JPWO2011125673A1 - アフィニティークロマトグラフィー用充填剤 - Google Patents
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Abstract
Description
水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有非架橋性ビニル単量体、あるいは水酸基とエポキシ基とを含有する架橋性ビニル単量体、を含むビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子、
前記多孔質粒子に結合したリガンド、ならびに
開環エポキシ基を有することを特徴とする。
(X−1)水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体20〜90質量部、
(X−2)水酸基もエポキシ基も含有しない架橋性ビニル単量体0〜40質量部、
(M−1)エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体1〜40質量部、および
(M−2)エポキシ基を含有しない非架橋性ビニル単量体0〜70質量部
から構成される(但し、(X−1)、(X−2)、(M−1)および(M−2)の合計は100質量部である。)ことができる。
前記ビニル単量体100質量部と、
(P−1)炭素数7〜14である直鎖状、分岐鎖状および環状のアルコール、エーテル、アルデヒド、ケトン、エステル、炭素数8〜10のアルキルベンゼンから選ばれる少なくとも1つのポロジェン(但し、ポロジェンの合計量は100〜400質量部であり、(P−1)はポロジェンの合計量100質量%中に10質量%以上である。)を必須成分とする水系混合物と、
を懸濁重合して得ることができる。
上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤を用いて、前記充填剤にイムノグロブリンを吸着させる工程、および
前記イムノグロブリンを溶出させる工程
を含む。
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有非架橋性ビニル単量体、あるいは水酸基とエポキシ基とを含有する架橋性ビニル単量体、を含むビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子、
前記多孔質粒子に結合したリガンド、ならびに
開環エポキシ基を有する。
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を構成する多孔質粒子は、水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有非架橋性ビニル単量体を必須成分とするビニル単量体の共重合体、あるいは水酸基とエポキシ基とを含有する架橋性ビニル単量体のみを必須成分とするビニル単量体の単独重合体からなる担体粒子である。該重合体にはエポキシ基が含まれることから、該重合体からなるリガンド結合前における多孔質粒子はエポキシ基を含む。リガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量は、0.05〜4.0mmol/gである。
水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体は、1分子中に、2個以上の重合性ビニル基(エチレン性不飽和結合を有する基)と、1個以上の水酸基とを有し、かつエポキシ基を有さない架橋性の単量体である。水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体を用いて、多孔質粒子を親水化し、適切な弾性率に制御することにより、タンパク質の動的結合容量が高く、しかも圧力特性に優れたアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を得ることが出来る。
エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体は、1分子中に、1個の重合性ビニル基と、1個以上のエポキシ基とを有する非架橋性の単量体である。エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体が有するエポキシ基の数は、1分子中に1〜3個が好ましく、1個がより好ましい。エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体は、水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有非架橋性ビニル単量体を含むビニル単量体の共重合体から得られる多孔質粒子のリガンド結合前に、適切な量のエポキシ基を導入するための必須成分である。
ビニル単量体は、
(X−1)水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体20〜90質量部、
(X−2)水酸基もエポキシ基も含有しない架橋性ビニル単量体0〜40質量部、
(M−1)エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体1〜40質量部、および
(M−2)エポキシ基を含有しない非架橋性ビニル単量体0〜70質量部
から構成される(但し、(X−1)、(X−2)、(M−1)および(M−2)の合計は100質量部)であることが好ましい。
(X−1)水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体25〜85質量部、
