CN105154371A - 一株产阿魏酸酯酶的噬淀粉乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产阿魏酸酯酶的噬淀粉乳杆菌，该菌株命名为噬淀粉乳杆菌(Lactobacillus？amylovorus)c，已于2015年7月6日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCC？No.11056。实验证实，本发明的菌株在含淀粉培养基中生长可以产生淀粉酶，在含阿魏酸乙酯培养基中生长可以产生阿魏酸酯酶，预示其在造纸、纺织、食品、化妆品、医药行业有潜在的应用价值，特别是其发酵青贮饲料可以提高乳酸含量8％，降低pH值0.27，缩短发酵周期15天，在制备发酵青贮饲料和其它微生态制剂中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一株产阿魏酸酯酶的噬淀粉乳杆菌及其应用。
背景技术
噬淀粉乳杆菌是一种具有淀粉水解活性的乳酸细菌，其产生的解淀粉酶具有淀粉酶和支链淀粉酶的双重活性，因此噬淀粉乳杆菌可以直接转化复杂的淀粉质底物生成乳酸。目前从自然环境中分离筛选出利用淀粉为碳源生产乳酸的噬淀粉乳杆菌成为乳酸发酵研究领域的一个热点。
阿魏酸酯酶是一类能够降解植物细胞壁中阿魏酸与木质素或***半糖相交联的酯键的水解酶。阿魏酸酯酶同其它纤维素酶如木聚糖酶、***糖苷酶等具有协同作用，共同作用于植物细胞壁时，能提高细胞壁的降解效率。利用阿魏酸酯酶，可以降低生产工艺中采用化学法所带来的环境污染问题。同时，阿魏酸酯酶水解细胞壁释放的阿魏酸是一种天然的抗氧化剂，可以清除细胞内的自由基。鉴于阿魏酸酯酶的上述优点，它在造纸、纺织、食品、化妆品、医药等行业具有广泛应用。
目前阿魏酸酯酶主要来源于微生物，不同微生物所产生的阿魏酸酯酶各具特性，它们在编码序列、氨基酸结构、物理化学性质和及催化特性上都有所差异。已报道的菌株其阿魏酸酯酶的产量均较低，无法满足工业化生产。因而筛选获得新的阿魏酸酯酶产生菌株仍有很大的必要性。
饲料青贮技术的研究及应用已有上百年的历史。青贮饲料是将含水率为65％－75％的青绿秸秆切碎后，在密闭绝氧的条件下，通过乳酸菌的厌氧发酵作用，抑制各种杂菌的繁殖，而得到的一种粗饲料。青贮饲料气味酸香、柔软多汁、适口性好、营养丰富、利于长期保存，是家畜优良饲料来源。青贮饲料对草食动物，尤其是对奶牛已成为不可缺少的常规饲料。目前在青贮过程中，除乳酸菌外还会添加淀粉酶和纤维素酶等青贮酶制剂。淀粉酶可以降解秸秆中的淀粉，为微生物的生长繁殖提供可溶性碳源，并且代谢产生的乳酸可以对其它微生物起到抑制作用。鉴于阿魏酸酯酶降解植物细胞壁中交联的阿魏酸基团后，更有利于其它纤维素酶作用的发挥，相互协同下提高对秸秆的利用率，开发或筛选具有淀粉酶和阿魏酸酯酶产生能力的乳杆菌，在降解淀粉的同时增强纤维素的水解能力，以满足对青贮饲料发酵的要求成为目前研究课题的热点。
发明内容
针对传统发酵青贮饲料菌株特性不足，本发明要解决的问题是提供一株产阿魏酸酯酶的噬淀粉乳杆菌及其应用。
本发明所述的产阿魏酸酯酶的噬淀粉乳杆菌，其特征在于：所述菌株命名为噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)c，该菌株已于2015年7月6日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCCNo.11056。
上述噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)c分离自山东青贮发酵玉米饲料中，是一株能够产生阿魏酸酯酶的噬淀粉乳杆菌，具有噬淀粉乳杆菌的典型特征，即为：革兰氏阳性、兼性厌氧，无芽孢，不运动；菌落较小且大小均一，边缘整齐，乳白色；细胞呈长杆状，单个出现或呈短链，1.0μm×3.0-5.0μm；上述噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)c的生理生化特征详见表1。
表1：上述噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)c的生理生化特征
上述噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056生长温度为25-42℃，最适生长温度为37℃。
上述噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056在MRS培养基中生长，静置培养12小时后，菌体密度达到5.74，pH值为4.12。
上述MRS培养基的配方：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5g，葡萄糖20.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，乙酸钠3.12g，磷酸氢二钠1.63g，乙酸钾2.25g，吐温-801.0mL，蒸馏水1000mL，固体需加琼脂20.0g，115℃灭菌30分钟。
上述噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056在含淀粉培养基固体平板中37℃静置培养48小时，形成的淀粉水解圈如图1所示；在含淀粉培养基液体试管中37℃静置培养48小时，菌体密度可达到6.26，pH值降至3.92，上清液处理淀粉2小时后还原糖含量达到0.6mg/mL。
上述含淀粉培养基配方为：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5g，可溶性淀粉10.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，乙酸钠3.12g，磷酸氢二钠1.63g，乙酸钾2.25g，吐温-801.0mL，蒸馏水1000mL，固体需加琼脂20.0g，115℃灭菌30分钟。
