CN113351190B

CN113351190B - 一种固定化金属离子亲和色谱微球材料及其制备与应用

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Publication number: CN113351190B
Application number: CN202010105968.6A
Authority: CN
Inventors: 马淑娟; 唐睿智; 欧俊杰; 叶明亮
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2020-02-20
Filing date: 2020-02-20
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2040-02-20
Also published as: CN113351190A

Abstract

本发明涉及一种以环氧聚合物微球为基质的固定化金属离子亲和色谱材料及其在磷酸化肽富集中的应用。具体是，首先以烯丙基缩水甘油醚和季戊四醇四丙烯酸酯为原料，采用悬浮聚合法方法制备了带有环氧基团的多孔聚合物微球，然后以该聚合物微球为基质，以带有磷酸根官能团的O‑磷酸‑L‑丝氨酸为修饰剂，在碱性条件下通过环氧‑氨开环反应，在材料表面引入磷酸官能团，最后通过螯合钛离子得到了可用于富集磷酸肽的Ti⁴⁺‑IMAC材料。所得到的Ti⁴⁺‑IMAC材料对磷酸肽有很高的选择性，可用于生物样品β‑酪蛋白酶解液和人血清中的内源化磷酸化肽的高灵敏度和高选择性富集。

Description

一种固定化金属离子亲和色谱微球材料及其制备与应用

技术领域

本发明涉及一种以环氧聚合物微球为基质制备具有高比表面积的固定化金属离子亲和色谱(Ti⁴⁺-IMAC)材料及其在蛋白质组学中的应用。具体制备过程是：

首先采用悬浮聚合法制备多孔环氧微球，，随后利用环氧-胺开环反应将O-磷酸-L-丝氨酸单体一步引入微球表面，再与Ti⁴⁺进行螯合，最终得到Ti⁴+-IMAC微球材料。

背景技术

磷酸化修饰是蛋白组学中极为重要的一类转录后修饰，在多种细胞生理活动和过程起到极为重要的作用(文献1,Ptacek,J.et.al“Global analysis of proteinphosphorylation in yeast”,Nature,2005,438,679-684.)。基于质谱分析的蛋白质组学方法是研究磷酸化肽最常用、最有效的工具之一。在“bottom up”分析策略中，先将目标蛋白酶解，对得到的所有肽段进行特异性富集，最后对富集到的磷酸化肽段进行cLC-MS/MS分析鉴定，这种从多肽层面进行组学分析而的方法也被形象地称为“鸟枪法”(文献2,Zhang,Y.et.al“Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics”,Chemical Reviews,2013,113(4),2343-2394.)。由于蛋白酶解产物中非磷酸化肽段含量高，而磷酸化肽段丰度极低，要达到理想的分析灵敏度和精确度，磷酸化肽的富集过程就变得尤为重要。

金属离子亲和色谱(IMAC)是常用的磷酸肽富集方法，广泛应用于磷酸化蛋白组学研究中(文献3，翟贵金等，“血清磷酸化肽的分离富集和质谱定量及其作为潜在肿瘤标志物的评价”，色谱，2016，34(12)，1192-1198)。这种材料由色谱基质，螯合剂和金属离子三部分组成。利用螯合在基质上的金属离子如Fe(III)、Ti(IV)、Zr(IV)等的静电作用和螯合作用，在强酸性或强磷酸盐条件下可以高效、高特异性地与磷酸化肽段中的磷酸基团结合，从而将其从大量非磷酸肽中特异性地富集出来。典型的色谱基质材料有纳米材料、微球色谱基质、棉纤维、分子印迹材料、整体材料、共价有机骨架材料等(文献4，相小超等，“功能材料在蛋白质组研究中的应用进展”，色谱，2019，37(11)，1135-1141)。

以聚合物微球为基质的IMAC材料具有制备简单、分散性好、pH耐受范围宽、材料化学性能稳定等优点。但是由于与某些酸性肽段发生静电或螯合作用，IMAC材料中会有大量的非特异性吸附产生。Zou等发现了膦酸酯钛(锆)与与磷酸化肽之间的高特异性相互作用，并以此建立了新一代Ti⁴⁺-IMAC材料(文献5,Zou H.et.al“Robust phosphoproteomeenrichment using monodisperse microsphere–based immobilized titanium(IV)ionaffinity chromatography”,Nature Protocols,2013,8,461-480.)，很大程度提高了富集的特异性和选择性。但其制备流程复杂，反应条件苛刻，不利于规模化生产和实际应用。因此，发展一种制备方法简单、条件温和、特异性高的IMAC材料仍然具有很大的积极意义。

