CN103068970A - 来自多能细胞的前部前肠内胚层的形成 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及诱导前部前肠内胚层分化的活体外方法，以及通过该方法生产的前部前肠内胚层富集群。此类富集群对于研究分化期间发生的分子事件以及对于产生细胞替代治疗用细胞是有用的。

Description

来自多能细胞的前部前肠内胚层的形成
优先权声明
本申请要求2010年4月25日提交的美国临时申请序列号61/343,272；2010年10月12日提交的61/392,429；和2011年1月25日提交的61/436,166的权益。将前述全部内容引入于此以作参考。
政府资助的研究或开发
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的批准号5T32CA078207-12的政府资助下做出的。政府具有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及(至少部分涉及)来自多能细胞的组织前体细胞群的形成方法，更具体地涉及来自多能细胞的前部前肠内胚层(anterior foregut endoderm)的形成方法。
背景技术
胚胎干细胞(ES)为衍生自囊胚内细胞团的多能细胞，并在人类和小鼠中均可在特定条件下保持多能状态。ES细胞理论上可分化成一切体细胞和生殖细胞类型。因此，将ES细胞分化成各种细胞类型和组织的适当条件的研发使得对于未来细胞替代疗法充满期许。多能细胞还可通过将成年体细胞重编程为多能状态(例如，诱导多能干细胞，或iPS细胞)，提供患者特异的多能细胞的形成途径来获得，这将克服与ES细胞来源的组织移植相关的排斥问题。
发育开始于原肠胚形成过程，在此期间，来自囊胚内细胞团的未分化细胞分化成三种胚层，由这三种胚层形成机体的所有组织。外胚层形成皮肤及其附属物、神经***和肾上腺组织。中胚层发育成泌尿生殖***、***、肌肉、骨骼、软骨、血管、血液和心脏。内胚层产生肠、肝、胰腺、食管、气管、肺和衍生自最前部前肠内胚层的咀嚼器(pharyngeal apparatus)。
沿胚胎的背腹侧、前后部和左右轴发生复杂的图式形成(patterning)过程，导致这些胚层中的特定结构域定形，随后将发育成特定组织和器官。图式形成伴随着复杂的分子变化。因此获得富集或纯的成熟细胞功能群显得至关重要，需要顺次(sequentially)施加发育信号(developmental cues)，从而引导活体内多能细胞的分化。
发明内容
本发明至少部分基于发现了由多能干细胞，如人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞形成前部前肠内胚层的方法。
在某些实施方案中，本发明提供前部前肠内胚层细胞的富集细胞群。在某些实施方案中，本发明提供咽内胚层细胞(pharyngeal endoderm cell)的富集细胞群。这些细胞群可通过本文所述方法获得。如本文所使用的，术语“细胞群”是指分离的细胞群，而不是存在于动物中的正常发育所产生的细胞群。
在某些实施方案中，本发明提供用于衍生前部前肠内胚层的方法，所述方法包括在无活化素A下用BMP抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂培养定形内胚层(definitive endoderm)。在一些实施方案中，在无活化素A下用BMP抑制剂和TGF-β信号传导抑制剂二者培养定形内胚层细胞。
在优选实施方案中，BMP抑制剂为头蛋白(Noggin)，TGF-β信号传导抑制剂为SB-431542。
在某些实施方案中，本发明提供由多能细胞，如ES细胞或iPS细胞衍生前部前肠内胚层的方法，所述方法包括诱导所述多能细胞形成例如表达本文所述的标记物EPCAM、CXCR4和C-KIT的定形中胚层，然后由本文所述的定形中胚层衍生前部前肠内胚层。
在某些实施方案中，通过本文所述方法所衍生的前部前肠内胚层细胞表达FOXA2，并包括与在所述定形内胚层细胞中SOX2和CDX2的表达相比升高的SOX2表达水平和降低的CDX2表达水平。
在优选实施方案中，本发明提供一种由多能细胞，如ES或iPS细胞、最优选人ES或iPS细胞来制备前部前肠内胚层细胞的富集群的方法，其包括：
(i)在碱性FGF(bFGF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)和活化素A的存在下培养所述多能细胞从而诱导所述多能细胞形成定形内胚层细胞；和
(ii)在BMP抑制剂如头蛋白或腱蛋白(Chordin)或卵泡抑素(follistatin)和/或TGF-β信号传导抑制剂如SB-431542的存在下，和在无活化素A下，培养所述定形内胚层细胞，从而诱导定形内胚层细胞形成前部前肠内胚层细胞。
在某些实施方案中，本发明提供一种影响前部前肠内胚层细胞的增殖、分化或存活的试剂的鉴别方法，所述方法包括在要试验试剂的存在和不存在下培养前部前肠内胚层富集细胞群，并比较所述细胞在所述试剂存在和不存在下的增殖、分化或存活，其中在所述试剂存在下的差异表示鉴别出影响所述细胞的增殖、分化或存活的试剂。
在某些实施方案中，本发明提供一种参与细胞分化的基因的鉴别方法，所述方法包括分离定形内胚层细胞和前部前肠内胚层细胞，并比较所述定形内胚层细胞和所述前部前肠内胚层细胞的基因表达谱，其中鉴别出在所述定形内胚层细胞和所述前部前肠内胚层细胞之间差异表达的基因表示参与细胞分化的基因。
在某些实施方案中，本发明提供一种抗体的鉴别方法，所述抗体识别从定形内胚层向前部前肠内胚层发展的分子标记物，所述方法包括将抗体温育于前部前肠内胚层的富集细胞群，并筛选出与所述前部前肠内胚层的结合显著高于与所述定形内胚层的结合的抗体。
在某些实施方案中，本发明提供一种诱导前部内胚层/咽内胚层(anterior/pharyngeal)的腹侧(ventral)细胞命运(fate)或咽囊命运的方法，所述方法包括施用选自由Wnt配体、Wnt信号传导激活剂、BMP、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子组成的组中的一种或多种因子。
在某些实施方案中，本发明提供一种在细胞中诱导甲状旁腺命运的方法，所述方法包括用音猬因子(Sonic Hedgehog,SHH)和成纤维细胞生长因子(FGF)培养腹面发育的前部前肠内胚层细胞。
在某些实施方案中，本发明提供一种在细胞中诱导肺命运的方法，所述方法包括在维甲酸的存在下用FGF和Wnt信号传导激活剂培养腹面发育的前部前肠内胚层。
另外提供通过本文所述方法生产的细胞和细胞群(例如，富集群)。
除另外规定外，本文所使用的所有科技术语与本发明所述领域普通技术人员所通常理解的含义相同。本文所述的方法和材料用于本发明；也可使用本领域已知的其他适合的方法和材料。材料、方法和实施例仅为示例性，并不意于限制。将本文所提及的所有公开物、专利申请、专利、序列、数据库条目(database entries)和其他文献的全部内容引入以作参考。在冲突的情况下，将调控本说明书，包括定义。
从以下详细描述和附图，以及从权利要求书中，本发明的其他特性和优势将显而易见。
附图说明
图1a-i示出在头蛋白(NOGGIN)/SB-431542处理的定形内胚层中AFE标记物的诱导。(1a)hES细胞中活化素A-介导的定形内胚层诱导期间FOXA2、MIXL1、SOX17、SOX2和CDX2mRNA的表达。数据表示为β-肌动蛋白(ACTIN)(还称为ACTB)标准化的mRNA的定量，按比例的最大诱导百分比。如图(条带)上方所示添加细胞因子。(1b)在活化素A诱导的第5天定形内胚层的标记物CXCR4、C-KIT和EPCAM的典型的流式细胞术分析。示出两个生物学独立的实验。(1c)在用列于左下图的因子诱导定形内胚层后第5天处理的培养物中FOXA2、SOX2、CDX2、PAX9和TBX1 mRNA在第9天的表达(参见左上图)(n=3个生物学重复；*，显著不同于所有其他条件，P<0.0001；单因素方差分析(one-way ANOVA))。d0，分化开始前；d5，第5天。(1d)在sFRP存在和不存在下用头蛋白/SB-431542(SB)诱导定形内胚层后第5天处理的培养物中SOX2和PAX9在第9天的表达(*，P<0.05，n=3个生物学重复)。(1e)在如前所述分化为神经外皮层(第1天添加头蛋白/SB-431542)，或者在内胚层诱导后(内胚层诱导至第5天，随后添加头蛋白/SB-431542)的hE S细胞中BRACHYURY和PAX6 mRNA在第9天的表达。对于BRAYCHURY，将暴露于活化素A并经历原肠胚形成的第3.5天hES细胞用作阳性对照(*，P<0.0001，n=3个实验，所述实验由各三个生物学重复组成)。(1f)在定形内胚层诱导至第5天后用头蛋白/SB-431542平行处理的或者在肝脏条件(hepatic condition)下培养的培养物中ODD1、CDX2、EVX1、CREB313、CEBPA、TBX1、PAX9、SOX2和FGF8mRNA在第9天的表达(n=3个实验，所述实验由各三个生物学重复组成)。(1g)在HDF2和HDF9 hiPS细胞中活化素A诱导的第5天定形内胚层的标记物CXCR4和C-KIT的典型的流式细胞术分析。(1h,i)在用无血清分化基质(对照，ctrl)或头蛋白/SB-431542诱导定形内胚层后，从第5天处理的培养物中HFGD2和HDF9hiPS细胞中FOXA2、SOX2和PAX9 mRNA第9天的表达(参见左上图)(n=3个生物学三次重复，*显著不同于基质对照)。
