的比例(分压)的高低，当藻液中CO2分压等于空气中CO2的分压时，藻液从空气中吸收CO2的速率等于向空气释放CO2的速率，此时的藻液pH称为平衡pH；当藻液pH高于平衡pH时，藻液中CO2分压低于空气中CO2分压，藻液从空气中吸收CO2；当藻液pH低于平衡pH时，藻液中CO2分压高于空气中CO2的分压，藻液向空气中释放CO2，造成CO2的浪费(Kern1960,Journalofchemicaleducation(1):14；张丹等,2014,水生生物学报.2014(3):401-406)。显然，筛选能够适应较高pH的藻种可以高效地利用外源CO2，在固定烟道气CO2方面的潜力较大。
微藻规模培养过程中生物污染，特别是原生动物(轮虫、纤毛虫等)的污染，可以在短时间内使藻细胞密度大幅度降低(Wangetal.2013,BioresourceTechnology128:745-750)，对藻的生长造成严重的影响。产油微藻规模培养过程中生物污染的控制技术，是国际上公认的一个制约微藻生物柴油产业化进程的关键技术难题(McBrideetal.2014,IndustrialBiotechnology10(3):221-227；Regoetal.2015,Bioelectrochemistry103:60-64)。因此，在满足生长快，目标产物(例如油脂)含量高的前提下，筛选具有抗生物污染能力(如个体较大、具有化学防御能力、耐受极端环境等)的藻种，有利于进行室外大量培养生产。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种油球藻Graesiellasp.WBG-1，该藻株生长快、对pH等环境条件具有很强的适应性；该藻株能够在不同的培养条件下积累不同的目标产物，目标产物产率高；同时，该藻株还具有细胞大(直径8～12μm)、易沉降、抵抗原生动物吞食等适合进行大规模培养的特性。
本发明利用微吸管分离法(Andersen,2005,Algalculturingtechniques)分离油球藻Graesiellasp.WBG-1，该方法针对显微镜视野中可见的微藻细胞进行操作，具有针对性强、分离效率高等优点。
本发明的另一个目的在于提供一种油球藻Graesiellasp.WBG-1在微藻生物柴油原料生产、微藻蛋白质生产、微藻固定外源二氧化碳方面的应用。所述微藻在高氮条件下培养，细胞中蛋白质含量可达干重的50％以上，可用于微藻蛋白质的生产，作为蛋白源进一步用于食品或水产饲料的生产；所述微藻在低氮条件下培养，细胞中油脂含量可达干重的50％以上，可作为微藻生物柴油的原料；所述微藻能适应较宽泛的培养液pH范围，在高pH条件下能高效利用外源CO2，可应用于烟道气中CO2的生物固定。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种油球藻Graesiellasp.WBG-1的分离筛选方法，其步骤是：
1、水样采集：利用浮游生物采集网从自然水体中采集样品，用于分离微藻细胞；
2、分离及纯化：利用微吸管分离法分离微藻细胞，并通过琼脂平板涂布或划线的方法对分离的藻种进行纯化；
3、藻种鉴定：通过观察显微形态(细胞形态、大小，色素体形态、排布方式等)，结合18SrDNA和ITS序列比对(NCBIBlast)的方法，进行藻种的分类鉴定；
4、油球藻Graesiellasp.WBG-1的藻种培养制备：利用人工光照在三角烧瓶中进行油球藻Graesiellasp.WBG-1的藻种培养制备，藻种培养条件为：光照强度30～50μmolphotonm-2s-1，温度20～25℃，摇床转速100rpm，培养周期3-5天，所用培养基为标准BG-11。
5、油球藻Graesiellasp.WBG-1的筛选评比：利用柱状气升式反应器，在同等的条件(培养管内径3cm，高度35cm，培养管表面光照300μmolm-2s-1，温度30℃，连续通气(含1％CO2的空气)鼓气速率250mLmin-1)下培养油球藻Graesiellasp.WBG-1及其他微藻，根据生物质干重及油脂含量对藻种进行评价；使用改良BG-11培养基配方(每升培养基)：硝酸钠(NaNO3)0.1g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)0.04g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.075g，氯化钙(CaCl2·2H2O)0.036g，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.005g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2)0.01g，碳酸氢钠(NaHCO3)1.0g，硼酸(H3BO3)2.86mg，氯化锰(MnCl2·4H2O)1.8mg，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.22mg，硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.08mg，钼酸铵((NH4)6Mo7O24·4H2O)0.1104mg，硝酸钴(Co(NO3)2·6H2O)0.0494mg。
