CN102834407B - 亲和色谱用填充剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供含有蛋白质的动态结合容量高且压力特性优异的多孔粒子的、对蛋白质纯化有用的亲和色谱用填充剂。本发明的亲和色谱用填充剂的特征在于,具有:由乙烯基单体的聚合物形成的多孔粒子、结合于上述多孔粒子的配体、以及开环环氧基,所述乙烯基单体包括:含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体和含有环氧基的非交联性乙烯基单体、或者含有羟基和环氧基的交联性乙烯基单体。
Description
技术领域
本发明涉及亲和色谱用填充剂。尤其涉及含有蛋白质的动态结合容量高且压力特性优异的多孔粒子的、对蛋白质纯化有用的亲和色谱用填充剂。
背景技术
亲和色谱法在包括单克隆抗体的蛋白质的研究、开发和制造中承担着重要的作用。亲和色谱用填充剂一般包含具有选择性地与靶分子结合的配体的固相载体。就亲和色谱法而言,固相载体上的配体对于靶分子具有高选择性,因此,与离子色谱法、凝胶过滤色谱法、反相液体色谱法等其它色谱法相比,可以进行收率优异以及高速且经济的纯化。
亲和色谱用填充剂的固相载体主要使用琼脂糖粒子(专利文献1、2)。琼脂糖粒子由于其高亲水性,因此配体的活性高,对于靶分子的动态结合容量高。
作为其它亲和色谱用填充剂的固相载体,有时使用由苯乙烯-二乙烯基苯的聚合物形成的多孔粒子(专利文献3、4)。由苯乙烯-二乙烯基苯这样的乙烯基单体的聚合物形成的多孔粒子一般来说弹性模量高,压力特性优异。
另外,为了兼顾亲和色谱用填充剂中的高动态结合容量和压力特性,也提出了将琼脂糖这样的糖链结合于由乙烯基单体的聚合物形成的多孔粒子的细孔而得到的粒子(专利文献5)。
另一方面,虽然有将由含有羟基的交联性乙烯基单体的聚合物形成的多孔粒子用于色谱法的例子,但它们均仅适合于以分析为目的的凝胶过滤色谱法、反相液体色谱法(专利文献6~8)。
专利文献1:日本特表2008-523140号公报
专利文献2:日本特表2009-522580号公报
专利文献3:日本特开平8-278299号公报
专利文献4:日本特表平10-501173号公报
专利文献5:日本特开2008-232764号公报
专利文献6:日本特开2002-239380号公报
专利文献7:日本特开2003-176363号公报
专利文献8:日本特开2000-187028号公报
发明内容
但是,琼脂糖粒子一般弹性模量低,因此具有在高速流过介质时柱的压力变高这个缺点,从而压力特性较差。另外,琼脂糖粒子一般是从天然的海草经过长的复杂工序而制造成的,因此具有难以获得恒定质量的琼脂糖粒子这个缺点。另一方面,由苯乙烯-二乙烯基苯这样的乙烯基单体的聚合物形成的多孔粒子的亲水性低,因此,配体的活性低,从而具有对靶分子的动态结合容量低这个缺点。另外,将琼脂糖这样的糖链结合于由乙烯基单体的聚合物形成的多孔粒子的细孔而得到的粒子与琼脂糖粒子同样地是经过长的复杂工序而制造成的,因此,具有可以作为亲和色谱使用的质量的粒子昂贵、或难以获得恒定质量的粒子的缺点。进而,在现有的凝胶过滤色谱法、反相液体色谱法中使用的、由含有羟基的交联性乙烯基单体的聚合物形成的多孔粒子不能达到兼顾作为亲和色谱用填充剂的高动态结合容量和压力特性。
于是,本发明的目的在于提供蛋白质的动态结合容量高、压力特性也优异、对蛋白质纯化有用的亲和色谱用填充剂。
本发明的一个方式所涉及的亲和色谱用填充剂其特征在于,具有:
由乙烯基单体的聚合物形成的多孔粒子,所述乙烯基单体包括:含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体和含有环氧基的非交联性乙烯基单体、或者含有羟基和环氧基的交联性乙烯基单体,
结合于上述多孔粒子的配体,以及
开环环氧基。
在上述亲和色谱用填充剂中,上述配体可以是含有至少1个蛋白A、蛋白A的免疫球蛋白结合域、或者其变异体的蛋白质。
在上述亲和色谱用填充剂中,上述乙烯基单体可以由以下构成:
(X-1)含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体20~90质量份、
(X-2)不含有羟基和环氧基的交联性乙烯基单体0~40质量份、
(M-1)含有环氧基的非交联性乙烯基单体1~40质量份、以及
(M-2)不含有环氧基的非交联性乙烯基单体0~70质量份
(其中,(X-1)、(X-2)、(M-1)和(M-2)的合计是100质量份)。
在上述亲和色谱用填充剂中,上述开环环氧基可以利用硫甘油使上述聚合物所含有的环氧基开环而获得。
在上述亲和色谱用填充剂中,上述多孔粒子可以将上述乙烯基单体100质量份与以(P-1)为必需成分的水系混合物悬浮聚合而获得,所述(P-1)是选自碳原子数为7~14的直链状、支链状以及环状的醇、醚、醛、酮、酯、碳原子数为8~10的烷基苯中的至少1种的致孔剂(其中,致孔剂的合计量是100~400质量份,(P-1)在致孔剂的合计量100质量%中为10质量%以上)。
在上述亲和色谱用填充剂中,利用压汞仪对相当于孔径为10~5000nm范围的细孔进行测定时上述多孔粒子的细孔容积可以是1.00~1.90ml/g。
在上述亲和色谱用填充剂中,上述多孔粒子的粒径可以是35~100μm。
本发明的另一方式所涉及的离析免疫球蛋白的方法包括:
利用上述亲和色谱用填充剂使免疫球蛋白吸附于上述填充剂的工序,以及
使上述免疫球蛋白溶出的工序。
本发明的另一方式所涉及的柱是填充有上述亲和色谱用填充剂的亲和色谱法用填充柱。
利用本发明所涉及的亲和色谱用填充剂,可以提供蛋白质的动态结合容量高、且压力特性优异、对蛋白质纯化有用的亲和色谱用填充剂。
附图说明
图1是表示本发明的实施例1中制备的免疫球蛋白结合蛋白质(SP4Z)的氨基酸序列的图。
图2是说明在表达载体(pETM-11)中***的、编码本发明的实施例1所涉及的免疫球蛋白结合蛋白质的DNA片段的构成的图。
图3是表示本发明的实施例2中制备的免疫球蛋白结合蛋白质(SPATK)的氨基酸序列的图。
图4是说明在表达载体(pETM-11)中***的、编码本发明的实施例2所涉及的免疫球蛋白结合蛋白质的DNA片段的构成的图。
具体实施方式
下面,对于本发明的亲和色谱用填充剂进行具体地说明。
1.亲和色谱用填充剂
本发明的亲和色谱用填充剂具有:
由乙烯基单体的聚合物形成的多孔粒子,所述乙烯基单体包括:含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体和含有环氧基的非交联性乙烯基单体、或含有羟基和环氧基的交联性乙烯基单体,
结合于上述多孔粒子的配体,以及
开环环氧基。
1.1.多孔粒子的构成
构成本发明的亲和色谱用填充剂的多孔粒子是由以含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体和含有环氧基的非交联性乙烯基单体为必需成分的乙烯基单体的共聚物、或者仅以含有羟基和环氧基的交联性乙烯基单体为必需成分的乙烯基单体的均聚物形成的载体粒子。由于该聚合物所含有环氧基,因此,配体结合前的由该聚合物形成的多孔粒子含有环氧基。配体结合前的多孔粒子的环氧基含量是0.05~4.0mmol/g。
1.1.1.含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体
含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体是在1分子中具有2个以上聚合性乙烯基(具有乙烯性不饱和键的基团)和1个以上羟基、且不具有环氧基的交联性单体。通过使用含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体将多孔粒子亲水化并控制成适合的弹性模量,可以获得蛋白质的动态结合容量高、且压力特性优异的亲和色谱用填充剂。
作为含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体,优选为脂肪族聚乙烯基单体,进一步优选为多元醇的(甲基)丙烯酸酯。作为含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体,具体地可以举出甘油二(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基乙烷二(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷二(甲基)丙烯酸酯、丁三醇二(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇二(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇三(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇二(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇三(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇四(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇五(甲基)丙烯酸酯、肌醇二(甲基)丙烯酸酯、肌醇三(甲基)丙烯酸酯、肌醇四(甲基)丙烯酸酯等。