CN102660519B - 一种利用发酵废液制备生物酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用发酵废液制备生物酶的方法，包括：(1)将微生物在培养基中培养2-10天，分离获得剩余发酵废液；(2)利用上述剩余发酵废液制得生物酶生产菌的发酵培养基；(3)将生物酶生产菌的菌株接种到种子培养基于25-30℃，120-250r/min条件下培养24-48小时；(4)以5-10％接种量转接至发酵培养基中产酶，其中加入1-10％诱导物；(5)在25-30℃，120-250r/min条件下培养4-10天，过滤，离心得粗酶液。本发明既降低了酶制剂的生产成本，也减少了发酵废液对环境带来的危害，有效实现发酵废弃物变废为宝、资源化再利用的低碳减排目的。
Description
技术领域
本发明属于发酵废液再利用领域，特别涉及一种利用发酵废液制备生物酶的方法。
背景技术
随着全球能源危机、粮食危机和环境危机的到来，人们将目光转向木质纤维素资源——地球上最丰富、最廉价的可再生资源。木质纤维素是由纤维素、半纤维素和木质素的混合物组成，它们三组分相互交联在一起形成类似于钢筋混凝土的结构。由于木质纤维素的结构复杂，因此对木质纤维素资源进行预处理是获得相关发酵产物的重要的环节之一，其中木质纤维素降解酶(纤维素酶、木聚糖酶、漆酶等)在这一过程中又扮演着非常重要的角色。
为了更好的利用木质纤维素资源，国内外对于木质纤维素降解酶的研究已经达到白热化，但迄今为止能够进行大规模生产较高酶活的优良菌株依然不多，因此，木质纤维素降解酶(纤维素酶、木聚糖酶、漆酶等)酶活比较低、成本过高成为研究开发中遇到的普遍问题。目前，提高木质纤维素降解酶产量的方法主要有三种：(1)筛选优良菌株，获得酶活力最高的菌株；(2)用基因工程技术构建含木质纤维素酶基因的克隆菌株，表达具有较高活力的酶。(3)优化生产工艺提高酶的产量。这些方法在一定程度上提高了酶活力，但却导致了酶制剂的价格过高。
生产木质纤维素降解酶的微生物包括真菌、细菌和放线菌。在众多的生产菌株中，里氏木霉、黑曲霉和米曲霉等具有降解纤维素与半纤维素的较完整的酶系，能同时合成多种降解木质纤维素酶类。
发酵工业中，产品大规模发酵生产后会产生大量的发酵废液，如果不加以处理排放，会造成河流湖泊的COD和BOD急剧上升，环境污染严重。如果在废液直接排放前进行污水处理，由于处理成本高、处理负荷重，企业一直对此颇感头疼。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用发酵废液制备生物酶的方法，该方法利用废弃的发酵液高效制备出具有较高酶活力的木质纤维素降解酶，既降低了酶制剂的生产成本，也减少了发酵废液对环境带来的危害，有效实现发酵废弃物变废为宝、资源化再利用的低碳减排目的。
本发明的一种利用发酵废液制备生物酶的方法，包括：
(1)将微生物在培养基中培养2-10天，分离获得剩余发酵废液；
(2)利用上述剩余发酵废液制得生物酶生产菌的发酵培养基；
(3)将生物酶生产菌的菌株接种到种子培养基于25-30℃，120-250r/min条件下培养24-48小时；
(4)以5-10％接种量转接至由步骤(2)制得的发酵培养基中产酶，其中加入1-10％诱导物；
(5)在25-30℃，120-250r/min条件下培养4-10天，过滤，离心得粗酶液。
所述步骤(1)中的微生物为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、木醋杆菌或酵母菌。
所述大肠杆菌分离获得剩余发酵废液的具体工艺为：将大肠杆菌取1-2环接种到含有1％胰蛋白胨或蛋白胨、0.5％酵母浸膏、1％NaCl、pH7.0的培养基中，在37℃下培养24-72h后，用滤纸或0.2微米的滤膜将培养基过滤或高速离心取上清液，获得大肠杆菌发酵废液。
所述金黄色葡萄球菌分离获得剩余发酵废液的具体工艺为：将金黄色葡萄球菌取1-2环接种到含有0.5％胰蛋白胨或蛋白胨、0.3％牛肉膏、5％NaCl、pH7.4的培养基中，在37℃下培养24-72h后，用滤纸或0.2微米的滤膜将培养基过滤或高速离心取上清液，获得金黄色葡萄球菌发酵废液。
所述木醋杆菌分离获得剩余发酵废液的具体工艺为：将木醋杆菌取1-2环接种到含有2.5％葡萄糖、0.3％胰蛋白胨或蛋白胨、0.5％酵母提取物、pH4.0-7.0的种子培养基中，25-30℃动态培养24h制备种子液，然后按体积百分比3-15％的接种量转接到发酵培养基中，30℃静置或动态培养7-14天，取出产生的细菌纤维素，获得木醋杆菌发酵废液。
所述酵母菌分离获得剩余发酵废液的具体工艺为：将酵母菌取1-2环接种到含有0.5％胰蛋白胨或蛋白胨、1.5％酵母浸膏、0.5％硫酸铵、2％葡萄糖、pH5-6的培养基中，在30℃下培养24-72h后，用滤纸或0.45微米的滤膜将培养基过滤或高速离心取上清液，获得酵母菌发酵废液。