所获得的一种油球藻Graesiellasp.WBG-1已于2015年8月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山)，保藏编号为CCTCCNO：M2015486。
所述的油球藻Graesiellasp.WBG-1中含有核苷酸序列：序列为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列(18S-1722)，序列为SEQIDNO:2所示的核苷酸序列(ITS1-349)，序列为SEQIDNO:3所示的核苷酸序列(ITS2-303)。
所述的油球藻Graesiellasp.WBG-1，具有以下特征：细胞为球形至椭球形，直径8～12μm，细胞中可见一蛋白核，色素体杯状，周生，细胞表面无鞭毛、突起等结构，具体见附图1。由于该藻株细胞较大，静置时很容易从培养液中沉降到底部。此外，所述油球藻Graesiellasp.WBG-1还具有很强的pH适应性，能够在广泛的pH环境(pH7～10.5)中正常生长并积累特定产物。
一种油球藻Graesiellasp.WBG-1在微藻生物柴油原料、微藻蛋白质生产中的应用，其步骤是：
1、反应器准备：首先清洗反应器及附属器件(通气管、砂芯气体分散器)并进行灭菌，培养基用水经过煮沸灭菌并冷却，然后将40L无菌水注入培养箱中，放入砂芯气体分散器开始鼓气。
2、培养基配制：按照改良的BG11培养基逐个加入培养基组份，每添加一种组份后充分搅拌，再添加下一种组份，防止局部离子浓度过高而沉淀。改良BG-11培养基的化学组分(每升培养基)：硝酸钠(NaNO3)0.1～1.5g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)0.04g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.075g，氯化钙(CaCl2·2H2O)0.036g，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.005g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2)0.01g，碳酸氢钠(NaHCO3)1.0g，硼酸(H3BO3)2.86mg，氯化锰(MnCl2·4H2O)1.8mg，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.22mg，硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.08mg，钼酸铵((NH4)6Mo7O24·4H2O)0.1104mg，硝酸钴(Co(NO3)2·6H2O)0.0494mg。所述改良BG-11培养基中硝酸钠(NaNO3)浓度为0.1～1.5gL-1。优选地，将所述油球藻Graesiellasp.WBG-1用于食品、饲料应用(微藻蛋白)时，硝酸钠(NaNO3)浓度为1.5gL-1；将所述油球藻Graesiellasp.WBG-1用于生物柴油原料(微藻油脂)时，硝酸钠(NaNO3)浓度为0.1gL-1。
3、分批培养：将藻种培养液接入上述反应器中，使藻液OD540达到0.1；在自然光照和温度条件下培养，连续通气，流量为3L/min，通入的气体为空气/二氧化碳混合气体(CO2/空气＝1/99,V/V)并经过0.22μm孔径滤膜过滤除菌，培养8天。
4、生物质采收及分析：将藻液静置，油球藻细胞自然沉到底部，将上清液排出，浓藻液1500rpm离心10min采收细胞，真空冷冻干燥获得藻粉。采收的微藻生物质即可作为微藻生物柴油(油脂)或微藻蛋白质的原料。
一种油球藻Graesiellasp.WBG-1在微藻固定外源二氧化碳方面的应用，其步骤是：
1、油球藻Graesiellasp.WBG-1分批培养：在环形培养池反应器中培养Graesiellasp.WBG-1，培养基为改良的BG-11，接种后藻液光密度(OD540)0.2，培养液搅拌器叶片转速50rpm，液面高度20cm，温度30℃，液面处光照300μmolm-2s-1；
2、外源二氧化碳的补充及固定：微藻光合作用是以光照为能源，利用藻液中的CO2为碳源，将无机碳转化为有机碳的过程。微藻吸收利用藻液中的CO2，引起pH升高、向藻液中通CO2，培养液吸收CO2后pH又下降。利用上述原理，使用pH在线控制器自动控制外源CO2向油球藻Graesiellasp.WBG-1培养液中的通入和关闭，将培养液pH控制在设定的范围。当培养液pH达到控制范围的上限时，pH在线控制器控制外源CO2通入到培养液中，藻液pH下降，当pH下降到控制范围的下限时，停止通入外源CO2。培养液pH随着光合作用的进行又缓慢上升，当培养液pH再次达到控制范围的上限时，外源CO2再次通入到培养液中，如此不断循环，藻液的pH一直保持在适合微藻光合作用的范围内，微藻通过光合作用持续不断地将CO2转变为有机碳，实现对外源CO2的生物固定。