(X−2)水酸基もエポキシ基も含有しない架橋性ビニル単量体0〜20質量部、
(M−1)エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体2〜30質量部、および
(M−2)エポキシ基を含有しない非架橋性ビニル単量体0〜70質量部
から構成されるビニル単量体、
又は、
(X−1)水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体30〜80質量部、
(X−2)水酸基もエポキシ基も含有しない架橋性ビニル単量体0〜20質量部、
(M−1)エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体3〜15質量部、および
(M−2)エポキシ基を含有しない非架橋性ビニル単量体0質量部を超え40質量部以下
から構成されるビニル単量体が挙げられる。但し、いずれのビニル単量体の具体例においても、(X−1)、(X−2)、(M−1)および(M−2)の合計は100質量部である。
多孔質粒子は、公知のシード重合、懸濁重合などにより製造することができる。シード重合法として、特公昭57−24369号公報記載の二段膨潤重合法も好適に用いられる。重合に際しては、上記単量体の他、水、ポロジェンを必須成分とし、重合開始剤、高分子分散剤、界面活性剤、塩、シード粒子、水溶性重合禁止剤などを必要に応じて使用する。
上述のビニル単量体100質量部と、
(P−1)炭素数7〜14である直鎖状、分岐鎖状および環状のアルコール、エーテル、アルデヒド、ケトン、エステル、炭素数8〜10のアルキルベンゼンから選ばれる少なくとも1つのポロジェンと、を必須成分とする水系混合物の懸濁重合法である。
アルコールとして、1−ヘプタノール、2−ヘプタノール、3−ヘプタノール、4−ヘプタノール、2,4−ジメチル−3−ペンタノール、5−メチル−2−ヘキサノール、2−エチル−1−ヘキサノール、2−オクタノール、3−オクタノール、5−メチル−3−ヘプタノール、1−ノナノール、3,5,5−トリメチルヘキサノール;
エーテルとして、ヘキシルメチルエーテル、ジブチルエーテル、シネオール;
アルデヒドとして、ヘプタナール、オクタナール、2−エチル−1−ヘキサナール、ノナナール、3,5,5−トリメチルヘキサナール、1−デカナール、ドデカナール;
ケトンとして、2−ヘプタノン、3−ヘプタノン、4−ヘプタノン、2,4−ジメチル−3−ペンタノン、4,4−ジメチル−2−ペンタノン、5−メチル−2−ヘキサノン、2−オクタノン、3−オクタノン、5−メチル−3−ヘプタノン、2,6−ジメチル−4−ヘプタノン、2−ノナノン、3−ノナノン、4−ノナノン、3,3,5−トリメチルシクロヘキサノン、2−デカノン、3−デカノン、2−ウンデカノン、4−t−ペンチルシクロヘキサノン、2−ヘキシルシクロペンタノン、2−ヘプチルシクロペンタノン、ジシクロヘキシルケトン;
エステルとして、蟻酸ヘキシル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソブチル、酪酸プロピル、酪酸イソプロピル、イソ酪酸プロピル、イソ酪酸イソプロピル、吉草酸エチル、イソ吉草酸エチル、ピバル酸エチル、ヘキサン酸メチル、酢酸ヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸−2−エチルブチル、プロピオン酸イソペンチル、酪酸ブチル、イソ酪酸ブチル、酪酸イソブチル、イソ酪酸イソブチル、吉草酸プロピル、イソ吉草酸プロピル、ヘキサン酸エチル、ヘプタン酸メチル、酢酸ヘプチル、プロピオン酸ヘキシル、酪酸ペンチル、酪酸イソペンチル、イソ酪酸ペンチル、イソ酪酸イソペンチル、吉草酸イソブチル、ヘキサン酸プロピル、ヘキサン酸イソプロピル、ヘプタン酸エチル、オクタン酸メチル、酢酸オクチル、酢酸イソオクチル、酢酸−2−エチルヘキシル、酪酸ヘキシル、酪酸シクロヘキシル、吉草酸ペンチル、イソ吉草酸イソペンチル、ヘキサン酸ブチル、ヘキサン酸イソブチル、オクタン酸エチル、ノナン酸メチル、酢酸ノニル、ヘキサン酸ペンチル、ノナン酸エチル、2−エチルヘキサン酸プロピル、3,5,5−トリメチルヘキサン酸エチル、デカン酸メチル、δ−ドデカノラクトン、酢酸デシル、デカン酸エチル、酢酸シトロネリル、ドデカン酸メチル、酢酸ドデシル、ドデカン酸エチル;
アルキルベンゼンとして、キシレン、エチルベンゼン、クメン、n−プロピルベンゼン、n−ブチルベンゼン、t−ブチルベンゼン、sec−ブチルベンゼン、iso−ブチルベンゼン、エチルトルエン、シメン、メシチレンなどが挙げられる。
リガンド結合前の多孔質粒子に含まれるエポキシ基は、リガンドを結合するための官能基であり、また、さらに開環後にアフィニティークロマトグラフィー用充填剤としての親水性向上の元となる官能基である。リガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量は、0.05〜4.0mmol/gであり、好ましくは0.08〜2.5mmol/gであり、最も好ましくは0.10〜1.5mmol/gである。リガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量が0.05mmol/g以上であるとリガンドの結合量が適度であり、タンパク質の動的結合容量の低下が抑制される。リガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量が4.0mmol/g以下であると、保存中におけるリガンドの活性の低下が抑制され、タンパク質の動的結合容量の低下も抑制される。リガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量は、多孔質粒子に塩酸を過剰に添加して塩酸を付加反応することによりエポキシ基を開環し、残余の塩酸を過剰量の水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、残余の水酸化ナトリウムを塩酸で逆滴定することにより定量することが出来る。リガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量は、エポキシ基含ビニル単量体の量、重合温度、重合時間、重合液のpH、さらには、重合後の開環処理などによって、調整することが出来る。