所述步骤(2)中的生物酶生产菌为里氏木霉、黑曲霉或米曲霉。
所述步骤(2)中的发酵培养基的组分为：剩余发酵废液中，补加0-1％葡萄糖，0.1-1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N(125g/L二水柠檬酸钠，250g/L KH2PO4，100g/L NH4NO3，10g/L MgSO4·7H2O，250μg/L生物素，5g/L CaCl2·2H2O，5mL/L微量元素溶液，其中，微量元素溶液含50g/L一水柠檬酸，50g/L ZnSO4·7H2O，10g/LFe(NH4)2(SO4)2·6H2O，2.5g/L CuSO4·5H2O，0.5g/L MnSO4·H2O，0.5g/L H3BO3，0.5g/LNa2MoO4·2H2O)，pH5.0；或者是补加0.1-1％葡萄糖，0.1-1％蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.015％Tween 80，0.14％(NH4)2SO4，0.2％KH2PO4，0.03％尿素，0.04％CaCl2·2H2O，0.03％MgSO4·7H2O，0.0005％FeSO4·7H2O，0.00016％MnSO4·H2O，0.00014％ZnSO4·7H2O，0.00037％CoCl2·6H2O(Mandels培养基)，以上百分比均为重量百分比。
所述步骤(3)中的种子培养基包含：1％葡萄糖，0.1-1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N(125g/L二水柠檬酸钠，250g/L KH2PO4，100g/L NH4NO3，10g/L MgSO4·7H2O，250μg/L生物素，5g/L CaCl2·2H2O，5mL/L微量元素溶液，其中，微量元素溶液含50g/L一水柠檬酸，50g/L ZnSO4·7H2O，10g/L Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O，2.5g/LCuSO4·5H2O，0.5g/L MnSO4·H2O，0.5g/L H3BO3，0.5g/L Na2MoO4·2H2O)，pH5.0；或者是包含1％葡萄糖，0.1-1％蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.015％Tween 80，0.14％(NH4)2SO4，0.2％KH2PO4，0.03％尿素，0.04％CaCl2·2H2O，0.03％MgSO4·7H2O，0.0005％FeSO4·7H2O，0.00016％MnSO4·H2O，0.00014％ZnSO4·7H2O，0.00037％CoCl2·6H2O(Mandels培养基)，pH4.8-5.0，以上百分比均为重量百分比。
所述步骤(4)中的诱导物为纸浆废料、微晶纤维素、棉布、脱脂棉、木屑、稻壳、麸皮、秸秆、草和玉米芯的一种或者几种。
所述步骤(4)产酶过程中，采用的是间歇分批式、连续培养式或分批补料式的培养方法。
所述步骤(5)得到的粗酶液包括纤维素酶和木聚糖酶。
本发明利用培养微生物后的剩余发酵液作为诱导包括里氏木霉、黑曲霉、米曲霉等的丝状真菌生产纤维素酶和木聚糖酶的培养基，培养基原料廉价易得，来源广泛，同时降低了环境污染。实验结果表明，在同等条件下，利用培养微生物后的剩余发酵液作为诱导里氏木霉、黑曲霉和米曲霉产酶的培养基与一般的普通培养基相比，纤维素酶酶活相差不大，木聚糖酶酶活比一般培养基更高。因此，证实利用培养微生物后的剩余发酵液作为诱导微生物生产纤维素酶和木聚糖酶的培养基是廉价可行的。
有益效果
(1)本发明以微生物发酵废液为原料，充分利用了废液中的营养和产酶促进因子，不需加入太多的碳源和氮源，降低了水耗、能耗；
(2)本发明既减少了微生物发酵废液排放对环境的污染及其处理成本，又可以大大降低木质纤维素降解酶的生产成本；
(3)本发明的发酵培养基与常规培养基相比，产生的纤维素酶活力相差不大，木聚糖酶活力比常规培养基的更高，活力最高达5倍以上；
(4)该生产工艺具有原料来源广泛，成本低，可操作性强等优点。
附图说明
图1是实施例1中纤维素酶活力测定结果；
图2是实施例1中木聚糖酶活力测定结果；
图3是实施例2中纤维素酶活力测定结果；
图4是实施例2中木聚糖酶活力测定结果；
图5是实施例3中纤维素酶活力测定结果；
图6是实施例3中木聚糖酶活力测定结果；
图7是实施例4中纤维素酶活力测定结果；
图8是实施例4中木聚糖酶活力测定结果；
