WO2019004440A1 - 液体クロマトグラフィー用充填剤及び液体クロマトグラフィー用カラム - Google Patents

液体クロマトグラフィー用充填剤及び液体クロマトグラフィー用カラム Download PDF

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filler
meth
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column
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修弥 中島
奈津姫 小田
順也 加藤
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昭和電工株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a packing for liquid chromatography having a sulfo group and a column for liquid chromatography packed with the packing.
  • Liquid chromatography (hereinafter also referred to as "HPLC") is used in various fields as a wide range of sample analysis methods. Among them, cation exchange chromatography using a filler having a sulfo group is used for analysis of proteins, amino acids and the like.
  • nonspecific adsorption of the proteins to the packing may occur. If nonspecific adsorption of protein occurs, not only accurate analysis results can not be obtained, but also a problem of accelerating deterioration of the column arises, so it is necessary to use a packing material which does not cause this nonspecific adsorption.
  • Nonspecific adsorption of proteins is mainly due to the hydrophobic interaction between the packing agent and the protein. For this reason, as a means to control this, particles with high hydrophilicity are used for the filler.
  • particles using a (meth) acrylate polymer as a filler are widely known.
  • Patent Document 1 discloses a method of analyzing glucohemoglobin using an ion exchanger in which a sulfo group is introduced to particles made of a methacrylic acid ester-based polymer.
  • Patent Document 2 discloses a filler obtained by forming a hydrophilic polymer layer such as methacrylic acid on the surface of a divinylbenzene hydrophobic particle.
  • a layer of methacrylic acid ester is formed on the surface of the core of a polymer of divinylbenzene generated by a polymerization reaction in acetonitrile, particles are obtained, and epichlorohydrin is reacted with the particles.
  • an example of analysis of protein using a filler having a sulfo group introduced therein is disclosed.
  • an object of the present invention is to provide a packing material for liquid chromatography and a column for liquid chromatography that can be suitably used for analysis of proteins, amino acids and the like and can be efficiently produced.
  • a filler for liquid chromatography comprising particles of a copolymer having a monomer unit derived from (meth) acrylic acid ester and a monomer unit derived from divinylbenzene, wherein the monomer unit derived from (meth) acrylic acid ester 70 to 90% by mass: 30 to 10% by mass of the monomer unit derived from the divinylbenzene, a structure in which a sulfo group is bonded to the particle surface, and a sulfo group is bonded, the formula (1) (Wherein, R represents a partial structure derived from the surface of the copolymer particle, X represents an oxygen atom or a sulfur atom, and n represents an integer of 2 to 4).
  • a filler for liquid chromatography which comprises 40 ⁇ mol / g to 300 ⁇ mol / g of sulfo groups in particles.
  • a method for producing the filler as described in 1 or 2 above which comprises copolymerizing a monomer mixture containing (meth) acrylate and divinylbenzene by suspension polymerization to obtain copolymer particles, And a step of reacting with a sulfonating agent in a solvent containing a secondary alcohol in the presence of a base and a method for producing a filler.
  • the packing agent for liquid chromatography and the column for liquid chromatography in one embodiment of the present invention can be suitably used for analysis of proteins, amino acids and the like.
  • the filler is based on an acrylic polymer
  • the strength can be increased while the hydrophilicity is kept high, so that the particle size can be reduced, whereby the analysis ability is improved.
  • the packing and the column can be produced efficiently.
  • FIG. 7 is a chromatogram obtained by Analysis Example 1.
  • 7 is a chromatogram obtained by Analysis Example 2.
  • 7 is a chromatogram obtained by Analysis Example 3.
  • 7 is a chromatogram obtained by Analysis Example 4.
  • FIG. 6 is a SEM photograph (20,000 ⁇ magnification) of the filler particles obtained in Example 1.
  • the filler for liquid chromatography in one embodiment of the present invention uses, as a base material, particles of a copolymer including a monomer unit derived from (meth) acrylic acid ester and a monomer unit derived from divinylbenzene.
  • (meth) acrylic acid ester means acrylic acid ester or methacrylic acid ester.
  • the copolymer in one embodiment of the present invention uses divinylbenzene as a crosslinkable monomer.
  • divinylbenzene as the crosslinkable monomer
  • the resulting copolymer has high mechanical strength. Therefore, even if the particle size of this copolymer is reduced, the strength is high, and even when this particle is used as a filler for a column, it withstands an increase in pressure during analysis associated with the reduction of the particle size. It is possible. This can enhance the separation performance of the column.
  • Divinylbenzene as a monomer may be a mixture of meta and para isomers.
  • (meth) acrylic acid ester which is a monomer of a copolymer
  • methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, 4-hydroxybutyl (meth) acrylate, Glycerin di (meth) acrylate, glycidyl (meth) acrylate, etc. are mentioned, These can be used individually or in combination of 2 or more types.
  • the (meth) acrylic acid ester has a hydroxyl group or a glycidyl group at least a certain amount. Although the amount can not be generally said, 70 mass% or more of the (meth) acrylic acid ester whole is preferable, for example.
  • the (meth) acrylic acid ester having a hydroxyl group or glycidyl group include 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, glycerin di (meth) acrylate, 4-hydroxybutyl (meth) acrylate, glycidyl (meth) acrylate and the like.
  • glycidyl (meth) acrylate is more preferable because it can be suitably used for introducing a sulfo group structure and can be converted to a structure having a hydroxyl group by a ring opening reaction.
  • Glycidyl methacrylate is most preferred because of easy availability.
  • the (meth) acrylic acid ester highly hydrophobic ethylene glycol di (meth) acrylate, butyl (meth) acrylate and hexyl (meth) acrylate can be used in combination.
  • the amount thereof used may be in a range that does not significantly affect the hydrophilicity of the copolymer, and specifically, it is 10% by mass or less with respect to the total amount of (meth) acrylic acid ester.
  • the ratio of the (meth) acrylic acid ester-derived monomer unit to the divinylbenzene-derived monomer unit is (meth) acrylic acid ester-derived monomer units (when plural types are used) (Total amount of them): 70 to 90% by mass: 30 to 10% by mass of the monomer unit derived from the divinylbenzene, and more preferably 75 to 85% by mass: 25 to 15% by mass.
  • the monomer unit derived from (meth) acrylic acid ester is less than 70% by mass, the hydrophobicity of the copolymer becomes high, and nonspecific adsorption of proteins is likely to occur. Moreover, when introduce
  • the monomer unit derived from (meth) acrylate exceeds 90% by mass, the strength of the copolymer particles decreases, and when it is used as a column filler, the particles are deformed and the column is deteriorated. It is easy to invite.
  • the polymer may contain other monomer units in addition to the monomer unit derived from (meth) acrylic acid ester and the monomer unit derived from divinylbenzene.
  • the amount of other monomer units may be in a range that does not significantly affect the hydrophilicity of the copolymer, and is, for example, an amount of 10% by mass or less of the copolymer. The amount is preferably 5% by mass or less, more preferably 3% by mass or less.
