CN104845951B - 一种地衣芽孢杆菌三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法 - Google Patents

一种地衣芽孢杆菌三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种地衣芽孢杆菌三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，以地衣芽孢杆菌为生产菌株，通过菌株活化、种子液培养、三角瓶发酵、酶制剂制备的工艺步骤制备耐热阿魏酸酯酶制剂，得到固体阿魏酸酯酶酶制剂稳定性好、适用范围广，制备工艺简单，酶活高，酶活力可达300U/g，总回收率达到了82%，具有极好的工业化应用前景。

Description

一种地衣芽孢杆菌三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的 方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法。
背景技术
阿魏酸(ferulic acid，FA)是普遍存在于植物中的一种天然抗氧化剂，是多种植物中的一种酚酸，具有镇静、抗癌、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、降血脂等独特的功能。但阿魏酸在植物中大部分以交联的形式存在，人和动物不能直接吸收这类阿魏酸，必须依靠微生物产生酯酶将阿魏酸游离出来。另一方面，在植物细胞壁中，阿魏酸或二聚体阿魏酸主要以酯键的形式连接在***木聚糖的***糖残基上，增强***木聚糖链的强度，但从空间上限制了动物和微生物对植物细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解。
阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73，feruloyl esterase)又称肉桂酸酯酶或肉桂酰酯酶，可以水解阿魏酸、二聚阿魏酸形成的酯键，将阿魏酸释放出来。它能与其他水解酶如木聚糖酶、纤维素酶和木质素酶相互联合作用，较为彻底地降解细胞壁中的多糖和木质素。因此，阿魏酸酯酶在食品、医药、造纸、饲料加工、生物合成及能源开发等诸多领域都有着巨大的应用潜能。
自首次在链霉菌中发现阿魏酸酯酶以来，至今已分离纯化近30种阿魏酸酯酶，但主要集中在青霉和曲霉，只有少数是来自于细菌，例如嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌等，而且它们的阿魏酸酯酶的酶学特性以及氨基酸序列都有所不同。由于天然真菌生长、酶产量以及真菌对生长条件的种种限制都制约着酶法制备阿魏酸的工业化生产。故寻求以细菌为发酵菌株生产阿魏酸酯酶具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，以地衣芽孢杆菌为生产菌株，通过菌株活化、种子液培养、三角瓶发酵、酶制剂制备的工艺步骤制备耐热阿魏酸酯酶制剂，所得到的阿魏酸酯酶耐热性好、pH适用范围宽、酶活产量高。
所述的地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)DBM12，已于2014年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC(地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏编号：CGMCC No.8672。
所述三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，包括以下步骤：
步骤1，菌株活化：取地衣芽孢杆菌DBM12菌株，在活化培养基平板上划线，放于40-45℃温箱培养18-24h，将生长好的单菌落进行再次划线，40-45℃温箱培养18-24h，菌株活化完成；
步骤2，种子液培养：取步骤1所得活化后的平板菌种，接种于50mL一级种子培养基中，40-45℃、180r/min振荡培养24h后，再以10v/v％接种量接种二级种子培养基，40-45℃、80r/min振荡培养20～24h，得二级种子液；
步骤3，三角瓶发酵：按照5-10v/v％的接种量将步骤2所得二级种子液接种到80-120mL发酵培养基中，160-180r/min下震荡培养，发酵初始到发酵24h，培养温度控制在40-45℃，发酵24-36h，温度降至35-40℃，在发酵36h时，向发酵液中补加营养液15mL，继续发酵至72h；
步骤4，酶制剂的制备：将步骤3所得发酵液在4℃、8000r/min、离心20min，所得上清进行超滤浓缩，向浓缩后的粗酶液中添加2-3wt％可溶性淀粉，搅拌，再添加8-12wt％麦芽糊精，搅拌均匀后喷雾干燥，即得阿魏酸酯酶制剂。