其中，图1-图8中，(◆)代表实施例1-4中实验组产生的纤维素酶和木聚糖酶的酶活，(□)代表葡萄糖对照组产生的纤维素酶和木聚糖酶的酶活。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.大肠杆菌发酵废液的制备
将大肠杆菌(Escherichia coli)CVCC 1420接种1环到含1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸膏，1％NaCl，pH7.0的培养基中。在37℃下培养24h后用滤纸将培养基中的一些杂质去除，获得大肠杆菌发酵培养基清液，将其作为诱导里氏木霉菌株产酶的培养基。
2.里氏木霉的种子培养
(1)里氏木霉种子培养基：1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N(125g/L二水柠檬酸钠，250g/L KH2PO4，100g/L NH4NO3，10g/LMgSO4·7H2O，250μg/L生物素，5g/L CaCl2·2H2O，5mL/L微量元素溶液)；其中，微量元素溶液含50g/L一水柠檬酸，50g/L ZnSO4·7H2O，10g/L Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O，2.5g/LCuSO4·5H2O，0.5g/L MnSO4·H2O，0.5g/L H3B03，0.5g/L Na2MoO4·2H2O；
(2)以里氏木霉(T.reesei)Rut C30为生产菌株，在pH5.0，30℃，160r/min条件下培养36h。
3.里氏木霉发酵产酶
(1)里氏木霉产酶培养基(实验组)：大肠杆菌发酵废液100mL，补加1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N，添加2％硫酸盐纸浆废料作为诱导物，pH5.0；
里氏木霉产酶培养基(对照组)：蒸馏水100mL，1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N，添加2％硫酸盐纸浆废料作为诱导物，pH5.0；
(2)以10％接种量，在28℃，160r/min条件下培养10d诱导产酶；过滤或离心收集的发酵液清液，测定每天所产生的纤维素酶和木聚糖酶酶活。
4.纤维素酶活力测定
(1)粗酶液中还原糖的测定：0.1mL粗酶液+0.9mL蒸馏水+3mL 3，5-二硝基水杨酸(DNS)，沸水浴5min，冷却后加蒸馏水至25mL，550nm处测得OD1；
(2)粗酶液与羧甲基纤维素钠(CMC-Na)反应后总还原糖的测定：0.1mL粗酶液+0.9mL1％CMC-Na溶液(用50mM，pH5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制)，50℃水浴10min后加入3mLDNS，沸水浴5mn；冷却后加蒸馏水至25mL，550nm处测得OD2；
(3)ΔOD＝OD2-OD1，1个酶活力单位(IU)定义为每分钟水解羧甲基纤维素钠产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量。
式中K为葡萄糖标准曲线斜率，N为稀释倍数，1000为mg转化为μg的系数，180为葡萄糖的分子量，10为反应时间(min)。
5.木聚糖酶活力测定
(1)底物空白：0.5mL的50mM，pH5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液+1mL 1％木聚糖(用50mM，pH5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制)+3mLDNS，沸水煮5min；冷却后加蒸馏水至25mL，550nm处测吸光度，记为OD1；
(2)酶液空白：0.5mL稀释100倍的酶液+1mL的50mM，pH5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液+3mLDNS，沸水煮5min；冷却后加蒸馏水至25mL，550nm处测吸光度，记为OD2；
(3)反应液：0.5ml稀释100倍的酶液+1mL用50mM，pH5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制的1％(w/v)木聚糖(Sigma公司制造)溶液，在50℃水浴锅中保温30min；
(4)加DNS试剂3mL，沸水中煮5min，冷却后加水至25mL，混匀后在550nm测吸光度值，记为OD3；
(5)ΔOD＝OD3-OD2-OD1，1个木聚糖酶活力单位(IU)定义为每分钟水解羧甲基纤维素钠产生1μmolD-木糖所需的酶量。
式中K为D-木糖标准曲线斜率，N为稀释倍数，1000为mg转化为μg的系数，150为D-木糖的分子量，30为反应时间(min)。
