CN106459141B - 亲和色谱用载体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种杂质的非特异吸附得到抑制、且因长期保存所致的动态结合容量的降低得到抑制的保存稳定性优异的亲和色谱用载体。所述亲和色谱用载体包含固相载体、使环氧基开环而得到的开环环氧基和结合于所述固相载体的配体,所述固相载体含有包含(M-1)结构单元和(M-2)结构单元的共聚物,(M-1)结构单元是来自含环氧基的单乙烯基单体的结构单元,相对于全部结构单元为大于20质量份且为99.5质量份以下,(M-2)结构单元是来自聚乙烯基单体的结构单元,相对于全部结构单元为0.5~80质量份,其中,将所述亲和色谱用载体填充于任意的柱容器,用含有2M的NaCl的pH7.5的20mM磷酸钠缓冲液对柱进行置换,在40℃下静置7天时的柱内的pH上升幅度为2以下。
Description
技术领域
本发明涉及一种亲和色谱用载体。特别是涉及一种对于抗体等蛋白质的纯化有用的亲和色谱用载体。
背景技术
亲和色谱用载体在包含单克隆抗体的蛋白质的研究、开发和制造中起到重要的作用。亲和色谱用载体一般而言包含具有与靶物质选择性地结合的配体的固相载体。亲和色谱用载体由于固相载体上的配体对靶物质具有高的选择性,因此,与离子色谱、凝胶过滤色谱、反相液相色谱等其它色谱相比,能够以优异的收率且高速地进行经济的纯化。
通常,作为蛋白质纯化用的亲和色谱所要求的性能,可以举出:(1) 不会非特异吸附靶蛋白质以外的杂质;(2)不会因长时间保管而使结合容量降低,保存稳定性优异;(3)柱操作上具有充分的机械强度等。
其中,作为亲和色谱用载体的固相载体,提出了琼脂糖粒子(专利文献1、2)、由苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物构成的多孔粒子(专利文献3、4)、由甲基丙烯酸酯系乙烯基单体的聚合物所成的多孔粒子(专利文献5、6)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表2008-523140号公报
专利文献2:日本特表2009-522580号公报
专利文献3:日本特开平08-278299号公报
专利文献4:日本特表平10-501173号公报
专利文献5:国际公开第2011/125674号公报
专利文献6:日本特开2012-141212号公报
发明内容
然而,琼脂糖粒子通常弹性模量低,因此,具有以高速流动介质时柱的压力变高这样缺点。另外,琼脂糖粒子通常由天然海草经过漫长、繁杂的工序而制造,因此,难以得到品质一定的琼脂糖。
另外,由苯乙烯-二乙烯基苯这样的芳香族乙烯基单体的共聚物构成的多孔粒子通常耐碱性优异,但亲水性低,因此,具有配体的活性低、对靶物质的动态结合容量低这样的缺点。
进而,由甲基丙烯酸酯系乙烯基单体的聚合物构成的多孔粒子虽然具有高的亲水性和机械强度,但对于杂质的除去性能期望进一步的改善。
本发明所要解决的课题在于提供一种杂质的非特异性吸附得到抑制、且因长期保存所致的动态结合容量的降低得到抑制的保存稳定性优异的亲和色谱用载体。
因此,本发明人进行了潜心研究,结果发现具有含有分别包含特定量的来自含环氧基的单乙烯基单体的结构单元和来自聚乙烯基单体的结构单元的共聚物的固相载体、结合于所述固相载体的配体和开环环氧基的特定亲和色谱用载体的靶物质的动态结合容量高,而且杂质的除去性能和保存稳定性优异,完成了本发明。
即,本发明提供<1>一种亲和色谱用载体,包含固相载体、使环氧基开环而得到的开环环氧基和结合于所述固相载体的配体,所述固相载体含有包含(M-1)结构单元和(M-2)结构单元的共聚物,
(M-1)结构单元是来自含环氧基的单乙烯基单体的结构单元,相对于全部结构单元为大于20质量份且为99.5质量份以下,
(M-2)结构单元是来自聚乙烯基单体的结构单元,相对于全部结构单元为0.5~80质量份,其中,
将所述亲和色谱用载体填充于任意的柱容器,用含有2M的NaCl 的pH7.5的20mM磷酸钠缓冲液对柱进行置换,在40℃下静置7天时的柱内的pH上升幅度为2以下。
另外,本发明提供<2>一种亲和色谱柱,是将上述<1>的亲和色谱用载体填充于柱容器而成的。
另外,本发明提供<3>一种靶物质的纯化方法,其特征在于,使用上述<1>的亲和色谱用载体。
本发明的亲和色谱用载体的表面上的环氧基残留量减少,而且因开环环氧基而具备高的亲水性。
因此,利用本发明的亲和色谱用载体,能够改善非特异性地吸附的杂质、例如宿主细胞蛋白质(HCP=Host Cell Protein)、DNA的除去性能。
另外,由于能够较高地保持配体的活性,因此,即使在将本发明的亲和色谱用载体用于例如免疫球蛋白的纯化之后进一步长时间反复使用,免疫球蛋白等的动态结合容量也不易降低,能够以低成本进行免疫球蛋白的纯化。
具体实施方式
以下,对本发明的亲和色谱用载体详细地进行说明。
[亲和色谱用载体]
<固相载体的构成>
构成本发明的亲和色谱用载体的固相载体含有包含(M-1)和(M -2)的共聚物,
(M-1)是来自含环氧基的单乙烯基单体的结构单元,相对于全部结构单元为大于20质量份且为99.5质量份以下,
(M-2)是来自聚乙烯基单体的结构单元,相对于全部结构单元为 0.5~80质量份,
并且含有使环氧基开环而得到的开环环氧基。固相载体的形态可以为整体(monolith)、膜、中空纤维、粒子、盒(cassette)、片(chip) 等中的任一种,但优选粒子。另外,从提高表面积的观点考虑,固相载体优选多孔粒子等经多孔化的载体。另外,作为多孔粒子,优选多孔聚合物粒子。应予说明,固相载体除上述共聚物以外,也可以含有天然高分子、合成高分子等。
((M-1)来自含环氧基的单乙烯基单体的结构单元)
含环氧基的单乙烯基单体为1分子中具有1个聚合性乙烯基(具有乙烯性不饱和键的基团)和1个以上环氧基的单体。含环氧基的乙烯基单体能够利用于将适当量的环氧基导入固相载体中而得到适当的配体结合量、开环环氧基量。
作为含环氧基的单乙烯基单体,例如可以举出:(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸4-羟基丁酯缩水甘油醚、(甲基)丙烯酸3,4 -环氧环己基甲酯、α-(甲基)丙烯基-ω-缩水甘油基聚乙二醇等不含羟基的(甲基)丙烯酸酯类;甘油单(甲基)丙烯酸酯缩水甘油醚等含羟基的(甲基)丙烯酸酯类;乙烯基苄基缩水甘油醚等芳香族单乙烯基化合物,此外,可以举出:烯丙基缩水甘油醚、3,4-环氧-1-丁烯、3,4-环氧-3-甲基-1-丁烯等。可以单独使用这些中的1种,也可以组合使用2种以上。