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、前記多孔質粒子、前記多孔質粒子に結合したリガンド、および開環エポキシ基を含む。
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤の一実施形態としては、上記特定の重合体からなる多孔質粒子にリガンドを結合し、該重合体に含まれるエポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子を含む。
リガンドは、標的物に対して適度なアフィニティーを有するものであれば、その種類は特に限定されないが、例えば、プロテインA、プロテインG、アビジン等のタンパク質;インシュリン等のペプチド;モノクローナル抗体等の抗体;酵素;ホルモン;DNA;RNA;ヘパリン、ルイスX、ガングリオシド等の糖質;イミノジ酢酸、合成色素、2−アミノフェニル硼素酸、4−アミノベンズアミジン、グルタチオン、ビオチンやその誘導体のような低分子化合物を用いることができる。上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるそのフラグメントを用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体であってもよい。
プロテインAのイムノグロブリン結合ドメインは、天然型のイムノグロブリン結合ドメインであってもよいし、または、組換え型のイムノグロブリン結合ドメインであってもよい。プロテインAのイムノグロブリン結合ドメインは、Aドメイン、Bドメイン、Cドメイン、Dドメイン、Eドメイン、およびZドメインから選ばれる少なくとも1種であることが好ましい。Aドメイン、Bドメイン、Cドメイン、Dドメイン、およびEドメインのアミノ酸配列は例えば、Moks T, Abrahms L, et al.,Staphylococcal protein Aconsists of five IgG−binding domains, Eur J Biochem. 1986, 156, 637−643のFig.1に記載されている。該文献はこの参照により開示に含まれる。また、上記文献に記載された各ドメインのアミノ酸配列と70%以上(好ましくは90%以上)の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質も、本発明におけるプロテインAのイムノグロブリン結合ドメインとして使用することができる。
好ましいリガンドの一例であるイムノグロブリン結合タンパク質(以下、「タンパク質1」ともいう。)は、下記一般式(1)で表される。
(式中、Rは4〜20個のヒスチジンが連続した部位を含む4〜300個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、R2はプロテインAのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも1個含む50〜500個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す(ここで、R2がRに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインのC末端またはN末端である。)。)
(式中、R1は4〜20個のヒスチジンが連続した部位を含む4〜100個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し(ここで、R1において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がrと結合する。)、rは7〜200個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。)
リガンドは、耐アルカリ性のイムノグロブリン結合性タンパク質であってもよい。耐アルカリ性のイムノグロブリン結合性タンパク質として、好ましいリガンドの他の一例であるイムノグロブリン結合タンパク質(以下、「タンパク質2」ともいう。)は、下記一般式(3)で表される。
(式中、Rは4〜20個のヒスチジンが連続した部位を含む4〜300個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、R2はZドメイン、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む50〜500個のアミノ酸からなる、イムノグロブリンと結合可能なアミノ酸配列を示す(ここで、R2がRに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインのC末端またはN末端である。)。)