发明内容

本发明的主要内容包括一种聚合物微球亲和金属离子固定化材料的制备及其在磷酸化肽富集中的应用，首先制备了一种具有环氧基团的聚合物微球，然后在弱碱性环境中磷酸氨基酸通过环氧-胺开环反应修饰到微球表面，最后与钛离子螯合，得到了一种新型的带有磷酸基团的离子亲和色谱(IMAC)微球材料。

将含有磷酸根的O-磷酸-L-丝氨酸单体一步接枝到多孔聚合物微球表面，再与钛离子通过螯合作用制备出可用于磷酸肽富集的固定化金属离子亲和色谱Ti⁴⁺-IMAC材料。

具体包括如下步骤：

(1)多孔环氧微球的制备：将60～80mg聚乙烯醇加入40～80mL水和甲苯的混合液中作为分散剂，甲苯/水的体积比为0.1～0.5，加热至50～70℃使聚乙烯醇完全溶解后冷却至室温。逐滴加入3.0～8.0mL烯丙基缩水甘油醚和2.0～5.0mL季戊四醇四丙烯酸酯，最后加入50～100mg偶氮二异丁腈作为引发剂。在50～70℃油浴中以450rpm的速率机械搅拌1～3h再升至80～95℃反应0.5～1h，得到成型的聚合物微球。产物用乙醇和水分别洗涤2～4次，抽滤除去残余溶剂，50～70℃真空干燥4～10h，得到环氧聚合物微球；

(2)微球表面修饰磷酸功能基团：首先在离心管中将0.5～1.0g O-磷酸-L-丝氨酸溶于15～20mL水，用氢氧化钠调节溶液pH值到6～7之间，再加入0.1～0.3g碳酸钠，调整pH值到8～9之间，最后将1.0～2.0g步骤(1)制备的环氧聚合物微球与上述溶液一同加入到圆底烧瓶内，在油浴中加热，反应温度为60～100℃，并用机械搅拌以100～150rpm反应4～12h。反应结束后，用水将材料洗至中性，得到多孔的磷酸功能化的IMAC微球；

(3)Ti⁴⁺-IMAC材料的制备：将步骤(2)得到的磷酸功能化IMAC微球加入到15～30mL浓度为10～100mg/mL的硫酸钛溶液中，微球与硫酸钛的质量比为1：10～1：100；在室温下振荡反应4～16h，依次用体积浓度0.1％～1％TFA、100～200mM NaCl水溶液和去离子水洗涤后，50～80℃真空干燥5～12h，最终得到Ti⁴⁺-IMAC磷酸功能化微球材料。

所述Ti⁴⁺-IMAC磷酸功能化微球材料的制备方法的优点在于：

(1)原料价格低廉，易于获得；

(2)过程温和，无需严苛的反应环境，适用于大尺度制备；

(3)磷酸化修饰简单，仅需一步即可将磷酸官能团引入聚合物微球基质表面。。

所述Ti⁴⁺-IMAC微球材料优点在于：

(1)粒径均匀，耐酸碱能力强；

(2)对磷酸化肽段具有良好的富集特异性。

本发明首先以烯丙基缩水甘油醚(Allyl glycidyl ether，AGE)和季戊四醇四丙烯酸酯(Pentaerythritol tetraacrylate)为原料，采用悬浮聚合法方法制备了带有环氧基团的多孔聚合物微球，然后以该聚合物微球为基质，以带有磷酸根官能团的O-磷酸-L-丝氨酸为修饰剂，在碱性条件下通过环氧-氨开环反应，在材料表面引入磷酸官能团，最后通过螯合钛离子得到了可用于富集磷酸肽的Ti⁴⁺-IMAC材料。该方法以环氧功能化的聚合物微球为基质，可在强酸碱性条件下使用而不破坏基质结构，以O-磷酸-L-丝氨酸为修饰剂可将磷酸官能团一步引入基质表面，避免了传统修饰方法步骤繁多的不足，所得到的Ti⁴⁺-IMAC材料对磷酸肽有很高的选择性，可用于生物样品β-酪蛋白酶解液和人血清中的内源化磷酸化肽的高灵敏度和高选择性富集。