其中,作为含环氧基的单乙烯基单体,从防污性、保存稳定性等观点考虑,优选含环氧基的(甲基)丙烯酸酯类、含环氧基的芳香族单乙烯基化合物,更优选含环氧基的(甲基)丙烯酸酯类,进一步优选(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、(甲基)丙烯酸4-羟基丁酯缩水甘油醚,特别优选(甲基)丙烯酸缩水甘油酯。应予说明,通过正相悬浮聚合使固相载体为粒子状时,作为含环氧基的单乙烯基单体,从开环环氧基量的控制容易的方面考虑,优选水不溶性的含环氧基的单乙烯基单体。在此,水不溶性是指相对于水100mL在室温(25℃)下不溶解10g以上。应予说明,含环氧基的单乙烯基单体可以使用市售品,也可以依照公知的方法合成而使用。
来自含环氧基的单乙烯基单体的结构单元的含量相对于全部结构单元为大于20质量份且为99.5质量份以下。若该含量为20质量份以下,则开环环氧基的量减少而配体结合后的亲和色谱用载体的亲水性变低,杂质的除去性能变低。另一方面,若大于99.5质量份,则机械强度变低,无法耐受作为亲和色谱用载体的操作。
从防污性、保存稳定性等观点考虑,来自含环氧基的单乙烯基单体的结构单元的含量相对于全部结构单元,优选为25质量份以上,更优选为30质量份以上,进一步优选为40质量份以上,特别优选为50质量份以上,另外,从防污性、保存稳定性等观点考虑,相对于全部结构单元,优选为95质量份以下,更优选为90质量份以下,进一步优选为 85质量份以下,特别优选为80质量份以下。
((M-2)来自聚乙烯基单体的结构单元)
聚乙烯基单体为1分子中具有2个以上聚合性乙烯基(具有乙烯性不饱和键的基团)的乙烯基单体。以下,将该聚乙烯基单体分成不含羟基的聚乙烯基单体和含羟基的聚乙烯基单体进行说明。应予说明,聚乙烯基单体可以单独使用1种或组合使用2种以上。
作为不含羟基的聚乙烯基单体,例如可以举出:乙二醇二(甲基) 丙烯酸酯、二乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、1,4-丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1,6-己二醇二 (甲基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇四(甲基)丙烯酸酯等(甲基)丙烯酸酯类;二乙烯基苯、三乙烯基苯等芳香族聚乙烯基化合物;丁二烯、异氰脲酸二烯丙酯、异氰脲酸三烯丙酯等烯丙基化合物等,可以单独使用1种或组合使用2种以上。其中,作为不含羟基的聚乙烯基单体,优选(甲基)丙烯酸酯类、芳香族聚乙烯基化合物。
另外,作为上述不含羟基的聚乙烯基单体中所含的聚合性乙烯基的个数,在1分子中优选2~5个,更优选2或3个。
作为含羟基的聚乙烯基单体,优选多元醇的(甲基)丙烯酸酯类、各种糖类的2取代以上的(甲基)丙烯酸酯类、多元醇的(甲基)丙烯酰胺类。
作为多元醇的(甲基)丙烯酸酯类,可以举出:甘油二(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基乙烷二(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷二(甲基) 丙烯酸酯、丁三醇二(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇二(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇三(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇二(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇三(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇四(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇五(甲基)丙烯酸酯、肌醇二(甲基)丙烯酸酯、肌醇三(甲基) 丙烯酸酯、肌醇四(甲基)丙烯酸酯等。
作为各种糖类的2取代以上的(甲基)丙烯酸酯类,例如可以举出:葡萄糖二(甲基)丙烯酸酯、葡萄糖三(甲基)丙烯酸酯、葡萄糖四(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇二(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇三(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇四(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇五(甲基)丙烯酸酯等。
进而,作为含羟基的聚乙烯基单体,除上述例示的含羟基的聚乙烯基单体以外,还可以举出:二氨基丙醇、三羟基甲基氨基甲烷、葡萄糖胺等氨基醇与(甲基)丙烯酸的脱水缩合反应物等。
另外,作为上述含羟基的聚乙烯基单体中所含的聚合性乙烯基的个数,在1分子中,优选2~5个,更优选2或3个。
其中,作为聚乙烯基单体,从较少量使用即可得到良好的多孔性和机械强度,对含环氧基的单乙烯基单体的使用量的限制少等观点考虑,优选不含羟基的聚乙烯基单体。不含羟基的聚乙烯基单体中,从防污性、保存稳定性等观点考虑,特别优选聚合性乙烯基的个数为3个的(甲基) 丙烯酸酯类、聚合性乙烯基的个数为2或3个的芳香族聚乙烯基化合物。作为特别适合的具体例,可以举出:三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、二乙烯基苯、三乙烯基苯。
来自聚乙烯基单体的结构单元的含量相对于全部结构单为0.5~80 质量份。若来自聚乙烯基单体的结构单元的含量小于0.5质量份,则固相载体的机械强度变低,无法耐受作为亲和色谱用载体的操作。另外,若大于80质量份,则亲水性降低,得不到HCP的减少效果,另外,配体的活性降低。
从防污性、保存稳定性等观点考虑,来自聚乙烯基单体的结构单元的含量相对于全部结构单元,优选为5质量份以上,更优选为10质量份以上,进一步优选为15质量份以上,进一步优选为20质量份以上,特别优选为25质量份以上,另外,从防污性、保存稳定性等观点考虑,相对于全部结构单元,优选为70质量份以下,更优选为65质量份以下,进一步优选为60质量份以下,进一步优选为50质量份以下,特别优选为40质量份以下。
((M-3)来自不含环氧基的单乙烯基单体的结构单元)
作为本发明中使用的固相载体中所含的共聚物,优选除上述结构单元(M-1)和结构单元(M-2)以外还进一步含有(M-3)来自不含环氧基的单乙烯基单体的结构单元:相对于全部结构单元为40质量份以下的共聚物。
不含环氧基的单乙烯基单体为1分子中具有1个聚合性乙烯基(具有乙烯性不饱和键的基团)且不含环氧基的乙烯基单体。以下,将不含环氧基的单乙烯基单体分成不含环氧基的不含羟基的单乙烯基单体、不含环氧基的含羟基的单乙烯基单体进行说明。