  • monomers of other monomer units include styrene, ethylstyrene, methylstyrene, propylstyrene, methoxystyrene, ⁇ -methylstyrene, butadiene, vinyl acetate and the like.
  • the particle size of the copolymer is not particularly limited as long as it can be used as a column packing agent for liquid chromatography, but considering the packing and separation performance into the column, the average particle diameter is 1 ⁇ m to 10 ⁇ m. Is preferred. When the average particle size is 10 ⁇ m or less, the separation ability of the compound is high, and good analysis results can be obtained. On the other hand, if it is less than 1 ⁇ m, the pressure of the column becomes high, and the packing tends to be difficult.
  • the average particle diameter of the particles is more preferably 2 ⁇ m to 7 ⁇ m, and most preferably 2 ⁇ m to 3 ⁇ m, in order to obtain a column with high separation capacity.
  • the average particle size in the present specification is a volume average particle size and can be measured as follows. First, the particles are imaged so as to be 2000 or more by the particle size distribution measuring apparatus, and from the obtained two-dimensional particle image (still image is preferable), the equivalent circle diameter of each particle (the same area as the projected area of the particle image) Get the diameter of the circle with. It is a particle diameter obtained by calculating the volume of each particle from the equivalent circle diameter and averaging based on the calculated volume. At this time, each particle is regarded as a sphere having the same diameter as the equivalent circle diameter described above. As a particle size distribution measuring apparatus, FPIA-3000 (made by Sysmex Corporation) etc. can be used.
  • the particles of the copolymer have few fine pores on the surface.
  • the total pore volume is 0.05 cm 3 / g or less with respect to the mass of the particles measured by a gas adsorption method, and more preferably less 0.02 cm 3 / g. Particles with few fine pores have improved strength.
  • HPLC analysis is performed using a filler based on the particles, compounds such as proteins contained in the sample do not diffuse in the pores, which enables rapid analysis.
  • the total pore volume can be measured using Cantachrome Autosorb® iQ as an apparatus.
  • the filler for liquid chromatography in one embodiment of the present invention is obtained by obtaining particles of a copolymer having a monomer unit derived from (meth) acrylic acid ester and a monomer unit derived from divinylbenzene, and then forming a sulfo group on the particle surface. It can be manufactured by introducing it.
  • a well-known oil-soluble radical polymerization initiator can be used for the said copolymerization.
  • the polymerization initiator include 2,2′-azobisisobutyronitrile (hereinafter also referred to as AIBN), 2,2′-azobis (2,4-dimethylvaleronitrile) (hereinafter also referred to as V-65), 2 And 2,2'-azobisisobutyrate dimethyl, 2,2'-azobis (2-methylbutyronitrile), benzoyl peroxide, lauroyl peroxide and the like.
  • the use amount of the polymerization initiator may be appropriately determined depending on the kind and amount of the monomer, but is usually 0.1 to 5 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the total amount of the monomers.
  • a suspension polymerization method for example, a suspension polymerization method, an emulsion polymerization method, a precipitation polymerization method and the like can be used.
  • a suitable organic solvent in which the monomer is soluble but not the polymer particles of uniform particle size can be obtained.
  • aggregation of particles may occur during polymerization, and it may be difficult to synthesize monodisperse particles with high yield.
  • the suspension polymerization method or the emulsion polymerization method is preferable, and the suspension polymerization method is more preferable in that aggregation of particles is less likely to occur.
  • SPG membrane suspension polymerization method using a Shirasu porous glass (SPG) membrane with controlled pore size and an internal pressure micro kit MN-20 manufactured by SGP Techno Co., Ltd.
  • microchannel suspension A microchannel suspension polymerization method using an apparatus manufactured by EPTEC Co., Ltd. is more preferable because particles having uniform particle diameter can be obtained.
  • the polymerization reaction can be carried out, for example, by heating at 60 to 80 ° C. for 6 to 20 hours.
  • classification is carried out using a sieve or classifier (for example, a semi-free-vortex classifier, Aerofine Classifier AC, manufactured by Nisshin Engineering Co., Ltd.) to obtain an average particle size, uniformity, and fine particle content.
  • a sieve or classifier for example, a semi-free-vortex classifier, Aerofine Classifier AC, manufactured by Nisshin Engineering Co., Ltd.
  • the amount etc can be adjusted.
  • a sulfonating agent can be used.
  • a sulfonating agent sodium 2-hydroxyethane sulfonate, sodium 3-hydroxypropane sulfonate, sodium 2-mercaptoethane sulfonate, sodium 3-mercaptopropane sulfonate, sodium 2-bromopropane sulfonate, 3-bromopropane Sulfonates such as sodium sulfonate, 1,3-propane sultone, sultone compounds such as 1,3-butane sultone, 1,4-butane sultone, 2,4-butane sultone and the like can be mentioned.
  • sodium 3-mercaptopropanone sulfonate and 1,3-propane sultone are preferable in view of easiness of reaction, and 1,3-propane sultone
  • sulfonating agents are bonded as sulfo groups utilizing a reaction with reactive functional groups present on the surface of the copolymer particles.
  • a reactive functional group a hydroxyl group or an epoxy group is preferable, and an epoxy group is more preferable.
  • the sulfonation agent directly reacts with the reactive functional group derived from the copolymer present on the particle surface, and also causes the reactive functional group to react with a spacer, or the epoxy is used when the reactive functional group is an epoxy group. It is also possible to react with a sulfonating agent after ring-opening reaction of the group. Preferably, the reaction is carried out directly, and the separation performance of the column using the packing obtained thereby is improved, and the production efficiency is also excellent.
  • direct sulfonation of the epoxy group is more effective for separation of the desired protein than sulfonation after the ring opening reaction of the epoxy group present on the surface of the copolymer particle. Will be better.
  • the reaction of the copolymer particles with the sulfonating agent can be carried out in a suitable manner depending on the type of sulfonating agent.
  • a base when introducing a sulfo group into a monomer unit derived from glycidyl methacrylate using a sultone compound as a sulfo agent, a base can be used.
  • inorganic bases such as sodium hydroxide, potassium hydroxide and lithium hydroxide, amines such as triethylamine and N, N-diisopropylethylamine, sodium methoxide, potassium methoxide, potassium t-butoxide, 1,8 And organic bases such as -diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene.
  • sodium hydroxide, potassium hydroxide and potassium t-butoxide are preferable, and sodium hydroxide and potassium hydroxide are more preferable.
  • the inorganic base is used in aqueous solution of appropriate concentration.
  • a sulfo group using a sulfonate as a sulfo agent it can carry out using a base similarly.
  • a sulfonate having a halogen group a sulfo group is introduced by a halogen substitution reaction with a hydroxyl group generated on the copolymer particles during the reaction, and when a sulfonate having a hydroxyl group or a mercapto group is used, copolymer particles
  • the sulfo group is introduced by a nucleophilic reaction involving the ring opening of the above epoxy group.