为了获得较高的CO2利用效率，藻液的pH控制在9.0-10.5范围内。
与现有技术相比，本发明专利具有以下有益效果：
①应用范围广：本发明提供的微藻藻株为油球藻属的一种(Graesiellasp.)，藻种编号为WBG-1，目前还未见报道，该藻株在不同的培养条件下产生不同的代谢产物，同时具有广泛的环境适应性，能够耐受高pH环境，具有多方面的用途。
②目标产物产率高：所述油球藻Graesiellasp.WBG-1在实验室条件下，初始硝酸钠浓度1.5gL-1，培养6天后，蛋白质含量最高可达细胞干重的53％，产率为253mgL-1d-1(见实施例4)；所述油球藻Graesiellasp.WBG-1在实验室条件下，初始硝酸钠浓度0.1gL-1，培养8天后，油脂含量最高可达细胞干重的55.55％，产率为174mgL-1d-1(见实施例3)；相比于其他藻种，本例报道的油球藻Graesiellasp.WBG-1蛋白质产率及油脂产率均具有明显的优势。
③高效利用外源CO2：普通藻种在高pH条件下生长受到严重抑制(HuntleyandRedalje,2007,Mitigationandadaptationstrategiesforglobalchange12(4):573-608)，而所述油球藻Graesiellasp.WBG-1能够在高pH环境下快速生长，油脂合成代谢不受影响(见实施例4)；由于油球藻Graesiellasp.WBG-1适应高pH环境，因此，其液体培养***能够高效利用外源CO2，可以应用于烟道气CO2的生物固定
④方便采收：所述油球藻Graesiellasp.WBG-1细胞直径8～12μm，明显大于报道和应用较多的小球藻(3～8μm)(Guccione,Biondietal.,2014,BiotechnologyforBiofuels7(1):84)，藻液静置时细胞下沉快(12小时内下沉20cm以上)；利用藻细胞自然沉降能方便快捷地从培养液中采收细胞生物质，可以减少采收能耗。
⑤对原生动物污染有较强抵抗力：一般情况下，微藻培养过程中经常会发生原生动物的污染，危害较大的是轮虫、纤毛虫等，轮虫和纤毛虫能够快速摄食微藻细胞，短时间内使微藻细胞密度大幅度下降，严重影响微藻的生长，原生动物的污染是制约微藻规模培养的技术难题(McBrideetal.2014,IndustrialBiotechnology10(3):221-227；Regoetal.2015,Bioelectrochemistry103:60-64)。发明人在室外开放池培养小球藻、栅藻、油球藻(Graesiellasp.WBG-1)等微藻，利用显微镜观察并进行藻细胞和原生动物的计数；在室外5m2开放池培养过程中，小球藻、栅藻培养液中经常能观察到原生生物污染，对微藻的生长和油脂的积累造成严重影响。其中一次小球藻培养中观察到，第4天轮虫开始大量繁殖，第5天小球藻细胞数量减少了40％，第6天细胞数量继续大幅度减少，第7天的细胞数量不到第4天的10％；另一次小球藻培养中发生了纤毛虫污染，第4天纤毛虫开始大量繁殖，第5天小球藻细胞数量锐减75％，第6天小球藻细胞继续减少，第7天小球藻细胞数量只有第4天的5％左右。与小球藻、栅藻的培养情况不同，一般情况下油球藻Graesiellasp.WBG-1培养液中观察不到原生动物，即使藻液中能观察到少量原生动物，原生动物也不会大量摄食油球藻Graesiellasp.WBG-1，对油球藻的生长和油脂的积累没有明显影响。可见所述油球藻Graesiellasp.WBG-1具有抵抗原生动物摄食的能力。油球藻Graesiellasp.WBG-1对原生动物摄食具有抵抗能力的原因，除了细胞个体较大(细胞直径8～12μm)给原生动物的摄食造成困难外，也可能通过其它途径，例如化感作用，抵抗原生动物(Mooij,P.R.,G.R.Stouten,etal.2015.CurrentOpinionInBiotechnology33:46-51)。所述油球藻Graesiellasp.WBG-1对原生动物摄食具有一定抵抗能力，这在室外大规模培养中具有显著的优势。
附图说明
图1为一种油球藻Graesiellasp.WBG-1细胞光学照片(A)及透射电镜照片(B)。
图A为光学显微照片，显示细胞为球形至椭球形，可见一个蛋白核，色素体杯状，细胞表面无鞭毛、突起等结构；图B为透射电镜照片，蛋白核和周生的色素体清晰可见。
图2为一种油球藻Graesiellasp.WBG-1(在40L反应器中培养)总脂薄层层析图。
薄层板基质为硅胶GF254，上样量20-40μg，展层剂为正己烷/***/乙酸＝7/3/0.1，最后以碘蒸汽显色。图中最大的椭圆斑点为中性脂TAG。