上述的里氏木霉产酶培养基实验组和对照组的唯一区别是：实验组是100mL的大肠杆菌发酵废液；对照组是100mL的蒸馏水。在培养基初始糖浓和实验条件完全相同的情况下，实验组所产生的纤维素酶酶活略高于对照组的酶活，如图1所示。值得注意的是，实验组所产生的木聚糖酶酶活远高于葡萄糖对照组，如图2所示。
实施例2
1.金黄色葡萄球菌发酵废液的制备
将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CICC23656接种2环到含有0.5％胰蛋白胨或蛋白胨，0.3％牛肉膏，5％NaCl，pH7.4的培养基中，在37℃下培养72h后用滤纸将培养基中的一些杂质去除，获得金黄色葡萄球菌发酵培养基清液，将其作为诱导里氏木霉菌株产酶的培养基。
2.里氏木霉的种子培养
(1)里氏木霉种子培养基：1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N；
(2)以里氏木霉Rut C30为生产菌种，在pH5.0，30℃，160r/min条件下培养36h。
3.里氏木霉发酵产酶
(1)里氏木霉产酶培养基(实验组)：金黄色葡萄球菌发酵废液100mL，补加1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N，添加2％硫酸盐纸浆废料作为诱导物，pH5.0；
里氏木霉产酶培养基(对照组)：蒸馏水100mL，1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N，添加2％硫酸盐纸浆废料作为诱导物，pH5.0；
(2)以10％接种量，在28℃，160r/min条件下培养10d诱导产酶；过滤或离心收集的发酵液清液，测定每天所产生的纤维素酶和木聚糖酶酶活。
4.纤维素酶活力测定，详见实施例1。
5.木聚糖酶活力测定，详见实施例1。
在本实施例中，里氏木霉产酶培养基实验组和对照组的唯一区别是：实验组是100mL的金黄色葡萄球菌发酵废液；对照组是100mL的蒸馏水。在培养基初始糖浓和实验条件完全相同的情况下，实验组所产生的纤维素酶的酶活略高于对照组的酶活，如图3所示。在发酵的初期，实验组的纤维素酶的活性较低，有可能是因为盐浓度太高抑制了里氏木霉产酶。而随着发酵的进行，里氏木霉可能适应了高盐的环境同时一部分盐也被里氏木霉吸收利用。所以在发酵的后期(7天-10天)，实验组所产生的纤维素酶的活性基本与对照组持平。而对于木聚糖酶，葡萄糖对照组的酶活一直很低。而实验组起初由于盐浓度过高，产酶受到抑制；而在发酵后期，检测到了很高的木聚糖酶酶活(如图4所示)。由图3和图4可知，利用金黄色葡萄球菌发酵废液生产纤维素酶和木聚糖酶，虽然发酵前期产酶受到抑制，但在后期可以得到较高活性的酶。
实施例3
1.木醋杆菌发酵废液的制备
将木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 23770接种2环到含有2.5％葡萄糖，0.3％胰蛋白胨或蛋白胨，0.5％酵母提取物，pH4.0-7.0的种子培养基中，30℃动态培养24h制备种子液，然后按体积百分比3％的接种量转接到发酵培养基中，30℃静置培养7天，取出产生的细菌纤维素膜，剩余的发酵废液作为诱导里氏木霉菌株产酶的培养基。
2.里氏木霉的种子培养
(1)里氏木霉种子培养基：1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N；
(2)以里氏木霉Rut C30为生产菌种，在pH5.0，30℃，160r/min条件下培养36h。
3.里氏木霉发酵产酶
(1)里氏木霉产酶培养基(实验组)：木醋杆菌发酵废液100mL，补加0.1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N，添加2％硫酸盐纸浆废料作为诱导物，pH5.0；
里氏木霉产酶培养基(对照组)：蒸馏水100mL，1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N，添加2％硫酸盐纸浆废料作为诱导物，pH5.0；
(2)以10％接种量，在28℃，160r/min条件下培养10d诱导产酶；过滤或离心收集的发酵液清液，测定每天所产生的纤维素酶和木聚糖酶酶活。
4.纤维素酶活力测定，详见实施例1。
5.木聚糖酶活力测定，详见实施例1。
在本实施例中，里氏木霉产酶培养基实验组和对照组的唯一区别是：实验组是100mL的木醋杆菌发酵废液；对照组是100mL的蒸馏水。在培养基初始糖浓和实验条件完全相同的情况下，实验组所产生的纤维素酶的酶活与对照组的酶活基本持平，如图5所示。但是，如图
6所示，实验组的木聚糖酶的酶活要远远高于葡糖糖对照组。
实施例4
1.大肠杆菌发酵废液的制备，详见实施例1.