作为不含环氧基的不含羟基的单乙烯基单体,从防止纯化时的杂质的非特异性吸附的观点考虑,优选非离子性单体。作为这样的非离子性单体,例如可以举出:(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸环己酯、(甲基)丙烯酸甲氧基乙酯等 (甲基)丙烯酸酯类;(甲基)丙烯酰胺、二甲基(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酰基吗啉、二丙酮(甲基)丙烯酰胺等(甲基)丙烯酰胺类,可以单独使用1种或组合使用2种以上。应予说明,作为非离子性单体,也可以使用(甲基)丙烯酸2-乙基己酯、(甲基)丙烯酸硬脂酯这样的疏水性(甲基)丙烯酸酯类;苯乙烯、α-甲基苯乙烯、乙基乙烯基苯这样的芳香族乙烯基化合物,但从抑制纯化时的杂质的非特异吸附的观点考虑,优选不为这样的单体而为上述例示的单体中具有碳原子数5以下的烷基或烷氧基烷基这样的(甲基)丙烯酸烷酯类或上述的(甲基) 丙烯酰胺类。
作为不含环氧基的含羟基的单乙烯基单体,例如可以举出:丙三醇单(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基乙烷单(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷单(甲基)丙烯酸酯、丁三醇单(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇单(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇单(甲基)丙烯酸酯、肌醇单(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸羟基乙酯、(甲基)丙烯酸羟基丙酯、聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯等(甲基)丙烯酸酯类;羟基乙基(甲基)丙烯酰胺等(甲基)丙烯酰胺类等,可以单独使用1种或组合使用2种以上。
另外,作为不含环氧基的含羟基的单乙烯基单体中所含的羟基的个数,在1分子中,优选1~5个,更优选1~3个。
其中,作为不含环氧基的单乙烯基单体,从防污性等观点考虑,优选不含环氧基的含羟基的单乙烯基单体,更优选丙三醇单(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸羟基乙酯、(甲基)丙烯酸羟基丙酯、羟基乙基(甲基)丙烯酰胺,进一步优选丙三醇单(甲基)丙烯酸酯、羟基乙基(甲基)丙烯酰胺,特别优选羟基乙基(甲基)丙烯酰胺。
来自不含环氧基的单乙烯基单体的结构单元的含量相对于全部结构单元,优选40质量份以下。通过使该含量为40质量份以下,在含羟基的单乙烯基单体的情况下,多孔粒子的亲水性提高,凝聚得到抑制,配体的变高,靶物质的动态结合量得到改善。另外,机械强度也得到改善。作为上述结构单元的含量,相对于全部结构单元,更优选为35质量份以下,进一步优选为30质量份以下,进一步优选为25质量份以下,特别优选为20质量份以下。另外,来自不含环氧基的单乙烯基单体的结构单元的含量也可以为0质量份。含有该结构单为时,相对于全部结构单元,优选5质量份以上。
上述结构单元(M-1)~(M-3)的含量的优选的组合为结构单元(M-1):相对于全部结构单元为40~90质量份,结构单元(M-2):相对于全部结构单元为10~60质量份,结构单元(M-3):相对于全部结构单元为0~25质量份,更优选的组合为结构单元(M-1):相对于全部结构单元为40~80质量份,结构单元(M-2):相对于全部结构单元为15~60质量份,结构单元(M-3):相对于全部结构单元为0~ 25质量份,特别优选的组合为结构单元(M-1):相对于全部结构单元为40~80质量份,结构单元(M-2):相对于全部结构单元为20~60质量份,结构单元(M-3):相对于全部结构单元为0~20质量份。
(环氧基含量)
配体结合前的固相载体中所含的环氧基为用于结合配体的官能团,另外,进一步在开环后成为作为亲和色谱用载体的亲水性提高的基础的官能团。配体结合前的固相载体的环氧基含量优选为1~6mmol/g,更优选为2~5mmol/g,特别优选为2.5~4mmol/g。若配体结合前的固相载体的环氧基含量为1mmol/g以上,则配体结合后得到的开环环氧基的量为适当量,靶物质以外的杂质的除去性能提高。若配体结合前的固相载体的环氧基含量为6mmol/g以下,则配体结合后的环氧基的残留量减少,作为亲和色谱用载体保存时的配体的活性的降低得到抑制,反复使用时的靶物质的动态结合容量的降低也得到抑制。
配体结合前的固相载体的环氧基含量可以通过含环氧基的单乙烯基单体的量、聚合温度、聚合时间、聚合液的pH以及聚合后的开环处理等进行调整。
<固相载体的制造>
举出固相载体为多孔粒子的情况为例对固相单体的制造法进行说明。
多孔粒子可以通过公知的晶种聚合、悬浮聚合等来制造。作为晶种聚合法,可以举出:日本特公昭57-24369号公报记载的二步溶胀聚合法。聚合时,除上述单体以外,可以根据需要使用聚合引发剂、多孔化剂、水系介质、分散稳定剂、表面活性剂、聚合调整剂、聚合抑制剂、晶种粒子等。
多孔粒子的制造中的优选的聚合法为以单体混合物、多孔化剂为必需成分的水系混合物的悬浮聚合法。
另外,作为悬浮聚合的具体方法,例如可以举出:将聚合引发剂溶解于含有单体混合物和多孔化剂的混合溶液(单体溶液)中,使其悬浮于水系介质并加热至规定温度使其聚合的方法、将聚合引发剂溶解于含有单体混合物和多孔化剂的混合溶液(单体溶液)中,添加于加热至规定温度的水系介质中使其聚合的方法、使含有单体混合物和多孔化剂的混合溶液(单体溶液)悬浮于水系介质中并加热至规定温度,添加聚合引发剂使其聚合的方法等。
作为聚合引发剂,优选自由基聚合引发剂。作为自由基聚合引发剂,例如可以举出:偶氮系引发剂、过氧化物系引发剂、氧化还原系引发剂等,具体而言,可以举出:偶氮双异丁腈、偶氮双异丁酸甲酯、偶氮双-2,4-二甲基戊腈、过氧化苯甲酰、过氧化二叔丁基、过氧化苯甲酰-二甲基苯胺等。聚合引发剂的合计使用量通常相对于单体总量100质量份为0.01~10质量份左右。
上述多孔化剂为了制造多孔粒子而使用,在油滴内的聚合中,与单体一同存在,作为非聚成分具有形成孔的作用。多孔化剂只要是在多孔表面能够容易地除去的物质就没有特别限制,例如可以举出:可溶于各种有机溶剂、单体混合物的线状聚合物等,也可以将它们并用。