除此之外还可以举出各种糖类2取代以上的(甲基)丙烯酸酯,例如还可以举出葡萄糖二(甲基)丙烯酸酯、葡萄糖三(甲基)丙烯酸酯、葡萄糖四(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇二(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇三(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇四(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇五(甲基)丙烯酸酯等。还可以进一步举出二氨基丙醇、三(羟甲基)氨基甲烷、葡糖胺等具有与多元氨基醇和(甲基)丙烯酸的脱水缩合反应物相同结构的含有羟基的交联性乙烯基单体等。作为含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体,特别优选为甘油二(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇三(甲基)丙烯酸酯、肌醇三(甲基)丙烯酸酯,最优选为甘油二(甲基)丙烯酸酯。如果考虑耐碱性,则优选甲基丙烯酸酯类、丙烯酰胺类、甲基丙烯酰胺类。考虑耐碱性时,特别优选的含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体是甘油二甲基丙烯酸酯、季戊四醇三甲基丙烯酸酯、肌醇三甲基丙烯酸酯,最优选的是甘油二甲基丙烯酸酯。
1.1.2.含有环氧基的非交联性乙烯基单体
含有环氧基的非交联性乙烯基单体是在1分子中具有1个聚合性乙烯基和1个以上环氧基的非交联性单体。含有环氧基的非交联性乙烯基单体具有的环氧基的数量优选在1分子中为1~3个,更优选为1个。含有环氧基的非交联性乙烯基单体是用于在多孔粒子的配体结合前导入合适量的环氧基的必需成分,所述多孔粒子由包含含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体和含有环氧基的非交联性乙烯基单体的乙烯基单体的共聚物获得。
作为含有环氧基的非交联性乙烯基单体,可以在工业上容易地获得在1分子中具有1个聚合性乙烯基和1个环氧基的非交联性单体。作为这样的含有环氧基的非交联性乙烯基单体,例如可以举出(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸4-羟基丁酯缩水甘油醚、(甲基)丙烯酸3,4-环氧环己基甲酯、α-(甲基)丙烯酰基-ω-缩水甘油基聚乙二醇等(甲基)丙烯酸酯类;乙烯基苄基缩水甘油醚等芳香族乙烯基化合物;烯丙基缩水甘油醚、3,4-环氧基-1-丁烯、3,4-环氧基-3-甲基-1-丁烯等,特别优选(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸4-羟基丁酯缩水甘油醚。
除此之外,作为乙烯基单体,可以单独使用含有羟基和环氧基的交联性乙烯基单体来代替含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体和含有环氧基的非交联性乙烯基单体。作为含有羟基和环氧基的交联性乙烯基单体,例如可以例示季戊四醇二(甲基)丙烯酸酯缩水甘油醚、肌醇二(甲基)丙烯酸酯缩水甘油醚、肌醇三(甲基)丙烯酸酯缩水甘油醚等。此外,可以将含有羟基和环氧基的交联性乙烯基单体、与上述含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体和含有环氧基的非交联性乙烯基单体一起使用。
1.1.3.优选的乙烯基单体
乙烯基单体优选由以下构成:
(X-1)含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体20~90质量份、
(X-2)不含有羟基和环氧基的交联性乙烯基单体0~40质量份、
(M-1)含有环氧基的非交联性乙烯基单体1~40质量份、以及
(M-2)不含有环氧基的非交联性乙烯基单体0~70质量份
(其中,(X-1)、(X-2)、(M-1)和(M-2)的合计是100质量份)。
(X-1)含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体的具体例、优选例是如在上述1.1.1.含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体中所述的内容。(X-1)优选为20~90质量份,更优选为25~85质量份,最优选为30~80质量份。如果(X-1)含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体为20质量份~90质量份,则蛋白质的动态结合容量优异。
(X-2)不含有羟基和环氧基的交联性乙烯基单体是在1分子中具有2个以上聚合性乙烯基、不具有羟基和环氧基的交联性单体。(X-2)不含有羟基和环氧基的交联性乙烯基单体补充(X-1)含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体而使用,并控制成合适的弹性模量,由此有时可以提高压力特性。作为(X-2)不含有羟基和环氧基的交联性乙烯基单体,优选为芳香族聚乙烯基单体、脂肪族聚乙烯基单体,作为芳香族聚乙烯基单体,优选二乙烯基苯,作为脂肪族聚乙烯基单体,优选多元(甲基)丙烯酸酯化合物。作为多元(甲基)丙烯酸酯化合物,例如可以举出乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、1,4-丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1,6-己二醇二(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇四(甲基)丙烯酸酯等,特别优选三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯。(X-2)不含有羟基和环氧基的交联性乙烯基单体优选为0~40质量份,更优选为0~20质量份。如果(X-2)超过40质量份,则有时蛋白质的动态结合量降低。
(X-1)含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体与(X-2)不含有羟基和环氧基的交联性乙烯基单体有时作为混合物在工业上供给,在本发明的范围内,也可以将它们直接使用。
(M-1)含有环氧基的非交联性乙烯基单体的具体例、优选例是如在上述1.1.2.含有环氧基的非交联性乙烯基单体中所述的内容。(M-1)含有环氧基的非交联性乙烯基单体优选为1~40质量份,更优选为2~30质量份,最优选为3~15质量份。如果(M-1)含有环氧基的非交联性乙烯基单体为1质量份~40质量份,则由得到的聚合物形成的多孔粒子所含有的环氧基含量为合适的量。
作为(M-2)不含有环氧基的非交联性乙烯基单体,优选亲水性乙烯基单体,进一步优选含有羟基的非交联性乙烯基单体。作为(M-2)不含有环氧基的非交联性乙烯基单体,在使用亲水性单体时,补偿亲和色谱用填充剂的亲水性,从而有时能够表现靶分子的高动态结合容量。在亲水性乙烯基单体之中,作为不含有羟基的非交联性亲水性乙烯基单体,例如可以举出二甲基丙烯酰胺、丙烯酰基吗啉、(甲基)丙烯酸甲氧基乙酯、双丙酮(甲基)丙烯酰胺、N-乙烯基-2-吡咯烷酮等。作为含有羟基的非交联性乙烯基单体,例如可以举出甘油单(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基乙烷单(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷单(甲基)丙烯酸酯、丁三醇单(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇单(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇单(甲基)丙烯酸酯、肌醇单(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸羟基乙酯、羟乙基(甲基)丙烯酰胺等,优选甘油单甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟基乙酯、羟乙基丙烯酰胺、聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯,最优选甘油单甲基丙烯酸酯。(M-2)不含有环氧基的非交联性乙烯基单体优选为0~70质量份,更优选为超过0质量份且40质量份以下。如果(M-2)超过70质量份,则有时压力特性差。
作为优选的乙烯基单体中合适的量比的具体例,可以举出由
(X-1)含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体25~85质量份、
(X-2)不含有羟基和环氧基的交联性乙烯基单体0~20质量份、
(M-1)含有环氧基的非交联性乙烯基单体2~30质量份、以及
(M-2)不含有环氧基的非交联性乙烯基单体0~70质量份
构成的乙烯基单体,
或者由
(X-1)含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体30~80质量份、
(X-2)不含有羟基和环氧基的交联性乙烯基单体0~20质量份、