  • Examples of the solvent used for the sulfonation reaction include water, dimethylsulfoxide, dimethylacetamide, dimethylformamide, N-methylpyrrolidone, alcohol and the like.
  • alcohols are preferred, and secondary alcohols are more preferred from the viewpoint of reaction efficiency and reactivity.
  • 2-propanol, 2-butanol, 3-methyl-2-butanol, 2-pentanol, 3-pentanol and the like can be mentioned, and from the economical viewpoint, 2-propanol is preferable.
  • secondary alcohols are particularly preferable from the viewpoint of reaction efficiency.
  • the reactivity is not sufficient.
  • a Lewis acid when used, the hydrophilicity of the obtained filler is low and it does not disperse in an aqueous solution, so that it can not be packed in a column and does not exhibit the function as a filler for protein separation.
  • the amount of sulfo group bound to the copolymer particles is preferably 20 ⁇ mol / g to 300 ⁇ mol / g, more preferably 40 ⁇ mol / g to 300 ⁇ mol / g. If the amount of sulfo group to be bound is less than 40 ⁇ mol / g, the retention time in liquid chromatography analysis such as HPLC becomes short, and good separation can not be performed.
  • the water dispersibility of a filler is favorable in it being 40 micromol / g or more, and it can obtain a favorable column for analysis of protein.
  • the amount of sulfo group to be bound exceeds 300 ⁇ mol / g, the retention of the sample becomes too strong, and the analysis time tends to be long, which is not preferable.
  • the amount of sulfo group can be measured by the following method. That is, 10 mL of 0.5 M hydrochloric acid is added to 1 g of particles (sample) dried under vacuum, dispersed, filtered, and washed with water. As a result, the sulfo group is in an acid form to obtain particles in a washed state. Next, 10 mL of 0.5 M sodium hydroxide is added to the particles, which is filtered with a container for collecting the filtrate, and then the particles are washed with 10 mL water. The filtrate and washings mixture is titrated with 0.1 M hydrochloric acid. The number of moles of hydrochloric acid required at this time is determined, and the value obtained by subtracting the number of moles of sodium hydroxide (5 mM in the above case) is taken as the amount of sulfo group.
  • This structure is copolymerized using, for example, glycidyl (meth) acrylate as at least one of (meth) acrylic acid esters, and then the epoxy group is opened by a sulfo agent and bound as a sulfo group, or an epoxy group is It is formed by ring opening to a diol or monool monothiol followed by coupling of a sulfo group with a sulfo agent.
  • copolymerization may be performed using a diol structure-containing ester or a monool monothiol-containing ester as at least one of (meth) acrylic acid esters, and then forming a sulfo group by bonding with a sulfo group.
  • the surface of the particle means a portion where solid copolymer particles can contact with the reagent in the reaction solvent, and usually does not include the solid interior.
  • a sulfo group may be bound inside the individual.
  • the packing material for liquid chromatography in one embodiment of the present invention is one obtained by bonding a specific structure having a sulfo group to the surface of the above-mentioned copolymer particle.
  • the liquid chromatography column in one embodiment of the present invention comprises the above-mentioned packing material.
  • the column is obtained by packing the above-mentioned filler into a column by a known packing method such as a slurry method.
  • the packing column can be made of PEEK or SUS as the housing material, but if it is made of SUS, there is a possibility that proteins will be adsorbed, so if analyzing a sample containing protein, PEEK is preferable .
  • a frit is provided in the column for preventing the flow of the filler particles, it is preferable to use a frit made of PEEK to suppress adsorption.
  • a buffer such as phosphoric acid can be preferably used as the eluent.
  • the average particle size measured in Examples and Comparative Examples is a volume average particle size, and was measured by the method described in the section of the embodiment of the present invention.
  • glycidyl methacrylate made by NOF Corporation
  • divinylbenzene made by Nippon Steel Sumikin Chemical Co., Ltd., purity 99%
  • the obtained mixture was made into oil droplets by a microchannel suspension apparatus (manufactured by EPTEC Co., Ltd.) using 500 g of a 1% aqueous solution of sodium alkyldiphenylether sulfonate as an aqueous phase, and polymerization reaction was further performed to obtain copolymer particles. .
  • the average particle size of the obtained particles was 2.6 ⁇ m.
  • 1.0 g of the filler particle 1 dried in vacuum was dispersed by adding 10 mL of 0.5 M hydrochloric acid, and after filtration, the dispersion was washed with water to obtain particles in which the sulfo group was in an acid form.
  • To the particles was added 10 mL of 0.5 M sodium hydroxide and filtered with the vessel in place to collect the filtrate, then the particles were washed with 10 mL water.
  • the mixed solution of the filtrate and the washing solution collected in a container installed was titrated with 0.1 M hydrochloric acid.
  • the amount of sulfo group was determined from the difference between the number of moles of sodium hydroxide (5 mM) used initially and the number of moles of hydrochloric acid required for the titration. As a result, the amount of sulfo groups based on the mass of the particles was 200 ⁇ mol / g.
  • the filler particles 1 were observed by SEM. No pores were identified. The observation results are shown in FIG. As a result of pore measurement by gas adsorption (Autosorb (registered trademark) iQ manufactured by Cantachrome Co., Ltd. was used as an apparatus used), the pore volume was a very small value of 0.01 cm 3 / g.
  • the obtained filler particles 1 were packed in a PEEK column with an inner diameter of 4.6 mm and a length of 10 mm by a slurry method to obtain a column 1.
  • Example 1 The column 1 manufactured in Example 1 was attached to a liquid chromatograph (Agilent (registered trademark) 1260 Infinity, manufactured by Agilent Technologies, Inc.), and a glycated hemoglobin control sample (manufactured by ARKRAY, Inc.) under the following analysis conditions Analysis was carried out.
  • Eluent phosphate buffer (pH 5.3)
  • Flow rate 1.7mL / min
  • Detector UV-Vis detector (wavelength: 415 nm)
  • Temperature 35 ° C
  • the obtained chromatogram is shown in FIG.
  • the theoretical plate height of the stable glycated hemoglobin peak at this time was 33 ⁇ m.
  • the obtained mixture was added to a 5% aqueous solution of polyvinyl alcohol (Kuraray Poval PVA 224, manufactured by Kuraray Co., Ltd.), and polymerized at 80 ° C. for 24 hours by a suspension polymerization method.
  • the obtained particles were classified to obtain filler particles 2 having an average particle diameter of 6.5 ⁇ m.
  • the obtained filler particles 2 were packed into a SUS column of inner diameter 4.6 mm ⁇ length 20 mm by a slurry method to obtain a column 2.