作为上述多孔化剂,例如可以举出:己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷等脂肪族烃类;环己烷、环戊烷等脂环式烃类;苯、甲苯、二甲苯、萘、乙基苯等芳香族烃类;四氯化碳、1,2-二氯乙烷、四氯乙烷、氯苯等卤化烃类;丁醇、戊醇、己醇、庚醇、己醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-己醇等脂肪族醇类;环己醇等脂环式醇类;2-苯基乙基醇、苄基醇等芳香族醇类;二乙基酮、甲基异丁基酮、二异丁基酮、苯乙酮、2-辛酮、环己酮等酮类;二丁基醚、二异丁基醚、苯甲醚、乙氧基苯等醚类;乙酸异戊酯、乙酸丁酯、乙酸-3-甲氧基丁酯、丙二酸二乙酯等酯类以及非交联性乙烯基单体的均聚物等线状聚合物。多孔化剂可以单独使用或混合使用2种以上。
上述多孔化剂的合计使用量通常相对于单体总量100质量份为40~ 400质量份左右。
作为上述水系介质,可以举出例如水溶性高分子水溶液等,作为水溶性高分子,例如可以举出:羟乙基纤维素、聚乙烯醇、羧甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、淀粉、明胶等。水系介质的合计使用量相对于单体总量100质量份,通常为200~7000质量份左右。
另外,使用水作为水系介质的分散介质时,也可以使用例如氯化钠、硫酸钠、碳酸钠、碳酸钙、磷酸钙等分散稳定剂。
另外,也可以使用以烷基硫酸酯盐、烷基芳基硫酸酯盐、烷基磷酸酯盐、脂肪酸盐等阴离子性表面活性剂为代表的各种表面活性剂。
另外,也可以使用亚硝酸钠等亚硝酸盐、碘化钾等碘化物盐、叔丁基儿茶酚、苯醌、苦味酸、氢醌、氯化铜、氯化铁等聚合抑制剂。
另外,也可以使用十二烷基硫醇等聚合调整剂。
另外,聚合温度只要根据聚合引发剂决定即可,例如使用偶氮双异丁腈作为聚合引发剂时,优选50~100℃,更优选60~90℃。
另外,聚合时间通常为5分钟~48小时,优选为10分钟~24小时。
聚合结束后,为了除去附着于得到的多孔粒子上的水溶性高分子等,优选使用水和/或热水进行清洗。
另外,从后述的配体的结合容易的观点考虑,优选使用晶种粒子或 /或多孔化剂的良溶剂进行清洗。作为清洗溶剂,可以优选使用丙酮、乙醇、异丙醇等。另外,也可以根据需要在清洗前后,使用超声波分散机等分散多孔粒子。进而,从压力特性的提高、靶物质等的动态结合容量的提高方面考虑,优选通过倾析、过滤、筛分级等方法来除去小粒子、粗大粒子,。
<亲和色谱用载体的上述以外的构成>
(开环环氧基)
本发明的亲和色谱用载体具有使环氧基开环而得到的开环环氧基。该开环环氧基可以在将配体结合于含有上述共聚物的固相载体后,使该共聚物中所含的环氧基,即与配体结合的环氧基以外的剩余环氧基开环而得到。环氧基除上述共聚物中所含的环氧基以外,也包含利用表氯醇、二缩水甘油醚化合物等在之后导入的环氧基,不论在本发明的亲和色谱用载体的制造中的哪一阶段导入。
而且,本发明的亲和色谱用载体系使固相载体表面的大部分环氧基开环,使亲和色谱用载体与高浓度的氯化物离子接触,使剩余的环氧基开环时放出的氢氧化物离子的量明显少。
因此,对于本发明的亲和色谱用载体,将亲和色谱用载体填充于任意的柱容器中,用含有2M的NaCl的pH7.5的20mM磷酸钠缓冲液对柱进行置换,在40℃下静置7天时的柱内的pH上升幅度为2以下。通过该构成,杂质的除去性能和保存稳定性优异。上述pH上升幅度优选为1.9以下,进一步改善杂质的除去性能时,更优选1.7以下。另外, pH上升幅度的下限值没有特别限制,例如为0.01。
上述pH上升幅度具体而言可以由以下的式子求出,更详细而言,可以通过实施例中记载的方法来测定。另外,本发明中,pH上升幅度的测定对新的亲和色谱用载体进行。新的亲和色谱用载体是指以前未使用的状态的载体,例如若使用于抗体纯化,则是指使用于抗体纯化之前的状态的记载。
(pH上升幅度)=(负荷pH)-(初期pH)
上述式中“初期pH”是指使含有2M的NaCl的pH7.5的20mM磷酸钠缓冲液通入柱中,柱内的pH达到平衡时的pH的值。
上述式中“负荷pH”是指测定初期pH后在40℃的恒温器内静置7 天后,使含有2M的NaCl的pH7.5的20mM磷酸钠缓冲液再次通入柱中,pH变得最高时的pH的值。
另外,作为环氧基开环而生成的开环环氧基,从防止杂质的非特异吸附,并且防止在保存中配体的活性降低的观点考虑,优选下述式(1) 所示的基团。
[式(1)中,
R1表示碳原子数1~6的2价的有机基团,
R2表示氢原子或碳原子数1~10的1价的有机基团,
X表示硫基(>S)、亚硫酰基(>S=O)、磺酰基(>S(=O)2)、亚氨基(>NH)或氧基(>O),
*表示键合位置]。
R1表示碳原子数1~6的2价的有机基团。作为该有机基团的碳原子数,优选为1~4,更优选为1或2。
另外,上述2价的有机基团可以为直链状,也可以为支链状。另外,作为该2价的有机基团,可以举出:2价的烃基、在2价的烃基的碳-碳原子间具有选自醚键、亚氨基和酯键中的1种以上的基团,优选2价的烃基。
上述2价的烃基优选为2价的脂肪族烃基,更优选为烷烃二基。
作为烷烃二基的具体例,可以举出:甲烷-1,1-二基、乙烷-1,1 -二基、乙烷-1,2-二基、丙烷-1,1-二基、丙烷-1,2-二基、丙烷-1,3-二基、丙烷-2,2-二基、丁烷-1,4-二基、戊烷-1,5-二基、己烷-1,6-二基等。
R2表示氢原子或碳原子数1~10的1价的有机基团,优选碳原子数 1~10的1价的有机基团。作为该有机基团,从使配体结合时的动态结合容量、防污性的观点考虑,优选下述式(2)或(3)所示的有机基团,更优选式(2)所示的有机基团。
[式(2)中,
R3表示碳原子数1~10的2价或3价的有机基团,
n表示1或2,
**表示与式(1)中的X的键合位置]。
[式(3)中,
R4表示碳原子数1~10的2价或3价的有机基团,
Y表示酸性基团或氨基,
m表示1或2,
**表示与式(1)中的X的键合位置]。
作为式(2)中的R3、式(3)中的R4所示的2价或3价的有机基团的碳原子数,从使配体结合时的动态结合容量等观点考虑,优选1~8,更优选1~6,进一步优选2~4。
另外,作为上述2价的有机基团,可以举出2价的烃基,可以为直链状,也可以为支链状。上述2价的烃基优选为2价的脂肪族烃基,更优选为烷烃二基。作为该烷烃二基的碳原子数,从使配体结合时的动态结合容量等观点考虑,优选1~8,更优选1~6,进一步优选2~4。
作为上述烷二基的具体例,可以举出:甲烷-1,1-二基、乙烷-1,1 -二基、乙烷-1,2-二基、丙烷-1,1-二基、丙烷-1,2-二基、丙烷-1,3-二基、丙烷-2,2-二基等。
另外,作为上述3价的有机基团,可以举出3价的烃基,可以为直链状,也可以为支链状。上述3价的烃基优选为3价的脂肪族烃基,更优选为烷烃三基。作为该烷烃三基的碳原子数,从使配体结合时的动态结合容量、防污性的观点考虑,优选1~8,更优选1~6,进一步优选2~ 4。
作为上述烷烃三基的具体例,可以举出:甲烷-1,1,1-三基、乙烷-1,1,2-三基、丙烷-1,2,3-三基、丙烷-1,2,2-三基等。