(M-1)含有环氧基的有非交联性乙烯基单体3~15质量份、以及
(M-2)不含有环氧基的非交联性乙烯基单体超过0质量份且40质量份以下
构成的乙烯基单体。其中,在任一乙烯基单体的具体例中,(X-1)、(X-2)、(M-1)和(M-2)的合计均是100质量份。
1.1.4.多孔粒子的制造
多孔粒子可以通过公知的接种聚合、悬浮聚合等来制造。作为接种聚合法,也优选使用日本特公昭57-24369号公报记载的二阶段溶胀聚合法。在聚合时,除了上述单体以外,将水、致孔剂作为必需成分,根据需要地使用聚合引发剂、高分子分散剂、表面活性剂、盐、接种粒子、水溶性聚合抑制剂等。
多孔粒子的制造中优选的聚合法是以上述乙烯基单体100质量份与(P-1)为必需成分的水系混合物的悬浮聚合法,所述(P-1)是选自碳原子数为7~14的直链状、支链状以及环状的醇、醚、醛、酮、酯、碳原子数为8~10的烷基苯中的至少1种的致孔剂。
此时,可以进一步并用作为(P-2)的(P-1)以外的致孔剂。相对于100质量份单体,致孔剂的用量优选合计为100~400质量份。(P-1)的用量优选在致孔剂的合计量100质量%中为10质量%以上。
具体地例示(P-1)的致孔剂,
作为醇,可以举出1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、4-庚醇、2,4-二甲基-3-戊醇、5-甲基-2-己醇、2-乙基-1-己醇、2-辛醇、3-辛醇、5-甲基-3-庚醇、1-壬醇、3,5,5-三甲基己醇;
作为醚,可以举出己基甲基醚、二丁基醚、桉树脑;
作为醛,可以举出庚醛、辛醛、2-乙基-1-己醛、壬醛、3,5,5-三甲基己醛、1-癸醛、十二烷醛;
作为酮,可以举出2-庚酮、3-庚酮、4-庚酮、2,4-二甲基-3-戊酮、4,4-二甲基-2-戊酮、5-甲基-2-己酮、2-辛酮、3-辛酮、5-甲基-3-庚酮、2,6-二甲基-4-庚酮、2-壬酮、3-壬酮、4-壬酮、3,3,5-三甲基环己酮、2-癸酮、3-癸酮、2-十一烷酮、4-叔戊基环己酮、2-己基环戊酮、2-庚基环戊酮、二环己基酮;
作为酯,可以举出甲酸己酯、乙酸戊酯、乙酸异戊酯、丙酸丁酯、丙酸异丁酯、丁酸丙酯、丁酸异丙酯、异丁酸丙酯、异丁酸异丙酯、戊酸乙酯、异戊酸乙酯、新戊酸乙酯、己酸甲酯、乙酸己酯、乙酸环己酯、乙酸-2-乙基丁酯、丙酸异戊酯、丁酸丁酯、异丁酸丁酯、丁酸异丁酯、异丁酸异丁酯、戊酸丙酯、异戊酸丙酯、己酸乙酯、庚酸甲酯、乙酸庚酯、丙酸己酯、丁酸戊酯、丁酸异戊酯、异丁酸戊酯、异丁酸异戊酯、戊酸异丁酯、己酸丙酯、己酸异丙酯、庚酸乙酯、辛酸甲酯、乙酸辛酯、乙酸异辛酯、乙酸-2-乙基己酯、丁酸己酯、丁酸环己酯、戊酸戊酯、异戊酸异戊酯、己酸丁酯、己酸异丁酯、辛酸乙酯、壬酸甲酯、乙酸壬酯、己酸戊酯、壬酸乙酯、2-乙基己酸丙酯、3,5,5-三甲基己酸乙酯、癸酸甲酯、δ-十二内酯、乙酸癸酯、癸酸乙酯、乙酸香茅酯、十二烷酸甲酯、乙酸十二烷基酯、十二烷酸乙酯;
作为烷基苯,可以举出二甲苯、乙基苯、异丙基苯、正丙基苯、正丁基苯、叔丁基苯、仲丁基苯、异丁基苯、乙基甲苯、甲基异丙基苯、等。
作为(P-1)的致孔剂,从不阻碍亲水性、且能够很高地维持配体的活性考虑,优选醇、醚、醛、酮、酯,进一步优选酮、酯,最优选碳原子数为7~10的酮、酯。
(P-2)是(P-1)以外的致孔剂,是可以为了调整多孔粒子的细孔容积而加入的成分。20℃时(P-2)在水中的溶解度优选为20%以下。
作为致孔剂的构成,如果以(P-2)致孔剂、即碳原子数低于7的直链和支链的醇、醚、醛、酮、酯、碳原子数低于8的烷基苯为主成分,则不能成为适于蛋白质分离等的大小的细孔径,而且有时细孔容积变小。另外,如果以碳原子数超过14的醇、醚、醛、酮、酯、或者碳原子数超过10的烷基苯为主成分,则有时细孔容积变小或者形成非多孔的微小粒子。
相对于上述单体总量100质量份,包含(P-1)的致孔剂的合计量通常为100~400质量份,优选为150~300质量份。如果致孔剂的合计量低于100质量份,则不能成为适于蛋白质分离等的大小的细孔径,而且有时细孔容积变小。如果致孔剂的合计量超过400质量份,则细孔容积变得过大或者形成非多孔的微小粒子。
(P-1)优选相对于致孔剂的合计量为10质量%以上,优选为20质量%以上。如果(P-1)在致孔剂的合计量中为10质量%以下,则有时细孔容积变小。
悬浮聚合时的聚合溶剂是水。在不损害本发明效果的范围,水中可以含有醇等有机溶剂等。相对于100质量份单体总量,水的量优选为200~10000质量份,更优选为500~5000质量份。如果水的量为上述范围内,则聚合中粒子彼此的合一受到抑制,易于控制粒径的,生产率优异。
作为聚合引发剂,可以使用过硫酸钾、过硫酸钠、过硫酸铵等过硫酸盐、过氧化氢、叔丁基过氧化氢、叔丁基过氧马来酸、过氧琥珀酸、2,2’-偶氮双〔2-N-苄基脒基〕丙烷盐酸盐等水溶性引发剂;过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰、氢过氧化枯烯、过氧化二碳酸二异丙酯、过氧化新癸酸异丙苯酯、过氧化辛酸异丙苯酯、过氧化2-乙基己酸叔丁酯、3,5,5-过氧化三甲基己酰、偶氮双异丁腈、偶氮双异戊腈等油溶性引发剂;并用了有机过氧化物和亚硫酸钠、雕白粉、抗坏血酸钠等还原剂的氧化还原系引发剂等,优选为油溶性引发剂或者油溶性的氧化还原引发剂,从生产率方面考虑,更优选为油溶性引发剂。相对于100质量份单体总量,引发剂的量优选为0.01~10质量份,更优选为0.05~5质量份。这些聚合引发剂可以溶解在水、单体混合物或者致孔剂中而提供给聚合体系,也可以单独添加到室温和加热中的聚合体系。使用过硫酸盐等在聚合中显示成酸性或者碱性的引发剂、且必须防止环氧基水解时,优选在将pH维持在中性附近的缓冲溶液中进行悬浮聚合。通过照射紫外线、电子束等,也可以不使用引发剂地进行悬浮聚合,也可以使用公知的光自由基引发剂。
作为高分子分散剂,可以使用皂化度为80~95%的聚乙烯基醇、聚乙烯基吡咯烷酮等水溶性聚合物。
作为表面活性剂,可以使用十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、聚氧乙烯十二烷基醚硫酸酯盐等阴离子性表面活性剂、聚氧乙烯烷基醚等非离子性表面活性剂等。
作为盐,可以优选使用氯化钠、硫酸钠、碳酸钠等。
作为接种粒子,可以使用重均分子量为1,000~100,000左右的聚苯乙烯粒子、聚(甲基)丙烯酸烷基酯粒子等。
作为水溶性聚合抑制剂,可以优选使用碘化钾等碘化物盐、亚硝酸钠等亚硝酸盐、硫代硫酸钠等硫代硫酸盐、磺化萘氢醌铵盐等水溶性醌化合物等。
在接种聚合中,通过调整接种粒子的大小和量、单体的量、致孔剂的量,可以获得具有作为本发明的亲和色谱用填充剂所必需的粒径的多孔粒子。在悬浮聚合中,通过调整高分子分散剂和表面活性剂的种类和量、搅拌速度、搅拌桨和聚合容器的形状和大小,可以获得作为本发明的亲和色谱用填充剂所必需的粒径的多孔粒子。
多孔粒子的细孔容积通过改变单体与致孔剂之比来调节是公知的。除此之外,也可以通过在聚合时使用的盐、聚合抑制剂的种类和量、聚合温度等来调节多孔粒子的细孔容积。作为亲和色谱用填充剂的多孔粒子的细孔容积,可以通过配体结合前的多孔粒子的细孔容积和结合的配体的量来调节。
使用氧化还原系引发剂以外的引发剂时,聚合的温度和时间优选为40~100℃、30分钟~24小时,更优选为60~90℃、1~10小时。
聚合完成后,从后述的配体易于结合方面考虑,优选使用接种粒子和/或致孔剂的良溶剂来洗涤。作为洗涤溶剂,可以优选使用丙酮、乙醇、异丙醇等。另外,可以根据需要地在洗涤前后使用超声波分散机等来分散多孔粒子。从提高压力特性、提高蛋白质等的动态结合容量方面考虑,优选进一步采用倾析、过滤等方法来除去小粒子、粗大粒子。
1.1.5.环氧基含量
配体结合前的多孔粒子含有的环氧基是用于结合配体的官能团,而且还是在进一步开环后提高作为亲和色谱用填充剂的亲水性的原因的官能团。配体结合前的多孔粒子的环氧基含量是0.05~4.0mmol/g,优选为0.08~2.5mmol/g,最优选为0.10~1.5mmol/g。如果配体结合前的多孔粒子的环氧基含量为0.05mmol/g以上,则配体的结合量是适当的,蛋白质动态结合容量的降低被抑制。如果配体结合前的多孔粒子的环氧基含量为4.0mmol/g以下,则在保存中的配体活性的降低被抑制,蛋白质动态结合容量的降低也被抑制。配体结合前的多孔粒子的环氧基含量可以通过以下方式来定量:在多孔粒子中过量地添加盐酸而对盐酸进行加成反应来将环氧基开环,用过量的氢氧化钠水溶液中和残余的盐酸后,用盐酸对残余的氢氧化钠进行反滴定。配体结合前多孔粒子的环氧基含量可以通过含环氧基的乙烯基单体的量、聚合温度、聚合时间、聚合液的pH、进而聚合后的开环处理等来调整。
1.2.亲和色谱用填充剂的构成
本发明的亲和色谱用填充剂包含上述多孔粒子、结合于上述多孔粒子的配体、和开环环氧基。
作为本发明的亲和色谱用填充剂的一个实施方式,包含配体结合多孔粒子,该配体结合多孔粒子将配体结合于由上述特定聚合物形成的多孔粒子,并具有使该聚合物所含有的环氧基开环而得到的开环环氧基。
上述配体结合多孔粒子的体积平均粒径优选为35~100μm,并且利用压汞仪测定相当于孔径为10~5000nm范围的细孔时的细孔容积优选为1.00~1.90ml/g。
1.2.1.配体