2.里氏木霉的种子培养
(1)里氏木霉种子培养基：1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N；
(2)以里氏木霉Rut C30为生产菌种，在pH5.0，30℃，160r/min条件下培养36h。
3.里氏木霉发酵产酶
(1)里氏木霉产酶培养基(实验组)：大肠杆菌发酵废液100mL，补加1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N，添加2％微晶纤维素作为诱导物，pH5.0；
里氏木霉产酶培养基(对照组)：蒸馏水100mL，1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N，添加2％微晶纤维素作为诱导物，pH5.0；
(2)以10％接种量，在28℃，160r/min条件下培养10d诱导产酶；过滤或离心收集的发酵液清液，测定每天所产生的纤维素酶和木聚糖酶酶活。
4.纤维素酶活力测定，详见实施例1。
5.木聚糖酶活力测定，详见实施例1。
本实施例与实施例1不同之处在于：实施例1用纸浆废料作为诱导物，实施例4以微晶纤维素作为诱导物。在本实施例中，里氏木霉产酶培养基实验组和对照组的唯一区别是：实验组是100mL的大肠杆菌发酵废液；对照组是100mL的蒸馏水。在培养基初始糖浓和实验条件完全相同的情况下，实验组所产生的纤维素酶的酶活与对照组的酶活基本持平，如图7所示。而如图8所示，实验组的木聚糖酶的酶活也要高于葡糖糖对照组。
实施例5
1.酵母菌发酵废液的制备
将酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)CICC 30356取1环接种到含有0.5％胰蛋白胨或蛋白胨，1.5％酵母浸膏，0.5％硫酸铵，2％葡萄糖，pH6的培养基中，在30℃下培养36h后用滤纸将培养基过滤，获得酵母菌发酵废液，将其作为诱导生产菌产酶的培养基。
2.里氏木霉的种子培养
(1)里氏木霉种子培养基：1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N；
(2)以里氏木霉Rut C30为生产菌种，在pH5.0，30℃，160r/min条件下培养36h。
3.里氏木霉发酵产酶
(1)里氏木霉产酶培养基(实验组)：大肠杆菌发酵废液100mL，补加0.1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N，添加2％微晶纤维素作为诱导物，pH5.0；
里氏木霉产酶培养基(对照组)：蒸馏水100mL，1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N，添加2％微晶纤维素作为诱导物，pH5.0；
(2)以10％接种量，在28℃，160r/min条件下培养10d诱导产酶；过滤或离心收集的发酵液清液，测定每天所产生的纤维素酶和木聚糖酶酶活。
4.纤维素酶活力测定，详见实施例1。
5.木聚糖酶活力测定，详见实施例1。
在本实施例中，里氏木霉产酶培养基实验组和对照组的唯一区别是：实验组是100mL的酵母菌发酵废液；对照组是100mL的蒸馏水。在培养基初始糖浓和实验条件完全相同的情况下，实验组所产生的纤维素酶的酶活与对照组的酶活基本持平，与图7结果类似，实验组的木聚糖酶的酶活也要高于葡糖糖对照组，与图8结果类似。
实施例6
1.黑曲霉ATCC 46890的种子培养
黑曲霉种子培养基：1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’smedium N；以黑曲霉Aspergillus niger ATCC 46890为生产菌种，在pH5.0，30℃，200r/min条件下培养36小时。
发酵产酶
2.黑曲霉发酵产酶
(1)黑曲霉产酶培养基(实验组)：在上述实施例2的金黄色葡萄球菌发酵废液100mL中，补加1％葡萄糖，0.1-1％蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.015％Tween 80，0.14％(NH4)2SO4，0.2％KH2PO4，0.03％尿素，0.04％CaCl2·2H2O，0.03％MgSO4·7H2O，0.0005％FeSO4·7H2O，0.00016％MnSO4·H2O，0.00014％ZnSO4·7H2O，0.00037％CoCl2·6H2O的Mandels培养基，添加10％脱脂棉作为诱导物，pH4.8-5.0；