式(2)中,n表示1或2,优选2。
式(3)中,Y表示酸性基团或氨基,但优选酸性基团。作为酸性基团,可以举出:羧基、磷酸基、磺基、它们的盐等。应予说明,作为盐,可以举出:钠盐、钾盐等碱金属盐;镁盐、钙盐等碱土金属盐;铵盐;有机铵盐等。
式(3)中,m表示1或2,优选1。
X表示硫基(>S)、亚硫酰基(>S=O)、磺酰基(>S(=O)2)、亚氨基(>NH)或氧基(>O),但优选硫基(>S)、亚硫酰基(>S=O)、氧基(>O),更优选硫基(>S)、亚硫酰基(>S=O),特别优选亚硫酰基(>S=O)。
作为固相载体中的环氧基的开环方法,例如可以举出在水溶剂中,在酸或碱存在下搅拌的方法。搅拌可以加热而进行,也可以在室温下进行。
另外,也可以使用巯基乙醇、硫代丙三醇、巯基乙酸、其盐、巯基琥珀酸、其盐、巯基乙磺酸、其盐、巯基丙磺酸、其盐等具有亲水性基团的巯基化合物;单乙醇胺、葡萄糖胺等具有亲水性基团的胺化合物;二乙二醇、甘油等多元醇类作为使环氧基开环的封闭剂(blocking agent)。应予说明,作为在此所谓的亲水性基团,可以举出:羟基;氨基;羧基、磷酸基、磺基、它们的盐等酸性基团等。作为盐,可以举出:钠盐、钾盐等碱金属盐;镁盐、钙盐等碱土金属盐;铵盐;有机铵盐等。
上述酸、碱、封闭剂的使用量相对于剩余的环氧基1摩尔,通常为 0.1~40摩尔当量。剩余的环氧基与配体多点结合,因此,在保存中使配体的活性降低,因此,优选以2~40摩尔当量的过量进行封闭。
另外,开环反应的反应时间没有特别限制,但通常为0.5~72小时左右,优选为1~48小时。又,反应温度只要在溶剂的沸点以下适当选择即可,但通常为2~100℃左右。
另外,也可以根据需要在碱性催化剂存在下进行封闭。作为该碱性催化剂,可以举出:三乙胺、N,N-二甲基-4-氨基吡啶、二异丙基乙胺等,可以单独使用1种或组合使用2种以上。
优选的开环环氧基为利用巯基化合物和/或多元醇类使固相载体中所含的环氧基开环而得到的开环环氧基,具有非特异吸附比利用具有氨基的封闭剂得到的开环基团少、并且动态结合量变高这样的优点。
另外,使用巯基化合物作为封闭剂时,可以使用氧化剂使硫基氧化成亚硫酰基,进一步提高亲水性。
上述氧化剂大致分成有机氧化剂和无机氧化剂,作为有机氧化剂,例如可以举出:过乙酸、过苯甲酸、偏氯过苯甲酸等。另一方面,作为无机氧化剂,例如可以举出:过氧化氢、铬酸、高锰酸盐等。应予说明,这些氧化剂可以单独使用1种或组合使用2种以上。
另外,氧化剂的合计使用量相对于硫基1摩尔,通常为0.1~10摩尔当量左右,优选为0.5~3摩尔当量。
另外,上述氧化反应优选在溶剂存在下进行。作为该溶剂,可以举出:水;二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等酰胺系溶剂;甲醇、乙醇等醇系溶剂等,这些溶剂可以单独使用1种或组合使用2种以上。
上述溶剂的合计使用量相对于原料的固相载体,通常为1~50质量倍左右,优选为5~15质量倍左右。
另外,上述氧化反应的反应时间没有特别限制,通常为1~72小时左右,反应温度只要在溶剂的沸点以下适当选择即可,但通常为1~ 90℃左右。
(配体)
本发明的亲和色谱用载体包含结合于固相载体的配体。
配体只要是对靶物质具有适度的亲和性即可,其种类没有特别限定,例如可以使用蛋白A、蛋白G、蛋白F、Fc结合蛋白、抗生物素蛋白等蛋白质;胰岛素等肽;单克隆抗体等抗体;酶;激素;DNA;RNA;肝素、路易斯X(Lewis X)、神经节糖苷等糖质;亚氨基二乙酸、合成色素、2-氨基苯基硼酸、4-氨基苯甲脒、谷胱甘肽、生物素、其衍生物这样的低分子化合物。上述例示的配体可以使用其整体,也可以使用通过重组、酶处理等而得到的片段。另外,也可以为人工合成的肽、肽衍生物。
上述配体中,作为免疫球蛋白的分离或纯化中优选的配体,可以举出:免疫球蛋白结合性蛋白质。
作为免疫球蛋白结合性蛋白质,优选选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、 Fc结合蛋白和它们的功能性变异体中的至少1种以上。其中,优选为蛋白A、蛋白G、它们的功能性变异体,更优选为蛋白A、其功能性变异体。
另外,本发明中,“蛋白质”是指具有肽结构单元的所有分子,例如是包含人为地改变天然型蛋白质的部分片段、天然型蛋白质的氨基酸序列的变异体的概念。另外,“免疫球蛋白结合域”表示单独具有免疫球蛋白结合活性的多肽的功能单元,“免疫球蛋白结合性蛋白质”表示对免疫球蛋白具有特异性的亲和性、且包含“免疫球蛋白结合域”的蛋白质。“免疫球蛋白结合”表示结合于免疫球蛋白分子的互补性决定区域(CDR)以外的区域、特别是Fc片段。本发明中,与亲和色谱有关而使用的术语“配体”表示与亲和色谱的靶物质结合的分子。
作为上述配体与固相载体的结合方法,将固相载体中所含的环氧基直接作为与配体的结合部位来利用作为工艺简便而优选。此外,也可以用甲苯磺酰基等将固相载体中所含的环氧基开环而生成的醇性羟基活化后,结合配体的方法,也可以由固相载体中所含的环氧基或通过该环氧基的开环而生成的基团进一步使连接体(linker)延长后,介由该连接体将使配体结合于固相载体。作为连接体,优选二缩水甘油氧基烷烃、聚亚烷基二醇二缩水甘油醚等二缩水甘油醚化合物。
配体的结合条件根据配体结合前的固相载体的环氧基含量、配体的种类而不同,可以采用对本领域技术人员而言公知的方法。配体为蛋白质时,蛋白质的N末端的氨基、蛋白质中所含的赖氨酸、半胱氨酸可以成为与环氧基的反应点。结合蛋白质时,例如可以使用与蛋白质的等电点接近的缓冲液类的水溶液,根据需要添加氯化钠、硫酸钠等盐,一边将蛋白质与固相载体混合一边使其在0~40℃下反应1~48小时,结合作为配体的蛋白质。
配体的结合量根据配体的种类、靶物质的种类等适当调节,将蛋白 A这样的免疫球蛋白结合性蛋白质作为配体结合时,每1g固相载体优选为10~200mg,更优选为25~100mg。将蛋白A这样的免疫球蛋白结合性蛋白质作为配体结合时,若每1g固相载体的配体的结合量为 10mg以上,则动态结合容量优异,若为200mg以下,则为了洗脱结合的抗体而使用的洗脱液的量为特别适当的量。
(粒径、比表面积)
构成本发明的亲和色谱用载体的固相载体为多孔粒子时,上述多孔粒子的粒径通常为35~100μm,优选为40~85μm。若粒径为35μm以上,则压力特性优异。若为100μm以下,则得到动态结合容量高的填充剂。
多孔粒子的粒径可以通过聚合时的条件进行调整。应予说明,本发明中的“粒径”是指利用激光衍射散射式粒度分布测定装置(Beckman Coulter公司制的LS13 320)得到的体积平均粒径。