附图说明

图1材料的制备流程示意图。

图2聚合物微球材料及其基质和单体的红外(IR)谱图。

图3聚合物微球材料的热失重(TG)曲线和失重速率(DTG)曲线。

图4聚合物微球的氮气吸附/脱附实验结果，(a)吸附/脱附曲线；(b)孔径分布曲线。

图5以多孔聚合物微球为基质的Ti⁴⁺-IMAC微球β-酪蛋白酶解液富集前后的。

MALDI-TOF-MS对比谱图，(a)直接检测；(b)实施例1所述Ti⁴⁺-IMAC材料富集β(c)；实施例2所述商业化IMAC材料富集。

图6对人血清中内源性磷酸化肽段进行富集的MALDI-TOF-MS对比谱图，(a)人血清直接检测；(b)实施例1所述Ti⁴⁺-IMAC材料富集后；(c)实施例2所述商业化IMAC材料富集后。

具体实施方式

实施例1 以多孔聚合物微球为基质的Ti⁴⁺-IMAC材料用于生物样品中磷酸化肽的分离富集

以多孔聚合物微球为基质的Ti⁴⁺-IMAC微球材料的制备：

将60mg PVA加入50mL水和10mL甲苯的混合液中，加热至60℃使其完全溶解，溶液冷却至室温，再逐滴加入4.7mL烯丙基缩水甘油醚和2.9mL季戊四醇四丙烯酸酯，最后加入80mg AIBN作为引发剂。在70℃油浴中以450rpm的速率机械搅拌2h再升至90℃反应30min，得到成型的聚合物微球。反应结束后，产物用乙醇和水分别洗涤3次，抽滤除去残余溶剂，50℃真空干燥6h，得到环氧聚合物微球。

在离心管中称取0.5g O-磷酸-L-丝氨酸，加入18mL水，超声溶解后，加入300μL1mol/L氢氧化钠调节溶液至中性，再加入0.16g碳酸钠，超声使其完全溶解，用氢氧化钠溶液调整pH值为8～9之间，与2.0g制备好的多孔环氧微球一同加入到两口圆底烧瓶内，在60℃油浴中加热反应4h，并辅以130rpm机械搅拌，反应结束后用15mL水洗三次；

最后将材料加入到80mL浓度为100mg/mL的硫酸钛溶液中，与Ti⁴⁺进行螯合，微球与硫酸钛的质量比为1：100；在室温下振荡16h，使材料表面的磷酸根与钛离子充分反应并螯合到材料上。随后依次用10mL体积浓度0.1％TFA、200mM NaCl水溶液和去离子水各洗涤三次后，在60℃真空干燥箱内干燥8h，最终得到Ti⁴⁺-IMAC磷酸功能化微球材料，所得微球的粒径范围为90～110μm，平均粒径为104μm。

β-酪蛋白酶解样品的制备：

将2mgβ-酪蛋白溶解在含8M尿素的0.1M的碳酸氢铵溶液中(pH＝8.2)，加入80μmolDL-1,4-二硫苏糖醇，在37℃中恒温2h，再加入40μmol 2-碘乙酰胺，避光反应40min，用0.1M碳酸氢铵溶液将尿素浓度稀释到1M，按照蛋白与胰蛋白酶1:25的质量比加入80μg胰蛋白酶，在37℃恒温反应时间16h，得蛋白酶解液，保存在-20℃的冰箱中备用。