对于配体,只要对靶物质具有适度亲和性,则其种类没有特别限定,例如可以使用蛋白A、蛋白G、抗生物素蛋白等的蛋白质;胰岛素等肽;单克隆抗体等抗体;酶;荷尔蒙;DNA;RNA;肝素、路易斯X、神经节苷酯等糖类;亚氨基二乙酸、合成色素、2-氨基苯基硼酸、4-氨基苯甲脒、谷胱甘肽、生物素、生物素衍生物这样的低分子化合物。在上述例示的配体可以使用其全部,也可以使用通过重组体、酶处理等而得到的其片段。另外,也可以是人工合成的肽、肽衍生物。
作为分离或者纯化免疫球蛋白优选的配体,例如为蛋白A和蛋白G,进一步优选为蛋白A的免疫球蛋白结合域,最优选为在蛋白A的免疫球蛋白结合域的末端加成含有连续4个以上组氨酸单元的肽而得到的蛋白质,作为这样的蛋白质,例如可以举出后述的通式(1)或者通式(2)表示的免疫球蛋白结合蛋白质。
应予说明,在本发明中,所谓“蛋白质”是指具有肽结构单元的所有分子,例如为包含人为地改变天然型蛋白质的部分片断、天然型蛋白质的氨基酸序列的变异体的概念。另外,所谓“免疫球蛋白结合域”表示单独具有免疫球蛋白结合活性的多肽功能单元,所谓“免疫球蛋白结合蛋白质”表示对免疫球蛋白具有特异性的亲和性、且包含“免疫球蛋白结合域”的蛋白质。所谓“免疫球蛋白结合”表示结合在免疫球蛋白分子的互补性决定区域(CDR)以外的区域、尤其是Fc片段。在本发明中,与亲和色谱法有关而使用的用语“配体”表示与亲和色谱法的靶物质结合的部分。
1.2.2.免疫球蛋白结合域
蛋白A的免疫球蛋白结合域可以是天然型免疫球蛋白结合域,或者也可以是重组型的免疫球蛋白结合域。蛋白A的免疫球蛋白结合域优选为选自A域、B域、C域、D域、E域、以及Z域中的至少1种。A域、B域、C域、D域、以及E域的氨基酸序列记载在例如、MoksT,AbrahmsL,etal.,StaphylococcalproteinAconsistsoffiveIgG-bindingdomains,EurJBiochem.1986,156,637-643的Fig.1中。该文献由于该参照而包含在公开中。另外,与在上述文献中记载的各域氨基酸序列具有70%以上(优选为90%以上)同源性的氨基酸序列形成的蛋白质也能够作为本发明中的蛋白A的免疫球蛋白结合域使用。
重组型免疫球蛋白结合域在免疫球蛋白结合活性中可以作为与改变前的免疫球蛋白结合域同等的结合域来处理,例如优选保持与天然型蛋白A的免疫球蛋白结合域的氨基酸序列具有70%以上(优选为90%以上)的同源性。作为具体例,可以举出在NilssonB.etal.,蛋白·工程(Proteinengineering),1987年,第1卷,2号,107-113页中记载的Z域(序列号1)、由HoberS等带来的在美国专利申请2006/0194955A1中记载的具有碱耐受性的Z域的变异体(mutant)。
在本发明的亲和色谱用填充剂中使用的配体可以具有多个相同或者不同种类的免疫球蛋白结合域。
例如,作为蛋白A的免疫球蛋白结合域,上述配体可以为(D域-A域)n(在此,n表示1以上的整数(优选为1~6),在D域与A域之间可以存在任意的氨基酸序列),即,可以包含含有A域和D域的重复单元。另外,由于本发明的亲和色谱用填充剂在使用时具有与碱水溶液接触的机会,因此,上述配体可以包含含有蛋白A的Z域的重复单元。
另外,在本发明中,配体可以将上述各域、或者其片段或者变异体单独含有或者组合含有2个以上。
在本发明中,所谓免疫球蛋白结合域的片段,是指具有该域的氨基酸序列的一部分、且具有免疫球蛋白结合活性的片段。优选免疫球蛋白结合域的片段是指与该域的氨基酸序列具有90%以上、更优选为具有95%以上的序列同一性、且具有免疫球蛋白结合活性的片段。另外,在本发明中,所谓免疫球蛋白结合域的变异体是指优选与该域的氨基酸序列具有90%以上、更优选具有95%以上序列同一性、且具有免疫球蛋白结合活性的变异体。
免疫球蛋白结合域可以包含选自例如Z域、或其片段或者变异体中的至少1个。对于Z域,记载在NilssonB.etal.,蛋白·工程(Proteinengineering),1987年,第1卷,2号,107-113页中。
另外,在本发明中,配体可以将Z域、或其片段或者变异体单独含有或者组合含有2个以上(优选为4~10个)。
作为Z域的变异体,例如可以举出具有在专利第4391830号中记载的序列的蛋白质。例如,在专利第4391830号的权利要求1中记载了含有序列号1中规定的2个以上重复单元(Z域)、23位的氨基酸残基是苏氨酸的蛋白质。
另外,所谓Z域的片段(Z片段)是指具有Z域的氨基酸序列的一部分、且具有免疫球蛋白结合活性的片段,例如,优选具有Z域的氨基酸序列的90%以上,更优选具有95%以上。另外,所谓Z域的变异体是指与例如Z域的氨基酸序列具有90%以上同源性、且具有免疫球蛋白结合活性的变异体,优选具有95%以上同源性。Z域的变异体优选与Z域比较改良碱耐受性。这种情况下,Z域的变异体与Z域比较是否改良碱耐受性可以通过后述的实施例记载的方法来确认。
1.2.3.免疫球蛋白结合蛋白质1
作为优选的配体一个例子的免疫球蛋白结合蛋白质(以下,也称为“蛋白质1”)以下述通式(1)表示。
R-R2·····(1)
(式(1)中,R表示含有4~20个组氨酸连续的部位的由4~300个氨基酸形成的氨基酸序列,R2表示含有至少1个蛋白A的免疫球蛋白结合域的由50~500个氨基酸形成的氨基酸序列(在此,R2结合于R的末端是免疫球蛋白结合域的C末端或者N末端)。)
在上述通式(1)中,R表示的氨基酸序列含有的氨基酸的数量优选为8~100个,R含有的组氨酸连续的部位的组氨酸数量优选为4~8个。另外,在上述通式(1)中,R2表示的氨基酸序列含有的氨基酸的数量优选为120~480个。
在上述通式(1)中,R表示的氨基酸序列和R2表示的氨基酸序列之中至少一个优选包含1~50个由含有选自赖氨酸、精氨酸、以及半胱氨酸中的1种氨基酸的氨基酸形成的域t。这种情况下,可以在上述氨基酸序列中含有多个相同或者不同的域t。
另外,在上述通式(1)中,R-优选为下述通式(2)表示的基团。
R1-r-·····(2)
(式中,R1表示含有4~20个组氨酸连续的部位的由4~100个氨基酸形成的氨基酸序列(在此,在R1中,上述组氨酸连续的部位的末端与r结合),r表示由7~200个氨基酸形成的任意氨基酸序列)
在上述通式(2)中,R1表示的氨基酸序列含有的氨基酸的数量优选为4~25个,R1含有的组氨酸连续的部位的组氨酸数量优选为4~8个,r表示的氨基酸序列含有的氨基酸数量优选为10~50个。
另外,在上述通式(2)所示的r表示的氨基酸序列中可以含有TEV域。在r表示的氨基酸序列中含有TEV域,由此可以通过利用TEV蛋白酶的剪切来分离R和R2,而且TEV域在载体中的固定化量多,并且实现了提高该载体的免疫球蛋白保持能力这个效果,因而是优选的序列。另外,可以在r表示的氨基酸序列中含有TEV域的变异体(Mutant)(与能否利用该TEV蛋白酶进行剪切没有关系,与TEV域的氨基序列具有70%以上、优选具有90%以上的同源性)。
构成本发明中使用的蛋白质1的氨基酸的总个数优选为54~800,用于与粒子结合的用途时,更优选为80~600。
1.2.4.免疫球蛋白结合蛋白质2
配体可以是耐碱性的免疫球蛋白结合性蛋白质。作为耐碱性的免疫球蛋白结合性蛋白质,作为优选的配体的另一个例子的免疫球蛋白结合蛋白质(以下,也称为“蛋白质2”)由下述通式(3)表示。
R-R2·····(3)
(式中,R表示含有4~20个组氨酸连续的部位的由4~300个氨基酸形成的氨基酸序列,R2表示含有Z域、或其片段或者变异体的由50~500个氨基酸形成的能够与免疫球蛋白结合的氨基酸序列(在此,R2结合于R的末端是免疫球蛋白结合域的C末端或者N末端))
在上述通式(3)中,R表示的氨基酸序列含有的氨基酸数量优选为8~100个,R含有的组氨酸连续的部位的组氨酸数量优选为4~8个。另外,在上述通式(1)中,R2表示的氨基酸序列含有的氨基酸数量优选为120~480个。
另外,在上述通式(3)中,R-优选为下述通式(4)表示的基团。
R1-r-·····(4)
(式中,R1表示含有4~20个组氨酸连续的部位的由4~100个氨基酸形成的氨基酸序列(在此,在R1中,上述组氨酸连续的部位的末端与r结合),r表示由7~200个氨基酸形成的任意氨基酸序列)
另外,与上述通式(2)同样地,在上述通式(4)中r表示的氨基酸序列中可以含有TEV域。在r表示的氨基酸序列中含有TEV域,由此可以通过利用TEV蛋白酶的剪切来分离R和R2,而且TEV域实现了本发明的效果(在载体中的固定化量多、且提高该载体的免疫球蛋白保持能力),因而是优选的序列。另外,可以在r表示的氨基酸序列中含有TEV域的变异体(Mutant)(与能否利用该TEV蛋白酶进行剪切没有关系,与TEV域的氨基序列具有70%以上、优选具有90%以上的同源性)。
在上述通式(4)中,R1表示的氨基酸序列含有的氨基酸数量优选为4~25个,R1含有的组氨酸连续的部位的组氨酸数量优选为4~8个,r表示的氨基酸序列含有的氨基酸数量优选为10~50个。
在上述通式(3)中,R表示的氨基酸序列和R2表示的氨基酸序列之中至少一个优选包含1~50个由含有选自赖氨酸、精氨酸、以及半胱氨酸中的1种氨基酸的氨基酸形成的域t。这种情况下,可以在上述氨基酸序列中含有多个相同或者不同的域t。
在本发明的亲和色谱用填充剂中,采用蛋白质2作为配体时,对于在碱性条件下的洗涤(例如利用氢氧化钠等碱性液的洗涤)具有高耐受性。作为其理由,认为是:通过将组氨酸连续的部位加成在Z域而使多孔粒子和Z域的结合位置与没有组氨酸连续部位时不同,以及对固定化后的Z域引起一些结构变化而使碱耐受性提高等。虽然不能利用实验来确认实际的理由,但是耐碱性的实验结果显示出具有由加成组氨酸连续部位而产生的作用效果。