图3为一种油球藻Graesiellasp.WBG-1(在40L反应器中培养)脂肪酸总离子流色谱图(气相色谱分离，质谱检测)。
图中横轴为保留时间，纵轴为总离子流(丰度)，波峰处标注对应的脂肪酸及其丰度。
具体实施方式
根据下列实施例，可以更好的理解本发明专利。实施例中，所描述的培养基组成、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当限制权利要求书中所详细描述的本发明的范围。
实施例1：油球藻Graesiellasp.WBG-1的分离筛选方法，其步骤是：
一种油球藻Graesiellasp.WBG-1的分离筛选方法，其步骤是：
1、水样采集：以400目纱绢网制成的浮游生物采集器在水面以下画“∞”字富集藻细胞，采集的样品置于无菌瓶中，添加少量浓缩的BG-11培养基，然后在弱光下静置3天，而后进行藻种的分离。本例中的水样采集自云南省永胜县。
2、分离及纯化：
(1)目标藻细胞的寻找与分离：在10倍或20倍显微镜下找到需要分离的藻细胞(目标藻细胞)，然后将微吸管(0.1mm内径)管口靠近目标细胞并迅速提起，利用虹吸作用快速地将目标细胞吸进微吸管。
(2)镜检确认：将微吸管中的水样吹出到载玻片上，在显微镜下进行观察，若含有目标藻细胞，则向水滴中添加大约10μL无菌水稀释，并重复步骤(1)。
(3)上述操作(步骤1-2)重复7-8次，直到所操作的微量液体中只可观察到一个目标藻细胞。
(4)培养确认：将含有单个目标藻细胞的水滴移入装有2-5mL无菌BG-11培养基的试管中，静置培养，温度20℃，光照30μmolm-2s-1，光暗周期12h:12h。待肉眼观察可见绿色时，在无菌条件下取10μL培养液滴于载玻片上，镜检确认是否为目标藻细胞；若不含有目标藻细胞，或同时含有目标藻细胞及其他藻细胞，则按步骤(1-4)重新分离；若仅可见目标藻细胞，则进行下一步操作。
(5)纯化：取目标藻细胞培养液100μL，稀释100倍，再取50μL稀释培养液滴加于BG-11琼脂平板上，涂布或四区划线，其后在温度20℃，光照30μmolm-2s-1，光暗周期12h:12h的条件下培养。待肉眼可见绿色藻落时，挑取斑点直径小于1mm的藻落，并重新划线于BG-11琼脂平板上培养；连续进行3-4次平板划线，每次挑取斑点直径小于1mm的藻落进行划线纯化。最后将纯化的藻落划线于BG-11琼脂试管斜面上，从而得到纯化的藻种。
3、藻种鉴定：经形态学观察(细胞形态、大小、色素体形态、色素体排布方式、有无鞭毛、细胞表面结构等)及18SrDNA及ITS序列比对(NCBIBlast)之后，将该藻株鉴定为Graesiella(油球藻)属物种，并编号为Graesiellasp.WBG-1。
4、油球藻Graesiellasp.WBG-1的藻种培养：无菌条件下，从BG-11平板上挑取纯化的藻落接入50mL三角烧瓶中，并加入20mL无菌BG-11液体培养基，透气型封口膜封口之后置摇床上培养，摇床转速80rpm，光照强度30μmolm-2s-1，光暗周期14h:10h，温度25℃，培养1周后将20mL培养液转入250mL三角烧瓶中，加入100mL无菌BG-11液体培养基，透气型封口膜封口之后置摇床上培养，摇床转速100rpm，光照强度50μmolm-2s-1，光暗周期14h:10h，温度25℃，培养3天后将120mL培养液转入1000mL三角烧瓶中，加入500mL无菌BG-11液体培养基，透气型封口膜封口之后置摇床上培养，摇床转速100rpm，光照强度50μmolm-2s-1，光暗周期14h:10h，温度25℃，培养4天后得到油球藻Graesiellasp.WBG-1的藻种培养液(OD540达到1.0)，可用于下一步接种。
5、油球藻Graesiellasp.WBG-1的筛选：利用常见的柱状气升式反应器进行藻种的培养筛选。所用柱状气升式反应器单个培养管高度为35cm，内径3cm。用高压灭菌锅对反应器及培养基用水进行灭菌，灭菌水自然冷却到室温(20～25℃)后配制改良BG-11培养基。将步骤4获得的藻种培养液接种到配制好的改良BG-11培养基中，使培养液OD540达到0.1。将上述接种后的藻液加入柱状反应器中，连续通入过滤除菌(0.22μm过滤)的空气-二氧化碳混合气体(CO2/空气＝1/99,V/V)，气流量为250mL/min，置人工光照(培养管表面300μmolm-2s-1)下培养，用水浴控制培养液温度为30℃，培养8天。每个藻种同时培养三管。改良BG-11培养基配方1组成(每升培养基)：硝酸钠(NaNO3)0.1g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)0.04g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.075g，氯化钙(CaCl2·2H2O)0.036g，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.005g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2)0.01g，碳酸氢钠(NaHCO3)1.0g，硼酸(H3BO3)2.86mg，氯化锰(MnCl2·4H2O)1.8mg，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.22mg，硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.08mg，钼酸铵((NH4)6Mo7O24·4H2O)0.1104mg，硝酸钴(Co(NO3)2·6H2O)0.0494mg。