(式中、R1は4〜20個のヒスチジンが連続した部位を含む4〜100個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し(ここで、R1において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がrと結合する。)、rは7〜200個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。)
本発明で用いるタンパク質1および2を製造するための標準技術としては、例えば、Frederick M. AusbelらによるCurrent Protocols In Molecular BiologyやSambrookら編集のMolecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用することができる。例えば、本発明で用いるタンパク質1または2は、米国特許第5,151,350号明細書に記載されている遺伝子組換え技術を用いて製造することができる。すなわち、目的の改変タンパク質(タンパク質1または2)をコードする核酸配列を含有させた発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、当該細胞を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、本発明で用いるタンパク質1または2を大量かつ経済的に取得することができる。好ましい発現ベクターとしては、細菌内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができ、例えば、米国特許第5,151,350号明細書に記載されているプラスミドや、Sambrookら編集のMolecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されているプラスミドが挙げられる。また、宿主中に核酸を導入することにより宿主を形質転換させるためには、当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Sambrookら編集のMolecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されている公知の方法を利用することができる。形質転換した細菌を培養して、発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。
上記担体と上記リガンドの結合方法としては、多孔質粒子に含まれるエポキシ基をそのままリガンドとの結合部位として利用することが、プロセスとして簡便であり、好ましい。その他に、多孔質粒子に含まれるエポキシ基を開環して生成するアルコール性水酸基をトシル基などで活性化してから、リガンドを結合する方法や、多孔質粒子に含まれるエポキシ基または、当該エポキシ基の開環により生成する基からさらにリンカーを伸ばしてから、当該リンカーを介して多孔質粒子にリガンドを結合しても良い。
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を構成するリガンド結合多孔質粒子は、開環エポキシ基を有する。この開環エポキシ基は、上記特定の重合体からなる多孔質粒子にリガンドを結合した後に、該重合体に含まれるエポキシ基、すなわち、リガンドと結合したエポキシ基以外の残余のエポキシ基を開環させて得られる。これは、多孔質粒子をアフィニティークロマトグラフィー用充填剤として使用する前に、多孔質粒子の表面のエポキシ基が実質的に全て開環していることを意味する。
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を構成する開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子の粒子径は、35〜100μmであることが好ましく、より好ましくは38〜75μmである。粒子径が35μm以上であると、圧力特性に優れる。100μm以下であると、動的結合容量が高い充填剤が得られる。開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子の粒子径は、上述の通り、多孔質粒子を重合する際の条件で調整することができる。なお、本発明における「粒子径」とは、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置により得られる体積平均粒子径である。
以下、本実施形態にかかるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。また、以下の記載は本発明の態様を概括的に示すものであり、特に理由なく、かかる記載により本発明は限定されるものではない。
2.1.1.エポキシ基含有量
リガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量は、重合で使用したエポキシ基含有モノマー量より計算されるエポキシ基モル数が2.00mmolとなるように、質量濃度約10%で正確な質量濃度がわかっている多孔質粒子水分散体をポリエチレンボトルに質量で測り取り、これに濃度38%の塩化カルシウム水溶液25mLおよび2規定の塩酸2.00mLを加えて、75℃で2時間30分攪拌することによりエポキシ基を開環し、冷却後、2規定の水酸化ナトリウム水溶液2.50mLで中和し、さらにpHメーターでpHをモニターしながら0.1規定の塩酸で逆滴定することにより定量した。
レーザ回折散乱式粒度分布測定装置(ベックマン・コールター社製 LS13320)により、粒子の体積平均粒子径を測定した。
40℃で24時間真空乾燥させて乾燥粒子を得、水銀ポロシメータ(島津製作所社製 オートポアIV9520)にて乾燥粒子の細孔容積、比表面積、および体積平均細孔径(細孔径)を求めた。測定範囲は細孔径範囲で10〜5000nmとした。