作为上述发明的进一步改进，步骤1中活化培养基配方为：牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、NaCl1g、琼脂粉1.5g、蒸馏水100mL，pH值7.0，121℃灭菌20min。
作为上述发明的进一步改进，步骤2中一级种子培养基配方为：牛肉膏0.4g、蛋白胨0.8g、酵母粉1g、NaCl 0.5g、KH2PO40.1g、MgSO4·7H2O 0.04g、蒸馏水100ml、pH7.0，121℃灭菌20min；二级种子培养基配方为：豆饼粉1g，玉米粉2g，葡萄糖2.5g，蛋白胨1g，硫酸铵0.2g，MgSO4·7H2O 0.015g，KH2PO40.008g，定容l00mL，pH 7.0-7.4，121℃灭菌20min。
作为上述发明的进一步改进，步骤3中发酵培养基配方为：葡萄糖0.5g、麸皮浸出液20mL、蛋白胨1g、酵母粉0.5g、NaCl 0.5g、KH2PO40.1g、微量元素溶液1mL，蒸馏水100mL、pH7.0；营养液配方：尿素20g、蔗糖50g、玉米浆100mL、胡萝卜浆500mL、土豆浸出液500mL，121℃灭菌15min；其中，麸皮浸出液制备方法：麸皮粉40g，加去离子水500mL，小火煮沸30min，过滤，加水定容至500mL；胡萝卜浆制备方法：胡萝卜500g，切成小块，再同适量去离子水混合，打浆机打浆，4层纱布过滤，加去离子水补充至1000mL；土豆浸出液制备方法：土豆500g，切成1cm3小块，加水1000mL，小火煮30min，4层纱布过滤，加去离子水补充至1000mL；微量元素：CaCl22g/L，MnSO4·4H2O 0.1g/L，FeSO4·7H2O 0.6g/L，ZnSO4·7H2O 0.5g/L，CoCl2·6H2O 2g/L，CuSO42g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L。121℃灭菌15min。
作为上述发明的进一步改进，步骤4中超滤浓缩分别采用截留分子量为200kDa的平板式超滤膜和截留分子量为20kDa的平板式超滤膜。
本发明与现有技术相比，其显著优点在于：第一，本发明的发酵方法不仅发酵液后续处理简便、生产成本低廉，而且发酵获得的地衣芽孢杆菌活力在175U/mL以上，与国内外其他发酵罐规模的阿魏酸酯酶生产方法相比，阿魏酸酯酶总产量和酶活力都达到了较高的水平，具有极好的工业化应用前景；第二，本发明得到固体阿魏酸酯酶酶制剂稳定性好、适用范围广，酶制剂在37℃温度下，保存100d，酶活保存在80％以上，阿魏酸酯酶适合在高温下酶解，在35℃～65℃之间降解酶活较高，相对酶活都在80％以上，酶的最适pH范围在5.0-8.0之间，酶活都在90％以上；第三，本发明所采用的液体发酵工艺简单，环保无毒，原材料使用豆饼粉、玉米粉、大豆秸秆分、麸皮粉等农副产物，成本低廉，整个发酵过程可控，不受外部环境条件限制，非常适合工业规模化发酵罐培养生产；第四，本发明的阿魏酸酯酶固体酶制剂制备工艺简单，酶活高，酶活力可达300U/g，总回收率达到了82％。
附图说明
图1为实施例3中温度对阿魏酸酯酶固体酶制剂储藏稳定性的影响；
图2为实施例3中室温条件下湿度对阿魏酸酯酶固体酶制剂储藏稳定性的影响；
图3为实施例3中温度对阿魏酸酯酶固体酶制剂酶解活性的影响；
图4为实施例3中pH对阿魏酸酯酶固体酶制剂酶解活性的影响。
具体实施方式
实施例1
地衣芽孢杆菌DBM12的筛选方法，包括以下步骤：
步骤1，土样采集及处理
土样采自江苏省徐州市云龙区农村正处于高温发酵中的家畜粪便堆肥。采集的土样置密封的无菌塑料袋中于室温保存，并在1周内进行目的菌株的分离。
取5-10g土样放入装有20-40mL无菌水并放有小玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上，120-160r/min旋转震荡20-30min，然后将三角瓶置于70-80℃水浴加热15-30min，期间每隔5min中震荡一次。
步骤2，富集培养
取1-2mL热处理后的土样于装有30-50mL富集培养基一的三角瓶中，在160-180r/min转速50-60℃下震荡培养20-24h。然后取1-2mL培养液接种到装有50mL浓度5-10％的富集培养基二中，继续在160-180r/min转速50-60℃下震荡培养18-20h。
富集培养基一：酵母提取物0.5g，KH2PO40.1g，NH4NO30.1g，NaCl 0.1g，MgSO4·7H2O0.25g，微量元素1mL，阿魏酸乙酯1g，去离子水100mL，调节pH4.0。
富集培养基二：NH4NO30.5g，尿素0.1g，KH2PO40.1g，NaCl 0.1g，阿魏酸乙酯1g，去离子水100mL，调节pH3.0。