1500rpm离心10min采收油球藻细胞，真空冷冻干燥获得藻粉。0.45μm滤膜过滤法测得所培养的三管油球藻Graesiellasp.WBG-1生物质干重平均为2.51gL-1，采用正己烷/乙酸乙酯法(温小斌等,2012,中国油脂.37(11):80-85)抽提脂肪，测得总脂含量平均值为干重的55.55％。
利用上述方法，对其他29株分离获得的绿藻进行培养筛选。29株微藻的生物质干重平均值最低为0.37gL-1，最高为1.98gL-1；总脂含量平均值最低为干重的19.31％，最高为干重的49.83％。与29株绿藻相比，无论生物质干重还是总脂含量，Graesiellasp.WBG-1均为最高。
申请人于2015年8月14日将纯化后的油球藻Graesiellasp.WBG-1提交中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏号为：CCTCCNO:M2015486。
所述的油球藻Graesiellasp.WBG-1中含有核苷酸序列：其序列为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列(18S-1722)；
所述的油球藻Graesiellasp.WBG-1中含有核苷酸序列：其序列为SEQIDNO:2所示的核苷酸序列(ITS1-349)；
所述的油球藻Graesiellasp.WBG-1中含有核苷酸序列：其序列为SEQIDNO:3所示的核苷酸序列(ITS2-303)。
实施例2：油球藻Graesiellasp.WBG-1的扩大培养及其用于微藻油脂(生物柴油原料)的生产。
一种油球藻Graesiellasp.WBG-1在微藻生物柴油原料中的应用，其步骤是：
1、反应器准备：首先用75％乙醇擦拭培养箱内表面三次，然后注入40升经过煮沸消毒并冷却到室温的培养用水，将经过煮沸消毒的通气管和砂芯气体分散器放入培养箱中，接通气源开始通气(气流量3L/min)，通入的气体为空气/二氧化碳混合气体(CO2/空气＝1/99,V/V)并经过0.22μm孔径滤膜过滤除菌。
2、培养基配制：按照改良的BG11培养基配方1逐个加入培养基组份，每添加一种组份后充分搅拌，再添加下一种组份，防止局部离子浓度过高而沉淀。改良BG-11培养基配方1的化学成分(每升培养基)：硝酸钠(NaNO3)0.1g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)0.04g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.075g，氯化钙(CaCl2·2H2O)0.036g，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.005g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2)0.01g，碳酸氢钠(NaHCO3)1.0g，硼酸(H3BO3)2.86mg，氯化锰(MnCl2·4H2O)1.8mg，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.22mg，硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.08mg，钼酸铵((NH4)6Mo7O24·4H2O)0.1104mg，硝酸钴(Co(NO3)2·6H2O)0.0494mg。
3、培养：将实施例1获得的藻种培养液接入上述培养箱中，使藻液OD540达到0.1，同时接种三个培养箱，在自然光照和温度条件下培养8天，培养过程中日平均光照强度30～45molm-2d-1，日平均气温21.8～30.5℃。
4、生物质采收及总脂提取测定：
将藻液静置，油球藻细胞自然沉到底部，将上清液排出，浓藻液1500rpm离心10min采收细胞，真空冷冻干燥获得藻粉。
0.45μm滤膜过滤法测得三个培养箱的生物质干重平均值为1.09gL-1，生物质产率平均值136.25mgL-1d-1，采用正己烷/乙酸乙酯法(温小斌等,2012,中国油脂.37(11):80-85)抽提脂肪，测得总脂含量平均值为干重的35.63％。
