CN102796673B

CN102796673B - 一株阿魏酸酯酶生产菌株及应用该菌株生产阿魏酸酯酶的方法

Info

Publication number: CN102796673B
Application number: CN201210307546.2A
Authority: CN
Inventors: 徐泽平; 马韵升; 史庆苓; 杨传伦; 张心青; 王秀芝; 付慧君; 虞凤慧
Original assignee: Chambroad Chemical Industry Research Institute Co Ltd; Shandong Chambroad Holding Group Co Ltd
Current assignee: Chambroad Chemical Industry Research Institute Co Ltd
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2012-08-24
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2032-08-24
Also published as: CN102796673A

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株阿魏酸酯酶高产菌株及利用该菌株进行液体发酵制备阿魏酸酯酶的方法；本发明所涉及的阿魏酸酯酶生产菌株为丝状真菌，经16SrDNA鉴定为一株绿色木霉（Trichodermaviride），菌株代码为JBSH-001，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.5612。可利用该菌株液体发酵生产阿魏酸酯酶，该方法发酵所得阿魏酸酯酶酶活可达200mU/ml以上,纯化后的阿魏酸酯酶酶活可达50000mU/g以上。

Description

一株阿魏酸酯酶生产菌株及应用该菌株生产阿魏酸酯酶的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株高产阿魏酸酯酶的微生物菌株，特别涉及一株绿木霉及利用该菌生产阿魏酸酯酶的方法。

背景技术

阿魏酸酯酶也被称为肉桂酸酯酶，是羧酸酯水解酶的一个亚类，也是一种胞外酶，它可以水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，将阿魏酸游离出来。阿魏酸在植物细胞壁结构中起着重要的作用，它可以在植物细胞壁的木质素与木质素之间，木质素与半纤维素之间，半纤维素与半纤维素之间形成交接，从而构成一个骨架结构，使得整个细胞壁变得坚硬。阿魏酸酯酶可以打开细胞壁木质素中阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等分子与半纤维素支链形成的致密网状交联结构，从空间上对细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解，因此阿魏酸酯酶已被推测认为是消除细胞壁降解限制因子的关键酶之一。

在造纸工业中，经阿魏酸酯酶处理的原料，木质素更容易脱除，可减少制浆工序的化学药品用量。而纤维细胞壁经阿魏酸酯酶处理后，表面变得疏松，成纸时可以提高纸品的机械强度。利用阿魏酸酯酶处理纸浆后产生的阿魏酸可作为优质的抗氧化剂，除此之外，阿魏酸还具有的抗肿瘤、消炎、促进伤口愈等保健作用，所以阿魏酸可作为功能因子开发功能性的食品。同时，阿魏酸可以作为合成天然香兰素的前体，以阿魏酸为原料，利用微生物的方法生产的香兰素与合成的香兰素相比具有毒性低，安全性高的特点，可以用作食品和化妆品行业的香料。

专利CN200810056477.6公开了一种阿魏酸酯酶的提取方法，但操作较为复杂，关于阿魏酸酯酶的研究，有很多问题需要解决，主要是目前筛选出的分泌阿魏酸酯酶的微生物的分泌量仍然达不到工业化生产阿魏酸酯酶的要求；其次，阿魏酸酯酶提取方法有待改进，其工业化生产受到限制。

发明内容

本发明针对上述技术存在的不足，提供一种利用绿色木霉（Trichoderma viride）通过液体发酵生产阿魏酸酯酶的方法，收率较现有文献报道提高了数倍，所采用的菌株代码为JBSH-OO1，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.5612；该菌株可应用于生产阿魏酸酯酶，该方法发酵所得阿魏酸酯酶酶活可达200mU/ml以上,纯化后的阿魏酸酯酶酶活可达50000mU/g以上。

本发明提供的具体技术方案是：

首先获得了一株新的菌株，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.5612，其具体获得方法如下：