此外,利用本发明的亲和色谱用填充剂离析免疫球蛋白时,通过例如利用本发明的亲和色谱用填充剂使免疫球蛋白吸附于上述填充剂的工序(第一的工序)、和使上述免疫球蛋白溶出的工序(第二的工序),可以离析免疫球蛋白,优选进一步经过用碱性液对上述填充剂进行CIP洗涤的工序(第三的工序)。
在第一工序中,使含有免疫球蛋白的溶液在免疫球蛋白吸附于该填充剂的配体的条件下流过填充有上述亲和色谱用填充剂的柱等中。在此,所谓含有上述免疫球蛋白的溶液,可以是含有免疫球蛋白的任意溶液,例如可以举出血清等来自生物体的检测体、杂交瘤细胞培养基的上清等。作为上述免疫球蛋白吸附的条件,例如可以举出免疫球蛋白浓度为0.1~10g/L、溶液pH5~9、柱中的停留时间为0.5~50分、温度为0~40℃。
在该第一工序中,溶液中的免疫球蛋白以外的物质几乎没有吸附而通过柱。通常为了除去一部分保持得弱的物质,用含有NaCl等盐的中性缓冲液、例如磷酸二氢钠/磷酸氢二钠溶液、柠檬酸/磷酸氢二钠溶液、盐酸/三(羟甲基)氨基甲烷溶液、HEPES/氢氧化钠溶液等洗涤填充剂。在第二工序中,使pH2~5合适的缓冲液、例如柠檬酸/柠檬酸钠溶液、乙酸/乙酸钠溶液、盐酸/甘氨酸溶液等流过来使免疫球蛋白溶出。在第三工序中,用碱性液洗涤(CIP洗涤)填充剂。
作为在此使用的碱性液,例如可以举出氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、三乙胺、氢氧化四丁基铵等。
1.2.5.蛋白质1和2的制造
作为用于制造在本发明中使用的蛋白质1和2的标准技术,例如可以利用由FrederickM.Ausbel等带来的在CurrentProtocolsInMolecularBiology、Sambrook等编辑的MolecularCloning(ColdSpringHarborLaboratoryPress,3rdedition,2001)等中记载的公知的基因重组技术。例如,在本发明中使用的蛋白质1或2可以利用在美国专利第5,151,350号说明书中记载的基因重组技术来制造。即,通过将使对目标改变蛋白质(蛋白质1或者2)编码的核酸序列含有的表达载体转化到大肠杆菌等宿主中、并在适合的液体培养基中培养该细胞,可以从培养后的细胞中大量且经济地取得在本发明中使用的蛋白质1或2。作为优选的表达载体,能够在细菌中复制的已知的载体均可以使用,例如可以举出在美国专利第5,151,350号说明书中记载的质粒、在Sambrook等编辑的MolecularCloning(ColdSpringHarborLaboratoryPress,3rdedition,2001)等中记载的质粒。另外,为了通过向宿主中导入核酸来使宿主转化,可以使用在该技术领域中已知的任一方法,例如可以利用在Sambrook等编辑的MolecularCloning(ColdSpringHarborLaboratoryPress,3rdedition,2001)等中记载的公知的方法。对于将转化的细菌培养而表达的蛋白质进行回收的方法是本领域技术人员熟知的。
具体而言,将对需要的氨基酸序列编码的DNA分割并合成为由数十个碱基形成的合成寡核苷酸,通过由DNA连接酶引发的连接反应连接它们并***到质粒中,由此可以取得目标表达载体。在此时,出于使该蛋白质在大肠杆菌中高效地表达的目的,对本领域技术人员来说,采用利用大肠杆菌的最适密码子的核酸序列是一般进行的方法。另外,可以如后述本发明的实施例所示地利用PCR(PolymeraseChainReaction)技术由Straphylococcusaureus的基因组DNA构筑对需要的氨基酸序列编码的DNA序列。
例如,在上述制造方法中使用的核酸可以对免疫球蛋白结合蛋白质(蛋白质1或2)或者其等功能变异体进行编码。在本发明中,免疫球蛋白结合蛋白质的所谓“等功能变异体(functionalvariant)”,是由于部分氨基酸的加成、削除、取代、氨基酸残基的化学修饰等而改变的免疫球蛋白结合蛋白质,意思是能够与改变前的免疫球蛋白结合蛋白质的氨基酸序列保持70%以上、优选为90%以上同源性、且在免疫球蛋白结合活性中作为与改变前的免疫球蛋白结合蛋白质同等蛋白质来处理的免疫球蛋白结合蛋白质。即,作为上述核酸,包括对本说明书中的蛋白质1或2编码的核酸。
另外,如上所述,在本发明中使用的蛋白质1和2可以是含有1个以上(优选为2~12个,更优选为4~10个)免疫球蛋白结合域的蛋白质。对这样的蛋白质编码的cDNA可以通过将规定个数的对1个免疫球蛋白结合域编码的cDNA(互补DNA)串列地连结来容易地制作。通过将这样制作成的cDNA***并利用到适合的表达质粒中,可以容易地制造含有1个以上免疫球蛋白结合域的蛋白质。
例如,在后述实施例中示出的具有序列号4的氨基酸序列的蛋白质(SPATK)、具有序列号2的氨基酸序列的蛋白质(SP4Z)、由在序列号2或序列号4中缺失、取代或者加成1个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列形成、且具有免疫球蛋白结合活性的蛋白质作为在本发明中使用的免疫球蛋白结合蛋白质是优选的。
1.2.6.配体的结合
作为上述载体与上述配体的结合方法,将多孔粒子含有的环氧基直接作为与配体的结合部位来利用作为工艺是简便的,从而优选。除此之外还有用甲苯磺酰基等将多孔粒子含有的环氧基开环而生成的醇性羟基活性化后结合配体的方法,也可以由多孔粒子含有的环氧基或者该环氧基开环而生成的基团进一步使连接体延长后、介由该连接体将配体结合于多孔粒子。
配体的结合条件根据配体结合前多孔粒子的环氧基含量、配体的种类不同而异,但可以采用对于本领域技术人员来说公知的方法。配体为蛋白质时,蛋白质N末端的氨基、蛋白质含有的赖氨酸、半胱氨酸可以成为与环氧基的反应点。结合蛋白质时,例如,可以使用与蛋白质的等电点接近的缓冲类水溶液,根据需要地添加氯化钠、硫酸钠等盐,边将蛋白质与多孔粒子混合边使其在0~40℃下反应1~24小时来结合作为配体的蛋白质。
配体的结合量根据配体的种类、靶分子的种类等来适当调节,将蛋白A这样的抗体结合性蛋白质作为配体结合时,每1g多孔粒子,优选为10~200mg,更优选为25~100mg。如果将蛋白A这样的抗体结合性蛋白质作为配体结合时,每1g多孔粒子的配体结合量为10mg以上,则动态结合容量优异,如果为200mg以下,则用于溶出结合的抗体的溶出液的量是合适量。
1.2.7.开环环氧基
构成本发明的亲和色谱用填充剂的配体结合多孔粒子具有开环环氧基。该开环环氧基是在将配体结合于由上述特定聚合物形成的多孔粒子后、使该聚合物所含有的环氧基、即与配体结合的环氧基以外余下的环氧基开环而获得的。这意思是在将多孔粒子用作亲和色谱用填充剂前、多孔粒子表面的环氧基实质上全部开环。
此外,所谓多孔粒子表面的环氧基实质上全部开环,意思是在具有开环环氧基的配体结合多孔粒子中残留的环氧基具体而言优选为低于0.04mmol/g,进一步优选为低于0.02mmol/g,最优选没有残留环氧基。如果开环环氧基的残留量低于0.04mmol/g,则保存稳定性优异。
作为环氧基开环生成的开环环氧基的醇性羟基发挥着以下作用:将粒子表面亲水化、防止蛋白质等非特异吸附,并且在水中使粒子的韧性提高、防止破坏高流速下的粒子。作为多孔粒子中环氧基的开环方法,例如可以举出在水溶剂中利用酸或碱在加热或者室温下进行搅拌的方法。另外,也可以利用巯基乙醇、硫甘油等具有巯基的封闭剂、单乙醇胺等具有氨基的封闭剂来使环氧基开环。最优选的开环环氧基是利用硫甘油使多孔粒子含有的环氧基开环而得到的开环环氧基。硫甘油作为原料与巯基乙醇等相比,毒性低,硫甘油加成的环氧开环基与由具有氨基的封闭剂而得到的开环基相比,具有非特异吸附低,而且动态结合量变高这个优点。
1.2.8.粒径、细孔容积
构成本发明的亲和色谱用填充剂的、具有开环环氧基的配体结合多孔粒子的粒径优选为35~100μm,更优选为38~75μm。如果粒径为35μm以上,则压力特性优异。如果为100μm以下,则能够获得动态结合容量高的填充剂。如上所述,具有开环环氧基的配体结合多孔粒子的粒径可以通过聚合多孔粒子时的条件来调整。此外,本发明中的“粒径”是利用激光衍射散射式粒度分布测定装置得到的体积平均粒径。
对于构成本发明的亲和色谱用填充剂的具有开环环氧基的配体结合多孔粒子,在利用压汞仪对相当于孔径为10~5000nm范围的细孔进行测定时,优选具有1.00~1.90ml/g的细孔容积,更优选具有1.05~1.85ml/g的细孔容积。如果细孔容积为上述范围内,则能够获得蛋白质的动态结合容量高的填充剂。而且,如果细孔容积为1.90ml/g以下,则压力特性优异。
构成本发明的亲和色谱用填充剂的具有开环环氧基的配体结合多孔粒子优选具有80~150m2/g的比表面积,更优选具有100~140m2/g的比表面积。在此,如果比表面积为80m2/g以上,则获得动态结合容量高的填充剂。另一方面,如果为150m2/g以下,则填充剂的强度优异,高流速下填充剂的破坏被抑制,柱压力的升高被抑制。所谓本发明中的“比表面积”是用粒子的干燥质量除利用压汞仪得到的具有细孔径为10~5000nm的细孔的表面积而得到的值。
构成本发明的亲和色谱用填充剂的具有开环环氧基的配体结合多孔粒子优选具有75~300nm的体积平均细孔径,更优选具有80~250nm的体积平均细孔径。在此,如果体积平均细孔径为75nm以上,则高流速下的动态结合容量降低被抑制。另一方面,如果为300nm以下,则能够不论流速地获得动态结合容量优异的填充剂。所谓本发明中的“体积平均细孔径”是利用压汞仪得到的细孔径为10~5000nm的细孔的体积平均细孔径。