图2a-c示出头蛋白/SB-431542诱导的AFE细胞的功能特性。(2a)在示意性示于图上方的两个条件下形成的HE S2衍生细胞中SOX2、NKX2.1、NKX2.5、PAX1和P63的表达(n=6个培养孔，来自两个独立实验；*，显著不同于头蛋白/SB-431542；P<0.05)，WKFBE：WNT3a、KGF、FGF10、BMP4和EGF。(2b)在示意性示于图上方的三个条件下形成的HES2衍生细胞中NKX2.1、NKX2.5和PAX1的表达(n=4-6个培养孔，来自三个独立实验；*，显著不同于其他条件；P<0.05)。(2c)腹侧AFE诱导效率的示意性概述图。WKFBE：WNT3a、KGF、FGF10、BMP4和EGF。
图2d-e说明由hES和hIPS细胞形成的AFE的功能。(2d)在示意性示于图上方的条件下分化成AFE的HDF2(上)和HFD9(下)hiPS细胞中SOX2、NKX2.1和PAX1 mRNA的表达(n=4-6个培养孔，来自2个独立实验，*，显著不同于头蛋白/SB-431542条件)。(2e)使用头蛋白/SB-431542接着用WKFBE分化成推定的腹侧AFE的HES2细胞中EPCAM的表达(左侧峰：同种型(isotype)对照，右侧峰：EPCAM)。
图3a-b示出来自体外形成的腹侧AFE的肺和咽囊标记物的诱导。(3a)在示意性示于图上方的两个条件下形成的HE S2衍生细胞中PAX1、NKX2.1、FOXP2、GATA6和FOXJ1的表达(n=4-6个培养孔，来自三个独立实验，*，显著不同于WKFBE条件；P<0.05)。WKFBE：WNT3a、KGF、FGF10、BMP4和EGF。(3b)在图中所示因子的存在下在腹面发育的AFE中SFTPC和GCM2mRNA的诱导。
具体实施方式
胚胎形成期间，前部内胚层和咽内胚层的形成是体平面(body plan)建立和多器官***如耳部、腭扁桃体、胸腺、甲状旁腺、甲状腺、肺、食管和气管发育中至关重要的步骤。继其形成以后，定形内胚层逐渐分化成内胚层亚谱系。更后期的内胚层形成中肠和后肠。肺野(lung field)前部的咽内胚层形成四个露头，称为咽囊。各咽囊发育成具体器官如咽鼓管和鼓膜的内叶(第一囊)、腭扁桃体(第二囊)、胸腺(第三前囊)、甲状旁腺(第三背囊和第4囊)和甲状腺的束旁C细胞(第四囊)。甲状腺由咽的室底(floor)适当地发育。肺、食管和气管衍生自囊远端的前部前肠内胚层。产生前部前肠内胚层/咽内胚层细胞群的能力在这些组织的细胞替代疗法中、在对影响细胞生长和分化的试剂的分析中和在组织发育和分化的研究中将会是有用的。然而，目前还没有从多能细胞形成前部前肠内胚层细胞群的方法，而调控前部前肠内胚层形成的分子机制还并未明确。获得前部前肠内胚层细胞群将会是有利的，从而更好的理解它们的形成和组织发育。迄今为止还不能够分离或形成前部前肠内胚层细胞的富集群。
本发明提供用于获得前部前肠内胚层群的方法：其通过诱导多能细胞分化成定形内胚层，随后使定形内胚层图式形成(patterning)为前部命运。前部前肠内胚层可随后被诱导分化成由其衍生的任何组织。在某些实施方案中，腹侧前部前肠内胚层、甲状旁腺和肺标记物由前部前肠内胚层/咽内胚层诱导。因此，本发明提供由多能细胞形成前部前肠内胚层细胞群的方法。此类细胞群对于鉴别影响细胞生长和分化的试剂、对于鉴别参与组织发育的基因以及对于形成细胞替代疗法用分化细胞和组织是有用的。
如本文所使用的，“前部前肠内胚层”是指发育成肝的内胚层前部的内胚层。本领域普通技术人员将容易理解“前部前肠内胚层”由此包括，例如咽内胚层及其他更加高度分化的内胚层细胞群，而由术语“前部前肠内胚层”所包括的各种细胞类型可呈现分子标记物的不同表达模式。本领域普通技术人员将容易理解“前部前肠内胚层”发育成各种组织，如扁桃体、鼓膜、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、气管、食管、胃、肺和喉/咽。
多能细胞如ES细胞直接分化成定形内胚层可通过应用高浓度的活化素A来实现。该策略的科学基础为通过成形素结节(morphogen nodal)的信号传导需要内胚层形成。活化素A激活与结节相同的受体，但作为可溶性细胞因子存在。尽管存在促使E S细胞分化成定形内胚层的可用方法，但目前还没有活体外使定形内胚层前部化(anteriorize)和衍生(或分离)前部前肠内胚层的可用方法。
胚胎组织表达典型的分子标记物组。内细胞团细胞表达转录调控因子OCT3/4、NANOG和SOX2。定形内胚层细胞表达转录调控因子FOXA2、SOX17和FOXA3。前部前肠内胚层细胞表达转录调控因子FOXA2和SOX2。咽内胚层细胞表达转录调控因子TBX1和SOX2.第三咽囊细胞表达转录调控因子PAX1/9、HOXA3和SIX1。胸腺上皮细胞表达转录调控因子FOXN1。前部前肠内胚层的肺野表达NKX2.1和GATA6。
组织中前部前肠内胚层标记物的检测，在其内部和其本身，不足以证明衍生自ES细胞的前部前肠内胚层的存在。ES细胞在特定培养条件下保持在未分化状态。除去这些条件导致作为经历自发原肠胚形成(spontaneous gastrulation)的细胞范围的胚状体(embryoid bodies,EBs)的形成，造成随机形成经历随机分化的所有胚层的衍生物。经历随机分化的EB表达许多胚胎组织的标记物，包括前部前肠内胚层的标记物。由于前部前肠内胚层由此需要该组织具有除仅表达前部前肠内胚层的标记物以外的额外特性，从而抑制与前部前肠内胚层不相关的细胞命运，或者耗尽定形内胚层的和后部内胚层的(posterior endodermal)信号，因此需要ES衍生组织的适当分类。
用于形成衍生自咽和前部前肠内胚层的组织的方法可通过如下步骤来进行：由多能细胞诱导定形内胚层，诱导定形内胚层从而形成前部前肠内胚层，随后进一步分化成例如咽内胚层，以及特化为特定的衍生物。
定形内胚层的形成
由人ES或iPS细胞形成定形内胚层可通过调整用于由鼠ES细胞发育成定形内胚层的实验步骤来完成。Kubo等，Development 131:1651-1662(2004)；Gadue等，Proc Natl AcadSci USA 103:16806-16811(2006)；Gouon-Evans等，NatBiotechnol,24:1402-1411(2006)。在非组织处理的塑料上用低浓度BMP4(如约0.5-10ng/ml、如1ng/ml)脉冲(pulse)人ES细胞，在低浓度BMP4和bFGF(如约5-20ng/ml、如约10ng/ml)下培养，然后在高浓度活化素A(50-500ng/ml、如75-150ng/ml、如约100ng/ml)下培养，从而导致胚状体(EB)的形成。EB几乎一致地由内胚层构成。内胚层的发育可通过CXCR4和c-KIT的表达来证实。通过5天内损失ES标记物、SOX2并顺次获得MIXL1、XOX17和FOZXA2来完成内胚层的发育。
在某些实施方案中，可使用其他多能干细胞代替ES细胞。例如，可使用成体干细胞(如从受试者，如要治疗的受试者的内耳、骨髓、间质、皮肤、脂肪、肝、肌肉或血液中获得的成体干细胞)；胚胎干细胞，或从胎盘或脐带获得的干细胞；祖细胞(如，衍生自内耳、骨髓、间质、肝、肌肉或血液的祖细胞)；和诱导的多能干细胞(如，iP S细胞)。在某些实施方案中，使用iP S细胞(参见，如，Maherali和Hochedlinger,Cell Stem Cell3:595-605(2008))。通常，优选人源细胞。
由定形内胚层形成前部前肠内胚层
已发现，尽管活化素A诱导内胚层，但活化素A使该组织后部化(posteriorize)。因此，前部前肠内胚层的制备需要在定形内胚层形成后减少或除去活化素A。在某些方面，本发明因而提供形成前部前肠内胚层的富集细胞群，以及耗尽中部内胚层和后部内胚层信号的方法。此群表达存在于前部前肠内胚层的分子标记物，并耗尽存在不存在于前部前肠内胚层的分子标记物。