微量元素：EDTA 5g，CaCl2·2H2O 6g，FeSO4·7H2O 6g，MnCl2·4H2O 1.15g，CoCl2·6H2O 0.8g，ZnSO4·7H2O 0.7g，CuCl2·2H2O 0.3g，H3BO30.3g，(NH4)6Mo7O2·4H2O0.25g，去离子水1000mL。
步骤3，初筛
对第二次富集的培养液无菌水稀释，分别取稀释到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液150-250μL涂布于初筛培养基一上，待培养基表面的菌液完全干后，培养皿以封口膜封口，将培养皿置于40-45℃培养箱中培养24-48h，然后将培养皿置于10-20℃培养箱中继续培养6-12h。
挑取不同形态的单菌落点接到初筛培养基二上，45-60℃恒温培养24-48h。挑选出在初筛培养基二上生长较好以及透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，划线接种于纯化培养基，于45-50℃培养1-2d。然后挑取其中的单菌落再次划线分离，重复操作3次。如连续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化。最后将纯化的菌株接种于斜面保藏培养基中4℃保存，接着进一步复筛。
初筛培养基一：蛋白胨0.5g，酵母提取物0.1g，NaNO30.3g，K2HPO40.1g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.025g，FeSO4·7H2O 0.001g，琼脂2.5，去离子水100mL，调节pH4.5。
初筛培养基二：KH2PO40.2g，(NH4)2SO40.4g，MgSO4·7H2O 0.03g，FeSO4·7H2O0.001g，MnSO40.001g，ZnCl20.001g，琼脂2.5g，去离子水100mL，pH4.0。培养基121℃、15min灭菌后，冷却至60-70℃时，加入阿魏酸乙酯溶液1mL，充分摇匀后，平均倒至3个直径90mm的培养皿中。
阿魏酸乙酯溶液：0.2g阿魏酸乙酯加到1.5mL无菌离心管中，再加入500μLN、N-二甲基甲酰胺溶解，然后再加入500μL无菌水，充分摇匀。
步骤4，复筛
将初筛得到的菌株划线接种到活化固体培养基中，40-45℃恒温培养箱培养16-20h。将活化好的菌株再接种到装有30-50mL种子培养液的三角瓶中，以培养温度为40-45℃，摇床转速160-200r/min频率下震荡恒温培养16-20h。按照4-10％的接种量接种到复筛发酵培养基中，摇床震荡培养。发酵条件为：250mL三角瓶，装液量为30-60mL，摇床震荡频率为160-200r/min，发酵温度40-50℃，发酵时间24-48h。发酵结束后，取发酵液以6000-1000r/min转速离心5-10min，取上清液检测酶活性。
复筛种子培养基：蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、酵母粉0.5g、NaCl 0.5g、K2HPO40.02g、加去离子水至100mL，pH4.5，121℃灭菌15min。
发酵培养基配方：可溶性淀粉0.5g、蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、NaCl 0.5g、KH2PO40.1g、MgSO4·7H2O 0.04g、去离子水100mL，pH4.5，121℃灭菌15min。
酶活平板检测方法：0.02mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(pH4.5)100mL，琼脂粉2.5g，121℃、15min灭菌后，冷却至60-70℃时，加入阿魏酸乙酯溶液1mL，充分摇匀后，平均倒至3个直径90mm的培养皿中。琼脂充分凝固后用直径6mm的打孔器均匀打孔约3-10个。将发酵液离心后取上清100μL加到孔中，45℃过夜，查看透明圈情况。
所得菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养24h，菌落圆形，直径2.4-3.2mm；菌落为白色，不透明，表面较平且干燥，牢固附着培养基，难以挑取。在牛肉膏蛋白胨液体培养基中静止培养，无沉淀，液体清亮，培养基表面形成白色皱皮膜，表面有颗粒，膜较薄。观察菌体形态，革兰氏染色阳性，生长过程产生芽孢，孢囊无膨大，无伴孢晶体，菌体杆状，具有运动性。菌株DBM12具体的形态学及生理生化特征见下表。
菌株DBM12形态学及生理生化特性