水スラリー状態の開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子の1滴を微小硬度計(フィッシャー・インストルメンツ社製HM2000)のステージに乗せ、湿潤状態の1個の粒子について、微小硬度計のプローブを粒子の真上から当てて粒子を直径の5%変形させたときに測定される応力(単位N)を記録した。また、プローブの位置と応力のグラフから応力=0となるプローブの位置を最小自乗法で算出し、これを対象粒子の直径とした。記録した応力を対象粒子の直径の円の面積(単位m2)で除した値を測定した1粒子の弾性率とした。測定は任意に選んだ5個の粒子について実施し、個々の弾性率の平均値を求めて、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤を構成する開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子の弾性率とした。
GEヘルスケアバイオサイエンス社製AKTAprime plusを用いて、線流速300cm/hrにおけるタンパク質(ヒトIgG抗体)の動的結合容量を測定した。カラム容量は4mL(5mmΦ×200mm長)、ヒトIgG抗体(Equitech Bio社製 HGG−1000)は20mMリン酸バッファー(pH7.5)で5mg/mLに希釈したものを使用し、溶出先端10%ブレークスルーのときのヒトIgG抗体吸着量とカラム充填体積から動的結合容量を求めた。以下、動的結合容量はDBCと記載することがある。
測定する開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子からなる充填剤を内径16mm、充填高さ100mmとなるようにカラムに充填し、このカラムをGEヘルスケアバイオサイエンス社製AKTApilotに接続し、純水を線流速で50cm/hrずつ段階的に上げながら流したときに、一定線流速で流している1分間に0.05MPaを超える経時的な圧力増加が見られたときの線流速を圧密流速として記録した。3000cm/hrでもこのような圧力増加が見られない場合、測定を中止し、>3000cm/hrと記録した。また、カラムの絶対圧力が1.9MPaに達した場合、このような圧力増加が見られない場合でも測定を中止し、1.9MPaに達したときの線流速を記録した。圧密流速は、900cm/hr以上が好ましく、1200cm/hr以上がより好ましく、1800cm/hr以上がさらに好ましく、2700cm/hr以上が最も好ましい。
多孔質粒子に結合したリガンドであるプロテインA(SPA)の結合量は、ビシンコニン酸(BCA)試薬を用いた試薬セットで定量した。具体的には、固形分換算で1mgの充填剤をテストチューブに採取し、これをThermo Fisher Scientific社(旧PIERCE社)のBCA Protein Assay Kitで定量した。反応は、37℃で30分間、転倒混和することによって行った。検量線は、多孔質粒子に結合させたプロテインAと同一のロットのものを用いて作成した。
2.2.1.実施例1
(i)多孔質粒子の懸濁重合
4091gの純水にポリビニルアルコール(クラレ社製 PVA−217)8.52g、ドデシル硫酸ナトリウム(花王社製 エマール10G)2.13gおよび炭酸ナトリウム4.26gを添加し、一晩撹拌して水溶液(S−1−1)を調製した。さらに重合当日、(S−1−1)の30gを別に抜き取り、残りの(S−1−1)に亜硝酸ナトリウム2.13gを溶解して、水溶液(S−2−1)を調製した。
2.2.1.1.SP4Z発現ベクターの構築
イムノグロブリン結合タンパク質(SP4Z)発現ベクターを下記のステップで構築した。図2は、SP4Zベクターの構築方法を説明する図である。
単量体ZドメインをコードするDNAを出発物質として、NcoI切断部位およびEcoRI切断部位を有する単量体Zドメインベクター(A−pETM11)(SP1Z)を構築した。
次に、A−pETM11ベクターにもう一個Zドメインを付加して、EcoRI切断部位およびSacI切断部位を有する2量体Zドメインベクター(AB−pETM11)(SP2Z)を構築した。
次いで、AB−pETM11ベクターに更にもう一個Zドメインを付加して、SacI切断部位およびHind III切断部位を有する3量体Zドメインベクター(ABC−pETM11)(SP3Z)を構築した。
最後に、ABC−pETM11ベクターに4個目のZドメインを付加して、HindIII切断部位およびXhoI切断部位を有するpETM11−SP4Zのベクターを構築した。
SPZK DNA(配列番号3)をテンプレートとし、フォワードプライマーとしてプライマー153(配列番号5)およびリバースプライマーとしてプライマー156(配列番号8)を用いてPCRを実施した。プライマー153およびプライマー156にはそれぞれ、NcoI切断部位およびSacIの制限酵素切断部位が含まれる。PCRの条件は以下の通りである。
プライマー153,156の代わりに、フォワードプライマーとしてプライマー153およびリバースプライマーとしてプライマー154(配列番号6)を用いて、実験2.2.1.2.と同様にA−pETM11ベクターを構築した。なお、DNAフラグメントの挿入は、pETM11のNcoI切断部位およびEcoRI切断部位を利用している。
フォワードプライマーとしてプライマー155(配列番号7)およびリバースプライマーとしてプライマー156を用いて、PCRでEcoRI切断部位およびSacI切断部位を有する単量体ZドメインのDNAを調製し、A−pETM11のEcoRI切断部位およびSacI切断部位に挿入して構築した。実験は実験2.2.1.2.と同様の条件で行った。