内胚层细胞群的特征和区别在于本领域已知的标记物。在定形内胚层中，ES标记物SOX2作为前部前肠内胚层的标记物而重现，而CDX2为后部内胚层(后肠)的标记物。将通过活化素A诱导4至5天形成内胚层的细胞延长培养导致CDX2的增加和SOX2的损失，暗示在这些条件下后部化。定形内胚层的前部化(anteriorization)可通过除去或阻断活化素A并添加前部化成形素来完成。优选的前部化成形素为BMP和TGF-β信号传导的抑制剂。BMP和TGF-β信号传导的抑制剂可单独或组合使用。优选地，组合使用BMP和TGF-β信号传导的抑制剂。BMP抑制剂的实例为头蛋白、腱蛋白和卵泡抑素。优选的BMP抑制剂为头蛋白。TGF-β信号传导抑制剂的实例为Ly364947(SD208)、SM16、SB-505124、SB-431542和抗TGF-β抗体。优选的TGF-β信号传导抑制剂为SB-431542。在优选的实施方案中，使用头蛋白和SB-431542的组合来诱导定形内胚层的前部化。在某些实施方案中，在培养的第4-5天添加头蛋白和SB-431542的组合，从而诱导定形内胚层的前部化。
用头蛋白和SB使定形内胚层的前部化可通过例如检测如SOX2、TBX1(咽)、PAX9(咽、胸腺)、FOXP2(肺、呼吸道表皮)、DLX3(食管)、FOXA2(定形内胚层)和/或SOX7(早期内胚层标记物)中的一种或多种的表达；和任选地检测PAX6(外胚层)和/或BRACHYURY(中胚层)的表达缺失来证实。
细胞群
在某些实施方案中，本发明因此提供前部前肠内胚层细胞的富集细胞群。前部前肠内胚层的富集群包含至少25%、例如至少50%、至少75%、至少90%、至少95%、至少99%或至少99.9%的前部前肠内胚层细胞。
在某些实施方案中，本发明提供咽内胚层细胞的富集细胞群。咽内胚层的富集群包括至少25%、例如至少50%、至少75%、至少90%、至少95%、至少99%或至少99.9%的咽内胚层细胞。
在某些实施方案中，本发明提供衍生前部前肠内胚层的方法，所述方法包括在无活化素A下用BMP抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂培养定形内胚层。在优选的实施方案中，在无活化素A下用BMP抑制剂和TGF-β信号传导抑制剂二者培养定形内胚层。
在某些实施方案中，BMP抑制剂为头蛋白。在本文所述方法的某些实施方案中，头蛋白以约1ng/ml至10μg/ml、10ng/ml至1μg/ml、10ng/ml至500ng/ml、10ng/ml至250ng/ml或10ng/ml至100ng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，头蛋白以约25ng/ml至150ng/ml、50ng/ml至150ng/ml或75ng/ml至150ng/ml的浓度存在于培养物中。在最优选的实施方案中，头蛋白以约100ng/ml的浓度存在于培养物中。
在某些实施方案中，TGF-β抑制剂为SB-431542。在本文所述方法的某些实施方案中，SB-431542以约0.1μm至1mM、1μM至100μM、1μM至500μM、1μM至250μM或1μM至100μM的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，SB-431542以约5μM至250μM、5μM至100μM、5μM至50μM或5μM至25μM的浓度存在于培养物中。在最优选的实施方案中，SB-431542以约10μM的浓度存在于培养物中。
另外优选的是其中用于本发明方法的培养物包括浓度约75ng/ml至150ng/ml的头蛋白和浓度约为5μM至25μM的SB-431542的实施方案。
腹侧前部前肠内胚层的诱导
源自最前部前肠内胚层的大多数器官如胸腺、甲状旁腺、气管和肺源自于前部前肠内胚层的腹侧或腹外侧面。
可通过用Wnt信号传导、FGF信号传导、BMP信号传导和EGF信号传导通路的一种或多种激动剂处理来进一步诱导由头蛋白/SB-431542所诱导的前部前肠内胚层，从而形成腹面发育的前部前肠内胚层。腹侧前部前肠内胚层的有效诱导依赖于用头蛋白/SB-431542的处理。诱导形成腹侧前部前肠内胚层的组织可由例如标记物NKX21和NKX2.5来鉴定。
在某些实施方案中，通过Wnt信号传导、FGF信号传导、BMP信号传导和EGF信号传导通路的两种或多种激动剂的组合来使前部前肠内胚层腹面发育(即，诱导形成腹面发育的前部前肠内胚层)。另外优选的是其中通过Wnt信号传导、FGF信号传导、BMP信号传导和EGF信号传导通路的两种或多种激动剂；Wnt信号传导、FGF信号传导、BMP信号传导和EGF信号传导通路的三种或多种激动剂；Wnt信号传导、FGF信号传导、BMP信号传导和EGF信号传导通路的四种或多种激动剂；或者Wnt信号传导、FGF信号传导、BMP信号传导和EGF信号传导通路的五种或多种激动剂的组合来使前部前肠内胚层腹面发育的实施方案。
在某些实施方案中，Wnt信号传导的激动剂为介导典型Wnt信号传导的Wnt3a；可使用典型Wnt信号传导的任何诱导物，例如，Wnt/β-联蛋白通路激动剂糖原合成酶激酶3β(GSK3b)抑制剂或酪蛋白激酶(CK1)抑制剂。Wnt激动剂的非限制性实例包括编码β-联蛋白的DNA(如，编码β-联蛋白的裸DNA、编码β-联蛋白的质粒表达载体、编码β-联蛋白的病毒表达载体)、β-联蛋白多肽、一种或多种Wnt/β-联蛋白通路激动剂(如，选自由Wnt配体、DSH/DVL-1,-2,-3、LRP6N、WNT3A、WNT5A和WNT3A,5A组成的组)、一种或多种糖原合成酶激酶3β(GSK3b)抑制剂(如，选自由以下物质组成的组：氯化锂(LiCl)、Purvalanol A,奥罗莫星(olomoucine)、阿尔斯特保龙(alsterpaullone)、肯保龙(kenpaullone)、苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷(thiadiazolidine)-3,5-二酮(TDZD-8)、2-硫代(3-碘代苄基)-5-(1-吡啶基)-[1,3,4]-噁二唑(GSK3抑制剂II)、2,4-二苄基-5-氧噻二唑烷-3-硫酮(OTDZT)、(2′Z,3′E)-6-溴靛红-3′-肟(BIO)、α-4-二溴苯乙酮(即，Tau蛋白激酶I(TPK I)抑制剂)、2-氯-1-(4,5-二溴-硫苯-2-基)-乙酮、N-(4-甲氧基苄基)-N′-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲(AR-A014418)、靛红-5-磺酰胺；靛红-5-磺酸(2-羟乙基)-酰胺靛红-3’-单肟；5-碘-靛红-3’-单肟；5-氟靛红；5,5’-二溴靛红；5-硝基靛红；5-氯靛红；5-甲基靛红、5-溴靛红、4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮(TDZD-8)、2-硫代(3-碘代苄基)-5-(1-吡啶基)-[1,3,4]-噁二唑(GSK3抑制剂II)、2,4-二苄基-5-氧噻二唑烷-3-硫酮(OTDZT)、(2′Z,3′E)-6-溴靛红-3′-肟(BIO)、α-4-二溴苯乙酮(即，Tau蛋白激酶I(TPK I)抑制剂)、2-氯-1-(4,5-二溴-硫苯-2-基)-乙酮、(vi)N-(4-甲氧苄基)-N′-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲(AR-A014418)、H-KEAPPAPPQSpP-NH2(L803)和Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2(L803-mts))、一种或多种与GSK3mRNA特异性结合的反义RNA或siRNA、一种或多种酪蛋白激酶1(CK1)抑制剂(如，与CK1 mRNA特异性结合的反义RNA或siRNA)、一种或多种蛋白酶抑制剂、一种或多种蛋白酶体抑制剂。当将WNT3a用于本文所述方法时，Wnt3a以约1ng/ml至10μg/ml、10ng/ml至1μg/ml、10ng/ml至500ng/ml、10ng/ml至250ng/ml或10ng/ml至100ng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，Wnt3a以约25ng/ml至150ng/ml、50ng/ml至150ng/ml或75ng/ml至150ng/ml的浓度存在于培养物中。在进一步优选的实施方案中，Wnt3a以约100ng/ml的浓度存在于培养物中。