利用硅胶薄层层析法(常规分析方法)对抽提到的脂肪进行定量分析，其中中性脂(TAGs)在总脂中的比例达到86.53％，见图2。利用甲醇(含0.5％NaOH)对上述总脂提取物进行酯化并进行脂肪酸组成的气相色谱分析(常规分析方法)，其中C16、C18等适合于炼制生物柴油的脂肪酸占总脂肪酸的94.62％以上，见图3。
实施例3：油球藻Graesiellasp.WBG-1的扩大培养及其用于微藻蛋白质的生产。
一种油球藻Graesiellasp.WBG-1在微藻蛋白质生产中的应用，其步骤是：
1、反应器准备：首先用75％乙醇擦拭培养箱内表面三次，然后注入40升经过煮沸消毒并冷却至室温的培养用水，将经过煮沸消毒的通气管和砂芯气体分散器放入培养箱中，接通气源开始通气(气流量3L/min)，通入的气体为空气/二氧化碳混合气(CO2/空气＝1/99,V/V)并经过0.22μm孔径滤膜过滤除菌。
2、培养基配制：按照改良的BG11培养基配方2逐个加入培养基组份，每添加一种组份后充分搅拌，再添加下一种组份，防止局部离子浓度过高而沉淀。改良BG-11培养基配方2的化学成分(每升培养基)：硝酸钠(NaNO3)1.5g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)0.04g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.075g，氯化钙(CaCl2·2H2O)0.036g，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.005g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2)0.01g，碳酸氢钠(NaHCO3)1.0g，硼酸(H3BO3)2.86mg，氯化锰(MnCl2·4H2O)1.8mg，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.22mg，硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.08mg，钼酸铵((NH4)6Mo7O24·4H2O)0.1104mg，硝酸钴(Co(NO3)2·6H2O)0.0494mg。
3、培养：将实施例1获得的藻种培养液接入上述反应器中，使藻液OD540达到0.1，同时接种三个培养箱，在自然光照和温度条件下培养8天，培养过程中日平均光照强度30～45molm-2d-1，日平均气温21.8～30.5℃。
4、生物质采收及蛋白质含量测定和氨基酸分析：将藻液静置，油球藻细胞自然沉到底部，将上清液排出，浓藻液1500rpm离心10min采收细胞，真空冷冻干燥获得藻粉。0.45μm滤膜过滤法测得三个培养箱的生物质干重平均值为2.85gL-1，生物质产率平均值467mgL-1d-1，凯氏定氮法(国标)测得蛋白质含量平均值为53.25％。利用氨基酸分析仪分析氨基酸组成和含量(魏文志等，2011，食品科学32(5)：254-257)，结果见表1。
表1油球藻Graesiellasp.WBG-1氨基酸组成和含量
*必需氨基酸
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，油球藻Graesiellasp.WBG-1含有18种氨基酸，包括人体和动物所需的8种必需氨基酸(表1中用“*”标记)。人体和动物自身不能合成必需氨基酸，只能通过食物摄取以供机体新陈代谢所需。世界卫生组织(WHO)和***粮农组织(FAO)提出一个参考标准，蛋白质中的必需氨基酸应达到氨基酸总量的40％，必需氨基酸与非必需氨基酸的比例应大于60％(魏文志等，2011，食品科学32(5)：254-257；董黎明等，2012，食品科学33(3)：232-237)，油球藻Graesiellasp.WBG-1所含的8种必需氨基酸占氨基酸总量的41.18％，必需氨基酸含量与非必需氨基酸含量的比值达到70％，符合世界卫生组织(WHO)和***粮农组织(FAO)的参考标准。一般来讲，饲料中必需氨基酸含量越高，营养价值越大，油球藻Graesiellasp.WBG-1必需氨基酸含量达到生物质干重的21.19％，优于我国主要饲料肉粉(必需氨基酸含量16.46％)、大豆饼(必需氨基酸含量12.64％)、花生仁饼(必需氨基酸含量9.81％)、玉米蛋白饲料(必需氨基酸含量5.81％)，接近优质鱼粉(必需氨基酸含量23.97％)和啤酒酵母(必需氨基酸含量23.70％)。
实施例4：不同pH培养油球藻Graesiellasp.WBG-1测定对外源二氧化碳的固定率
不同pH培养油球藻Graesiellasp.WBG-1测定对外源二氧化碳的固定率，其步骤是：
1、反应器准备
利用环形培养池反应器培养油球藻Graesiellasp.WBG-1，首先用75％乙醇擦拭环形培养池内表面和搅拌器叶片三次，然后注入20升经过煮沸消毒并冷却至室温的培养用水。
2、培养基配制