  • Analysis example 3 The analysis was performed using the column 2 obtained in Comparative Example 1 under the same conditions as in Analysis Example 1. The obtained chromatogram is shown in FIG. The theoretical plate height of the glycated hemoglobin peak at this time was 81 ⁇ m. Since the average particle size can not be reduced, the theoretical plate height is larger than that of Analysis Example 1. Furthermore, since sufficient separation was not obtained, the column length was required, and the time required for analysis was about 1.3 times that for Analysis Example 1.
  • Comparative example 3 To 3 g of the copolymer particles obtained in Example 1, 24 g of tetrahydrofuran was added and dispersed. To this, 3 g of 1,3-propane sultone and 0.1 g of boron trifluoride diethyl etherate were added, and allowed to react at 50 ° C. for 6 hours. The reaction solution was filtered, and particles were obtained by washing sequentially with tetrahydrofuran, water, 0.5 M hydrochloric acid, water, 0.5 M aqueous sodium hydroxide solution, and water.
  • the amount of sulfo groups based on the mass of particles was 38.2 mmol / g.
  • the particles obtained had the property of not being dispersed in water.
  • the reason for not dispersing in water is presumed to be because the amount of sulfo group introduced by the reaction of propane sultone is small in the acidic condition. As it did not disperse in water, no column suitable for protein analysis was obtained.
  • Example 2 3 g of the copolymer particles obtained in Example 1 was dispersed in 8 mL of water, 8 mL of 0.5 M sulfuric acid was added, and the mixture was reacted at 70 ° C. for 6 hours to open the epoxy ring. It was confirmed by FT-IR that the peak derived from the epoxy group was burned off that the epoxy ring was opened by the reaction with sulfuric acid.
  • the obtained particles were subjected to a modification step with 1,3-propane sultone by the same operation as in Example 1 to obtain 3 g of filler particles 4.
  • the amount of sulfo groups based on the mass of the particles was 180 ⁇ mol / g.
  • the obtained filler particles 4 were packed in a PEEK column with an inner diameter of 4.6 mm and a length of 10 mm by a slurry method to obtain a column 4.

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Abstract

本発明は、（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位とジビニルベンゼン由来のモノマー単位を有する共重合体の粒子を含む液体クロマトグラフィー用充填剤であって、前記（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位：前記ジビニルベンゼン由来のモノマー単位が７０～９０質量％：３０～１０質量％であり、前記粒子表面にスルホ基が結合してなり、スルホ基が結合した構造として式（１） （式中、Ｒは共重合体粒子の表面に由来する部分構造を表し、Ｘは酸素原子または硫黄原子を表し、ｎは２～４の整数を表す。）で示される構造が含まれ、前記粒子中にスルホ基が４０μｍｏｌ／ｇ～３００μｍｏｌ／ｇ含まれることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤及びその充填剤を用いたカラムに関する。前記カラムは、タンパク質やアミノ酸等の分析に好適に用いることができ、かつ効率的に生産可能である。

Description

液体クロマトグラフィー用充填剤及び液体クロマトグラフィー用カラム
　本発明はスルホ基を有する液体クロマトグラフィー用充填剤及びこの充填剤を充填してなる液体クロマトグラフィー用カラムに関する。
　液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」ともいう）は、幅広いサンプルの分析方法として、様々な分野で用いられている。中でもスルホ基を有する充填剤を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質やアミノ酸等の分析に用いられる。
　陽イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質の分析では、充填剤に対するタンパク質の非特異吸着が起こる場合がある。タンパク質の非特異吸着が起こると、正確な分析結果が得られないだけでなく、カラムの劣化を早めるという問題が生じるため、この非特異吸着が起こらない充填剤を用いる必要がある。
　タンパク質の非特異吸着は、充填剤とタンパク質間の疎水的相互作用が主な原因である。このため、これを抑制する手段として、充填剤に親水性の高い粒子が用いられている。例えば、充填剤として（メタ）アクリル酸エステル系重合体を利用した粒子が広く知られている。
　特許文献１にはメタクリル酸エステル系重合体からなる粒子に、スルホ基を導入したイオン交換体を利用するグルコヘモグロビンの分析方法が開示されている。
　特許文献２ではジビニルベンゼン系疎水性粒子の表面にメタクリル酸などの親水性重合体層を形成し得られた充填剤が開示されている。
　非特許文献１にはアセトニトリル中の重合反応により、発生させたジビニルベンゼンの重合体のコアの表面にメタクリル酸エステルの層を形成し粒子を取得し、さらに、該粒子にエピクロロヒドリンを反応させたうえ、スルホ基を導入した充填剤を用いたタンパク質の分析例が開示されている。