フォワードプライマーとしてプライマー155およびリバースプライマーとしてプライマー157(配列番号9)を用いて、PCRでEcoRI切断部位およびSacI切断部位を有する終止コドンなしの単量体ZドメインのDNAを調製し、A−pETM11のEcoRI切断部位およびSacI切断部位に挿入して、AB−pETM11ベクターを構築した。実験は実験2.2.1.2.と同様の条件で行った。
フォワードプライマーとしてプライマー158(配列番号10)およびリバースプライマーとしてプライマー161(配列番号13)を用いて、PCRでSacI切断部位およびXhoI切断部位を有する単量体ZドメインのDNAを調製し、AB−pETM11のEcoRI切断部位およびSacI切断部位に挿入して構築した。実験は実験2.2.1.2.と同様の条件で行った。
フォワードプライマーとしてプライマー158およびリバースプライマーとしてプライマー159(配列番号11)を用いて、PCRでSacI切断部位およびHindIII切断部位を有する終止コドン無しの単量体ZドメインのDNAを調製し、AB−pETM11のSacI切断部位およびHindIII切断部位に挿入して、ABC−pETM11ベクターを構築した。実験は実験2.2.1.2.と同様の条件で行った。
プライマー160(配列番号12)およびプライマー161を用いて、PCRでHindIII切断部位およびXhoI切断部位を有する単量体ZドメインのDNAを調製し、ABC−pETM11のHindIII切断部位およびXhoI切断部位に挿入して、SP4Z−pETM11ベクターを構築した。実験は実験2.2.1.2.と同様の条件で行った。
得られたSP4Z−pETM11ベクターをE.coli(BL21株)細胞(STRATAGENE製)に導入し、18℃で1mMのIPTG(Sigma−Aldrich製)を添加し、15時間インキュベートして、組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質(SP4Z)を発現させた。誘導に先立って、吸光度(OD600)が約0.6に到達するまで上記細胞を37℃でインキュベートした。タンパク質発現後、細胞を回収し、pH8.0のトリス緩衝液中で破砕した。
粒子乾燥質量換算で1gの多孔質粒子1、0.1gのSP4Zが25mLの0.1Mリン酸バッファー(pH6.8)に分散した混合液を調製し、10℃で24時間転倒混和し、SP4Zを多孔質粒子1に結合させた。生成した粒子を濾過した後、1Mチオグリセロール25mLと混合し30℃で4時間反応させ、残余のエポキシ基を開環し、PBS/0.5%Tween20で洗浄後、PBSで洗浄し、開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子からなるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤1(A−1)を得た。Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay kitで定量測定を行ったところ、前記粒子に結合したSP4Zの量は41mg/g粒子であった。結果を表2に示す。
(A−1)の粒子径は54μm、細孔容積は1.26mL/g、比表面積は111m2/g、体積平均細孔径は101nmであった。弾性率は5.6MPaであった。タンパク質(ヒトIgG抗体)の動的結合容量は40mg/mL、圧力流速は2700cm/hrであった。
実施例1の懸濁重合で、攪拌回転数を300rpmとした以外は、同様にして多孔質粒子2を得て、開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子からなるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤2(A−2)を製造、評価した。結果を表2に示す。多孔質粒子2のエポキシ基含有量は、0.45mmol/gであった。(A−2)の粒子径は31μm、細孔容積は1.438mL/g、比表面積は132m2/g、体積平均細孔径は110nmであった。弾性率は6.4MPaであった。タンパク質(ヒトIgG抗体)の動的結合容量は40mg/mL、圧力流速は1100cm/hrであった。
(i)多孔質粒子の懸濁重合
300gの純水にポリビニルアルコール(クラレ社製 PVA−217)0.600g、ドデシル硫酸ナトリウム(花王社製 エマール10G)0.030gおよび硫酸ナトリウム1.50gを添加し、一晩撹拌して水溶液(S−1−2)を調製した。さらに重合当日、(S−1−2)の5gを別に抜き取り、残りの(S−1−2)に亜硝酸ナトリウム0.150gを溶解して、水溶液(S−2−2)を調製した。
後述する調製例(1)〜(5)により、図3に示されるアミノ酸配列を有するイムノグロブリン結合タンパク質(SPATK(配列番号4))を調製した。
Staphylococus aureusのゲノムDNAをテンプレートとして、制限酵素NcoIサイトを有するプライマー(Primer11)、及び制限酵素BamH1とHindIIIサイトを有するプライマー(Primer12)を用いてPCRでD−AドメンをコードするDNAを得た。このDNAを制限酵素NcoIおよびHindIIIで切断し、同じく制限酵素NcoIおよびHindIIIで切断されたpETM11にライゲーションしてSPAKプラスミドを構築した。