按照改良的BG11培养基配方1逐个加入培养基组份，每添加一种组份后充分搅拌，再添加下一种组份，防止局部离子浓度过高而沉淀。改良BG-11培养基配方1化学成分(每升培养基)：硝酸钠(NaNO3)0.1g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)0.04g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.075g，氯化钙(CaCl2·2H2O)0.036g，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.005g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2)0.01g，碳酸氢钠(NaHCO3)1.0g，硼酸(H3BO3)2.86mg，氯化锰(MnCl2·4H2O)1.8mg，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.22mg，硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.08mg，钼酸铵((NH4)6Mo7O24·4H2O)0.1104mg，硝酸钴(Co(NO3)2·6H2O)0.0494mg。
3、油球藻Graesiellasp.WBG-1培养：
将实施例1获得的油球藻Graesiellasp.WBG-1藻种培养液接入环形培养池反应器中，使OD540达到0.2，接种后的藻液液面高度控制为20cm，环形培养池搅拌叶片的旋转速率50rpm，藻液温度30℃，液面处光照强度300μmolm-2s-1，光暗周期为14h:10h。
4、外源二氧化碳的供给及藻液pH控制：
环形培养池反应器安装一套CO2供给和pH控制***，该***由pH传感器、pH控制仪、CO2气体分散器、CO2管道、电磁阀、流量计和CO2钢瓶组成。CO2气体分散器位于环形培养池底部，气体分散器通过管道与流量计和电磁阀串联，然后与CO2钢瓶联通。通过调节流量计，可以准确地控制CO2通气速率。pH控制仪可以设定pH控制范围，当pH传感器探测到藻液的pH达到设定范围的上限，pH控制仪控制电磁阀开通，钢瓶中的CO2经过流量计、电磁阀流到气体分散器，成为微小的CO2气泡进入藻液中，CO2气泡在藻液中向上漂浮的过程中逐渐被藻液吸收。藻液吸收CO2后，pH降低，当pH传感器探测到藻液的pH达到设定范围的下限，pH控制仪控制电磁阀关闭。藻液的pH随着微藻光合作用的进行而升高，当再次达到pH设定范围的上限，开始下一轮充CO2的过程。如此不断循环，外源CO2被源源不断地通入藻液，为微藻的光合作用提供碳源，微藻将CO2转变为有机碳，实现外源CO2的生物固定。
在上述培养条件下，进行油球藻Graesiellasp.WBG-1的培养，藻液的pH值范围分别控制为pH7-8，pH8-9，pH9-10和pH10-10.5,每种pH控制条件下重复培养三次。
5、生物质采收及数据分析：
培养8天后，0.45μm滤膜过滤法测得四种pH条件下培养的生物质干重的平均值在0.987～1.152gL-1之间(表2)，不同pH培养条件下生物质干重平均值差异不显著(p＞0.05)。将藻液静置，油球藻细胞自然沉到底部，将上清液排出，浓藻液经过1500rpm离心10min采收细胞，真空冷冻干燥获得藻粉。采用正己烷/乙酸乙酯法(温小斌等,2012,中国油脂.37(11):80-85)抽提总脂，测得不同pH条件下三次培养的细胞总脂含量平均值分别为：pH7-8，44.17％；pH8-9，44.18％；pH9-10，42.94％；pH10-10.5，42.65％(表2)。可见，高pH环境并未对油球藻Graesiellasp.WBG-1的生长和油脂积累造成显著的抑制。
表2不同pH条件下油球藻Graesiellasp.WBG-1的生物量和总脂含量
根据微藻生物质干重含碳元素50％(GrobbelaarJU,2004.Algalnutrition-mineralnutrition.In:RichmondA.(Eds):Handbookofmicroalgalculture:biotechnologyandappliedphycology,97-115)，利用以下公式计算出4种pH条件下培养油球藻Graesiellasp.WBG-1对外源CO2的固定量(表3)。
CO2固定量＝(44/12)×生物质(干重)×0.5
式中44是CO2的分子量，12是碳元素的原子量，0.5表示微藻生物质(干重)含碳元素50％。
为了准确计量CO2的消耗量，使用5L容积的小型CO2钢瓶。将CO2减压阀从钢瓶上卸下来，此时，CO2钢瓶脱离供气***，即可对CO2钢瓶进行精确称重。每次培养前和培养结束后，都准确称量CO2钢瓶的重量，培养前、后重量的差值等于CO2的消耗量。
根据CO2固定量和CO2消耗量，计算CO2的固定率。
CO2固定率＝100％×CO2固定量/CO2消耗量
不同pH条件下培养油球藻Graesiellasp.WBG-1，生物质总量、CO2固定量、CO2消耗量和CO2固定率见表3。