上述噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056在含阿魏酸乙酯培养基固体平板中37℃静置培养72小时，菌株产阿魏酸酯酶水解阿魏酸乙酯形成的透明圈如图2所示；在含阿魏酸乙酯培养基液体试管中37℃静置培养72小时，检测阿魏酸酯酶酶活到达420mU每毫克蛋白。
上述含阿魏酸乙酯培养基配方为：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5g，10％(W/V)阿魏酸乙酯的DMSO溶液15mL，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，乙酸钠3.12g，磷酸氢二钠1.63g，乙酸钾2.25g，吐温-801.0mL，蒸馏水1000mL，固体需加琼脂20.0g，115℃灭菌30分钟。
将本发明的噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.1105616SrDNA基因序列与有关菌株的16SrDNA基因序列比较，虽有相似性，但却不完全相同，说明本发明的菌株是首次分离鉴定，具有原创性。
本发明所述产阿魏酸酯酶的噬淀粉乳杆菌在制备发酵青贮饲料中的应用。
其中：所述产阿魏酸酯酶的噬淀粉乳杆菌在含淀粉培养基中生长能产生淀粉酶，在含阿魏酸乙酯培养基中生长能产生阿魏酸酯酶，将其按每千克物料为1.0×106cfu的菌数接种量混合于青绿秸秆物料中，常温密闭发酵45天或以上，即获得每千克干物质乳酸含量20.49g以上的青贮饲料。
优选的实施方式是：所述青绿秸秆物料是长度为2±0.2cm的青绿玉米秸秆。
本发明公开了一株产阿魏酸酯酶的噬淀粉乳杆菌，实验证实，所述噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056可以水解淀粉，并可以产生阿魏酸酯酶，预示该菌株在造纸、纺织、食品、化妆品、医药行业有潜在的应用价值，特别是其发酵青贮饲料可以提高乳酸含量8％，降低pH值0.27，缩短发酵周期15天，在制备发酵青贮饲料和其它微生态制剂中具有广阔的应用前景。
附图说明
本发明所述噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)c菌株已于2015年7月6日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)”，其保藏编号为CGMCCNo.11056。
图1：噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056水解淀粉产生透明圈。
图2：噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056水解阿魏酸乙酯产生透明圈。
具体实施方式
实施例1：噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)c菌株的筛选及生理生化特性鉴定
将山东青贮发酵玉米饲料样品用无菌水洗涤并适度稀释后涂布在MRS培养基琼脂平板上，37℃培养24小时，挑取白色圆形且过氧化氢酶阴性的菌落，镜检为长杆菌，反复划线确定纯菌落，接种到MRS培养基，显微观察个体形态及进行生化反应测定，最终筛选得到一株噬淀粉乳杆菌，该菌株命名为噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)c。
上述噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)c经鉴定是革兰氏阳性菌，兼性厌氧，无芽孢，不运动；菌落较小且大小均一，边缘整齐，乳白色；细胞呈长杆状，单个出现或呈短链，1.0μm×3.0-5.0μm。其生理生化特征为：过氧化氢酶阴性，硝酸还原阴性，可利用淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、纤维二糖、海藻糖，不能利用***糖、核糖、木糖、鼠李糖、棉籽糖、木糖醇。其必须生长因子包括烟酸、叶酸、泛酸和核黄素。
将上述噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)c菌株接种到MRS液体培养基中，37℃静置培养12小时，菌体密度达到5.74，pH值为4.12。
上述MRS培养基的配方：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5g，葡萄糖20.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，乙酸钠3.12g，磷酸氢二钠1.63g，乙酸钾2.25g，吐温-801.0mL，蒸馏水1000mL，固体需加琼脂20.0g，115℃灭菌30分钟。
上述筛选倒的噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)c菌株已于2015年7月6日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCCNo.11056。
实施例2：噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056产淀粉酶水解淀粉实验
将噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056转接到含淀粉培养基固体平板中，37℃培养48小时。观察因降解培养基中淀粉而产生的透明圈。
上述含淀粉培养基配方为：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5g，可溶性淀粉10.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，乙酸钠3.12g，磷酸氢二钠1.63g，乙酸钾2.25g，吐温-801.0mL，蒸馏水1000mL，固体需加琼脂20.0g，115℃灭菌30分钟。