（1）出发菌株：以本实验室收藏的各种菌株作为起始菌株，其中包括多种木腐菌、软腐菌、枯萎菌和其他霉菌，分类培养建立菌种库。

（2）筛选方法：以阿魏酸甲酯作为唯一碳源制备平板培养基，接入上述菌株在适宜条件下培养，根据是否产生透明圈进行一级筛分。初步筛选具有产阿魏酸酯酶能力的菌株，然后对初筛菌株进行摇瓶培养，根据液体培养物中阿魏酸酯酶的活性大小筛选出其中的2株产酶活性最高的菌株作为驯化菌株。

（3）对2株待驯化菌株的生理生化特性、产酶性能等进行比较深入研究，最终筛选出一株产酶能力强、易于培养并具有稳定的传代特性的菌株，将其初步命名为JBSH01。

（4）以该菌株为出发菌株，采用常规诱变方法，如UV，DMS，MMS，NTG等，结合低能离子注入法，反复多次诱变，复筛，最终获得了高产菌株JBSH-001。

发明人对该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心进行了生物保藏，保藏编号为CGMCC No.5612，经检测其为存活状态。

上述JBSH-001菌株，其形态特征如下：

菌丝纤细无色，具分隔，多分枝。分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，对生或互生，一般有2-3次分枝，着生分生孢子的小梗瓶形或锥形。分生孢子多为球形，孢壁具小疣突，绿色。在PDA培养基上菌落初为白絮状，后为暗绿色。上述形态特征与绿色木霉Trichoderma viride的培养特性一致。

发明人同时对其进行了16S rDNA测序，其基因序列如Seq ID No:1所示，该序列为菌株JBSH-OO1的16S rDNA的全序列。

用所测得的16S rDNA序列进行BLSTN比对，结果显示，菌株JBSH-OO1的16S rDNA的核苷酸序列与木霉属Trichoderma spp.不同菌株的核苷酸序列有大于99%的同源性，与其中明确标记为绿色木霉Trichoderma viride的5株菌株有100%的同源性，因而进一步确定本发明所提供的菌株为一株绿色木霉菌株。

本发明所获得的菌株绿色木霉Trichoderma viride JBSH-OO1，可以应用于日常的生产当中，特别是可以应用于阿魏酸酯酶的生产，具体步骤主要包括绿色木霉菌液体发酵以及阿魏酸酯酶的提取分离和纯化步骤，其特征在于：在绿色木霉菌液体发酵中应用阿魏酸酯酶产生和积累诱导工序，

所述的阿魏酸酯酶产生和积累诱导工序具体步骤如下：

A.诱导因子筛选：

从阿魏酸衍生物、生长因子、酶系的调控方面筛选诱导因子，诱导因子选自维生素类或阿魏酸衍生物或诱导离子或其他诱导因子或其混合物；

B．诱导因子使用方法：

维生素类或阿魏酸衍生物或诱导离子添加入发酵培养基中，结合中期补加碳源和氮源，用于诱导和促进产生阿魏酸酯酶。

首先要用常规培养使木霉菌体生长，进入产酶期后再陆续补加葡萄糖、蔗糖等碳源和蛋白胨、酵母浸粉、酵母提取物等氮源，通过不断补料使菌体生长，从而增加阿魏酸酯酶的表达和分泌。

其中所述诱导因子中的诱导离子选自硼离子或镁离子或钴离子或钼离子中的一种或几种的混合物；维生素类选自维生素B或叶酸；阿魏酸衍生物为阿魏酸甲酯或阿魏酸乙酯；其它诱导因子为甲壳素或壳聚糖或米糠或麸皮中的一种或几种的混合物。

之所以选择上述的物质作为诱导因子，发明人经过研究后发现针对本发明所述的菌株而言，要使其产生胶霉菌素，诱导调控的方法主要通过三种方式：1、补充酶表达的底物，如阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、甲壳素、壳聚糖、麸皮，从而来诱导菌产生阿魏酸酯酶；2、补充生物生长必须的营养因子，如维生素B、叶酸等；3、补充菌体中各种酶系的辅酶离子，主要选择自金属离子或其他例子，一般可以采用其可溶性金属盐的形式，发明人发现通过上述的三种诱导因子，结合对于发酵过程的控制，可以实现阿魏酸酯酶的产量提高。