利用显微硬度计测定构成本发明的亲和色谱用填充剂的具有开环环氧基的配体结合多孔粒子湿润状态的1个粒子时的弹性模量优选为3.0~10.0MPa,进一步优选为5.0~8.0MPa。如果为3.0MPa以上,则压力特性优异。如果为10.0MPa以下,则获得蛋白质的动态结合容量优异的填充剂。本发明中的弹性模量是通过以下方式得到的值:将1滴水浆状态的构成亲和色谱用填充剂的具有开环环氧基的配体结合多孔粒子放在显微硬度计的载物台上,对于湿润状态的1个粒子,测定用显微硬度计的探针从粒子正上方触碰而使粒子变形为直径的5%时的应力,用与粒径相同直径的圆的面积(单位m2)除以上述应力(单位N)而得到值。
实施例
2.实施例
下面,举出实施例来进一步具体地说明本实施方式所涉及的亲和色谱用填充剂。另外,以下记载概括地表示本发明的方式,没有特别理由,不通过所涉及的记载来限定本发明。
2.1.评价方法
2.1.1.环氧基含量
配体结合前的多孔粒子的环氧基含量通过以下方式来定量:以质量计量取质量浓度约为10%且已知准确质量浓度的多孔粒子水分散体到聚乙烯瓶,以使得由聚合中使用的含有环氧基的单体量计算出的环氧基摩尔数为2.00mmol,向其中加入浓度为38%的氯化钙水溶液25mL和2规定的盐酸2.00mL,在75℃下搅拌2小时30分钟,由此将环氧基开环,冷却后,用2规定的氢氧化钠水溶液2.50mL中和,进而边用pH计监测pH边用0.1规定的盐酸进行反滴定。
2.1.2.粒径
利用激光衍射散射式粒度分布测定装置(Beckman·Coulter公司制LS13320)测定粒子的体积平均粒径。
2.1.3.细孔容积、比表面积、体积平均细孔径
在40℃下真空干燥24小时而获得干燥粒子,利用压汞仪(岛津制作所社制AUTOPOREIV9520)求得干燥粒子的细孔容积、比表面积、以及体积平均细孔径(细孔径)。测定范围以细孔径范围计为10~5000nm。
2.1.4.弹性模量
将1滴水浆状态的具有开环环氧基的配体结合多孔粒子放置在显微硬度计(Fischer·Instruments公司制HM2000)的载物台上,对于湿润状态的1个粒子,对将显微硬度计的探针从粒子的正上方触碰而使粒子变形为直径的5%时测定的应力(单位N)进行记录。另外,采用最小二乘法由探针位置与应力的图表计算出应力=0的探针位置,将其作为对象粒子的直径。用对象粒子直径的圆面积(单位m2)除以记录的应力而得到的值作为所测定的1个粒子的弹性模量。测定是对于任意选择的5个粒子而实施的,求得每个弹性模量的平均值,作为构成亲和色谱用填充剂的具有开环环氧基的配体结合多孔粒子的弹性模量。
2.1.5.蛋白质的动态结合容量
利用GEHealthcareBioScience公司制的AKTAprimeplus测定线性流速为300cm/hr时的蛋白质(人IgG抗体)的动态结合容量。柱容量为4mL(5mmφ×200mm长),人IgG抗体(EquitechBio公司制HGG-1000)用20mM磷酸缓冲液(pH7.5)稀释到5mg/mL,由溶出前端突破10%时的人IgG抗体吸附量和柱填充体积求得动态结合容量。以下,动态结合容量有时记载成DBC。
2.1.6.压力特性
以内径为16mm、填充高度为100mm的方式将由测定的具有开环环氧基的配体结合多孔粒子形成的填充剂填充到柱中,将该柱与GEHealthcareBioScience公司制的AKTApilot连接,使纯水边以线性流速每50cm/hr阶段性提高边流动时,将以恒定线性流速流动的1分钟观察到超过0.05MPa的经时压力增加时的线性流速记录为渗压流速。即使3000cm/hr也没有观察到这样的压力增加时,中止测定,记录为>3000cm/hr。另外,柱的绝对压力达到1.9MPa时,即使没有观察到这样的压力增加也中止测定,记录达到1.9MPa时的线性流速。渗压流速优选为900cm/hr以上,更优选为1200cm/hr以上,进一步优选为1800cm/hr以上,最优选为2700cm/hr以上。
2.1.7.蛋白A结合量
作为与多孔粒子结合的配体的蛋白A(SPA)的结合量是通过利用了二辛可宁酸(BCA)试剂的试剂组来定量的。具体而言,将以固体成分换算为1mg的填充剂取到试管中,用ThermoFisherScientific公司(旧PIERCE公司)的BCAProteinAssayKit进行定量。反应在37℃下通过颠倒混和进行30分钟。校正曲线是利用与结合于多孔粒子的蛋白A同一批次的蛋白制作成的。
2.2.实验例
2.2.1.实施例1
(i)多孔粒子的悬浮聚合
在4091g纯水中添加聚乙烯醇(Kuraray公司制PVA-217)8.52g、十二烷基硫酸钠(花王社制EMAL10G)2.13g和碳酸钠4.26g,搅拌一夜制备成水溶液(S-1-1)。进而,聚合当天另抽取30g的(S-1-1),在余下的(S-1-1)中溶解亚硝酸钠2.13g,制备成水溶液(S-2-1)。
接着,使甘油二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业社制)125g、甲基丙烯酸缩水甘油酯(MitsubishiRayon公司制)17.9g、甘油单甲基丙烯酸酯(日本油脂社制)35.9g溶解在2-辛酮(东洋合成社制)86.4g和苯乙酮(和光纯药工业社制)253g中,制备成单体溶液。此外,使单体的总质量为100质量份时的、各单体的份数是甘油二甲基丙烯酸酯为70质量份、甲基丙烯酸缩水甘油酯为10质量份、甘油单甲基丙烯酸酯为20质量份。
在(S-1-1)30g中添加2,2’-偶氮二异丁腈(和光纯药工业社制)2.2g并分散,作为引发剂分散液。
接着,将准备的溶液(S-2-1)和单体溶液投入到带有挡板的7L可拆式烧瓶内,安装温度计、搅拌桨、以及冷却管,安置在温水浴中,氮气氛下、以220rpm开始搅拌。接着,通过温水浴对可拆式烧瓶加热,内温达到85℃后,添加引发剂分散液,边将温度保持在85℃边进行5小时的搅拌。
接着,冷却反应液后,用布氏漏斗过滤所述反应液,用纯水和异丙醇洗涤。将洗涤的粒子转移到塑料瓶中,分散在水中进行3次倾析,除去小粒子。通过以上操作获得分散在水中的12.5质量%的多孔粒子1(粒子干燥质量为123g)。多孔粒子1的环氧基含量是0.47mmol/g。
(ⅱ)配体的制作
2.2.1.1.SP4Z表达载体的构筑
按照下述步骤构筑免疫球蛋白结合蛋白质(SP4Z)表达载体。图2是说明SP4Z载体的构筑方法的图。
(1)步骤1
将编码单体Z域的DNA作为起始物质,构筑具有NcoI剪切位点和EcoRI剪切位点的单体Z域载体(A-pETM11)(SP1Z)。
(2)步骤2
接着,在A-pETM11载体上再加成一个Z域,构筑具有EcoRI剪切位点和SacI剪切位点的2聚体Z域载体(AB-pETM11)(SP2Z)。
(3)步骤3
接着,在AB-pETM11载体上进一步再加成一个Z域,构筑具有SacI剪切位点和HindIII剪切位点的3聚体Z域载体(ABC-pETM11)(SP3Z)。
(4)步骤4
最后,在ABC-pETM11载体上加成第4个Z域,构筑具有HindIII剪切位点和XhoI剪切位点的pETM11-SP4Z的载体。
2.2.1.2.SP1Z-pETM11载体(具有终止密码子的单体Z域载体)的构筑
将SPZKDNA(序列号3)作为模板,用作为正向引物的引物153(序列号5)和作为反向引物的引物156(序列号8)实施PCR。在引物153和引物156中分别包含NcoI剪切位点和SacI的限制性内切酶剪切位点。PCR的条件如下。
阶段1:94℃1分钟1循环,阶段2:94℃30秒钟,55℃30秒钟,72℃2.5分钟(25循环),阶段3:72℃10分钟1循环,之后4℃下保持。
PCR生成物是利用GEHealthcareBioScience公司制的生成试剂盒进行PCR纯化的。接着,用NcoI限制性内切酶和SacI限制性内切酶进行剪切的pETM11载体与PCR生成物的连接。利用限制性内切酶的消化反应用NewEnglandBiolabs制的NcoI限制性内切酶和SacI限制性内切酶在37℃下进行1小时,用GEHealthcareBioScience公司制生成试剂盒进行PCR纯化。
对于连接反应,利用T4DNA连接酶(Invitrogen公司制)在室温下进行整夜。利用DH5acompetentcell(BiomedalLifeScience公司制)使连接得到的载体转化,将得到的转化体在含有卡那霉素的LB培养基中37℃下整夜培养,从阳性集落(Colony)中提取出质粒,通过3730DNA序列分析仪(AppliedBiosystems公司制)确认***的DNA片段序列是正确的。
2.2.1.3.A-pETM11载体(没有终止密码子的单体Z域载体)的构筑
用作为正向引物的引物153和作为反向引物的引物154(序列号6)来代替引物153、156,与实验2.2.1.2.同样地构筑A-pETM11载体。此外,DNA片段的***利用pETM11的NcoI剪切位点和EcoRI剪切位点进行。
2.2.1.4.SP2Z-pETM11载体(有终止密码子的2聚体Z域载体)的构筑
用作为正向引物的引物155(序列号7)和作为反向引物的引物156,通过PCR制备具有EcoRI剪切位点和SacI剪切位点的单体Z域的DNA,***到A-pETM11的EcoRI剪切位点和SacI剪切位点中进行构筑。实验与实验2.2.1.2.在同样的条件下进行。
2.2.1.5.AB-pETM11载体(没有终止密码子的2聚体Z域载体)的构筑