特開平３－２５５３６０号公報 特開平３－０７３８４８号公報
Ｓｈｕｈｏｎｇ　Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ、９６５　（２００２）　８３－９２
　タンパク質を分析するカラムでは、粒子の親水性を高める必要がある。広く使われている（メタ）アクリル酸エステル系共重合体からなる粒子を充填剤として用いる場合、その原料として親水性のモノマーが選択され、使用されている。このときに架橋のために使われる架橋性（メタ）アクリル酸エステルは、比較的に疎水性が高いという特徴があり、このため、タンパク質の分析用途の充填剤においては、架橋性（メタ）アクリル酸エステル単量体の割合を上げられない。その結果、充填剤の架橋度を上げられず、十分な強度を持たない。分析能を上げるためには充填剤の粒径を小さくすることが考えられるものの、充填剤の強度が高くない状態で小粒径にすると、カラムにした場合の圧力に耐えらずに変形してしまい、良好な分析はできないことになる。そのため、高い親水性を有し、小粒径で使用できる強度の高い充填剤が求められている。
　また、特許文献２のように、疎水性粒子の表面に親水性重合体層を形成する方法では、親水性層を形成する必要性から作業工程が増え、生産性が低下するという問題がある。
　したがって、本発明の課題は、タンパク質やアミノ酸等の分析に好適に用いることができ、かつ効率的に生産可能な、液体クロマトグラフィー用充填剤及び液体クロマトグラフィー用カラムを提供することにある。
　本発明は以下の液体クロマトグラフィー用充填剤及びその充填剤を充填してなるカラムを提供する。
［１］（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位とジビニルベンゼン由来のモノマー単位を有する共重合体の粒子を含む液体クロマトグラフィー用充填剤であって、前記（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位：前記ジビニルベンゼン由来のモノマー単位が７０～９０質量％：３０～１０質量％であり、前記粒子表面にスルホ基が結合してなり、スルホ基が結合した構造として式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式中、Ｒは共重合体粒子の表面に由来する部分構造を表し、Ｘは酸素原子または硫黄原子を表し、ｎは２～４の整数を表す。）で示される構造が含まれ、前記粒子中にスルホ基が４０μｍｏｌ／ｇ～３００μｍｏｌ／ｇ含まれることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤。
［２］前記（メタ）アクリル酸エステルがグリシジルメタクリレートを含む前記１に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤。
［３］前記１または２に記載の充填剤の製造方法であって、（メタ）アクリル酸エステルとジビニルベンゼンとを含むモノマー混合物を懸濁重合により共重合し、共重合体粒子を得る工程、および塩基の存在下、第二級アルコールを含む溶媒中でスルホ化剤と反応させる工程を有する充填剤の製造方法。
［４］前記の共重合体粒子を得る工程の後、得られた粒子を別の化学反応に供することなく、前記のスルホ化剤と反応させる工程を実施する前記３に記載の充填剤の製造方法。
［５］（メタ）アクリル酸エステルがグリシジルメタクリレートであり、スルホ化剤がプロパンスルトンであり、第二級アルコールが２－プロパノールである前記３または４に記載の充填剤の製造方法。
［６］前記１または２に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤を充填してなる糖化ヘモグロビン分析用の液体クロマトグラフィー用カラム。
［７］前記１または２に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤を充填してなるカラムを用いた糖化ヘモグロビンの分析方法。
　本発明の一実施態様における液体クロマトグラフィー用充填剤及び液体クロマトグラフィー用カラムは、タンパク質やアミノ酸等の分析に好適に用いることができる。特に充填剤はアクリル系重合体を基剤とするにもかかわらず、親水性を高くしたまま強度を高めることができるため粒径を小さくすることができ、そのため分析能が向上する。
　また、前記充填剤及びカラムは効率的に生産することができる。
分析例１により得られたクロマトグラムである。 分析例２により得られたクロマトグラムである。 分析例３により得られたクロマトグラムである。 分析例４により得られたクロマトグラムである。 実施例１で得られた充填剤粒子のＳＥＭ写真（倍率２００００倍）である。
　本発明の一実施態様における液体クロマトグラフィー用充填剤は、（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位とジビニルベンゼン由来のモノマー単位を含む共重合体の粒子を基材として用いる。なお、（メタ）アクリル酸エステルとは、アクリル酸エステルまたはメタクリル酸エステルを意味する。
　本発明の一実施態様における共重合体は、架橋性単量体としてジビニルベンゼンを用いる。架橋性単量体としてジビニルベンゼンを使用することにより、非架橋性単量体の割合を高めても、得られる共重合体は高い機械的強度を有するようになる。そのため、この共重合体の粒子は粒径を小さくしても強度が高く、この粒子をカラムの充填剤として使用した場合にも粒子の小粒径化に伴う分析時の圧力の上昇にも耐えることが可能である。これにより、カラムの分離性能を高めることができる。
　単量体としてのジビニルベンゼンは、メタ及びパラ位の異性体混合物であっても良い。
　共重合体の単量体である（メタ）アクリル酸エステルとしては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート等が挙げられ、これらは単独でまたは二種以上組み合わせて用いることができる。
　基材の親水性を高めるためや、スルホ基を導入するために、（メタ）アクリル酸エステルは水酸基やグリシジル基を有するものが一定量以上含まれていることが好ましい。その量は一概にいえないが、（メタ）アクリル酸エステル全体の例えば７０質量％以上が好ましい。水酸基やグリシジル基を有する（メタ）アクリル酸エステルとしては、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート等が挙げられる。この中で、グリシジル（メタ）クリレートは、スルホ基構造の導入に好適に利用できるうえに、開環反応により水酸基を持つ構造に変換できるため、より好ましい。入手が容易さから、グリシジルメタクリレートが最も好ましい。
　（メタ）アクリル酸エステルには、疎水性の強いエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレートを併用することもできる。その使用量は、共重合体の親水性に大きな影響を与えない範囲であればよく、具体的には（メタ）アクリル酸エステルの全量に対して１０質量％以下である。
　本発明の一実施態様における共重合体において、（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位とジビニルベンゼン由来のモノマー単位との比は、（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位（複数種を用いるときはそれらの合計量）：前記ジビニルベンゼン由来のモノマー単位が、７０～９０質量％：３０～１０質量％であり、７５～８５質量％：２５～１５質量％がより好ましい。
　（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位が７０質量％未満であると、共重合体の疎水性が高くなってしまい、タンパク質の非特異吸着が起こりやすくなる。また、（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位にスルホ基を導入する場合、スルホ基を効率的に導入することが難しくなる。一方、（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位が９０質量％を超えると、共重合体粒子の強度が低くなり、それをカラムの充填剤に用いた場合は、粒子が変形しカラムの劣化を招き易くなる。