更为具体的生产步骤如下：

（1）绿色木霉菌液体发酵：

A.菌种活化；

B.液体种子制备；

C.发酵：菌种活化后，经液体发酵扩繁种子液，再利用液体深层发酵方法获得阿魏酸酯酶发酵液；

其中发酵过程：将液体种子以2-10%（v/w）的接种量接到发酵培养基中，26℃培养48h，补加0.5-1%（v/w）的碳源以及0.05-0.2%（v/w）的氮源；

（2）阿魏酸酯酶的制备：

A.固液分离：将上述发酵的阿魏酸酯酶发酵液经固液分离后，清液用于制备阿魏酸酯酶；

B.发酵清液采用微滤脱除胶质以及不溶性颗粒，经超滤膜浓缩后，添加保护剂，经喷雾干燥得到阿魏酸酯酶粗品；

而为了得到阿魏酸酯酶纯品，发明人将上述步骤（2）获得的清夜，直接经固液分离后，采用微滤脱除胶质以及不溶性颗粒，经超滤膜浓缩后，用盐析的方法，得到阿魏酸酯酶粗酶，经复溶后，配制0.5-2%的酶液，经层析纯化，超滤脱盐后，经冷冻干燥得到阿魏酸酯酶纯品。

其中所述步骤（2）中的固液分离为板框过滤或三足离心或碟式离心；所述的步骤（3）中微滤膜的孔径为0.1-0.5μm，超滤膜的孔径为2000-10000Dalton；所述的盐析介质是氯化钠或硫酸钠或硫酸镁或硫酸铵；所述的步骤（3）中层析采用的是离子交换层析，使用的层析介质为DOWEX MXA-1或Q-Sepharose FF或DEAE-Sephacel或DEAE-Sepharose FF或717强碱性离子交换树脂或D201大孔强碱性阴离子交换树脂。

更为具体的过程如下：

（1）菌种活化：将4℃条件下保存在PDA培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下（20℃-25℃）活化4h-8h；

（2）液体种子制备：在无菌操作台上，用10mL灭菌后的蒸馏水将经过活化的试管斜面菌种制成菌体悬浮液，冲洗入装有灭菌液体培养基的三角瓶中，1支试管菌种接种1个三角瓶，培养温度24℃，摇床转速200r/min，振荡培养24-48h制备种子液；

（3）发酵、诱导过程：在发酵培养基中添加占培养基总重量0.01-0.05%金属离子（如镁离子或钴离子或钼离子或硼离子中的一种或几种混合物）；及占培养基总重量0.005-0.02%的生长因子（如维生素B或叶酸或其混合物），将液体种子以2-10%（v/w）的接种量在无菌操作的条件下接到发酵培养基中，26℃ 培养48h，补加0.5-1%（v/w）的碳源（如葡萄糖或蔗糖一种或几种混合物）以及0.05-0.2%的氮源（如蛋白胨或酵母浸粉或酵母粉中的一种或几种混合物），总共培养96-144h，获得阿魏酸酯酶发酵液，经固液分离后获得发酵清液。

（4）阿魏酸酯酶的提取：发酵清液经4000-6000r/min离心分离后，清液采用0.1-0.22μm的微滤膜组件过滤澄清溶液，进而用2000-60000Dalton的超滤膜组件超滤浓缩，浓缩到浓度为5-10%（v/v），添加5-10%的保护剂（w/v），经喷雾干燥得到阿魏酸酯酶粗品。

（5）阿魏酸酯酶的纯化

发酵清液经4000-6000r/min离心分离后，清液采用0.1-0.22μm的微滤膜组件澄清溶液，进而用2000-60000Dalton的超滤膜组件浓缩，浓缩到浓度为5-10%（v/v），用重量分数50-70%硫酸铵盐析，经2000-6000r/min离心后，沉淀用pH为6.86的磷酸盐缓冲盐配制0.5-1%（w/v，湿重）的酶液，采用QFF琼脂糖凝胶层析纯化，超滤脱盐后，经冷冻干燥得到阿魏酸酯酶纯品。