次に、上記に得られたSPAKプラスミドをテンプレートとして制限酵素BamHIサイトを有するプライマー(Primer13)と制限酵素HindIIIサイトを有するプライマー(Primer14)を用いてPCRで新たなD−AドメンをコードするDNAを得た。このDNAを制限酵素BamHIおよびHindIIIで切断し、同じく制限酵素BamHIおよびHindIIIで切断された上記に得られたSPAKプラスミドにライゲーションしてSPATKプラスミドを構築した。
Staphylococus aureusのゲノムDNAをテンプレートとして、Primer11とPrimer12を用いてPCRを実施した。PCRの条件は以下の通りである。
段階1:94℃1分間1サイクル、段階2:94℃30秒間、53℃30秒間、72℃2.5分間(25サイクル)、段階3:72℃10分間1サイクル、その後4℃で保持した。
SPAKプラスミドをテンプレートとしてPrimer13とPrimer14を用いてPCRで新たなD−AドメンをコードするDNAを得た。PCRの条件は段階1:94℃1分間1サイクル、段階2:94℃30秒間、55℃30秒間、72℃2.5分間(25サイクル)、段階3:72℃10分間1サイクル、その後4℃で保持した。PCR生成物はGEヘルスケアバイオサイエンス社製の精製キットで精製した。次に、BamHI制限酵素およびHindIII制限酵素用いてこのDNAを切断した。SPAKプラスミドについても同じくBamHI制限酵素およびHindIII制限酵素で切断した。制限酵素による消化反応は、New England Biolabs製BamHI制限酵素およびHindIII制限酵素を用い、GEヘルスケアバイオサイエンス社製精製キットで精製した。ライゲーション反応は、T4 DNAリガーゼ(Invitrogen社製)で室温にて終夜行った。ライゲーションで得られたベクターをDH5a competent cell(Biomedal Life Science社製)に形質転換させ、陽性colonyのプラスミド(SPATKプラスミド)の配列が正しいことを3730 DNA Sequencer(Applied Biosystems社製)で確認した。
得られたSPATKプラスミドをE.coli(BL21株)細胞(STRATAGENE製)に形質転換した。18℃で1mMのIPTG(Sigma−Aldrich製)を添加し、15時間インキュベートして、組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質(SPATK)を発現させた。誘導に先立って、吸光度(OD600)が約0.6に到達するまで上記細胞を37℃でインキュベートした。タンパク質発現後、細胞を回収し、pH8.0のトリス緩衝液中で破砕した。
粒子乾燥質量換算で1gの多孔質粒子3、0.1gのSPATKが25mLの0.1Mリン酸バッファー(pH6.8)に分散した混合液を調製し、10℃で24時間転倒混和し、SPATKを多孔質粒子3に結合させた。生成した粒子を濾過した後、1Mチオグリセロール25mLと混合し30℃で4時間反応させ、残余のエポキシ基を開環し、PBS/0.5%Tween20で洗浄後、PBSで洗浄し、開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子からなるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤3(A−3)を得た。Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay kitで定量測定を行ったところ、前記粒子に結合したSPATKの量は44mg/g粒子であった。結果を表2に示す。
(A−3)の粒子径は50μm、細孔容積は1.07mL/g、比表面積は104m2/g、体積平均細孔径は68nmであった。弾性率は6.6MPaであった。タンパク質(ヒトIgG抗体)の動的結合容量は39mg/mL、圧力流速は>3000であった。
実施例3において、単量体の全質量を100質量部としたときの、各単量体の部数を、表2の通りとした以外は、同様にして開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子からなるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤4〜6(A−4〜6)を得、評価した。結果を表2に示す。
実施例3において、硫酸ナトリウムを使用せず、亜硝酸ナトリウム1.50gとし、単量体の全質量を100質量部としたときの各単量体の部数を、表2の通りとした以外は、同様にして開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子からなるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤7(A−7)を得、評価した。結果を表2に示す。
実施例3において、単量体の全質量を100質量部としたときの、各単量体の部数を、表3の通りとした以外は、同様にして比較アフィニティークロマトグラフィー用充填剤1〜2(B−1〜2)を得、評価した。結果を表3に示す。
(i)多孔質粒子の懸濁重合
4257gの純水にポリビニルアルコール(クラレ社製 PVA−217)8.51g、ドデシル硫酸ナトリウム(花王社製 エマール10G)0.425gおよび硫酸ナトリウム21.3gを添加し、一晩撹拌して水溶液(S−1−6)を調製した。さらに重合当日、(S−1−6)の20gを別に抜き取り、残りの(S−1−6)にヨウ化カリウム2.13gを溶解して、水溶液(S−2−6)を調製した。
実施例1と同様にして、作製、評価した。結果を表4に示す。