提取本申请菌株DBM12基因组，依据细菌16SrDNA中最保守的序列设计引物，其中正向引物为F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(如SEQ ID NO.2所示)；反向引物为R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'(如SEQ ID NO.3所示)。PCR反应体系为(20μL):ddH2O 12.7μL，10×PCR buffer 2.0μL，dNTP mix(2.5mmol/L)2.0μL，正向引物(10μmol/L)1.0μL，反向引物(10μmol/L)1.0μL，Taq FlexiPolymerase(5U/μL)0.3μL,模板1.0μL。热循环参数94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸2min，循环30次，72℃延伸10min。用pGM-T载体克隆测序。测得序列如SEQ ID NO.1所示，与从NCBI中比对获得的相近细菌的16S rDNA序列采用ClustalX1.83进行多序列比对，显示菌株DBM12的16S rDNA核苷酸序列与Bacillus licheniformis(EU162839)的16S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似性(maxident)达到99.2％。综合DBM12菌株的形态学特征、生理生化特征及16S rDNA核苷酸序列同源性分析结果，将菌株DBM12鉴定为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。
实施例2
本实施例说明采用三角瓶发酵制备耐热阿魏酸酯酶制剂，包括以下步骤：
步骤1，菌株活化：取地衣芽孢杆菌DBM12菌株，在牛肉膏蛋白胨平板上划线，放于40-45℃温箱培养18-24h，将生长好的单菌落进行再次划线，同样条件下培养18-24h后，菌株活化完成。
活化培养基配方：牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、NaCl 1g、琼脂粉1.5g、蒸馏水100mL，pH值7.0。
步骤2，种子液培养：取步骤1所得活化后的平板菌种，接种于50mL一级种子培养基中，40-45℃、180r/min振荡培养24h后，再以10％接种量接种二级种子培养基，40-45℃、80r/min振荡培养20～24h，得二级种子液。
一级种子培养基配方：牛肉膏0.4g、蛋白胨0.8g、酵母粉1g、NaCl 0.5g、KH2PO40.1g、MgSO4·7H2O 0.04g、蒸馏水100mL、pH7.0，121℃灭菌20min。
二级种子培养基：豆饼粉1g，玉米粉2g，葡萄糖2.5g，蛋白胨1g，硫酸铵0.2g，MgSO4·7H2O0.015g，KH2PO40.008g，定容l00mL，pH 7.0-7.4，121℃灭菌20min。
步骤3，三角瓶发酵：按照5-10％的接种量将步骤2所得二级种子液接种到80-120mL发酵培养基中，160-180r/min下震荡培养。发酵初始到发酵24h，培养温度控制在40-45℃，发酵24-36h，温度降至35-40℃，在发酵36h时，向发酵液中补加营养液15mL，继续发酵至72h。所得发酵液中阿魏酸酯酶酶活为175U/L。
发酵培养基配方：葡萄糖0.5g、麸皮浸出液20mL、蛋白胨1g、酵母粉0.5g、NaCl0.5g、KH2PO40.1g、微量元素溶液1mL，蒸馏水100mL，pH7.0，121℃灭菌20min。
麸皮浸出液制备方法：麸皮粉40g，加去离子水500mL，小火煮沸30min，过滤，加水定容至500mL。
营养液配方：尿素20g、蔗糖50g、玉米浆100mL、胡萝卜浆500mL、土豆浸出液500mL，121℃灭菌15min。
胡萝卜浆制备方法：胡萝卜500g，切成小块，再同适量去离子水混合，打浆机打浆，4层纱布过滤，加去离子水补充至1000mL。
土豆浸出液制备方法：土豆500g，切成1cm3小块，加水1000mL，小火煮30min，4层纱布过滤，加去离子水补充至1000mL。
微量元素：CaCl22g/L，MnSO4·4H2O 0.1g/L，FeSO4·7H2O 0.6g/L，ZnSO4·7H2O0.5g/L，CoCl2·6H2O 2g/L，CuSO42g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L。121℃灭菌15min。
步骤4，酶制剂的制备：
将发酵结束后的发酵液4℃、8000r/min、离心20min，弃去沉淀菌体，所得上清即为粗酶液。
利用截留分子量为200kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，0.09m2)对所得粗酶液进行超滤分离，超滤截留液的体积减少至原体积的10～20％时，添加去离子水至原体积的40％，继续超滤至截留液为原体积的4-5％。收集两次的滤出液。超滤条件：进口压力0.35MPa，出口压力0.2MPa，流速1.5L/h。