磷酸肽的富集：

称取5mg Ti⁴⁺-IMAC微球材料于离心管中，用200μL上样溶液(体积浓度80％ACN(乙腈)，体积浓度6％TFA(三氟乙酸)，其余为水)的酸化平衡Ti⁴⁺-IMAC微球材料。然后加入200μL蛋白酶解液，在室温下振荡30min。随后离心15min(14,000rpm)，除去上清溶液后，用洗涤溶液A(200mM NaCl，体积浓度50％ACN，体积浓度6％TFA，其余为水)洗涤三次以除去非特异性吸附肽段(每次洗涤后均分离除去洗涤后溶液)，再用洗涤溶液B(体积浓度30％ACN，体积浓度0.1％TFA，其余为水)洗涤三次除去材料中的盐，每次各15min(每次洗涤后均分离除去洗涤后溶液)。接着用100μL 10％(wt％)的氨水将Ti⁴⁺-IMAC微球材料上的吸附的磷酸化肽段进行洗脱(室温，振荡30min)。洗脱后，离心15min(14,000rpm)，分离洗脱液与材料，所得洗脱液用MALDI-TOF MS分析。

MALDI-TOF-MS质谱分析

将0.5μL样品液滴加在MALDI靶上，待自然晾干后，再将0.5μL 2,5-二羟基苯甲酸溶液(DHB，25mg/mL)覆盖到样品点上作为基质，待完全自然晾干后，送入MALDI-TOF质谱仪进行分析。

产物表征：

以傅里叶变换衰减全反射红外光谱法(ATR-FTIR)对多孔环氧微球、O-磷酸-L-丝氨酸和磷酸功能化的IMAC微球进行红外表征。结果如图2所示，环氧微球的红外谱图中出现了910cm^-1和1255cm^-1两处环氧基团的C-O特征峰，而在磷酸功能化的IMAC微球中910cm^-1的谱峰消失了，表明微球表面的环氧基团与与单体中的氨基发生了反应而在被消耗了；在O-磷酸-L-丝氨酸的谱图中可以发现位于3175cm^-1和3101cm^-1的两条-NH₂中的N-H伸缩振动峰，以及1560cm^-1处N-H弯曲振动峰，在IMAC微球中没有这几条伯胺或仲胺的特征峰，表明氨基中的N在反应后以C-N-C键的形式存在，确认了环氧-胺开环反应的发生。O-磷酸-L-丝氨酸和反应后的IMAC微球中都有位于1257cm^-1的磷酸根中P＝O双键的伸缩振动特征峰存在，根据环氧特征峰910cm^-1的消失可以排除环氧基团的干扰，从而可以确定磷酸根被成功地键合到IMAC微球当中了。

对磷酸功能化的IMAC材料进行热失重分析(TG)和微商热重分析(DTG)。检测条件为：初温40℃，终温800℃，程序升温10℃/min，气氛为空气气氛。结果如图3所示，材料失重起始点为275.3℃，在302.4℃失重速率达到峰值，到550℃后恒定，表明材料具有一定的热稳定性。

如图4，氮气物理吸附/脱附实验结果显示，环氧微球材料BET比表面积为120.6m²/g，孔体积0.037cm³/g，材料孔径分布较宽，最可几孔径为96.8nm(图4b)，孔结构主要以介孔和大孔为主。

实施例2 商业化IMAC微球用于磷酸化肽的分离富集

商业化IMAC微球材料螯合钛：

取0.5g商业化IMAC微球(购自Sigma-Aldrich)，按1：10的比例与5g硫酸钛在水溶液中进行螯合16h，依次用10mL体积浓度0.1％TFA、200mM NaCl水溶液和去离子水洗净残余的钛离子，50℃真空干燥6h，得到商业化Ti-IMAC材料。

商业化Ti-IMAC材料富集磷酸化肽：

以商业化Ti-IMAC进行磷酸化肽富集，实验具体操作和条件同“实施例1”。

如图5所示，将两种材料同时用于β-casein酶解液中磷酸肽的富集。富集前，如图5a，谱图中出现了大量的非磷酸肽信号峰，磷酸肽的信号受到强烈抑制；采用实施例1所制备的Ti⁴⁺-IMAC微球和实施例2得到的商业化IMAC微球材料富集后，如图5b和5c，富集的非磷酸肽信号明显降低，可以完整地富集到三条磷酸化肽段，但是与商品化的材料相比，本发明所制备的Ti⁴⁺-IMAC微球材料各磷酸肽峰具有更高的丰度，说明其对磷酸肽具有更高的富集能力。