実施例8において、ペンタエリスリトールトリアクリレート60質量%およびペンタエリスリトールテトラアクリレート40質量%からなる単量体(新中村化学工業社製商品名「NKエステルA−TMM−3LM−N」)96.7g、4−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル(日本化成社製)19.3g、ヒドロキシエチルアクリルアミド(興人社製)77.3gを2−オクタノン(東洋合成社製)139gおよびアセトフェノン(和光純薬工業社製)175gに溶解させ、単量体溶液を調製し、2、2’−アゾイソブチロニトリル(和光純薬工業社製)の質量を2.69gとした以外は、同様にして開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子からなるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤9(A−9)を得、評価した。結果を表4に示す。
実施例9において、内温が85℃に到達したところで、開始剤分散液を添加し、85〜90℃に温度を保持しつつ、5時間攪拌を行った以外は、同様にして開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子からなるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤10(A−10)を得、評価した。結果を表4に示す。
実施例1の懸濁重合で、グリセリンジメタクリレート(新中村化学工業社製)125g、グリシジルメタクリレート(三菱レーヨン社製)17.9gの代わりに、グリシジルメタクリレート142.9gを使用した以外は、同様にして、単量体溶液を調製、重合を実施した。なお、単量体の全質量を100質量部としたときの、各単量体の部数は、グリシジルメタクリレート80質量部、グリセロールメタクリレート20質量部である。次いで、反応液を冷却したのち、かかる反応液をヌッチェでろ過し、純水とイソプロピルアルコールで洗浄しようとしたが、ろ過の途中で溶剤を含んだ白色塊状物となり、詰まりが生じて次の工程に進むことができなかった。
Claims (9)
- 水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有非架橋性ビニル単量体、あるいは水酸基とエポキシ基とを含有する架橋性ビニル単量体、を含むビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子、
前記多孔質粒子に結合したリガンド、ならびに
開環エポキシ基を有することを特徴とする、
アフィニティークロマトグラフィー用充填剤。 - 前記リガンドが、プロテインA、プロテインAのイムノグロブリン結合ドメイン、または、その変異体を少なくとも1個含むタンパク質である、請求項1に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
- 前記ビニル単量体が、
(X−1)水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体20〜90質量部、
(X−2)水酸基もエポキシ基も含有しない架橋性ビニル単量体0〜40質量部、
(M−1)エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体1〜40質量部、および
(M−2)エポキシ基を含有しない非架橋性ビニル単量体0〜70質量部
から構成される(但し、(X−1)、(X−2)、(M−1)および(M−2)の合計は100質量部である。)、請求項1または2に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。 - 前記開環エポキシ基は、前記重合体に含まれるエポキシ基をチオグリセロールにより開環させて得られる、請求項1〜3のいずれか1つに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
- 前記多孔質粒子が、
前記ビニル単量体100質量部と、
(P−1)炭素数7〜14である直鎖状、分岐鎖状および環状のアルコール、エーテル、アルデヒド、ケトン、エステル、炭素数8〜10のアルキルベンゼンから選ばれる少なくとも1つのポロジェン(但し、ポロジェンの合計量は100〜400質量部であり、(P−1)はポロジェンの合計量100質量%中に10質量%以上である。)を必須成分とする水系混合物と、
を懸濁重合して得られる、請求項1〜4のいずれか1つに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。 - 水銀ポロシメータで孔径10〜5000nmの範囲に相当する細孔を測定したときの前記多孔質粒子の細孔容積が1.00〜1.90ml/gである、請求項1〜5のいずれか1つに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
- 前記多孔質粒子の粒子径が35〜100μmである、請求項1〜6のいずれか1つに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
- 請求項1〜7のいずれか1つに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を用いて、前記充填剤にイムノグロブリンを吸着させる工程、および
前記イムノグロブリンを溶出させる工程
を含む、イムノグロブリンを単離する方法。 - 請求項1〜7のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤が充填された、アフィニティークロマトグラフィー用充填カラム。
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