利用截留分子量为20kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，0.09m2)对上部获得的滤出液进行超滤浓缩，当超滤至截留液为原体积的30％时，停止超滤，收集截留液。分离条件：进口压力0.4MPa，出口压力0.3MPa，流速1.1L/h。
向浓缩后的粗酶液中，添加可溶性淀粉至2-3％(g/v)，搅拌30min，然后添加麦芽糊精至浓度为8-12％，搅拌均匀后进行喷雾干燥，得阿魏酸酯酶制剂。喷雾干燥条件为：进风量4.5m3/min，进风温度100℃，进料速度150mL/h，出风温度60℃，通针3秒/次，进料速度170mL/h，雾化器压力0.4MPa。以本发明的三角瓶液态震荡发酵制备酶制剂的制备工艺步骤得到的阿魏酸酯酶酶活力可达300U/g，总回收率达到了82％，酶制剂含水量为7.2％。
实施例3
本实施例说明本发明说得阿魏酸酯酶制剂的特性。
(1)温度对阿魏酸酯酶固体酶制剂储藏稳定性的影响
将制备好的固体阿魏酸酯酶酶制剂分别储藏在-20℃、4℃、28℃、37℃和50℃这五个温度环境下，储藏100d，每20d测定一次酶活力。考察温度对阿魏酸酯酶酶稳定性的影响。图4是阿魏酸酯酶固体酶制剂在不同温度储藏条件下的酶活力变化曲线。酶活是经过不同温度储存后的酶制剂活力和对应的储存前的阿魏酸酯酶酶活力的比值。
由图1可知，温度对阿魏酸酯酶活力在储存过程中的稳定性有一定影响。-20℃、4℃和28℃储藏80d时酶活都在保持90％以上，储藏100d时，-20℃、4℃、28℃和37℃温度下，保存酶活液在80％以上。由此表明阿魏酸酯酶的温度稳定性非常好。但在50℃温度条件下，经过60d和100d的储存，酶活下降明显，酶活保留率为70％和60％。整体看，阿魏酸酯酶在低温和室温条件下表现出很好的稳定性，100d的保存时间酶活力基本没有损失。
(2)室温条件下湿度对阿魏酸酯酶固体酶制剂储藏稳定性的影响
为确定相对潮湿和相对干燥的室内条件下阿魏酸酯酶固体酶制剂的稳定性，进行了室内条件(温度8-25℃范围内变化)下，相对干燥(相对湿度0％)和相对潮湿(相对湿度95％)的环境对阿魏酸酯酶固体酶制剂储藏稳定性影响的实验。酶制剂样品用1.5mL塑料离心管敞口分装，每管相同量，分别在加干燥剂和加水的密闭容器中保存，每隔20d取出一管，进行酶活测定。
由图2可知，相对潮湿的室内环境下储藏的酶制剂样品活力损失速度比较快，在潮湿环境下保存60d和100d时保留酶活及分别下降至85％和70％。保存而干燥环境下的样品酶活基本没有变化。这说明湿度条件对酶制剂的储藏稳定性影响很大，而且在实验过程中发现，室内干燥环境保存的酶制剂状态比较稳定，而在潮湿环境下的固体酶制剂会很快吸收环境中的水分，发生结块现象，保存40d之后有染菌现象出现，这些现象都大大加快了酶制剂的失活。说明湿度越大对酶制剂的储藏稳定性的负面影响越明显。鉴于以上实验结果，实际使用阿魏酸酯酶酶制剂过程中应尽量避免酶制剂在湿度较大的环境中长时间放置。
(3)阿魏酸酯酶固体酶制剂的最适作用温度
按照酶活力测定的方法，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃下酶解反应。以温度为横坐标，以相对酶活力为纵坐标作图，以酶活最高者为100％。
由图3可知，阿魏酸酯酶固体酶制剂在35℃～65℃之间酶活较高，相对酶活都在80％以上，其中最适反应温度为50℃，反应温度超过65℃之后，酶活下降较快，但在70℃仍具有一定74％的催化反应活力。整体看酶在高温下酶活力较高。
(4)阿魏酸酯酶固体酶制剂最适作用pH
分别用pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的缓冲液作为反应缓冲液，按照酶活力测定方法，测定在不同pH时的酶活力，以pH值为横坐标，以相对酶活力为纵坐标作图，以酶活最高者为100％。
由图4可知，阿魏酸酯酶固体酶制剂在所检测的pH范围内，酶活较高。在pH4.0时酶活最低，但也在75％。酶的最适pH范围在5.0-8.0之间，酶活都在90％以上。当pH高于7.5时，酶活开始逐渐回落。整体看阿魏酸酯酶pH的适应范围较广。
序列表
<110> 徐州工程学院
<120> 一种地衣芽孢杆菌三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法
<130> 001
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1505
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis）
<400> 1
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggaccgacgg gagcttgctc 60