其中，步骤（4）获得的阿魏酸酯酶粗品成本较低，可以直接用于饲料、农产品加工中，而步骤（4）获得的阿魏酸酯酶纯品纯度高，可用于食品、造纸等方面。

其中菌株产阿魏酸酯酶的生产条件的确定，其方法如下：

（1）采用单因子试验和正交试验，通过改变温度、初始pH值、接种量、装料量和培养时间，确定液体种子最佳培养条件和液体发酵最佳培养条件；

（2）采用单因子试验和正交试验，通过改变培养的碳氮源和无机盐组成确定该菌株液体种子最佳培养基组成和液体发酵的最佳培养基组成。

经过上述单因子试验和正交试验所获得菌株、液体种子培养基组成及发酵条件如下：

液体种子培养基组成，按重量计（w/w）为：蔗糖2%～4%，酵母浸粉0.2%～1%，硫酸镁0.02-0.1%，磷酸二氢钾0.01-0.05%,加水至1000mL；

液体种子培养条件：接种量为每个三角瓶接种1只菌株斜面培养物，pH值自然，培养温度24～28℃，摇床转速75-200r/mi n，培养时间为24～48h；

经过上述单因子试验和正交试验所获得菌株液体发酵培养基组成和发酵条件如下：

液体培养基组成，按重量计（w/w）为：蔗糖2%～4%，蛋白胨0.2～1%，麸皮：1-4%；土豆汁1-4%；硫酸镁0.02-0.1%，磷酸二氢钾0.01-0.05%，硫酸锌0.001-0.005%,维生素B120.005%，加水至1000mL；

液体发酵条件：接种量为5%-10%（v/w），pH值自然，培养温度24～28℃，摇床转速75-200r/min，培养时间为96-144h；

利用上述绿木霉发酵，将液体发酵后阿魏酸酯酶酶活可达200mU/ml以上，纯化后的阿魏酸酯酶酶活可达50000mU/g以上。

利用该菌株生产阿魏酸酯酶有以下优点：

1、利用该菌株发酵制备阿魏酸酯酶酶活可达200mU/ml以上，纯化后的阿魏酸酯酶酶活可达50000mU/g以上；

2、该菌株的代谢产物阿魏酸酯酶为胞外酶，减少细胞壁破碎过程，大大降低能耗，降低生产成本。

综上所述，本发明提供了一株阿魏酸酯酶高产菌株及利用该菌株进行液体发酵制备阿魏酸酯酶的方法，该菌株可应用于生产阿魏酸酯酶，该方法发酵所得阿魏酸酯酶酶活产率可达200mU/ml以上。

保藏信息

保藏时间：2011年12月16日

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏编号：CGMCC No.5612

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所

分类命名:绿色木霉（Trichoderma viride）

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，下述实施例中所采用的菌种均为保藏号为CGMCC No.5612的菌种。

实施例1

（1）菌种活化：将4℃条件下保存在PDA培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下（20-25℃）活化4h；

（2）液体种子制备：在无菌操作台上，用10mL灭菌后的蒸馏水将经过活化的试管斜面菌种制成菌体悬浮液，在无菌的条件下冲洗入装有灭菌种子培养基的三角瓶中，1支试管菌种接种1个三角瓶，pH值自然，培养温度24℃，摇床转速200r/min，培养时间为48h；

种子培养基组成，按重量计（w/w）为：蔗糖2%，酵母浸粉0.2%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.025%,加水至1000mL；灭菌条件为121℃，0.15Mpa灭菌20min；

（3）发酵、调控过程：将液体种子以10%（v/v）的接种量接到发酵培养基中，26℃培养48h，补加40%（w/v）的葡萄糖无菌溶液25mL1%（w/v）的葡萄糖及20%（w/v）的蛋白胨无菌溶液5mL0.1%（w/v）的蛋白胨，共培养96h。