在优选的实施方案中，使用FGF信号传导的激动剂，例如FGF7、FGF9或FGF10。为了用于本文所述方法，FGF7或FGF10以约1ng/ml至10μg/ml、10ng/ml至1μg/ml、10ng/ml至500ng/ml、10ng/ml至250ng/ml或10ng/ml至100ng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，FGF7或FGF10以约25ng/ml至150ng/ml、50ng/ml至150ng/ml或75ng/ml至150ng/ml的浓度存在于培养物中。在最优选的实施方案中，FGF7和FGF10二者均以约10ng/ml的浓度存在于培养物中。在某些实施方案中，可使用FGF信号传导的其他激动剂，例如FGF1、2、3、5、6、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23。
在优选的实施方案中，EGF信号传导的激动剂为EGF。为了用于本文所述方法，EGF以约1ng/ml至10μg/ml、10ng/ml至1μg/ml、10ng/ml至500ng/ml、10ng/ml至250ng/ml或10ng/ml至100ng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，EGF以约25ng/ml至150ng/ml、50ng/ml至150ng/ml或75ng/ml至150ng/ml的浓度存在于培养物中。在最优选的实施方案中，EGF均以约20ng/ml的浓度存在于培养物中。
在优选的实施方案中，BMP信号传导的激动剂为BMP-4，尽管在某些实施方案中可使用另外的BMP，例如BMP-1至-20中的任一种，如BMP 2-7中的任一种。为了用于本文所述方法，BMP-4以约1ng/ml至10μg/ml、10ng/ml至1μg/ml、10ng/ml至500ng/ml、10ng/ml至250ng/ml或10ng/ml至100ng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，BMP-4以约25ng/ml至150ng/ml、50ng/ml至150ng/ml或75ng/ml至150ng/ml的浓度存在于培养物中。在最优选的实施方案中，BMP-4均以约10ng/ml的浓度存在于培养物中。
在最高度优选的实施方案中，FGF7、FGF10、EGF、BMP-4和Wnt3a分别以10、10、20、10和100ng/ml的浓度存在。
来自腹面发育的内胚层的早期肺标记物的诱导
可通过用维甲酸(RA)与选自由Wnt配体、Wnt信号传导激活剂、BMP、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子组成的组的一种或多种因子的组合处理来诱导表达肺标记物GATA6的腹面发育的前部前肠内胚层。在某些实施方案中，通过在Wnt3a、FGF10、FGF7、BMP4、EGF和RA的存在下培养定形内胚层来促进肺标记物的诱导(例如，表达肺标记物的细胞或组织的形成)。
在优选的实施方案中，维甲酸为全反式-反式维甲酸(ATRA)。为了用于本文所述方法，ATRA以约1nM至10μM、1nM至100μM、5nM至10μM、5nM至1μM、50nM至1μM和100nM至5μM的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，ATRA以约100nM至1μM或1μM至5μM的浓度存在于培养物中。在最优选的实施方案中，ATRA以约1μM的浓度存在于培养物中。在某些实施方案中，将ATRA与上述因子组合使用，从而诱导更偏向与咽区相对的肺野的腹侧前部前肠。
末端肺标记物SP-C的诱导
继续用Wnt3a、FGF10、FGF7、BMP4、EGF和RA处理到第19天，产生低水平的末端肺泡II型细胞标记物SP-C。当在第11天时将这些因子替换为Wnt3a、FGF7和FGF10时实现了SP-C的最佳表达。
在优选的实施方案中，在RA与两种或多种Wnt信号传导、FGF信号传导和BMP的激动剂组合的存在下由腹面发育的前部前肠内胚层诱导末端肺标记物SP-C。
在某些实施方案中，Wnt信号传导的激动剂为Wnt3a；还可如本文所述使用其他激动剂。为了用于本文所述方法，Wnt3a以约1ng/ml至10μg/ml、10ng/ml至1μg/ml、10ng/ml至500ng/ml、10ng/ml至250ng/ml或10ng/ml至100ng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，Wnt3a以约25ng/ml至150ng/ml、50ng/ml至150ng/ml或75ng/ml至150ng/ml的浓度存在于培养物中。在进一步优选的实施方案中，Wnt3a以约100ng/ml的浓度存在于培养物中。
在某些实施方案中，FGF信号传导的激动剂为FGF7或FGF10；如本文所述还可使用其他激动剂。为了用于本文所述方法，FGF7或FGF10以约1ng/ml至10μg/ml、10ng/ml至1μg/ml、10ng/ml至500ng/ml、10ng/ml至250ng/ml或10ng/ml至100ng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，FGF7或FGF10以约25ng/ml至150ng/ml、50ng/ml至150ng/ml或75ng/ml至150ng/ml的浓度存在于培养物中。在最优选的实施方案中，FGF7和FGF10均以约10ng/ml的浓度存在于培养物中。
在最高度优选的实施方案中，FGF7、FGF10和Wnt3a分别以10、10和100ng/ml的浓度存在。
特异性甲状旁腺标记物GCMB的诱导
当在Wnt3a、FGF 10、FGF7、BMP4、EGF的存在下使前肠内胚层腹面发育，随后在第11天除去这些因子并添加SHH、FGF 8或者二者时实现了由腹面发育的前肠内胚层诱导特异性甲状旁腺标记物。
在优选的实施方案中，通过SHH和FGF8信号传导的一种或多种激动剂的组合，由腹面发育的前肠内胚层诱导特异性甲状旁腺标记物SP-C。
在优选的实施方案中，SHH信号传导的激动剂为SHH。为了用于本文所述方法，SHH以约1ng/ml至10μg/ml、10ng/ml至1μg/ml、10ng/ml至500ng/ml、10ng/ml至250ng/ml或10ng/ml至100ng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，SHH以约25ng/ml至150ng/ml、50ng/ml至150ng/ml或75ng/ml至150ng/ml的浓度存在于培养物中。在进一步优选的实施方案中，Wnt3a以约100ng/ml的浓度存在于培养物中。
在优选的实施方案中，FGF信号传导的激动剂为FGF8。为了用于本文所述方法，FGF8以约1ng/ml至10μg/ml、10ng/ml至1μg/ml、10ng/ml至500ng/ml、10ng/ml至250ng/ml或10ng/ml至100ng/ml的浓度存在于培养物中。在优选的实施方案中，FGF8以约25ng/ml至150ng/ml、50ng/ml至150ng/ml或75ng/ml至150ng/ml的浓度存在于培养物中。在最优选的实施方案中，FGF8均以约10ng/ml的浓度存在于培养物中。
在最高度优选的实施方案中，FGF8和SHH分别以10和100ng/ml的浓度存在。
筛选方法
在某些实施方案中，本发明提供一种影响前部前肠内胚层细胞的增殖、分化或存活的试剂的鉴别方法。所述方法包括在要试验试剂的存在下培养前部前肠内胚层细胞的富集群，并比较所述细胞在所述试剂存在和不存在时的增殖、分化或存活，其中在所述试剂存在下的差异表示鉴别出影响所述细胞增殖、分化或存活的试剂。
在某些实施方案中，本发明提供一种参与细胞分化的基因的鉴别方法。所述方法包括分离定形内胚层细胞和前部前肠内胚层细胞，并比较所述定形内胚层细胞和所述前部前肠内胚层细胞的基因表达谱，其中鉴别出在所述定形内胚层细胞和所述前部前肠内胚层细胞之间差异表达的基因表示参与细胞分化的基因。测定基因谱的方法是本领域公知的。
在某些实施方案中，本发明提供一种抗体的鉴别方法，所述抗体识别从定形内胚层向前部前肠内胚层发展的分子标记物。所述方法包括将抗体温育于前部前肠内胚层细胞的富集群，并筛选出与所述前部前肠内胚层细胞的结合显著高于与所述定形内胚层的结合的抗体。温育和筛选抗体的方法是本领域内公知的。优选的抗体为单克隆抗体。