黑曲霉产酶培养基(对照组)：蒸馏水100mL，1％葡萄糖，0.1-1％蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.015％Tween 80，0.14％(NH4)2SO4，0.2％KH2PO4，0.03％尿素，0.04％CaCl2·2H2O，0.03％MgSO4·7H2O，0.0005％FeSO4·7H2O，0.00016％MnSO4·H2O，0.00014％ZnSO4·7H2O，0.00037％CoCl2·6H2O的Mandels培养基，添加10％脱脂棉作为诱导物，pH4.8-5.0；
(2)以10％接种量，在28℃，160r/min条件下培养10d诱导产酶；过滤或离心收集的发酵液清液，测定每天所产生的纤维素酶和木聚糖酶酶活。
3.纤维素酶活力测定，详见实施例1。
4.木聚糖酶活力测定，详见实施例1。
在本实施例中，黑曲霉产酶培养基实验组和对照组的唯一区别是：实验组是100mL的金黄色葡萄球菌发酵废液；对照组是100mL的蒸馏水。在培养基初始糖浓和实验条件完全相同的情况下，实验组所产生的纤维素酶的酶活略高于对照组的酶活，与图3类似。在发酵的初期，实验组的纤维素酶的活性较低，有可能是因为盐浓度太高抑制了黑曲霉产酶。而随着发酵的进行，黑曲霉可能适应了高盐的环境同时一部分盐也被黑曲霉吸收利用。所以在发酵的后期(7天-10天)，实验组所产生的纤维素酶的活性基本与对照组持平。而对于木聚糖酶，葡萄糖对照组的酶活一直很低。而实验组起初由于盐浓度过高，产酶受到抑制；而在发酵后期，检测到了很高的木聚糖酶酶活(与图4类似)。
实施例7
1.米曲霉ATCC 20719的种子培养
米曲霉种子培养基：1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’smedium N；以米曲霉Aspergillus oryzae ATCC 20719为生产菌种，在pH5.0，30℃，200r/min条件下培养36小时。
2.米曲霉发酵产酶
(1)米曲霉产酶培养基(实验组)：以上述实施例3的木醋杆菌发酵废液100mL，补加0.1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N，添加2％硫酸盐纸浆废料作为诱导物，pH5.0；
米曲霉产酶培养基(对照组)：蒸馏水100mL，1％葡萄糖，0.1％蛋白胨，0.05％柠檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N，添加2％经硫酸盐处理过的纸浆废料作为诱导物，pH5.0；
(2)以10％接种量，在28℃，160r/min条件下培养10d诱导产酶；过滤或离心收集的发酵液清液，测定每天所产生的纤维素酶和木聚糖酶酶活。
3.纤维素酶活力测定，详见实施例1。
4.木聚糖酶活力测定，详见实施例1。
在本实施例中，米曲霉产酶培养基实验组和对照组的唯一区别是：实验组是100mL的木醋杆菌发酵废液；对照组是100mL的蒸馏水。在培养基初始糖浓和实验条件完全相同的情况下，实验组所产生的纤维素酶的酶活与对照组的酶活基本持平，与图5类似。但是，实验组的木聚糖酶的酶活要远远高于葡糖糖对照组，与图6类似。
由上述实施例可知，利用常见的微生物(如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、木醋杆菌和酵母)产生的发酵废液生产纤维素酶和木聚糖酶是切实可行的，尤其是所生产的木聚糖酶的酶活力很高，为木聚糖酶的大规模生产提供了一种新的技术方法。该技术既降低了酶制剂的生产成本，又减少了发酵废液对环境带来的危害，有效实现发酵废弃物变废为宝、资源化再利用的低碳减排目的。
Claims (7)
1.一种利用发酵废液制备生物酶的方法，包括：