ccttaggtca gcggcggacg agtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120
aactccagga aaccggggct aataccggat gcttgattga acagcatggt tcaatcataa 180
aaggtggctt tcagctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg 240
taacggctca ctaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg 300
actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg 360
aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aaactctgtt 420
gttagagaag aacaagtacc gttcgaatag ggcggtacct tgacggtacc taaccagaaa 480
gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gatggcaagc gttgtccgga 540
attattgggc gtaaagcgcg cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct 600
caaccgggga gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc 660
cacgtgtagc ggcgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc 720
tggtctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc gaacaggatc agataccctg 780
gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg 840
cagcaaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga 900
attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa 960
ccttaccagg tcttgacatc ctcttacaac cctagagata gggcttcccc ttcgggggca 1020
gagtgacagg tggtgactgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1080
gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggagact 1140
gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct 1200
gggctacaca cgtgctacaa tgggcavaac aaagggcagc gaagccgcga ggctaagcca 1260
atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga 1320
atcgctcgta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac 1380
cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc ttttggagcc 1440
agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtatcggaa 1500
ggtgc 1505
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 正向引物
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 反向引物
<400> 3
aaggaggtga tccagccgca 20

Claims (5)

1.一种地衣芽孢杆菌三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，菌株活化：取地衣芽孢杆菌DBM12菌株，在活化培养基平板上划线，放于40-45℃温箱培养18-24h，将生长好的单菌落进行再次划线，40-45℃温箱培养18-24h，菌株活化完成；