　重合体には、（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位やジビニルベンゼン由来のモノマー単位以外にも、他のモノマー単位を含むことができる。他のモノマー単位の量は、共重合体の親水性に大きな影響を与えない範囲であればよく、例えば共重合体の１０質量％以下の量である。好ましくは５質量％以下の量であり、さらに好ましくは３質量％以下の量である。他のモノマー単位のモノマーとしては、スチレン、エチルスチレン、メチルスチレン、プロピルスチレン、メトキシスチレン、α－メチルスチレン、ブタジエン、酢酸ビニルなどが挙げられる。
　共重合体の粒子の大きさは、液体クロマトグラフィーのカラム用充填剤として使用できる範囲であれば特に制限はないが、カラムへの充填と分離性能を考慮すると、平均粒子径が１μｍ～１０μｍであることが好ましい。平均粒子径が１０μｍ以下であれば、化合物の分離能力が高く、良好な分析結果を得ることができる。一方で１μｍ以下ではカラムの圧力が高くなり、充填が困難になり易い。分離能力が高いカラムを得るためには、粒子の平均粒子径は２μｍ～７μｍがより好ましく、２μｍ～３μｍが最も好ましい。
　本明細書における平均粒子径は、体積平均粒子径であり、次のようにして測定することができる。まず、粒子を粒度分布測定装置で２０００個以上になるように撮像し、得られた二次元の粒子像（静止画像が好ましい）から、各粒子の円相当径（粒子像の投影面積と同じ面積を持つ円の直径）を得る。その円相当径から各粒子の体積を算出して、算出された体積を基準に、平均化して得た粒子径である。このとき、各粒子は、上記の円相当径と同一の直径を有する球体とみなす。粒度分布測定装置としては、ＦＰＩＡ－３０００（シスメックス社製）などが使用できる。
　共重合体の粒子は、その表面に微細な細孔をほとんど有しないことが好ましい。具体的には、ガス吸着法によって測定される全細孔容積が粒子の質量に対して０．０５ｃｍ3／ｇ以下であることが好ましく、０．０２ｃｍ3／ｇ以下であることがさらに好ましい。微細な細孔がほとんどない粒子は、強度が向上する。また、この粒子を基材とした充填剤を用いてＨＰＬＣ分析を行う場合、試料に含まれるたんぱく質などの化合物が、細孔内を拡散することがないので、迅速な分析が可能になる。
　全細孔容積は、装置としてカンタクローム社製Ａｕｔｏｓｏｒｂ（登録商標）　ｉＱを用いて測定することができる。
　本発明の一実施態様における液体クロマトグラフィー用充填剤は、（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位とジビニルベンゼン由来のモノマー単位を有する共重合体の粒子を得た後、粒子表面にスルホ基を導入することにより製造することができる。
　上記共重合には、公知の油溶性ラジカル重合開始剤を用いることができる。重合開始剤としては、例えば２，２’－アゾビスイソブチロニトリル（以下ＡＩＢＮともいう）、２，２’－アゾビス（２，４－ジメチルバレロニトリル）（以下Ｖ－６５ともいう）、２，２’－アゾビスイソ酪酸ジメチル、２，２’－アゾビス（２－メチルブチロニトリル）、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル等が挙げられる。
　重合開始剤の使用量はモノマーの種類や量によって適切に定めれば良いが、通常、モノマーの合計量１００質量部に対して０．１～５質量部である。
　共重合の方法としては、例えば、懸濁重合法、乳化重合法、沈殿重合法などが利用できる。モノマーは溶解するが重合物は溶解しない適当な有機溶媒中で重合反応を行う沈殿重合では、粒径の揃った粒子を得ることができる。しかし、沈殿重合では、重合中に粒子の凝集が起きることがあり、単分散な粒子を収率よく合成することが困難な場合がある。粒子の凝集が起こりにくい点で、懸濁重合法または乳化重合法が好ましく、懸濁重合法がより好ましい。懸濁重合法の中でも、細孔径が制御されたシラス多孔質ガラス（ＳＰＧ）膜と内圧式マイクロキットＭＮ－２０（ＳＧＰテクノ株式会社製）を用いたＳＰＧ膜懸濁重合法、マイクロチャネル懸濁装置（株式会社イーピーテック製）を用いたマイクロチャネル懸濁重合法などが、粒径の揃った粒子を得ることができるのでより好ましい。
　このような重合方法においては、重合反応は、例えば、６０～８０℃で６～２０時間加熱することで行うことができる。
　重合後は、篩や分級装置（例えば、半自由渦式分級機エアロファインクラシファイアＡＣ，日清エンジニアリング株式会社製）を使用して分級を行うことにより、平均粒子径、均一性及び微細粒子の含有量などを調節することができる。
　共重合体の粒子の表面に微細な細孔をほとんど設けないようにするためには、例えば、重合時に希釈剤を添加しないことにより行うことができる。
　得られた共重合体粒子の表面にスルホ基を導入ためには、例えば、スルホ化剤を用いることができる。スルホ化剤としては、２－ヒドロキシエタンスルホン酸ナトリウム、３－ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム、２－メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、３－メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム、２－ブロモプロパンスルホン酸ナトリウム、３－ブロモプロパンスルホン酸ナトリウム等のスルホン酸塩、１，３－プロパンスルトン、１，３－ブタンスルトン、１，４－ブタンスルトン、２，４－ブタンスルトン等のスルトン化合物等が挙げられる。これらの中では、反応の容易さから３－メルカプトプロパンンスルホン酸ナトリウム及び１，３－プロパンスルトンが好ましく、１，３－プロパンスルトンがより好ましい。
　これらのスルホ化剤は、共重合体粒子の表面に存在する反応性官能基との反応を利用して、スルホ基として結合する。反応性官能基としては、水酸基やエポキシ基が好ましく、エポキシ基がより好ましい。
　スルホ化剤は、粒子表面に存在する共重合体由来の反応性官能基に直接反応させるほか、前記反応性官能基にスペーサーを反応させたり、前記反応性官能基がエポキシ基である場合にエポキシ基を開環反応させた後に、スルホ化剤と反応させることもできる。好ましくは、直接反応させるものであり、それにより得られる充填剤を用いたカラムの分離性能が向上するほか、製造効率にも優れる。特に、糖化ヘモグロビンの分析においては、共重合体粒子の表面に存在するエポキシ基の開環反応を行った後にスルホ化するよりも、エポキシ基を直接スルホ化する方が、目的とするたんぱく質の分離が良好になる。
　このように、得られた共重合体粒子を、エポキシ基の開環反応も含め、他の反応に供することなく、スルホ基化剤との反応に用いることが好ましい。
　共重合体粒子とスルホ化剤の反応は、スルホ化剤の種類に応じた適切な方法で行うことができる。例えば、グリシジルメタクリレート由来のモノマー単位に、スルホ剤としてスルトン化合物を用いてスルホ基を導入する場合には、塩基を用いて行うことができる。塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等の無機塩基や、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン等のアミン類、ナトリウムメトキシド、カリウムメトキシド、カリウムｔ－ブトキシド、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等の有機塩基が挙げられる。上記塩基の中で、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、カリウムｔ－ブトキシドが好ましく、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムがより好ましい。無機塩基は適当な濃度の水溶液で使用される。