（1）将微生物在培养基中培养2-10天，分离获得剩余发酵废液；其中，微生物为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、木醋杆菌或酵母菌；
（2）利用上述剩余发酵废液制得生物酶生产菌的发酵培养基；其中，生物酶生产菌为里氏木霉、黑曲霉或米曲霉；发酵培养基的组分为：剩余发酵废液中，补加0-1%葡萄糖，0.1-1%蛋白胨，0.05%柠檬酸，0.015%Tween80，2%Vogel’s medium N，pH5.0；或者是补加0.1-1%葡萄糖，0.1-1%蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.015%Tween80，0.14%(NH4)2SO4，0.2%KH2PO4，0.03%尿素，0.04%CaCl2·2H2O，0.03%MgSO4·7H2O，0.0005%FeSO4·7H2O，0.00016%MnSO4·H2O，0.00014%ZnSO4·7H2O，0.00037%CoCl2·6H2O，以上百分比均为重量百分比；
（3）将生物酶生产菌的菌株接种到种子培养基于25-30℃，120-250r/min条件下培养24-48小时；其中，种子培养基包含：1%葡萄糖，0.1-1%蛋白胨，0.05%柠檬酸，0.015%Tween80，2%Vogel’s medium N，pH5.0；或者是包含1%葡萄糖，0.1-1%蛋白胨，终浓度为0.05M的柠檬酸缓冲液，0.015%Tween80，0.14%(NH4)2SO4，0.2%KH2PO4，0.03%尿素，0.04%CaCl2·2H2O，0.03%MgSO4·7H2O，0.0005%FeSO4·7H2O，0.00016%MnSO4·H2O，0.00014%ZnSO4·7H2O，0.00037%CoCl2·6H2O，pH4.8-5.0，以上百分比均为重量百分比；
（4）以5-10%接种量转接至由步骤（2）制得的发酵培养基中产酶，其中加入1-10%诱导物；
（5）在25-30℃，120-250r/min条件下培养4-10天，过滤，离心得粗酶液；其中，得到的粗酶液包括纤维素酶和木聚糖酶。
2.根据权利要求1所述的一种利用发酵废液制备生物酶的方法，其特征在于：所述大肠杆菌分离获得剩余发酵废液的具体工艺为：将大肠杆菌取1-2环接种到含有1%胰蛋白胨或蛋白胨、0.5%酵母浸膏、1%NaCl、pH7.0的培养基中，在37℃下培养24-72h后，用滤器将培养基过滤或高速离心取上清液，获得大肠杆菌发酵废液。
3.根据权利要求1所述的一种利用发酵废液制备生物酶的方法，其特征在于：所述金黄色葡萄球菌分离获得剩余发酵废液的具体工艺为：将金黄色葡萄球菌取1-2环接种到含有0.5%胰蛋白胨或蛋白胨、0.3%牛肉膏、5%NaCl、pH7.4的培养基中，在37℃下培养24-72h后，用滤器将培养基过滤或高速离心取上清液，获得金黄色葡萄球菌发酵废液。
4.根据权利要求1所述的一种利用发酵废液制备生物酶的方法，其特征在于：所述木醋杆菌分离获得剩余发酵废液的具体工艺为：将木醋杆菌取1-2环接种到含有2.5%葡萄糖、0.3%胰蛋白胨或蛋白胨、0.5%酵母提取物、pH4.0-7.0的种子培养基中，25-30℃动态培养24h制备种子液，然后按体积百分比3-15%的接种量转接到发酵培养基中，30℃静置或动态培养7-14天，取出产生的细菌纤维素，获得木醋杆菌发酵废液。
5.根据权利要求1所述的一种利用发酵废液制备生物酶的方法，其特征在于：所述酵母菌分离获得剩余发酵废液的具体工艺为：将酵母菌取1-2环接种到含有0.5%胰蛋白胨或蛋白胨、1.5%酵母浸膏、0.5%硫酸铵、2%葡萄糖、pH5-6的培养基中，在30℃下培养24-72h后，用滤器将培养基过滤或高速离心取上清液，获得酵母菌发酵废液。
6.根据权利要求1所述的一种利用发酵废液制备生物酶的方法，其特征在于：所述步骤（4）中的诱导物为纸浆废料、微晶纤维素、棉布、脱脂棉、木屑、稻壳、麸皮、秸秆、草和玉米芯的一种或者几种。
7.根据权利要求1所述的一种利用发酵废液制备生物酶的方法，其特征在于：所述步骤（4）产酶过程中，采用的是间歇分批式、连续培养式或分批补料式的培养方法。
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