如图6所示，将两种材料同时用于人血清中内源性磷酸肽的富集。图6a中，人血清在MALDI-TOF-MS中直接检测，仅能检测到2条内源性磷酸化肽段，且出现大量非磷酸肽的信号峰；采用实施例1所制备的Ti⁴⁺-IMAC微球和实施例2得到的商业化IMAC微球材料富集后，如图6b和6c，可以发现图6b中非磷酸肽的谱峰基本消失，检测到全部4条内源性磷酸化肽段，而图6c中仅有两条内源性磷酸化肽，并且有数条非磷酸化肽段干扰峰的存在，这表明与商业化IMAC材料相比，Ti⁴⁺-IMAC磷酸功能化微球可以从复杂的生物样品中较理想地富集到磷酸肽，且比商业化IMAC材料具有更好的特异性富集能力。

Claims

1.一种固定化金属离子亲和色谱微球材料的制备方法，其特征在于：将含有磷酸根的O-磷酸-L-丝氨酸单体接枝到多孔聚合物微球表面，再与钛离子通过螯合作用制备出可用于磷酸肽富集的固定化金属离子亲和色谱Ti⁴⁺-IMAC材料；

首先以烯丙基缩水甘油醚和季戊四醇四丙烯酸酯为原料，采用悬浮聚合法制备了带有环氧基团的多孔聚合物微球，然后以该聚合物微球为基质，以带有磷酸根官能团的O-磷酸-L-丝氨酸为修饰剂，在碱性条件下通过环氧-氨开环反应，在材料表面引入磷酸官能团，最后通过螯合钛离子得到了可用于富集磷酸肽的Ti⁴⁺-IMAC材料；

可按如下步骤操作，

（1）多孔环氧微球的制备：将60~80 mg聚乙烯醇加入40~80 mL水和甲苯的混合液中作为分散剂，甲苯/水的体积比为0.1~0.5，加热至50~70^oC使聚乙烯醇完全溶解后冷却至室温；逐滴加入3.0~8.0 mL烯丙基缩水甘油醚和2.0~5.0 mL季戊四醇四丙烯酸酯，最后加入50~100 mg偶氮二异丁腈作为引发剂；在50~70^oC以450 rpm的速率机械搅拌1~3 h再升至80~95^oC反应0.5~1 h，得到成型的聚合物微球；产物用乙醇和水分别洗涤2~4次，抽滤除去残余溶剂，干燥，得到环氧聚合物微球；

（2）微球表面修饰磷酸功能基团：首先在离心管中将0.5~1.0 g O-磷酸-L-丝氨酸溶于15~20 mL水，用氢氧化钠调节溶液pH值到6~7之间，再加入0.1~0.3 g碳酸钠调节pH值到8~9之间，最后将1.0~2.0 g步骤（1）制备的环氧聚合物微球与上述溶液一同加入到圆底烧瓶内，在油浴中加热，反应温度为60~100^oC，并用机械搅拌以100~150 rpm反应4~12 h；反应结束后，用水将材料洗至中性，得到多孔的磷酸功能化的IMAC微球；

（3）Ti⁴⁺-IMAC材料的制备：将步骤（2）得到的磷酸功能化IMAC微球加入到15~30 mL浓度为10~100 mg/mL的硫酸钛溶液中，微球与硫酸钛的质量比为1：10~1：100；在室温下振荡反应4~16 h，依次用体积浓度0.1%~1%TFA、100~200mM NaCl水溶液和去离子水洗涤后，干燥，最终得到Ti⁴⁺-IMAC磷酸功能化微球材料。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中的干燥过程是50~70^oC真空干燥4~10 h；

步骤（3）中的干燥过程是在50~80^oC真空干燥5~12 h。

3.一种权利要求1或2任一所述的制备方法制备获得的固定化金属离子亲和色谱微球材料，其为Ti⁴⁺-IMAC微球材料。

4.根据权利要求3所述固定化金属离子亲和色谱微球材料，其特征在于：

微球的粒径范围为90~110 μm。

5.一种权利要求3或4所述固定化金属离子亲和色谱微球材料的应用，其特征在于：

所述Ti⁴⁺-IMAC微球材料应用于分离富集生物样品中的磷酸化肽段。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述生物样品为β-酪蛋白和人血清中的一种或二种以上。