　スルホ剤としてスルホン酸塩を用いてスルホ基を導入する場合にも、同様に塩基を用いて行うことができる。ハロゲン基を有するスルホン酸塩を用いる場合、反応中に共重合体粒子上に生じる水酸基によるハロゲン置換反応によりスルホ基が導入され、水酸基あるいはメルカプト基を有するスルホン酸塩を用いる場合、共重合体粒子上のエポキシ基の開環を伴う求核反応によりスルホ基を導入される。
　スルホ化反応に使用される溶媒としては、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、Ｎ－メチルピロリドン、アルコール等が挙げられる。これらの中ではアルコールが好ましく、反応効率及び反応性の観点から第二級アルコールがより好ましい。第二級アルコールとしては、２－プロパノール、２－ブタノール、３－メチル―２－ブタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノールなどが挙げられ、経済的観点からは２－プロパノールが好ましい。スルホ化剤としてスルトン化合物を用いる場合は、反応効率性の観点からも特に第二級アルコールが好ましい。
　共重合体粒子とスルホ化剤の反応に酸性触媒を用いた場合には反応性が十分ではない。特に、ルイス酸を用いた場合には、得られた充填剤の親水性が低く、水溶液に分散しないため、カラムに充填できないなど、タンパク質分離用充填剤としての機能を発揮しない。
　共重合体粒子に結合するスルホ基の量は、好ましくは２０μｍｏｌ／ｇ～３００μｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは４０μｍｏｌ／ｇ～３００μｍｏｌ／ｇである。結合するスルホ基の量が４０μｍｏｌ／ｇ未満では、ＨＰＬＣなどの液体クロマトグラフィー分析における保持時間が短くなり、良好な分離が行えない。４０μｍｏｌ／ｇ以上であると、充填剤の水分散性が良好であり、タンパク質の分析に良好なカラムを得ることができる。また、結合するスルホ基の量が３００μｍｏｌ／ｇを超える場合は、試料の保持が強くなり過ぎ、分析時間が長くなる傾向にあり好ましくない。
　前記のスルホ基の量は以下の方法によって測定することができる。すなわち、真空乾燥させた粒子（試料）１ｇに０．５Ｍ塩酸１０ｍＬを加えて分散させ、濾過した後に水で洗浄する。これにより、スルホ基が酸型になり、洗浄された状態の粒子を得る。次に、前記粒子に０．５Ｍ水酸化ナトリウム１０ｍＬを加え、濾液を集めるための容器を設置した状態でそれを濾過し、次いで粒子を水１０ｍＬで洗浄する。濾液と洗浄液の混合液を０．１Ｍ塩酸で滴定する。このときに要した塩酸のモル数を求め、水酸化ナトリウムのモル数（上記の場合、５ｍＭ）から引いた値を、スルホ基の量とする。
　本発明の一実施態様における共重合体粒子の表面には、スルホ基が導入された下記式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、Ｒは共重合体粒子の表面に由来する部分構造を表し、Ｘは酸素原子または硫黄原子を表し、ｎは２～４の整数を表す。）
で示される構造を有することが望ましい。
　この構造は、例えば（メタ）アクリル酸エステルの少なくとも一種としてグリシジル（メタ）アクリレートを用いて共重合を行い、その後、スルホ剤によりエポキシ基を開環させるとともにスルホ基として結合させるか、エポキシ基を開環させてジオールまたはモノオールモノチオールとした後にスルホ剤にてスルホ基を結合させることにより形成される。また、（メタ）アクリル酸エステルの少なくとも一種としてジオール構造含有エステルまたはモノオールモノチオール含有エステルを用いて共重合を行い、その後、スルホ剤にてスルホ基を結合させることにより形成してもよい。
　本願明細書において、粒子の表面とは、固体の共重合体粒子が反応溶媒中で試薬と接することのできる部分のことを意味し、通常、固体内部は含まない。但し、個体内部にスルホ基が結合していても良い。
　本発明の一実施態様における液体クロマトグラフィー用充填剤は、上記の共重合体粒子の表面にスルホ基を有する特定の構造が結合してなるものである。
　本発明の一実施態様における液体クロマトグラフィー用カラムは、上記充填剤を有してなる。カラムは上記充填剤をスラリー法等の公知の充填法によってカラムに充填することによって得られる。充填用のカラムは、筐体の材質としてＰＥＥＫ製またはＳＵＳ製のものが使用できるが、ＳＵＳ製の場合はタンパク質が吸着するおそれもあるため、タンパク質を含む試料を分析する場合はＰＥＥＫ製が好ましい。カラム内には充填剤粒子が流出しないためのフリットが設置されるが、そのフリットも吸着を抑制するためにＰＥＥＫ製のものを使用することが好ましい。
　本発明の一実施態様における液体クロマトグラフィー用カラムはイオン交換クロマトグラフィー用カラムとして用いることにより、種々のタンパク質やアミノ酸等を分析することができる。この場合、溶離液として、例えばリン酸等の緩衝液が好ましく利用できる。
　以下に実施例及び比較例を挙げて本発明を具体的に説明する。
　実施例及び比較例にて測定した平均粒子径は、体積平均粒子径であり、発明を実施する形態の欄に記載した方法により測定した。
実施例１
［重合工程］
　グリシジルメタクリレート（日油株式会社製）及びジビニルベンゼン（新日鉄住金化学株式会社製，純度９９％）（グリシジルメタクリレート：ジビニルベンゼン＝８２：１７（質量比））からなる単量体混合物５０ｇに、重合開始剤としての過酸化ラウロイル（ナカライテスク株式会社製）０．５ｇ（前記単量体混合物の１質量％に相当する量）を添加し、混合物を得た。得られた混合物を、１％アルキルジフェニルエーテルスルホン酸ナトリウム水溶液５００ｇを水相として、マイクロチャネル懸濁装置（株式会社イーピーテック製）により油滴とし、さらに重合反応を行い、共重合体粒子を得た。
　得られた粒子の平均粒子径は２．６μｍであった。
［修飾工程］
　上記共重合体粒子３ｇに２－プロパノール２４ｇ及び１，３－プロパンスルトン（東京化成工業株式会社製）３ｇを加え、５０℃に加熱した。これに８Ｍ水酸化カリウム水溶液１．２ｇを加え、６時間撹拌した後に濾過し、０．５Ｍ塩酸、水、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、水で順次洗浄することで充填剤粒子１を得た。
　真空乾燥させた充填剤粒子１の１．０ｇを、０．５Ｍ塩酸１０ｍＬを加えて分散させ、濾過した後に水で洗浄し、スルホ基が酸型になった粒子を得た。前記粒子に０．５Ｍ水酸化ナトリウム１０ｍＬを加え、濾液を集めるための容器を設置した状態でそれを濾過し、次いで粒子を水１０ｍＬで洗浄した。設置した容器に採取された濾液と洗浄液の混合液を０．１Ｍ塩酸で滴定した。初めに使用した水酸化ナトリウムのモル数（５ｍＭ）と、滴定に要した塩酸のモル数の差から、スルホ基の量を求めた。その結果、粒子の質量に対するスルホ基量は２００μｍｏｌ／ｇであった。
　充填剤粒子１をＳＥＭ観察した。細孔は確認されなかった。観察結果を図５に示す。ガス吸着による細孔測定（使用装置としてカンタクローム社製Ａｕｔｏｓｏｒｂ（登録商標）ｉＱを用いた。）の結果、細孔容積は０．０１ｃｍ3／ｇと非常に小さい値であった。
　得られた充填剤粒子１を、内径４．６ｍｍ×長さ１０ｍｍのＰＥＥＫ製カラムにスラリー法で充填し、カラム１を得た。
分析例１
　実施例１にて製造したカラム１を液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）　１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ，アジレント・テクノロジー株式会社製）に装着し、下記の分析条件にて糖化ヘモグロビンコントロールサンプル（アークレイ株式会社製）の分析を行った。
　溶離液：リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
　流速：１．７ｍＬ／ｍｉｎ
　検出器：ＵＶ－Ｖｉｓ検出器（波長：４１５ｎｍ）
　温度：３５℃
　得られたクロマトグラムを図１に示す。この際の安定型糖化ヘモグロビンピークの理論段高さは３３μｍであった。
分析例２
　実施例１にて製造したカラム１を液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）　１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ，アジレント・テクノロジー株式会社製）に装着し、下記の分析条件にてタンパク質の分析を行った。