构成本发明的亲和色谱用载体的固相载体为多孔粒子时,上述多孔粒子的比表面积在测定相当于孔径10~5000nm的范围的孔隙(pore) 时,以孔隙尺寸10nm~5000nm的比表面积计优选为70m2/g以上,更优选为90m2/g以上。若比表面积在上述范围内,则得到靶物质的动态结合容量高的亲和色谱用载体。应予说明,本发明中的“比表面积”是指利用压汞仪(岛津制作所株式会社制的Autopore IV9520)得到的细孔径10~5000nm的细孔所具有的表面积除以粒子的干燥质量而得到的值。
本发明的亲和色谱用载体的杂质除去性能高,而且保存稳定性优异,对于抗体等蛋白质的纯化特别有用。
[亲和色谱柱]
本发明的亲和色谱柱是将本发明的亲和色谱用载体填充于柱容器中而成的。
[靶物质的纯化方法]
本发明的靶物质的纯化方法的特征在于,使用本发明的亲和色谱用载体。
纯化除使用本发明的亲和色谱用载体以外,与常规方法同样,例如可以举出包含如下工序的方法:准备含有靶物质的组合物的准备工序;将上述组合物通入本发明的色谱柱的通液工序;以及使通过该通液工序而吸附于载体的靶物质洗脱的洗脱工序。
本发明的纯化方法适于蛋白质的纯化,特别适于免疫球蛋白的纯化。
实施例
以下,举出实施例对本发明详细地进行说明,但本发明并不限定于这些实施例。
(实施例1)
(1)在360g的纯水中添加聚乙烯醇(KURARAY公司制,PVA- 217)3.58g,加热搅拌使聚乙烯醇溶解,冷却后,添加十二烷基硫酸钠 (和光纯药工业制)0.36g、硫酸钠(和光纯药工业制)0.36g、亚硝酸钠(和光纯药工业制)0.18g,进行搅拌而制备水溶液S。
另一方面,将由甲基丙烯酸缩水甘油酯(三菱丽阳公司制)12.00g 和二乙烯基苯(新日铁化学公司制)1.33g构成的单体组合物溶解于二异丁基酮(三井化学公司制)24.43g中,制备单体溶液。
接着,将上述水溶液S总量投入500mL可拆式烧瓶内,安装温度计、搅拌桨和冷却管,设置于温水浴,在氮气氛下开始搅拌。将上述单体溶液总量投入可拆式烧瓶内,在利用温水浴进行加温而内温到达85℃时添加2,2’-偶氮异丁腈(和光纯药工业公司制)0.53g,将温度维持在 86℃。
(2)然后,将温度维持在86℃,进行3小时搅拌。接着,将反应液冷却后,过滤该反应液,用纯水和乙醇进行清洗。使清洗的粒子分散于纯水中进行3次倾析,除去小粒子。接着,以粒子的浓度成为10质量%的方式使粒子分散于纯水中,得到多孔粒子分散液。
(3)将改性蛋白A(Repligen制的rSPA)0.15g分散于1.2M硫酸钠/0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.6)40mL中,得到蛋白A分散液,在该蛋白A分散液中添加实施例1的工序(2)中得到的多孔粒子分散液(以粒子干燥质量换算计相当于1g)。使该分散液在25℃下振荡搅拌5小时,将蛋白A固定于粒子。
(4)用0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.6)清洗生成的蛋白A固定粒子后,使其分散于1.0M硫酸水溶液(和光纯药工业公司制)40mL中,在40℃下振荡搅拌4小时,由此使未反应的环氧基开环。
然后,用0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.6)、0.1M氢氧化钠水溶液、0.1M 柠檬酸钠缓冲液(pH3.2)清洗,得到亲和色谱用填充剂1。
(实施例2)
实施例1的工序(1)中,使由甲基丙烯酸缩水甘油酯(三菱丽阳公司制)9.20g、1-乙基-4-乙烯基苯(ChemSampCo公司制)0.58g 和二乙烯基苯(新日铁化学公司制)1.73g构成的单体组合物溶解于二异丁基酮(三井化学公司制)19.59g和苯甲醚(和光纯药工业公司制) 6.05g的混合液中,制备单体溶液,除此以外,进行与实施例1的工序 (1)和(2)同样的操作,得到多孔粒子分散液。
然后,通过与实施例1的工序(3)同样的操作固定蛋白A,生成蛋白A固定粒子。
接着,使生成的蛋白A固定粒子分散于1.0M 2-巯基乙醇(和光纯药工业公司制)/0.1M硫酸钠(pH8.3)40mL中,在25℃下振荡搅拌 17小时,由此使未反应的环氧基开环。进而,将得到的未反应的环氧基开环的蛋白A固定粒子用0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.6)、0.1M氢氧化钠水溶液、0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3.2)进行清洗,得到亲和色谱用填充剂2。
(实施例3)
实施例1的工序(1)中,使由甲基丙烯酸缩水甘油酯(三菱丽阳公司制)8.18g、N-(2-羟基乙基)丙烯酰胺(东京化成工业公司制) 1.36g和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(SATOMER公司制)4.09g构成的单体组合物溶解于4-甲基-2-戊醇(和光纯药工业制)21.97g和碳酸二乙酯(和光纯药工业制)2.95g的混合液中,制备单体溶液,除此以外,进行与实施例1的工序(1)和(2)同样的操作,得到多孔粒子分散液。
然后,通过与实施例1的工序(3)同样的操作固定蛋白A,生成蛋白A固定粒子。
接着,使生成的蛋白A固定粒子(PA-1)分散于1.0M 1-硫代丙三醇(旭化学工业公司制)/0.1M硫酸钠(pH8.3)40mL中,在25℃下振荡搅拌17小时,使未反应的环氧基开环。进而,将得到的未反应的环氧基开环的蛋白A固定粒子(PA-2)用0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.6)、 0.1M氢氧化钠水溶液、0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3.2)进行清洗,得到亲和色谱用填充剂3。
(实施例4)
以粒子的浓度成为10质量%的方式使通过与实施例3同样的操作而得到的未反应的环氧基开环的蛋白A固定粒子(PA-2)分散于纯水中。在其中添加30%过氧化氢0.48g,在25℃下振荡搅拌24小时。进而,用0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.6)、0.1M氢氧化钠水溶液、0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3.2)进行清洗,得到亲和色谱用填充剂4。
(实施例5)
使通过与实施例3同样的操作而生成的蛋白A固定粒子(PA-1) 分散于1.0M 1-硫代丙三醇/0.1M硫酸钠(pH8.3)40mL中,在25℃下振荡搅拌40小时,使未反应的环氧基开环。进而,将得到的未反应的环氧基开环的蛋白A固定粒子用0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.6)、0.1M 氢氧化钠水溶液、0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3.2)进行清洗,得到亲和色谱用填充剂5。