用作为正向引物的引物155和作为反向引物的引物157(序列号9),通过PCR制备具有EcoRI剪切位点和SacI剪切位点且没有终止密码子的单体Z域的DNA,***到A-pETM11的EcoRI剪切位点和SacI剪切位点中,从而构筑AB-pETM11载体。实验与实验2.2.1.2.在同样的条件下进行。
2.2.1.6.SP3Z-pETM11载体(有终止密码子的3聚体Z域载体)的构筑
用作为正向引物的引物158(序列号10)和作为反向引物的引物161(序列号13),通过PCR制备具有SacI剪切位点和XhoI剪切位点的单体Z域的DNA,***到AB-pETM11的EcoRI剪切位点和SacI剪切位点中进行构筑。实验与实验2.2.1.2.在同样的条件下进行。
2.2.1.7.ABC-pETM11载体(没有终止密码子的3聚体Z域载体)的构筑
用作为正向引物的引物158和作为反向引物的引物159(序列号11),通过PCR制备具有SacI剪切位点和HindⅢ剪切位点且没有终止密码子的单体Z域的DNA,***到AB-pETM11的SacI剪切位点和HindⅢ剪切位点中,从而构筑ABC-pETM11载体。实验与实验2.2.1.2.在同样的条件下进行。
2.2.1.8.SP4Z-pETM11载体(有终止密码子的4聚体Z域载体)的构筑
用引物160(序列号12)和引物161,通过PCR制备具有HindⅢ剪切位点和XhoI剪切位点的单体Z域的DNA,***到ABC-pETM11的HindⅢ剪切位点和XhoI剪切位点中,从而构筑SP4Z-pETM11载体。实验与实验2.2.1.2.在同样的条件下进行。
2.2.1.9.SP4Z的表达和纯化
将得到的SP4Z-pETM11载体导入到E.coli(BL21株)细胞(STRATAGENE制)中,在18℃下添加1mM的IPTG(Sigma-Aldrich制),孵育15小时,使重组型免疫球蛋白结合蛋白质(SP4Z)表达。在诱导之前,将上述细胞在37℃下孵育直至吸光度(OD600)达到约0.6。蛋白质表达后,回收细胞,在pH8.0的Tris缓冲液中破碎。
得到的重组型免疫球蛋白结合蛋白质(SP4Z)采用Ni亲和色谱法(Ni-NTA(三乙酸胺)粒子,QIAGEN公司制)进行纯化。纯化的免疫球蛋白结合蛋白质采用阴离子交换色谱法(Q-琼脂糖凝胶FF,GEBioScience公司制)进一步纯化。由SDS-PAGE确认的免疫球蛋白结合蛋白质的纯度为96%。
另外,得到的重组型免疫球蛋白结合蛋白质(SP4Z)通过MALDI-TOF质谱分析,各个的氨基酸序列一致,由此确认具有图1所示的氨基酸序列(序列号2)。
此外,在图1中,R和R2与上述通式(1)和(3)中的R和R2相对应,R1和r与上述通式(2)和(4)中的R1和r相对应。r中的下线部表示TEV域(TEV蛋白酶(肽结合水解合成酶)剪切位点)。
(ⅲ)多孔粒子与配体的结合
制备以粒子干燥质量换算为1g的多孔粒子1、0.1g的SP4Z分散在25mL的0.1M磷酸缓冲液(pH6.8)中的混合液,在10℃下颠倒混和24小时,使SP4Z与多孔粒子1结合。将生成的粒子过滤后,与1M硫甘油25mL混合,在30℃下反应4小时,将余下的环氧基开环,用PBS/0.5%Tween20洗涤后,用PBS洗涤,从而获得由具有开环环氧基的配体结合多孔粒子形成的亲和色谱用填充剂1(A-1)。利用ThermoScientificPierceBCAProteinAssaykit进行定量测定,结果与上述粒子结合的SP4Z的量为41mg/g粒子。将结果示于表2。
(ⅳ)评价
(A-1)的粒径为54μm,细孔容积为1.26mL/g,比表面积为111m2/g,体积平均细孔径为101nm。弹性模量为5.6MPa。蛋白质(人IgG抗体)的动态结合容量为40mg/mL,压力流速为2700cm/hr。
2.2.2.实施例2
在实施例1的悬浮聚合中,使搅拌转速为300rpm,除此之外,同样地进行,获得多孔粒子2,制造并评价由具有开环环氧基的配体结合多孔粒子形成的亲和色谱用填充剂2(A-2)。将结果示于表2。多孔粒子2的环氧基含量为0.45mmol/g。(A-2)的粒径为31μm,细孔容积为1.438mL/g、比表面积为132m2/g、体积平均细孔径为110nm。弹性模量为6.4MPa。蛋白质(人IgG抗体)的动态结合容量为40mg/mL,压力流速为1100cm/hr。
2.2.3.实施例3
(i)多孔粒子的悬浮聚合
在300g纯水中添加聚乙烯基醇(Kuraray公司制PVA-217)0.600g、十二烷基硫酸钠(花王社制EMAL10G)0.030g和硫酸钠1.50g,搅拌一夜,制备成水溶液(S-1-2)。进而,聚合当天另抽取5g的(S-1-2),在余下的(S-1-2)中溶解亚硝酸钠0.150g,制备成水溶液(S-2-2)。
接着,使甘油二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业社制)8.19g、甲基丙烯酸缩水甘油酯(MitsubishiRayon公司制)3.51g溶解在2-辛酮(东洋合成社制)6.25g和苯乙酮(和光纯药工业社制)18.3g中,制备成单体溶液。此外,使单体的总质量为100质量份时的、各单体的份数是甘油二甲基丙烯酸酯为70质量份、甲基丙烯酸缩水甘油酯为30质量份。
在(S-1-2)5g中添加2,2’-偶氮二异丁腈(和光纯药工业社制)0.149g并分散,作为引发剂分散液。
接着,将得到的溶液(S-2-2)和单体溶液投入到带有挡板的0.5L可拆式烧瓶内,安装温度计、搅拌桨、以及冷却管,安置在温水浴中,氮气氛下、以680rpm开始搅拌。接着,通过温水浴对可拆式烧瓶加热,内温达到85℃后,添加引发剂分散液,边将温度保持在85℃边进行5小时的搅拌。
接着,冷却反应液后,用布氏漏斗过滤所述反应液,用纯水和异丙醇洗涤。将洗涤的粒子转移到塑料瓶中,分散在水中进行3次倾析,除去小粒子。通过以上操作获得分散在水中的12.5质量%的多孔粒子3(粒子干燥质量为8.7g)。多孔粒子3的环氧基含量是1.7mmol/g。
(ⅱ)配体的制作
通过后述的制备例(1)~(5),制备成具有图3所示的氨基酸序列的免疫球蛋白结合蛋白质(SPATK(序列号4))。
(1)步骤1
将金黄色葡萄球菌(Staphylococusaureus)基因组DNA作为模板,用具有限制性内切酶NcoI位点的引物(引物11)、和具有限制性内切酶BamH1以及HindⅢ位点的引物(引物12),通过PCR获得编码D-A域的DNA。利用限制性内切酶NcoI和HindⅢ剪切该DNA,与同样地由限制性内切酶NcoI和HindⅢ剪切的pETM11连接来构筑SPAK质粒。
(2)步骤2
接着,将上述得到的SPAK质粒作为模板,用具有限制性内切酶BamHI位点的引物(引物13)和具有限制性内切酶HindⅢ位点的引物(引物14),通过PCR获得编码新D-A域的DNA。用限制性内切酶BamHI和HindⅢ剪切该DNA,与同样地由限制性内切酶BamHI和HindⅢ剪切的上述得到的SPAK质粒连接来构筑SPATK质粒。
(3)SPAK质粒的构筑
将金黄色葡萄球菌基因组DNA作为模板,用引物11和引物12实施PCR。PCR的条件如下。
阶段1:94℃1分钟1循环,阶段2:94℃30秒钟,53℃30秒钟,72℃2.5分钟(25循环),阶段3:72℃10分钟1循环,然后4℃下保持。
PCR生成物利用GEHealthcareBioScience公司制的纯化试剂盒进行纯化。接着,用NcoI限制性内切酶和HindⅢ限制性内切酶剪切。对于pETM11载体,同样地用NcoI限制性内切酶和HindⅢ限制性内切酶剪切。利用限制性内切酶的消化反应用NewEnglandBiolabs制的NcoI限制性内切酶和HindⅢ限制性内切酶进行,用GEHealthcareBioScience公司制纯化试剂盒进行纯化。对于连接反应,利用T4DNA连接酶(Invitrogen公司制)在室温下整夜进行。使连接得到的载体转化成DH5acompetentcell(BiomedalLifeScience公司制),通过3730DNA序列分析仪(AppliedBiosystems公司制)确认阳性集落质粒(SPAK质粒)的序列是正确的。
(4)SPATK质粒的构筑的构筑
将SPAK质粒作为模板,用引物13和引物14,通过PCR获得编码新D-A域的DNA。PCR的条件是阶段1:94℃1分钟1循环,阶段2:94℃30秒钟、55℃30秒钟、72℃2.5分钟(25循环),阶段3:72℃10分钟1循环,然后4℃下保持。PCR生成物利用GEHealthcareBioScience公司制的纯化试剂盒进行纯化。接着,用BamHI限制性内切酶和HindⅢ限制性内切酶剪切该DNA。对于SPAK质粒,也同样地用BamHI限制性内切酶和HindⅢ限制性内切酶剪切。利用限制性内切酶的消化反应用NewEnglandBiolabs制的BamHI限制性内切酶和HindⅢ限制性内切酶进行,用GEHealthcareBioScience公司制纯化试剂盒进行纯化。对于连接反应,利用T4DNA连接酶(Invitrogen公司制)在室温下整夜进行。使连接得到的载体转化成DH5acompetentcell(BiomedalLifeScience公司制),通过3730DNA序列分析仪(AppliedBiosystems公司制)确认阳性集落质粒(SPATK质粒)的序列是正确的。
(5)SPATK的表达和纯化