　溶離液：（Ａ）２０ｍＭ　２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ５．６）
　　　　　（Ｂ）（Ａ）＋０．５Ｍ　Ｎａ2ＳＯ4
　　　　　リニアグラジエント　０ｍｉｎから２ｍｉｎ、（Ａ）から（Ｂ）
　流速：１．７ｍＬ／ｍｉｎ
　検出器：ＵＶ－Ｖｉｓ検出器（波長：２８０ｎｍ）
　温度：室温
　サンプル：１．オボアルブミン、２．トリプシノーゲン、３．リボヌクレアーゼＡ、４．シトクロムＣ、５．リゾチーム（シグマアルドリッチ社製）
　得られたクロマトグラムを図２に示す。１．５分という短時間で５種類のタンパク質が良好に分離されていることがわかる。
比較例１
　ジエチレングリコールジメタクリレート（日油株式会社製）３０ｇ、２－アクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸（東京化成工業株式会社製）１０ｇ（ジエチレングリコールジメタクリレート：２－アクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸＝７５：２５（質量比））からなる単量体混合物に、重合開始剤としての過酸化ベンゾイル０．１ｇ（前記単量体混合物の０．２５質量％に相当する量）を溶解させ混合物を得た。得られた混合物を、５％ポリビニルアルコール（クラレポバールＰＶＡ２２４，株式会社クラレ製）水溶液に加え、懸濁重合法により８０℃にて２４時間重合させた。得られた粒子を分級し、平均粒子径６．５μｍの充填剤粒子２を得た。
　得られた充填剤粒子２をスラリー法にて内径４．６ｍｍ×長さ２０ｍｍのＳＵＳ製カラムに充填し、カラム２を得た。
分析例３
　比較例１にて得られたカラム２を用いて、分析例１と同じ条件で分析を行った。得られたクロマトグラムを図３に示す。この際の糖化ヘモグロビンピークの理論段高さは８１μｍであった。
　平均粒子径を小さくできないので、分析例１と比べ、理論段高さが大きい。さらに、十分な分離が得られないためカラム長さが必要になり、分析例１に比べ、分析に要する時間が約１．３倍となった。
比較例２
［重合工程］
　グリシジルメタクリレート５６ｇとエチレングリコールジメタクリレート２４ｇ（グリシジルメタクリレート：エチレングリコールジメタクリレート＝７０：３０（質量比））からなる単量体混合物に、重合開始剤としてのＶ－６５　１．５ｇ（前記単量体混合物の１．８８質量％に相当する量）を溶解させ混合物を得た。水４００ｇにポリビニルアルコール４ｇと塩化ナトリウム４ｇを溶解させた水溶液に、得られた混合物を加え、懸濁重合法により６０℃で１０時間重合させた。得られた粒子を分級し、平均粒子径２．５μｍの共重合体粒子を得た。
［修飾工程］
　上記重合体粒子を実施例１と同様に修飾し、充填剤粒子３を得た。この充填剤粒子３を実施例１と同様にカラムに充填したところ、充填途中で充填剤粒子の変形により圧力が上昇し、送液が停止してしまいカラムに充填できなかった。
比較例３
　実施例１で得られた共重合体粒子３ｇにテトラヒドロフラン２４ｇを加え分散させた。これに１，３－プロパンスルトン３ｇと三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体０．１ｇを加え５０℃で６時間反応させた。反応液を濾過し、テトラヒドロフラン、水、０．５Ｍ塩酸、水、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、水の順に洗浄することで粒子を得た。
　得られた粒子１．０ｇに、２－プロパノール１ｍｌと０．５Ｍ塩酸１０ｍＬを加えて分散させ、濾過した後に水で洗浄し、スルホ基が酸型になった粒子を得た。前記粒子に０．５Ｍ水酸化ナトリウム１０ｍＬを加え、濾液を集めるための容器を設置した状態でそれを濾過し、次いで粒子を水１０ｍＬで洗浄した。設置した容器に採取された濾液と洗浄液の混合液に純水７０ｍＬを加え、０．１Ｍ塩酸で滴定した。計算の結果、粒子の質量に対するスルホ基量は３８．２ｍｍｏｌ／ｇであった。
　得られた粒子は、水に分散しない性質を有していた。
　水に分散しない理由としては、酸性条件では、プロパンスルトンの反応による導入されるスルホ基量が少ないからではないかと推測される。水に分散しないため、タンパク質の分析に適したカラムは得られなかった。
実施例２
　実施例１で得た共重合体粒子３ｇを８ｍＬの水に分散させ、０．５Ｍ硫酸８ｍＬを加えて７０℃で６時間反応させて、エポキシ環を開環させた。エポキシ環が硫酸との反応により開環したことは、ＦＴ－ＩＲでエポキシ基由来のピークが焼失したことにより確認した。得られた粒子に対し、実施例１と同様な操作によって１，３－プロパンスルトンとの修飾工程を行い、充填剤粒子４を３ｇ得た。粒子の質量に対するスルホ基量は１８０μｍｏｌ／ｇであった。
　得られた充填剤粒子４を、内径４．６ｍｍ×長さ１０ｍｍのＰＥＥＫ製カラムにスラリー法で充填し、カラム４を得た。
分析例４
　カラム４を用いて、溶離液条件として０ｍｉｎから０．５ｍｉｎは（Ａ）リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）、０．５ｍｉｎから１．０ｍｉｎは（Ｂ）リン酸緩衝液（ｐＨ８．５）であるステップグラジエントとした以外は分析例１と同様に測定を行った。得られたクロマトグラムを図４に示す。図１と同様に、糖化ヘモグロビンが短時間で良好に分離した。比較した場合、糖化ヘモグロビンと不安定型糖化ヘモグロビンの分離に関しては、図１のクロマトグラムが、やや勝っていた。

Claims (7)

  1. 　（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位とジビニルベンゼン由来のモノマー単位を有する共重合体の粒子を含む液体クロマトグラフィー用充填剤であって、前記（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位：前記ジビニルベンゼン由来のモノマー単位が７０～９０質量％：３０～１０質量％であり、前記粒子表面にスルホ基が結合してなり、スルホ基が結合した構造として式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒは共重合体粒子の表面に由来する部分構造を表し、Ｘは酸素原子または硫黄原子を表し、ｎは２～４の整数を表す。）で示される構造が含まれ、前記粒子中にスルホ基が４０μｍｏｌ／ｇ～３００μｍｏｌ／ｇ含まれることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤。
  2. 　前記（メタ）アクリル酸エステルがグリシジルメタクリレートを含む請求項１に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤。
  3. 　請求項１または２に記載の充填剤の製造方法であって、（メタ）アクリル酸エステルとジビニルベンゼンとを含むモノマー混合物を懸濁重合により共重合し、共重合体粒子を得る工程、および塩基の存在下、第二級アルコールを含む溶媒中でスルホ化剤と反応させる工程を有する充填剤の製造方法。
  4. 　前記の共重合体粒子を得る工程の後、得られた粒子を別の化学反応に供することなく、前記のスルホ化剤と反応させる工程を実施する請求項３に記載の充填剤の製造方法。
  5. 　（メタ）アクリル酸エステルがグリシジルメタクリレートであり、スルホ化剤がプロパンスルトンであり、第二級アルコールが２－プロパノールである請求項３または４に記載の充填剤の製造方法。
  6. 　請求項１または２に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤を充填してなる糖化ヘモグロビン分析用の液体クロマトグラフィー用カラム。
  7. 　請求項１または２に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤を充填してなるカラムを用いた糖化ヘモグロビンの分析方法。
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