(实施例6)
实施例1的工序(1)中,使由甲基丙烯酸缩水甘油酯(三菱丽阳公司制)5.26g、丙三醇单甲基丙烯酸酯(日油公司制)2.63g和二乙烯基苯(新日铁化学公司制)2.63g构成的单体组合物溶解于2-辛酮(东洋合成公司制)25.00g中,制备单体溶液,除此以外,进行与实施例1 的工序(1)和(2)同样的操作,得到多孔粒子分散液。
然后,通过与实施例1的工序(3)同样的操作固定蛋白A,生成蛋白A固定粒子。
接着,使生成的蛋白A固定粒子分散于1.0M 2-巯基丙磺酸钠(东京化成工业公司制)/0.1M硫酸钠(pH8.3)40mL中,在25℃下振荡搅拌17小时,使未反应的环氧基开环。进而,将得到的未反应的环氧基开环的蛋白A固定粒子用0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.6)、0.1M氢氧化钠水溶液、0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3.2)进行清洗,得到亲和色谱用填充剂6。
(实施例7)
实施例1的工序(1)中,使由丙烯酸4-羟基丁酯缩水甘油醚(日本化成公司制)4.77g和甘油二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制) 8.86g构成的单体组合物溶解于苯乙酮(井上香料制造所公司制)21.52g 和2-辛酮(东洋合成公司制)7.35g的混合液中,制备单体溶液,除此以外,进行与实施例1的工序(1)和(2)同样的操作,得到多孔粒子分散液。
然后,通过与实施例3同样的操作实施蛋白A的固定、未反应的环氧基的开环和清洗,得到亲和色谱用填充剂7。
(实施例8)
实施例1的工序(1)中,使由乙烯基苄基缩水甘油醚(东丽精密化学公司制)3.43g、丙三醇单甲基丙烯酸酯(日油公司制)4.11g和乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)6.17g构成的单体组合物溶解于苯乙酮(井上香料制造所公司制)21.52g和2-辛酮(东洋合成公司制)7.35g的混合液中,制备单体溶液,除此以外,进行与实施例1的工序(1)和(2)同样的操作,得到多孔粒子分散液。
然后,通过与实施例3同样的操作,实施蛋白A的固定、未反应的环氧基的开环和清洗,得到亲和色谱用填充剂8。
(比较例1)
实施例3中,在蛋白A固定后未进行未反应的环氧基的开环,除此以外,通过与实施例3同样的操作得到亲和色谱用填充剂9。
(比较例2)
实施例1的工序(1)中,使由甲基丙烯酸3,4-环氧环己基甲酯 (DAICEL公司制)1.41g、丙三醇单甲基丙烯酸酯(日油公司制)8.45g 和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(SATOMER公司制)4.23g构成的单体组合物溶解于苯乙酮(井上香料制造所公司制)21.50g和2-辛酮(东洋合成公司制)7.34g的混合液中,制备单体溶液,除此以外,进行与实施例1的工序(1)和(2)同样的操作,得到多孔粒子分散液。
然后,通过与实施例1的工序(3)同样的操作固定蛋白A,生成蛋白A固定粒子。
接着,使生成的蛋白A固定粒子分散于1.0M 1-硫代丙三醇(旭化学工业公司制)/0.1M硫酸钠(pH8.3)40mL中,在25℃下振荡搅拌4 小时,由此使未反应的环氧基开环。进而,用0.1M磷酸钠缓冲液 (pH6.6)、0.1M氢氧化钠水溶液、0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3.2)进行清洗,得到亲和色谱用填充剂10。
(比较例3)
比较例2中,将使蛋白A固定粒子分散于1.0M 1-硫代丙三醇(旭化学工业公司制)/0.1M硫酸钠(pH8.3)40mL之后的振荡搅拌时间由 4小时变更为17小时,除此以外,通过与比较例2同样的操作得到亲和色谱用填充剂11。
(比较例4)
实施例1的工序(1)中,使由甲基丙烯酸缩水甘油酯(三菱丽阳公司制)1.39g、丙三醇单甲基丙烯酸酯(日油公司制)2.79g和甘油二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)9.76g构成的单体组合物溶解于苯乙酮(井上香料制造所公司制)21.50g和2-辛酮(东洋合成公司制)7.34g的混合液中,制备单体溶液,除此以外,进行与实施例1的工序(1)和(2)同样的操作,得到多孔粒子分散液。
然后,通过与实施例3同样的操作实施蛋白A的固定、未反应的环氧基的开环和清洗,得到亲和色谱用填充剂12。
试验例1(环氧基含量的定量)
对实施例1~8和比较例1~4中得到的配体结合前的多孔粒子的环氧基含量进行定量。
即,在悬浮于氯化钙水溶液中的多孔粒子中过量地添加盐酸使盐酸进行加成反应,由此使环氧基开环,将剩余的盐酸用过量的氢氧化钠水溶液中和后,添加酚酞溶液,将剩余的氢氧化钠用盐酸进行反滴定,由此进行定量。应予说明,滴定的终点为酚酞的红色消失的蚀刻。将结果示于表1。
试验例2(剩余的环氧基量的评价(pH上升幅度的测定))
以填充高度约5cm将实施例1~8和比较例1~4中得到的亲和色谱用填充剂填充于GE Healthcare公司制的Tricorn 5/50柱中,将上述柱与GE Healthcare公司制的AKTAprime plus连接,一边监控pH一边以流速0.2mL/分钟通入含有2M的NaCl的pH7.5的20mM磷酸钠缓冲液,记录柱内的pH达到平衡时的pH值作为初期pH。进而,将置换为上述缓冲液的上述柱从AKTAprime plus取下,在40℃的恒温器内静置 7天。
然后,将上述柱再次与AKTAprime plus连接,一边监控pH一边以流速0.2mL/分钟通入上述缓冲液,记录柱内的pH变得最高时的pH 值作为负荷pH。求出初期pH与负荷pH之差作为pH上升幅度。应予说明,初期pH和负荷pH的测定在23±1℃的恒温室内实施。将结果示于表1。
试验例3(蛋白A结合量的定量)
使用二喹啉甲酸(BCA)试剂对结合于实施例1~8和比较例1~4 中得到的亲和色谱用填充剂的配体的蛋白A的结合量进行定量。具体而言,在试管中采取以固体成分换算计为1mg的填充剂,将其用 ThermoFisher Scientific公司的BCA蛋白质分析试剂盒进行定量。反应通过在37℃下颠倒混合30分钟来进行。标准曲线使用与结合于载体的蛋白A相同的蛋白A制作。将结果示于表1。
试验例4(DBC的测定和保存稳定性的评价)