表3不同pH条件下油球藻Graesiellasp.WBG-1对外源二氧化碳的固定率
从表3可以看出，4种pH条件下培养油球藻Graesiellasp.WBG-1，20升藻液对外源CO2的固定量在34.21-42.34g的范围内，pH变化对外源CO2的固定量影响不太大。但是，pH变化对外源二氧化碳的固定率影响非常大。pH越低，外源二氧化碳的固定率也越低；培养液pH控制在7.5-8.0时，外源二氧化碳的固定率只有3.43％，表明96％以上的二氧化碳从培养液溢出而浪费了；培养液pH控制在9.0以上时，外源二氧化碳的固定率远远高于pH低于9.0的二氧化碳固定率；当pH控制在10.0-10.5范围内，油球藻Graesiellasp.WBG-1对外源二氧化碳的固定率平均值达到69.11％，是pH7.5-8.0时外源二氧化碳的固定率的20倍以上。藻液pH对外源CO2的固定率影响如此之大，主要有两方面原因：1、在其它条件相同的情况下，pH越低，藻液中CO2所占的比例越高，藻液对外源CO2的吸收率越低(李夜光等，1996,武汉植物学研究.14(3):253-260)；2、藻液的pH决定藻液中CO2的分压，当藻液中CO2分压等于空气中CO2的分压时，藻液从空气中吸收CO2的速率等于向空气释放CO2的速率，此时的藻液pH称为平衡pH；当藻液pH高于平衡pH时，藻液中CO2分压低于空气中CO2分压，藻液从空气中吸收CO2；当藻液pH低于平衡pH时，藻液中CO2分压高于空气中CO2的分压，藻液向空气中释放CO2，造成CO2的浪费(Kern1960,Journalofchemicaleducation(1):14；张丹等,2014,水生生物学报.2014(3):401-406)。在其它条件相同的情况下，藻液pH越低，藻液向空气中释放CO2越快，造成CO2的浪费越大，被藻细胞固定的CO2就越少。
表1数据显示，高pH环境并未对油球藻Graesiellasp.WBG-1的生长和油脂积累造成显著的影响，即油球藻Graesiellasp.WBG-1能够适应高pH培养条件。表2数据表明，在高pH条件下培养油球藻Graesiellasp.WBG-1，能够实现对外源二氧化碳的高效利用。
SEQUENCELISTING
<110>中国科学院武汉植物园
<110>中国石油化工股份有限公司
<120>一株油球藻Graesiellasp.WBG-1及分离筛选方法和应用
<130>一株油球藻Graesiellasp.WBG-1及分离筛选方法和应用
<160>3
<170>PatentInversion3.1
<210>1
<211>1722
<212>DNA
<213>油球藻
<400>1
ctggtcttgttctcagattacgccatgcatgtctaagtataaactgcttatactgtgaaa60
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<211>349
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<213>油球藻
<400>2
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<210>3
<211>303
<212>DNA
<213>油球藻
<400>3
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aggccaagcaggaacgtgcttatgcatgcctaaacttcgacctgagctcagcaagcagcc300
cgt303

Claims (7)

1.一种油球藻，其特征在于：该藻株为油球藻Graesiellasp.WBG-1，保藏编号为：CCTCCNO:M2015486。
2.根据权利要求1所述的一种油球藻Graesiellasp.WBG-1，其特征在于：所述的油球藻中含有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种油球藻Graesiellasp.WBG-1，其特征在于：所述的油球藻中含有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的一种油球藻Graesiellasp.WBG-1，其特征在于：所述的油球藻中含有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。
5.权利要求1所述的一种油球藻Graesiellasp.WBG-1在微藻生物柴油原料中的应用。
6.权利要求1所述的一种油球藻Graesiellasp.WBG-1在微藻蛋白质生产中的应用。
7.权利要求1所述的一种油球藻Graesiellasp.WBG-1在微藻固定外源二氧化碳中的应用。
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