发酵培养基组成，按重量计（w/w）为：蔗糖4%，蛋白胨1%，麸皮4%；硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.05%，氯化钴0.001%,维生素B120.005%，加水至1000mL；灭菌条件为121℃，0.15Mpa灭菌20mi n；

发酵结束以后，发酵液酶活为248mU/mL，发酵液经4000r/min离心10min后，清液采用0.22μm的陶瓷微滤膜组件过滤，滤液用10000Dalton的超滤膜组件浓缩，浓缩到重量浓度为5%（v/v），添加10%（w/v）的玉米淀粉，经喷雾干燥得到阿魏酸酯酶粗品25.3g。酶活7200mU/g。

实施例2

种子培养基组成（w/w）为：按重量计（w/w）为：蔗糖2%，酵母浸粉0.6%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.025%,加水至1000mL；灭菌条件为121℃，0.15Mpa灭菌20min；

（3）发酵、调控过程：将液体种子以5%（v/v）的接种量接到发酵培养基中，26℃培养48h，补加40%（w/v）的蔗糖无菌溶液25mL及20%（w/v）的酵母浸粉无菌溶液5mL1%（w/v）的蔗糖糖及0.1%（w/v）的酵母浸粉，共培养120h。

发酵培养基组成，按重量计（w/w）为：蔗糖4%，蛋白胨1%，阿魏酸乙酯1%；硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.05%，氯化钴0.001%,维生素B60.005%，加水至1000mL；灭菌条件为121℃，0.15Mpa灭菌20min；

发酵结束以后，发酵液经4000r/min离心10min，清液采用0.22μm的陶瓷微滤膜组件过滤，滤液用6000Dalton的超滤膜组件浓缩，浓缩到原体积的10%（v/v），用60%（w/v）硫酸铵盐析，经4000r/min离心后，沉淀用pH为6.86的磷酸盐缓冲盐配制成0.5%（w/v，湿重）的酶液，采用DEAE-Sepharose FF介质进行柱层析纯化，洗脱液超滤脱盐后，经冷冻干燥得到阿魏酸酯酶纯品470mg，酶活86450mU/g。

实施例3

（3）发酵、调控过程：将液体种子以5%（v/v）的接种量接到发酵培养基中，26℃培养48h，补加40%（w/v）的蔗糖无菌溶液25mL及20%（w/v）的酵母浸粉无菌溶液5mL补加1%（w/v）的蔗糖及0.1%（w/v）的酵母浸粉，共培养120h。

发酵培养基组成,按重量计（w/w）为：蔗糖4%，酵母浸粉1%，阿魏酸甲酯2%；硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸锌0.005%,钼酸铵0.001%，维生素B10.01%，加水至1000mL；

发酵结束以后，酶活为248mU/mL发酵液经4000r/min离心10min，清液采用0.1μm的陶瓷微滤膜组件过滤，滤液用10000Dalton的超滤膜组件浓缩，浓缩到重量浓度为8%（v/v），添加10%（w/v）的淀粉，经喷雾干燥得到阿魏酸酯酶粗品55.3g。测定其酶活为3800mU/g。

实施例4

发酵结束后，发酵液经4000r/min离心10min后，清液采用0.10μm的陶瓷微滤膜组件过滤，滤液用6000Dalton的超滤膜组件浓缩，浓缩到原滤液体积的10%，用70%的硫酸铵盐析，经4000r/min离心后，沉淀用pH为6.86的磷酸盐缓冲盐配制0.5%（w/v，湿重）的酶液，采用QFF琼脂糖凝胶柱层析纯化，再经超滤脱盐后，冷冻干燥得到阿魏酸酯酶纯品395mg，测定其酶活92600mU/g。

Claims

1.一株阿魏酸酯酶高产菌株，其保藏号为CGMCC No.5612，该菌株为绿色木霉菌株，其16S核糖体DNA即16S rDNA的基因序列如Seq ID No:1所示。