使用GE Healthcare公司制的AKTAprime plus测定线流速300cm/hr下的各实施例和比较例的各填充剂对蛋白质(人类IgG抗体, Equitech Bio公司制的HGG-1000)的DBC。柱使用容量4mL (长)的柱,蛋白质分别使用利用20mM磷酸钠/150mM 氯化钠水溶液(pH7.5)将蛋白质溶解成5mg/mL的蛋白质,由洗脱前端10%穿过时的蛋白质捕捉量和柱填充体积求出DBC。将结果示于表 1。
进而,与试验例2同样地用含有2M的NaCl的pH7.5的20mM磷酸钠缓冲液对DBC测定后的柱进行置换,直接在40℃下静置7天。然后,再次在与上述同样的条件下实施DBC测定,求出负荷DBC。将负荷DBC/初期DBC×100作为DBC维持率,评价亲和色谱用填充剂的保存稳定性。应予说明,初期DBC和负荷DBC的测定在23±1℃的恒温室内实施。将结果示于表1。
试验例5(HCP的定量)
以填充高度约5cm将实施例和比较例的各填充剂填充于柱容器(GE Healthcare公司制的Tricorn 10/50柱)中,制作柱。将得到的柱分别与 GE Healthcare公司制的AKTAprime plus连接,以流速1mL/分钟通入 5柱容量(柱容积的5倍)的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.5),使其平衡。
接着,以约23mg抗体/mL载体的负荷量以流速1mL/分钟将含有单克隆抗体曲妥珠单抗(Trastuzumab)的CHO细胞培养上清液通入柱中。
接着,以流速1mL/分钟分别依次通入5柱容量的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)、20mM磷酸钠/1M氯化钠缓冲液(pH7.5)和20mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)。
然后,以流速1mL/分钟将50mM柠檬酸钠缓冲液(pH3.2)通入柱中,使柱内所捕捉的单克隆抗体洗脱,回收Abs.280>100mAu的洗脱级分。
接着,使用光谱光度计测定回收的级分中所含有的抗体浓度 (mg.mL)。另外,使用Cygnus Technologies公司制的CHO HCP ELISA 试剂盒,使用3G,测定回收的级分中所含的宿主细胞蛋白质(HCP) 的浓度(ng/mL)。进而,将HCP的浓度除以抗体浓度,由此算出每单位抗体量的HCP量。将结果示于表1。
[表1]
表1中的各符号如下所述。
(M-1)GMA:甲基丙烯酸缩水甘油酯,HBAGE:甲基丙烯酸4 -羟基丁酯缩水甘油醚,VBGE:(4-乙烯基苄基)缩水甘油醚, METHB:甲基丙烯酸3,4-环氧环己基甲酯
(M-2)DVB:二乙烯基苯,TMP:三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯,GLDM:甘油二甲基丙烯酸酯,EDMA:乙二醇二甲基丙烯酸酯
(M-3)EVB:1-乙基-4-乙烯基苯,HEAA:N-(2-羟基乙基)甲基丙烯酰胺,GLM:丙三醇单甲基丙烯酸酯
(开环中使用的化合物)ME:2-巯基乙醇、TG:1-硫代丙三醇, MPSA:2-巯基丙磺酸钠。
Claims (24)
1.一种亲和色谱用载体,其特征在于,包含固相载体、使环氧基开环而得到的开环环氧基和结合于所述固相载体的配体,所述固相载体含有包含(M-1)结构单元和(M-2)结构单元的共聚物,
(M-1)结构单元是来自含环氧基的单乙烯基单体的结构单元,相对于全部结构单元100质量份为50质量份以上且99.5质量份以下,
(M-2)结构单元是来自聚乙烯基单体的结构单元,相对于全部结构单元100质量份为0.5~80质量份,其中,
将所述亲和色谱用载体填充于任意的柱容器,用含有2M的NaCl的pH7.5的20mM磷酸钠缓冲液对柱进行置换,在40℃下静置7天时的柱内的pH上升幅度为2以下,
所述开环环氧基为下述式(1)所示的基团,
式(1)中,
R1表示碳原子数1~6的2价的有机基团,
R2表示碳原子数1~10的1价的有机基团,
X表示硫基(>S)、亚硫酰基(>S=O)或磺酰基(>S(=O)2),
*表示键合位置。
2.根据权利要求1所述的亲和色谱用载体,其中,所述共聚物进一步含有(M-3)结构单元,(M-3)结构单元是来自不含环氧基的单乙烯基单体的结构单元,相对于全部结构单元100质量份为40质量份以下。
3.根据权利要求1或2所述的亲和色谱用载体,其中,R2为下述式(2)所示的基团,
式(2)中,
R3表示碳原子数1~10的2价或3价的有机基团,
n表示1或2,
**表示与式(1)中的X的键合位置。
4.根据权利要求1或2所述的亲和色谱用载体,其中,X为硫基(>S)或亚硫酰基(>S=O)。
5.根据权利要求3所述的亲和色谱用载体,其中,X为硫基(>S)或亚硫酰基(>S=O)。
6.根据权利要求1或2所述的亲和色谱用载体,其中,所述配体为免疫球蛋白结合性蛋白质。
7.根据权利要求3所述的亲和色谱用载体,其中,所述配体为免疫球蛋白结合性蛋白质。
8.根据权利要求4所述的亲和色谱用载体,其中,所述配体为免疫球蛋白结合性蛋白质。
9.根据权利要求5所述的亲和色谱用载体,其中,所述配体为免疫球蛋白结合性蛋白质。
10.根据权利要求6所述的亲和色谱用载体,其中,所述免疫球蛋白结合性蛋白质为选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、Fc结合蛋白和它们的功能性变异体中的至少1种以上。
11.根据权利要求1或2所述的亲和色谱用载体,其中,所述固相载体为多孔粒子。
12.根据权利要求3所述的亲和色谱用载体,其中,所述固相载体为多孔粒子。
13.根据权利要求4所述的亲和色谱用载体,其中,所述固相载体为多孔粒子。
14.根据权利要求5所述的亲和色谱用载体,其中,所述固相载体为多孔粒子。
15.根据权利要求6所述的亲和色谱用载体,其中,所述固相载体为多孔粒子。
16.根据权利要求7~9中任一项所述的亲和色谱用载体,其中,所述固相载体为多孔粒子。
17.根据权利要求10所述的亲和色谱用载体,其中,所述固相载体为多孔粒子。
18.根据权利要求11所述的亲和色谱用载体,其中,所述多孔粒子的粒径为35~100μm。
19.根据权利要求12~15中任一项所述的亲和色谱用载体,其中,所述多孔粒子的粒径为35~100μm。
20.根据权利要求16所述的亲和色谱用载体,其中,所述多孔粒子的粒径为35~100μm。
21.根据权利要求17所述的亲和色谱用载体,其中,所述多孔粒子的粒径为35~100μm。
22.一种亲和色谱柱,是将权利要求1~21中任一项所述的亲和色谱用载体填充于柱容器而成的。
23.一种靶物质的纯化方法,其特征在于,使用权利要求1~21中任一项所述的亲和色谱用载体。
24.根据权利要求23所述的纯化方法,其中,所述靶物质为靶蛋白质。
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