细胞替代疗法
在形成细胞替代疗法用细胞或组织，从而治疗因由其衍生的组织的损害或缺失所引起的病况中，通过本文所述方法由多能细胞衍生的前部前肠内胚层是有用的，所述病况诸如，例如但不限于，由于遗传突变、自身免疫攻击或手术移除(如甲状腺机能亢进或甲状腺癌)所引起的甲状腺无功能(甲状腺功能减退)或者由于遗传因素或者在手术消融后产生的甲状旁腺功能减退；肺损伤；如由同种异体造血干细胞移植(HSCT)所引起的胸腺表皮损伤或由于先天性疾病(迪乔治综合症(Digeorgesyndrome)和Nude/SCID综合症)而缺失胸腺表皮。
在某些实施方案中，细胞如通过本文所述方法衍生自ES或Ip sz细胞的胸腺上皮细胞(TEC)还可改善人源化小鼠模型(图1e)。免疫中的主要挑战是建立具有人类免疫***的小鼠模型。目前，最佳模型为由人脐带血造血干细胞和祖细胞新生移植的免疫缺陷型Rag1-/-ilr2g-/-或NOD-SCIDilr2g-/-小鼠。在该小鼠中，所有主要造血血统(hematopoietic lineage)均被重构，甚至次淋巴器官的结构也类似“人类”的。然而，除了同种异体反应性以外，人的T细胞应答弱，且外周T细胞的内稳态异常(Manz,Immunity.26:537-541(2007)；Traggiai等人，Science.304:104-107(2004)；Legrand等人，Methods Mol Biol.415:65-82(2008)；Gimeno等人，Blood.104:3886-3893(2004))。该具有更强T细胞活性的改进模型为BLT小鼠(Lan等人，Blood.2006;108:487-492；Melkus等人Nat Med.12:1316-1322(2006))。这是NOD-SCIDilr2g-/-小鼠，其在肾包膜(kidney capsule)下移植有人胎儿胸腺和肝，随后移植有胎儿肝脏CD34+祖细胞。在这些小鼠中，观察到先天以及限于MHC I和II型的T细胞依赖性免疫应答。有趣的是，所有T细胞的发育均发生在移植人胸腺中，而不是在内源小鼠胸腺中。这些数据表明，人胸腺组织的存在对于开发人源化小鼠可能是关键的。结果就是，TEC是胸腺的必要组分，ES或iPS衍生的TEC还可用于构建改进的人源化小鼠。此外，通过使用患者特异性iPS细胞，可以在小鼠模型中获取人的疾病易感性中的某些遗传多样性和免疫应答。最终，iPS技术将允许同源人类组织的共移植。在此类小鼠中，可研究在自身免疫或感染时的器官或组织特异性免疫应答，或者可试验疫苗。作为一个实例，自身免疫或免疫介导的疾病的小鼠模型可通过向免疫缺陷小鼠移植如本文所述衍生的骨髓干细胞和TEC(如，来自皮肤细胞衍生的iPS细胞)来构建，两种细胞均来自患有自身免疫或免疫介导的疾病(如，风湿性关节炎、糖尿病、多发性硬化症、牛皮癣或结肠炎)的人类受试者。在某些实施方案中，骨髓干细胞和TEC二者均来自同一受试者，而在某些实施方案中，它们来自不同的受试者。骨髓血干细胞将进入人源胸腺，并在此制备T细胞。这可用于在小鼠中模拟自身免疫性疾病(以及任何其他免疫介导的疾病)。在某些实施方案中，所述方法进一步包括移植源自人类自身免疫靶组织(如，糖尿病中的胰岛)的iPS。
实施例
在以下实施例中进一步描述本发明，但这些实施例不限制权利要求书中所述的本发明的范围。
实施例1.来自人类胚胎和诱导的多能干细胞的前部前肠 内胚层的形成
将以下材料和方法用于该实施例。
细胞和培养条件。在以8,000-12,000个细胞/cm2铺板的鼠胚胎成纤维细胞上培养hESC(HES2，国立卫生研究院代码ES02，来自ES细胞国际组织；传代25–33)。每日更换DMEM/F12、20%敲除血清替代物(Gibco)、0.1mM β-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)和20ng/ml的FGF-2(R&D)的培养基。用胰蛋白酶，洗涤并以1:5至1:10的稀释度重新铺板来传代细胞。如hES2一样培养HDF2和HDF9(hiPS细胞系)。将hES和hiPS培养物保持在5%CO2/空气的环境中，并将hES分化物保持在5%CO2/5%O2/90%N2的环境中。
内胚层诱导。通过在含有Y-27632(10μM)的Matrigel(Gibco)上传代24h来耗尽小鼠胚胎成纤维细胞，并在低粘附盘(low-adherence dishes,Costar)上形成胚状体。在胚状体形成和分化期间，以相同浓度(1:1稀释)重新接种HES2细胞，而HDF和HDF 9需要较高接种(2:1-4:1浓度)以便有效地形成内胚层。在补充有N2(Gibco)、B27(Gibco)、抗坏血酸(50μg/ml,Sigma)、Glutamax(2mM,Invitrogen)、单硫代甘油(0.4μM,Sigma)的DMEM/F12(Invitrogen)培养基中进行分化。将以下浓度的因子用于初始划线(primitive streak formation)、内胚层诱导、前部内胚层/咽内胚层诱导和随后的前后部及背腹模式形成：人BMP-4,1ng/ml和10ng/ml；人bFGF,2.5ng/ml；人活化素A,100ng/ml；人头蛋白，200ng/ml；Y-27632,1μM；SB-431542,10μM；人FGF10,10ng/ml；人FGF7,10ng/ml；鼠EGF,20ng/ml；和人WNT3a,100ng/ml。肝脏条件如前所述，并包含BMP-4,50ng/ml；bFGF,10ng/ml；VEGF,10ng/ml；HGF,10ng/ml；TGFα,20ng/ml；***，40ng/ml。除了购自Toc ris的SB-431542和Y-27632和***(Sigma)以外所有因子均购自R&D systems。按如下顺序添加因子：第1天，Y-27632；第1-5天，BMP4、bFGF和活化素A；第5-9天，头蛋白和SB-431542；第7-19天，WNT3a、FG F10、BMP4、FGF 7和EGF。对于肝分化，按如下顺序添加因子：第1天，Y-27632；第1-5天，BMP4、bFGF和活化素A；第5-9天，***、bFGF、HGF、VEGF、EGF、TGFa和BMP4。对于某些实验，将500μM全反式维甲酸(Sigma)添加到培养物中。在第5天，胰蛋白酶(Gibco)化胚状体，并以10,000-50,000个细胞/cm2铺板到明胶涂布的组织培养-处理盘(Fisher)上。
第11天成形素的筛选(Fig.2h)包括成对和较高数量级地添加FGF(FGF10+FGF7)(R&D Systems)、SU-5402(EMDChemicals)、Wnt5a(R&D Systems)、WNT3a(R&D Systems)、sFRP1(R&D Systems)、BMP4、头蛋白、SHH(R&D Systems)、环巴胺(EMD Chemicals)、SB-431542、TGF-β1(R&D Systems)、DAPT(EMD Chemicals)、维甲酸(Sigma)、DEAB(Sigma)、EGF(R&D Systems)、酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrophastin)AG-1478(EMD Chemicals)和WP1066(EMD Chemicals)。
定量PCR。使用Trizol(Invitrogen),相锁管(phase lock tubes)(5′已接触抗原(Prime))和RNeasy试剂盒(Qiagen)提取总RNA。用DNase I(Qiagen)处理1-2μg总RNA，并使用随机六聚体和Superscript III(Invitrogen)将其反转录。使用SybrGreen(Invitrogen)检测扩增物。在ABI 7900HT热循环仪(thermocycler)(Applied Bio systems)上进行实时定量PCR，程序为95℃10min的步骤，随后95℃,15s和60℃,1min，40个循环。所有实验用SYBR GreenER定量PCR超混合物(quantitative PCRSuperMix)(Invitrogen)进行三次。将各基因的变性曲线用于证实DNA产物的同质性(homogeneity)。根据基因组DNA稀释系列的标准曲线获得绝对定量。参照通过持家基因GAPDH和β-肌动蛋白测定的内参(input)使目标基因的定量值标准化。各培养孔的qPCR进行三次。引物序列示于表1。
表1.基因正向引物(5′-3′)和反向引物(5′-3′)
Figure BDA00002650776000231
流式细胞术。用胰蛋白酶/EDTA离解第5天的胚状体或第13天的单层培养物(2min)。在补充有10%血清的IMDM中用直接共轭的CXCR4(Invitrogen)、c-KIT(BD Biosciences)和EPCAM(BDBiosciences)染色细胞。在LSRII上分析细胞。将Flowjo软件(TreeStar)用于所有分析。
免疫荧光。在25℃下用新鲜的低聚甲醛(4%)固定第7、9或13天的培养物30min然后在PB S中洗涤。在含有0.1%皂素、0.1%BSA、10%FCS(Gemstar)和10%驴胎儿血清(JacksonImmunofluorescence)的溶液中渗透并阻断细胞。对于三维培养物，在第5天，使用如之前所描述的(Lee等人，Nat.Methods 4,359–365(2007))“包埋”和“置顶(on-top)”分析将细胞包埋于Matrigel中。在第9天将培养物包埋于最适切割温度(OptimalCutting Temperature,OCT,Tissue Tek)、提取、切片并如上处理。加入一抗过夜，一抗包括PAX-9(Abcam)、TBX1(Abcam)、SOX2(Stemgent,Santa Cruz)、CDX2(Abcam)、NKX2-1(Invitrogen)和AIRE(Santa Cruz)。洗涤细胞并用驴抗鼠全IgG--Dylight488、驴抗羊全IgG-Cy3和驴抗兔全IgG-Cy5温育1小时(h)。洗涤细胞，并用DAPI(Invitrogen)染核。使用荧光显微镜(Leica DMI 4000B,Wetzlar,Germany)观察染色。该仪器固定有用于荧光采集的DFC340Fx单色冷数码相机(Leica)并使用可变物镜(5×-40×)。滤波器模型：A4UV，11504135；GFP,11532366；YFP 1153267；RFP,11513894；CY3,11600231。改变曝光设置，但基于平行分化和染色的肝脏特异性培养物而设置。使用Leica应用组高级荧光软件包AF6000(Leica)在25℃的PB S中获得图像。图像显示无渲染或反卷积。使用AdobePhotoshop CS4(Adobe)通过仅改变对比度和亮度来数字处理图像，这些操作是在肝脏特异的实验条件下同步进行的。通过在20×放大倍率下对最小10个随机场计数来进行定量。在大多数图上，列有物镜的放大倍率。
小鼠。NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NOD/SCIDIl2rg-/-)小鼠购自杰克森实验室(Jackson Laboratory)。动物饲养于特定的无菌设备中。根据西奈山研究院动物护理和使用委员会(Mount Sinai Institutional Animal Care and Use Committee)进行实验和动物护理。将一百万个细胞注入肾包膜下。切离副产物，包埋到OCT中，并使用苏木精和伊红染色剂来分析如上所述的特异性抗原的形态或免疫荧光。
统计分析。对于统计分析，使用不成对t检验，以及当比较不止两组时，使用单因素方差分析。结果表示为平均值±s.e.m。
结果
通过高浓度活化素A，在原肠胚形成期间模仿结点信号传导(nodal signaling)由ES细胞诱导定形内胚层(胚体(embryoproper)的三个胚层之一)。通过定量PCR在hES细胞系HES2中对该过程的检验揭示出，其中初始划线标记物MIXL1和随后的内胚层转录因子SOX17和FOXA2上调的转录级联(transcriptionalcascade)(图1a)(D’Amour等人，Nat.Biotechnol.24,1392–1401(2006)；Gouon-Evans等人，Nat.Biotechnol.24,1402–1411(2006)；Gadue等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103,16806–16811(2006)；Zorn&Wells,Annu.Rev.Cell Dev.Biol.25,221–251(2009)；Yasunaga等人，Nat.Biotechnol.23,1542–1550(2005))。在暴露于活化素A 4天后，>95%的细胞表达定形内胚层标记物CXCR4、c-KIT和EPCAM(图1b)(Yasunaga等人，Nat.Biotechnol.23,1542–1550(2005))。原肠胚形成后，定形内胚层形成具有明显前后轴特性的管(Zorn & Wells,Annu.Rev.Cell Dev.Biol.25,221–251(2009))。在定形内胚层中，多能标记物SOX2作为前肠标记物重现，而CDX2识别后肠(Sherwood等人，Dev.Dyn.238,29–42(2009))。在第5天除去培养物中的活化素A后，观察到CDX2和SOX2二者的表达均升高(图1a)，表明前后部定形内胚层的混合物的形成。因此，检测出在利于前部内胚层形成(SOX2+)和抑制后部内胚层形成(CDX2+)的定形内胚层诱导后添加哪个信号。
暴露于活化素A在胚状体中CXCR4+EPCAM+群的形成之后，离解胚状体，并铺板为单层。试验第5天时24个成形素和抑制剂组合的添加(图1c)，并在培养的第9天将FOXA2、SOX2、CDX2、TBX1(胃前部内胚层)(Graham,J.Exp.Zoolog.B Mol.Dev.Evol.310,336–344(2008)；Sherwood等人，Dev.Dyn.238,29–42(2009)；Peters等人，Genes Dev.12,2735–2747(1998))和PAX9(咽内胚层)(Rodewald,Annu.Rev.Immunol.26,355–388(2008)；Peters等人，Genes Dev.12,2735–2747(1998))的表达用作细胞特性读出(readout)。仅在作为BMP信号传导的生理抑制剂的头蛋白和作为活化素A/结点(nodal)和TGF-β信号传导的生理抑制剂的SB-431542的组合存在下诱导SOX2表达、抑制CDX2表达和维持FOXA2表达。此外，只有该条件诱导TBX1和PAX9的强烈表达(图1c)。在活化素A诱导阶段，细胞数增加4.5±1.9倍，而在头蛋白/SB-431542阶段，细胞又扩增了1.4±0.4倍。特别地，头蛋白/SB-431542处理在两个hiP S细胞系(HDF2和HDF9)中同样有效，均诱导SOX2、PAX9和TBX1(图1g-i)。多个FGF家族成员和WNT3a与其发育中的功能一致(Spence等人，Nature 470,105–109(2010)；Gadue等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103,16806–16811(2006)；Li等人，Genes Dev.22,3050–3063(2008))，如通过CDX2表达增加所示的那样，使定形内胚层后部化(Fig.1c)。然而，通过添加可溶性卷曲相关蛋白3(sFRP3)的WNT拮抗不足以诱导SOX2(图1c)。此外，sFRP3不与头蛋白/SB-431542协同，甚至对PAX9和SOX2的诱导产生不利影响(图1d)。添加头蛋白/SB-431542的时机是关键的，如仅在第5/6天均一的CXCR4+c-KIT+或CXCR4+EPCAM+群的形成在第9天诱导SOX2+FOXA2+群后，立即处理。早期施用终止原肠胚形成，而晚期施用难以下调后标记物CDX2。
FOXA2还在脊索(中胚层)中表达，并且FOXA2和SOX2被后脑底板(神经外胚层)共表达(Wood & Episkopou,Mech.Dev.86,197–201(1999)；Weinstein等人，Cell 78,575–588(1994))。此外，直接将头蛋白/SB-431542应用到hES细胞而不预先通过活化素A诱导内胚层将导向神经外胚层命运(Chambers等人，Nat.Biotechnol.27,275–280(2009))。因此，分析这些可选命运的存在。不出所料，当在第1天加入头蛋白/SB-431542时，神经外胚层标记物PAX6在培养物中表达，而BRACHYURY作为脊索和处于原肠胚阶段的细胞的标记物在早期内胚层诱导期间表达(图1e)。BRACHYURY或PAX6均未在暴露于头蛋白/SB-431542的定形内胚层中表达(图1e)，表明活化素A诱导的定形内胚层的头蛋白/SB-431542处理仅对AFE特异。
为了进一步评价是否头蛋白/SB-431542-诱导的内胚层细胞与之前所述的内胚层谱系不同，将第9天的头蛋白/SB-431542-处理的培养物与在有利于肝脏命运(前肠后部)的条件下生长9天的培养物进行比较。之前已显示后者在内胚层的活化素A诱导后需要BMP-4和bFGF(Gouon-Evans等人，Nat.Biotechnol.24,1402–1411(2006))。CDX2、后肠标记物EVX1、肝脏标记物CREB313和CEBPA以及ODD1(胃家(stomach domain)标记物)(Sherwood等人，Dev.Dyn.238,29–42(2009))的表达在“肝脏”条件下比在头蛋白/SB-431542条件下高，而对于作为对咽囊内胚层特异的内胚层中标记物的前部标记物TBX1、PAX9、SOX2和FGF8，情况却相反(Vitelli等人，Development 129,4605–4611(2002))(图1f)。因此，头蛋白/SB-431542处理对AFE细胞特异，这不同于在肝脏条件中特异的那些。
将头蛋白/SB-431542应用到活化素A-诱导的定形内胚层围绕空腔状(empty lumen-like)或包囊状(cyst-like)开口产生密集的细胞群落(colonies)。如果以高密度铺板，则在此群落中发现超过90%的细胞。事实上，所有细胞都共表达SOX2和FOXA2，尽管极少细胞仅表达FOXA2。所有群落对TBX1、PAX9和咽内胚层标记物FOXG1的染色呈阳性。当细胞在未添加因子的培养基中培养时绝不会看到在头蛋白/SB-431542-处理的培养物中所观察到的典型群落。在这些条件中，观察到>95%的细胞表达FOXA2，而仅极少数为SOX2+FOXA2+细胞。具有该形态的群落也从未在肝脏条件中观察到。在头蛋白/SB-431542或肝脏条件中平行培养的HES2衍生的内胚层细胞的比较免疫荧光分析揭示出只有头蛋白/SB-431542培养物的特征为强烈的SOX2、PAX9和TBX1表达。
总体而言，这些表达数据表明，头蛋白/SB-431542特异于在活化素A-诱导的定形内胚层中具有AFE表型的高度富集的细胞群。这些发现与无BMP拮抗剂腱蛋白的小鼠表现为前部截断的事实(Bachiller等人，Development 130,3567–3578(2003))相一致，也与活化素A-诱导的内胚层含有大量CDX2+后部内胚层的观察相一致(图1a)。
为了确定在头蛋白/SB-431542条件中培养的细胞的活体内潜能，将106个细胞移植到NOD/S CIDIl2rg-/-小鼠的肾包膜下。然而，未分化的HES2细胞形成含有源自所有三种胚层的细胞的畸胎瘤，头蛋白/SB-431542-处理的细胞产生缺乏可辨认的外胚层或中胚层成分的生长。观察到通过假复层上皮细胞(典型的为上呼吸道上皮细胞)或者包含一到三层核的更紊乱的上皮细胞排列的多内腔结构。后者始终对表面活性蛋白-C(SFTPC)(对肺中的II型肺泡细胞特异的标记物)染色。在hE S细胞来源的畸胎瘤中，未观察到SFTPC染色。剩余细胞对于FOXA2染色几乎一致。然而，除了在内腔结构中以外，FOXA2被限定于细胞质中，这可能是由于分化成FOXA2端AFE衍生物或者由于异种移植物中的异常FOXA2调控。还检测到了表达PAX9的细胞岛以及显示AIRE的离散核小点的稀有区域(特定于骨髓胸腺上皮细胞(Rodewald,Annu.Rev.Immunol.26,355–388(2008)))。在hES来源的畸胎瘤中，仅在软骨形成区域中观察到PAX9，并未观察到AIRE的表达。总体而言，这些数据表明，在这些条件中头蛋白/SB-431542-诱导的定形内胚层的发育潜能主要限定于AFE衍生物。
接下来，进一步使这些细胞分化。AFE经历背腹模式形成，导致来自腹面发育的中胚层的WNT、BMP和FGF信号的肺芽特化(Rodewald,Annu.Rev.Immunol.26,355–388(2008)；Morrisey & Hogan,Dev.Cell 18,8-23(2010))。在该阶段，SOX2表达在背侧保持较高，而NKX2.1(肺野和甲状腺野(Zorn & Wells,Annu.Rev.Cell Dev.Biol.25,221–251(2009)；Morrisey &Hogan,Dev.Cell 18,8–23(2010)))、NKX2.5(在腹侧咽内胚层中瞬时表达(Tanaka等人，Mol.Cell.Biol.21,4391–4398(2001)))和PAX1(在内胚层中特异性表达于咽囊中(Wallin等人，Development 122,23–30(1996)))为特异的腹侧标记物。用头蛋白/SB-431542延长处理到第13天导致SOX2的持续表达，表示背侧命运(图2a)，并与头蛋白在AFE中背侧表达，而BMP4腹侧表达的事实(Morrisey & Hogan,Dev.Cell 18,8–23(2010))相一致。相反，在培养第7天用WNT3a、KGF、FGF10、BMP4和EGF(所有因子，WKFBE)代替头蛋白/SB-431542导致SOX2的表达较低，并在第13天诱导腹侧标记物NKX2.1、PAX1和NKX2.5(图2a的HES细胞和图2d的HDF2和HDF9 hiPS细胞)。然而，未观察到早期甲状腺标记物PAX8的表达，暗示出NKX2.1的诱导表明负责肺命运，而不是甲状腺命运。此外，强烈诱导了呼吸道祖细胞标记物P63(Morrisey & Hogan,Dev.Cell 18,8–23(2010))(图2a)，而绝大多数细胞表达上皮标记物EPCAM(图2e)。单个因子的添加对于该转录诱导是不充分的。此外，只有预先暴露于头蛋白/SB-431542，并且不暴露于肝脏混合物，或者仅暴露于培养基才能够随后通过WKFBE上调PAX1、NKX2.1和NKX2.5(图2b)，表明活化素A-诱导的定形内胚层的头蛋白/SB-431542处理需要朝向腹侧AFE的命运分化。WKFBE腹面发育刺激的时机是关键的，如仅在第7天而不是第9天处理的培养物足以表达NKX2.1、PAX1和NKX2.5。此时，92±2%的细胞为FOXA2+SOXA2+(图2c)。免疫荧光揭示在WKFBE诱导后，37±6%的细胞表达NKX2.1。在活化素A-诱导的内胚层的头蛋白/SB-43154处理以及随后的WKFBE处理后，细胞扩增了8.95±3.3倍(图2c)。因此，头蛋白/SB-431542-诱导的AFE特异性负责响应活体外的腹面发育信号。
在培养的第13天或第19天将头蛋白/SB-431542-诱导的AFE暴露于WKFBE并不产生胸腺、甲状旁腺、甲状腺或肺的末端分化标记物的表达。由于这些细胞具有在活体内产生SFTPC+细胞的潜能，因此试图在活体外实现肺特化。与维甲酸在早期肺发育中的关键作用(Chen等人，J.Clin.Invest.120,2040–2048(2010))相一致，将维甲酸添加到WKFBE混合物中使咽囊标记物PAX1的表达降低，但使FOXP2、NKX2.1、GATA6和FOXJ1(暗示肺命运的标记物群)(Morrisey & Hogan,Dev.Cell 18,8–23(2010))(图3a)升高。为了增强SFTPC诱导，在第11天向在维甲酸存在下的腹面发育的AFE添加信号传导激动剂和拮抗剂的组合。在所检测的>400个组合中，WNT3a+FGF 10+FGF7在第19天诱导高水平的SFTPC mRNA(图3b)，与FGF10和Wnt信号传导对于远端肺发育是至关重要的发育观察(Morrisey & Hogan,Dev.Cell 18,8–23(2010))相一致。为了评价是否头蛋白/SB-431542-诱导的AFE能够形成咽囊衍生物，试图在无维甲酸下使用WKFBE使腹面发育的培养物来模式形成。与甲状旁腺发育需要音猬因子(SHH)和FGF8(Moore-Scott & Manley,Dev.Biol.278,323–335(2005))相一致，向AFE培养物的FGF8或SHH的添加诱导甲状旁腺特异标记物GCM2(图3b)。SHH和FGF8的作用并未增加，反映出活体内上位性研究表明在小鼠咽囊发育中Shh是Fgf8的上游(Moore-Scott&Manley,Dev.Biol.278,323–335(2005))。尽管并未全面试验所有的瞬时和信号传导的全突变(permutation)，但这些数据表明头蛋白/SB-431542-诱导的细胞能够分化为下游谱系，包括肺野和咽囊。
总体而言，这些数据显示，hES/hiPS细胞来源的定形内胚层中BMP和TGF-β信号传导的双重抑制使高度富集的AFE群特化，提供了用于直接将人类多能细胞分化成源自体内AFE的细胞类型和组织的体外方法。
参考文献
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9.Wang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104,4449–4454(2007).