步骤2，种子液培养：取步骤1所得活化后的平板菌种，接种于50mL一级种子培养基中，40-45℃、180r/min振荡培养24h后，再以10% v/v接种量接种二级种子培养基，40-45℃、80r/min振荡培养20～24h，得二级种子液；
步骤3，三角瓶发酵：按照5-10% v/v的接种量将步骤2所得二级种子液接种到80-120mL发酵培养基中，160-180r/min下震荡培养，发酵初始到发酵24h，培养温度控制在40-45℃，发酵24-36h，温度降至35-40℃，在发酵36h时，向发酵液中补加营养液15mL，继续发酵至72h；
步骤4，酶制剂的制备：将步骤3所得发酵液在4℃、8000r/min、离心20min，所得上清进行超滤浓缩，向浓缩后的粗酶液中添加2-3wt%可溶性淀粉，搅拌，再添加8-12wt%麦芽糊精，搅拌均匀后喷雾干燥，即得阿魏酸酯酶制剂，该阿魏酸酯酶制剂在35℃～ 65℃的酶活在80%以上，最适反应温度为50℃；
所述地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)DBM12，已于2014 年1 月2 日保
藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCCNo.8672。
2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：步骤1中活化培养基配方为：牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、NaCl 1g、琼脂粉1.5g、蒸馏水100mL，pH值7.0，121℃灭菌20min。
3.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：步骤2中一级种子培养基配方为：牛肉膏0.4g、蛋白胨0.8g、酵母粉1g、NaCl0.5g、KH2PO4 0.1g、MgSO4·7H2O 0.04g、蒸馏水100ml、pH7.0，121℃灭菌20min；二级种子培养基配方为：豆饼粉1g，玉米粉2g，葡萄糖2.5g，蛋白胨1g，硫酸铵0.2g，MgSO4·7H2O0.015g，KH2PO4 0.008g，定容l00mL，pH 7.0-7.4，121℃灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：步骤3中发酵培养基配方为：葡萄糖0.5g、麸皮浸出液20mL、蛋白胨1g、酵母粉0.5g、NaCl 0.5g、KH2PO4 0.1g、微量元素溶液1mL，蒸馏水100mL、pH7.0；营养液配方：尿素20g、蔗糖50g、玉米浆100mL、胡萝卜浆500mL、土豆浸出液500mL，121℃灭菌15min；其中，麸皮浸出液制备方法：麸皮粉40g，加去离子水500mL，小火煮沸30min，过滤，加水定容至500mL；胡萝卜浆制备方法：胡萝卜500g，切成小块，再同适量去离子水混合，打浆机打浆，4层纱布过滤，加去离子水补充至1000mL；土豆浸出液制备方法：土豆500g，切成1cm3小块，加水1000mL，小火煮30min，4层纱布过滤，加去离子水补充至1000mL；微量元素：CaCl2 2g/L，MnSO4·4H2O 0.1g/L，FeSO4·7H2O 0.6g/L，ZnSO4·7H2O 0.5g/L，CoCl2·6H2O 2g/L，CuSO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，121℃灭菌15min。
5.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌三角瓶液体发酵制备耐热阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：步骤4中超滤浓缩分别采用截留分子量为200kDa的平板式超滤膜和截留分子量为20kDa的平板式超滤膜。
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Detection of ferulic acid esterase production by Bacillus spp. and lactobacilli;J. Donaghy等;《Applied Microbiology and Biotechnology》;19980831;第50卷;第257页右栏第3段，第259页左栏第1段、表1 *
地衣芽孢杆菌TS-01培养条件的研究;谷春涛;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)基础科学辑》;20040915(第3期);正文第15-17页3.2.4-3.2.9部分 *

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