将得到的SPATK质粒转化成E.coli(BL21株)细胞(STRATAGENE制)。在18℃下添加1mM的IPTG(Sigma-Aldrich制),孵育15小时,使重组型免疫球蛋白结合蛋白质(SPATK)表达。在诱导之前,将上述细胞在37℃下孵育直至吸光度(OD600)达到约0.6。蛋白质表达后,回收细胞,在pH8.0的Tris缓冲液中破碎。
得到的重组型免疫球蛋白结合蛋白质(SPATK)采用Ni亲和色谱法(Ni-NTA(三乙酸胺)粒子,QIAGEN公司制)进行纯化。纯化的免疫球蛋白结合蛋白质采用阴离子交换色谱法(Q-琼脂糖凝胶FF,GEBioScience公司制)进一步纯化。由SDS-PAGE确认的免疫球蛋白结合蛋白质的纯度为96%
另外,得到的重组型免疫球蛋白结合蛋白质(SPATK)通过MALDI-TOF质谱分析,各个的氨基酸序列一致,由此确认具有图3所示的氨基酸序列。
[表1]
(ⅲ)多孔粒子与配体的结合
制备以粒子干燥质量换算为1g的多孔粒子3、0.1g的SPATK分散在25mL的0.1M磷酸缓冲液(pH6.8)中的混合液,在10℃下颠倒混和24小时,使SPATK与多孔粒子3结合。将生成的粒子过滤后,与1M硫甘油25mL混合,在30℃下反应4小时,将余下的环氧基开环,用PBS/0.5%Tween20洗涤后,用PBS洗涤,从而获得由具有开环环氧基的配体结合多孔粒子形成的亲和色谱用填充剂3(A-3)。利用ThermoScientificPierceBCAProteinAssaykit进行定量测定,结果与上述粒子结合的SPATK的量为44mg/g粒子。将结果示于表2。
(ⅳ)评价
(A-3)的粒径为50μm,细孔容积为1.07mL/g,比表面积为104m2/g,体积平均细孔径为68nm。弹性模量为6.6MPa。蛋白质(人IgG抗体)的动态结合容量为39mg/mL,压力流速>3000。
2.2.4.实施例4~6
在实施例3中,使单体的总质量为100质量份时的、各单体的份数如表2所示,除此之外,同样地进行,获得由具有开环环氧基的配体结合多孔粒子形成的亲和色谱用填充剂4~6(A-4~6),并进行评价。将结果示于表2。
2.2.5.实施例7
在实施例3中,不使用硫酸钠,使亚硝酸钠为1.50g,使单体的总质量为100质量份时的各单体的份数如表2所示,除此之外,同样地进行,获得由具有开环环氧基的配体结合多孔粒子形成的亲和色谱用填充剂7(A-7),并进行评价。将结果示于表2。
2.2.6.比较例1~2
在实施例3中,使单体的总质量为100质量份时的、各单体的份数如表3所示,除此之外,同样地进行,获得比较亲和色谱用填充剂1~2(B-1~2),并进行评价。将结果示于表3。
2.2.7.实施例8
(i)多孔粒子的悬浮聚合
在4257g纯水中添加聚乙烯醇(Kuraray公司制PVA-217)8.51g、十二烷基硫酸钠(花王社制EMAL10G)0.425g和硫酸钠21.3g,搅拌一夜制备成水溶液(S-1-6)。进而聚合当天,另抽取20g的(S-1-6),在余下的(S-1-6)中溶解碘化钾2.13g,制备成水溶液(S-2-6)。
接着,使由季戊四醇三丙烯酸酯60质量%和季戊四醇四丙烯酸酯40质量%构成的单体(新中村化学工业社制商品名“NKESTERA-TMM-3LM-N”)104g、丙烯酸4-羟基丁酯缩水甘油醚(日本化成社制)20.7g、羟乙基丙烯酰胺(兴人社制)82.9g溶解在2-辛酮(东洋合成社制)134g和苯乙酮(和光纯药工业社制)169g中,制备成单体溶液。此外,使单体的总质量为100质量份时的、各单体的份数是季戊四醇三丙烯酸酯为30部、季戊四醇四丙烯酸酯为20部、丙烯酸4-羟基丁酯缩水甘油醚为10部、羟乙基丙烯酰胺为40部。
在(S-1-6)20g中添加并分散2,2’-偶氮二异丁腈(和光纯药工业社制)1.92g,作为引发剂分散液。
接着,将准备的溶液(S-2-6)和单体溶液投入到带有挡板的7L可拆式烧瓶内,安装温度计、搅拌桨、以及冷却管,安置在温水浴中,氮气氛下、以300rpm开始搅拌。接着,通过温水浴对可拆式烧瓶加热,内温达到80℃后,添加引发剂分散液,边将温度保持在80℃边进行5小时的搅拌。
接着,冷却反应液后,用布氏漏斗过滤所述反应液,用纯水和异丙醇洗涤。将洗涤的粒子转移到塑料瓶中,分散在水中进行3次倾析,除去小粒子。通过以上操作获得分散在水中的12.5质量%的多孔粒子8(粒子干燥质量为107g)。多孔粒子8的环氧基含量是0.29mmol/g。
(ⅱ)配体的制作、(ⅲ)多孔粒子与配体的结合、(ⅳ)评价与实施例1同样地进行制作并进行评价。将结果示于表4。
2.2.8.实施例9
在实施例8中,使由季戊四醇三丙烯酸酯60质量%和季戊四醇四丙烯酸酯40质量%构成的单体(新中村化学工业社制商品名“NKESTERA-TMM-3LM-N”)96.7g、丙烯酸4-羟基丁酯缩水甘油醚(日本化成社制)19.3g、羟乙基丙烯酰胺(兴人社制)77.3g溶解在2-辛酮(东洋合成社制)139g和苯乙酮(和光纯药工业社制)175g中,制备单体溶液,使2,2’-偶氮二异丁腈(和光纯药工业社制)的质量为2.69g,除此之外,与同样地进行,获得由具有开环环氧基的配体结合多孔粒子形成的亲和色谱用填充剂9(A-9),并进行评价。将结果示于表4。
2.2.9.实施例10
在实施例9中,内温达到85℃后,添加引发剂分散液,边将温度保持在85~90℃边进行5小时的搅拌,除此之外,与同样地进行,获得由具有开环环氧基的配体结合多孔粒子形成的亲和色谱用填充剂10(A-10),并进行评价。将结果示于表4。
[表2]
[表3]
[表4]
根据表2~4可以理解使用实施例1~10的填充剂时,与使用比较例1~2的填充剂时相比,配体的保持量多,压力特性优异。
2.2.10.比较例3
在实施例1的悬浮聚合中,使用甲基丙烯酸缩水甘油酯142.9g来代替甘油二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业社制)125g、甲基丙烯酸缩水甘油酯(MitsubishiRayon公司制)17.9g,除此之外,同样地进行,制备单体溶液并实施聚合。此外,使单体的总质量为100质量份时的、各单体的份数是甲基丙烯酸缩水甘油酯为80质量份,甘油甲基丙烯酸酯为20质量份。接着,冷却反应液之后,用布氏漏斗过滤所述反应液,想用纯水和异丙醇洗涤,但在过滤途中产生包含溶剂的白色块状物,发生堵塞,从而不能进行到下面的工序。
本实施方式所涉及的说明为以上内容。本发明不限定于上述实施方式,可以进一步进行各种变形。另外,本发明包括与实施方式中说明的构成实质上相同的构成(例如,功能、方法和结果相同的构成、或者目的和结果相同的构成)。另外,本发明包括将实施方式中说明的构成的非本质部分替换的构成。另外,本发明包括能够与实施方式中说明的构成发挥相同的作用效果的构成或者能够达到相同目的的构成。另外,本发明包括对实施方式中说明的构成附加公知技术的构成。
本发明的亲和色谱用填充剂与现有的载体相比,免疫球蛋白结合蛋白质的保持量多且该蛋白质的保持持能力优异。由此,能够提高目标蛋白质的捕集量,因此,可以使目标蛋白质(抗体)的结合容量增大。其结果,可以高效、低成本且大量地纯化纯度高的目标蛋白质。
Claims (8)
1.一种亲和色谱用填充剂,其特征在于,具有:
由乙烯基单体的聚合物形成的多孔粒子,所述乙烯基单体由以下构成:
(X-1)含有羟基且不含有环氧基的交联性乙烯基单体20~90质量份、
(X-2)不含有羟基和环氧基的交联性乙烯基单体0~40质量份、
(M-1)含有环氧基的非交联性乙烯基单体1~40质量份、以及
(M-2)不含有环氧基的非交联性乙烯基单体0~70质量份,
其中,(X-1)、(X-2)、(M-1)和(M-2)的合计是100质量份,
结合于所述多孔粒子的配体,以及
开环环氧基,所述开环环氧基,是在将配体结合于所述由乙烯基单体的聚合物形成的多孔粒子后,使所述由乙烯基单体的聚合物所含有的环氧基,即与配体结合的环氧基以外余下的环氧基开环而获得,
所述多孔粒子的粒径是35~100μm。
2.根据权利要求1所述的亲和色谱用填充剂,其中,所述配体是含有至少1个蛋白A、蛋白A的免疫球蛋白结合域、或者其变异体的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的亲和色谱用填充剂,其中,所述开环环氧基是利用硫甘油使所述聚合物所含有的环氧基开环而获得的。
4.根据权利要求1或2所述的亲和色谱用填充剂,其中,所述多孔粒子是将所述乙烯基单体100质量份与以(P-1)为必需成分的水系混合物悬浮聚合而获得的,所述(P-1)是选自碳原子数为7~14的直链状、支链状以及环状的醇、醚、醛、酮、酯、碳原子数为8~10的烷基苯中的至少1种的致孔剂,其中,致孔剂的合计量是100~400质量份,(P-1)在致孔剂的合计量100质量%中为10质量%以上。
5.根据权利要求1或2所述的亲和色谱用填充剂,其中,利用压汞仪对相当于孔径为10~5000nm范围的细孔进行测定时所述多孔粒子的细孔容积是1.00~1.90ml/g。
6.根据权利要求1或2所述的亲和色谱用填充剂,其中,所述多孔粒子的体积平均细孔径是75~300nm。
7.一种离析免疫球蛋白的方法,包括:
利用权利要求1~6中任一项所述的亲和色谱用填充剂使免疫球蛋白吸附于所述填充剂的工序,以及
使所述免疫球蛋白溶出的工序。
8.一种亲和色谱法用填充柱,填充有权利要求1~6中任一项所述的亲和色谱用填充剂。
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