其他实施方案
应理解的是，虽然参照本申请的详细说明描述了本发明，但前述说明书意于说明而不限定本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优势和修改均在权利要求书的范围内。
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Figure IDA00002650776900021
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Claims (51)

1.一种前部前肠内胚层细胞的富集细胞群。
2.根据权利要求1所述的细胞群，其包括至少约50%的前部前肠内胚层细胞。
3.根据权利要求1或2所述的细胞群，其中所述前部前肠内胚层细胞为咽内胚层细胞。
4.一种衍生前部前肠内胚层细胞的方法，所述方法包括用BMP抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂培养定形内胚层细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其包括用所述BMP抑制剂和所述TGF-β信号传导抑制剂培养所述定形内胚层细胞。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中在无活化素A下培养所述定形内胚层。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其中所述BMP抑制剂为头蛋白、腱蛋白或卵泡抑素。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述BMP抑制剂为头蛋白。
9.根据权利要求4-8任一项所述的方法，其中所述TGF-β信号传导抑制剂为SB431542。
10.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其中所述BMP为头蛋白，所述TGF-β信号传导抑制剂为SB-431542。
11.根据权利要求4-10任一项所述的方法，其中所述定形内胚层细胞为胚状体细胞。
12.根据权利要求4-11任一项所述的方法，其进一步包括在活化素A中培养所述定形内胚层细胞。
13.根据权利要求4-12任一项所述的方法，其中在无活化素A下用所述BMP抑制剂和所述TGF-β信号传导抑制剂培养所述定形内胚层细胞。
14.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中所述前部前肠内胚层细胞为人类细胞。
15.根据权利要求4-14任一项所述的方法，其中所述前部前肠内胚层细胞衍生自多能细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述多能细胞为ES细胞。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述多能细胞为iPS细胞。
18.根据权利要求15-17任一项所述的方法，其中所述多能细胞为人类细胞。
19.根据权利要求4-18任一项所述的方法，其中所述前部前肠内胚层细胞表达Foxa2，与在所述定形内胚层细胞中Sox2和Cdx2的表达相比，其包括升高的Sox2表达水平和降低的Cdx2表达水平。
20.一种由多能细胞制备前部前肠内胚层细胞的富集群的方法，其包括：
(i)在诱导所述多能细胞形成定形内胚层细胞的条件下培养所述多能细胞；和
(ii)在诱导所述定形内胚层细胞形成所述前部前肠内胚层细胞的条件下培养所述定形内胚层细胞，从而制备所述前部前肠内胚层细胞的富集群。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述多能细胞在bFGF、BMP4和活化素A的存在下培养，从而诱导所述多能细胞形成所述定形内胚层细胞。
22.根据权利要求20-21任一项所述的方法，其中所述定形内胚层细胞在BMP抑制剂或TGF-β信号传导抑制剂的存在下和在无活化素A下培养，从而诱导所述定形内胚层细胞形成所述前部前肠内胚层细胞。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述定形内胚层细胞在所述BMP抑制剂和所述TGF-β信号传导抑制剂的存在下和在无活化素A下培养，从而诱导所述定形内胚层细胞形成所述前部前肠内胚层细胞。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述BMP抑制剂为头蛋白或腱蛋白。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述BMP抑制剂为头蛋白。
26.根据权利要求22-25任一项所述的方法，其中所述TGF-β信号传导抑制剂的抑制剂为SB-431542。
27.根据权利要求20-26任一项所述的方法，其中将所述多能细胞培养1-4天。
28.根据权利要求20-27任一项所述的方法，其中将所述定形内胚层细胞为培养2-6天的细胞。
29.根据权利要求20-28任一项所述的方法，其进一步包括分离所述前部前肠内胚层细胞。
30.根据权利要求20-29任一项所述的方法，其中所述多能细胞为ES细胞。
31.根据权利要求20-29任一项所述的方法，其中所述多能细胞为iPS细胞。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述多能细胞为人类细胞。
33.一种前部前肠内胚层细胞，其由权利要求4-19任一项所述的方法衍生。
34.一种前部前肠内胚层细胞的富集群，其通过权利要求20-32任一项所述的方法制备。
35.一种影响前部前肠内胚层细胞增殖、分化或存活的试剂的鉴别方法，其包括在要试验的试剂存在下培养权利要求1-3任一项所述的细胞群，并比较所述细胞在所述试剂存在和不存在下的增殖、分化或存活，其中在所述试剂存在下的差异表示鉴别出影响所述细胞增殖、分化或存活的试剂。
36.一种参与细胞分化的基因的鉴别方法，其包括分离定形内胚层细胞和前部前肠内胚层细胞，并比较所述定形内胚层细胞和所述前部前肠内胚层细胞的基因表达谱，其中鉴别出在所述定形内胚层细胞和所述前部前肠内胚层细胞之间差异表达的基因表示参与细胞分化的基因。
37.一种抗体的鉴别方法，所述抗体识别从定形内胚层向前部前肠内胚层发展的分子标记物，所述方法包括将抗体温育于权利要求1所述的富集细胞群，并筛选出与所述前部前肠内胚层的结合显著高于与所述定形内胚层的结合的抗体。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述抗体不能显著结合到所述定形内胚层。
39.根据权利要求1-3任一项所述的细胞群，其中所述前部前肠内胚层细胞为腹面发育的前部前肠内胚层细胞。
40.一种诱导前部前肠内胚层腹面发育的方法，其包括用选自由Wnt配体、Wnt信号传导激活剂、BMP、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)组成的组中的一种或多种因子来培养所述前部前肠内胚层。
41.根据权利要求40所述的方法，其包括用选自由Wnt配体、Wnt信号传导激活剂、BMP、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)组成的组中的两种或多种因子来培养所述前部前肠内胚层。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述因子选自由FGF7、FGF10、EGF、BMP-4和Wnt3a组成的组。
43.一种在细胞中诱导肺命运的方法，其包括在维甲酸的存在下用选自由Wnt配体、Wnt信号传导激活剂、BMP、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)组成的组中的一种或多种因子来培养通过权利要求4-32任一项所述的方法所产生的前部前肠内胚层细胞，从而诱导所述腹面发育的前部前肠内胚层细胞呈现所述肺命运。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述呈现所述肺命运细胞的细胞表达一种或多种肺标记物。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述一种或多种肺标记物为Gata6或表面活性蛋白C(SP-C)。
46.根据权利要求43所述的方法，其中通过用选自由Wnt配体、Wnt信号传导激活剂、BMP、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)组成的组中的一种或多种因子培养前部前肠内胚层来诱导所述腹面发育的前部前肠内胚层细胞。
47.根据权利要求46所述的方法，其中通过用选自由Wnt配体、Wnt信号传导激活剂、BMP、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)组成的组中的两种或多种因子培养前部前肠内胚层来诱导所述腹面发育的前部前肠内胚层细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中通过用选自由Wnt配体、Wnt信号传导激活剂、BMP、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)组成的组中的两种或多种因子培养前部前肠内胚层来诱导所述腹面发育的前部前肠内胚层细胞。
49.一种在细胞中诱导甲状旁腺命运的方法，其包括用音猬因子(SHH)和成纤维细胞生长因子(FGF)培养腹面发育的前部前肠内胚层细胞。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述呈现所述甲状旁腺命运细胞的细胞表达甲状旁腺标记物。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述甲状旁腺标记物为GCMB。
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