结果见图1。
将噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056转接到含淀粉的液体培养基中，37℃静置培养48小时。4℃、10000g离心15分钟收集培养液上清液，上清液于4℃过夜透析后，测定其中淀粉酶的活性为上清液处理淀粉2小时后还原糖含量达到0.6mg/mL。
上述测定淀粉酶活性反应液：包括25mL溶于0.002MpH6.0磷酸缓冲液的2％可溶性淀粉，12.5mL上清酶液，12.5mL无菌水。反应体系置于37℃水浴，定时取出5mL反应液，于100℃加热10分钟后，用铁***法测定其中还原糖含量。反应体系37℃水浴2小时后测得其生成的还原糖含量。
实施例3：噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056产阿魏酸酯酶水解阿魏酸乙酯实验
将噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056接种到含阿魏酸乙酯的固体培养基中，37℃培养72小时。观察到因降解培养基中阿魏酸乙酯而产生的透明圈。
上述含阿魏酸乙酯培养基配方为：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5g，10％(W/V)阿魏酸乙酯的DMSO溶液15mL，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，乙酸钠3.12g，磷酸氢二钠1.63g，乙酸钾2.25g，吐温-801.0mL，蒸馏水1000mL，固体需加琼脂20.0g，115℃灭菌30分钟。
结果见图2。
将噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056转接到含阿魏酸乙酯的液体培养基中，37℃静置培养72小时，10000g离心5分钟收集菌体，用0.85％的氯化钠溶液洗涤菌体细胞两次后，重悬于等体积pH7.0的磷酸盐缓冲液中，超声破碎，4℃、20000×g离心15分钟收集上清液，上清液即为阿魏酸酯酶粗酶液，检测阿魏酸酯酶酶活到达420mU每毫克蛋白。
上述阿魏酸酯酶酶活测定方法：以阿魏酸对硝基苯酚酯为底物进行，反应体系为1ml，其组成为：100μl10mmol/L的阿魏酸对硝基苯酚酯的DSMO溶液，800μl含有2.5％(V/V)的TritonX-100的0.1mol/LpH7.0磷酸钠缓冲液和100μl的粗酶溶液。在室温混合后，于410nm波长处检测吸光值随时间变化，利用标准曲线计算产物生成量。酶活定义为室温下pH7.0时每分钟降解阿魏酸对硝基苯酚酯生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为一个酶活力单位U。
实施例4：制备噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056发酵青贮饲料
将噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056接种到MRS培养基中，37℃培养24小时，将培养液于6000g离心15分钟，弃去上清液，向残留的菌体加入重量百分比为10％海藻糖、1％谷氨酸钠溶液进行混悬，并用冷冻干燥剂进行干燥，制得噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056的冷冻干燥粉末。
收获的全株玉米切断为约2cm的长度，将制得的噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056冷冻干燥粉末溶解于水，以每千克材料为1.0×106cfu的菌数的方式添加并混合，另作不加噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)c的空白对照。将这些材料装入1升容积的聚乙烯塑料瓶(每个塑料瓶中塞入材料600g)，关闭盖子进行密封。常温下进行发酵，定期进行取样，对得到的青贮饲料用pH计分析pH值，用HPLC分析乳酸含量。
结果显示：未接种乳酸菌的饲料青贮至60天时，pH值达到稳定值4.08，乳酸含量12.5g每千克干物质，而接种噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)cCGMCCNo.11056的青贮饲料在45天时就达到稳定，pH值为3.81，乳酸含量20.49g每千克干物质。
Claims (4)
1.一株产阿魏酸酯酶的噬淀粉乳杆菌，其特征在于：所述菌株命名为噬淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)c，该菌株已于2015年7月6日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCCNo.11056。
2.权利要求1所述的产阿魏酸酯酶的噬淀粉乳杆菌在制备发酵青贮饲料中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述产阿魏酸酯酶的噬淀粉乳杆菌在含淀粉培养基中生长能产生淀粉酶，在含阿魏酸乙酯培养基中生长能产生阿魏酸酯酶，将其按每千克物料为1.0×106cfu的菌数接种量混合于青绿秸秆物料中，常温密闭发酵45天或以上，即获得每千克干物质乳酸含量20.49g以上的青贮饲料。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述青绿秸秆物料是长度为2±0.2cm的青绿玉米秸秆。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |