KR20090129068A

KR20090129068A - 신규한 글루콘아세토박터 속 ｃ１ 균주 및 이를 이용한셀룰로오스 생산방법

Info

Publication number: KR20090129068A
Application number: KR1020080055149A
Authority: KR
Inventors: 전효곤; 권선화; 이정숙; 이근철
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2008-06-12
Filing date: 2008-06-12
Publication date: 2009-12-16
Also published as: KR101005560B1

Abstract

본 발명은 신규한 글루콘아세토박터 속 C1(Gluconacetobacter sp. C1) 균주 및 이를 이용한 셀룰로오스 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 발효식품에서 분리한 신규한 글루콘아세토박터 속 C1 균주는 탄소원으로 글리세롤을 이용하여 셀룰로오스 막을 형성하며, 최적조건 하에서 상기 셀룰로오스 생산량이 월등히 뛰어난 바, 폐 글리세롤을 이용한 박테리얼 셀룰로오스의 대량생산에 유용하게 사용될 수 있다.

글리세롤, 박테리얼 셀룰로오스, 글루콘아세토박터 속 C1(Gluconacetobacter sp. C1).

Description

신규한 글루콘아세토박터 속 Ｃ１ 균주 및 이를 이용한 셀룰로오스 생산방법{Novel Gluconacetobacter sp．C１ strain and a production method of cellulose using thereof}

본 발명은 신규한 글루콘아세토박터 속 C1(Gluconacetobacter sp. C1) 균주 및 이를 이용한 셀룰로오스 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 발효식품에서 분리한 신규한 글루콘아세토박터 속 C1 균주를 이용하여 글리세롤로부터 셀룰로오스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근, 식초 발효과정에서 형성되는 피막을 이용한 다당류 개발에 많은 관심이 모아지고 있으며, 이러한 다당류는 셀룰로오스(cellulose) 또는 생체 고분자화합물(biopolymer)로 불리고 있다. 현재까지 다당류 생산은 주로 식물과 해초에서 이루어져 대량생산에 많은 어려움이 있었다.

셀룰로오스는 자연계에 가장 풍부한 생체물질자원으로 특히, 초산균이 생성하 는 셀룰로오스는 식품의 첨가제뿐만 아니라, 고부가가치의 산업용 신소재로 많은 주목을 받고 있다. 특히, 박테리아가 생성하는 셀룰로오스는 식물체가 생성하는 셀룰로오스와는 상이하게 달라 헤미셀룰로오스나 리그닌과 같은 것들이 함유되지 않은 고순도의 셀룰로오스이며, 물리학적인 성질이 매우 우수하여 실용화 소재 개발에 많은 연구가 진행되고 있다.

국외의 연구동향으로 코코넛을 이용한 나태데코코는 주생산국인 필리핀 과실 가공식품의 31%를 차지하고 이들 중 96%가 일본으로 수출되고 있으며, 일본에서는 셀룰로오스 물리적인 성질을 이용하여 고품질의 음향진동판을 사용한 스피커를 생산하여 연간 10만조 이상을 판매하고 있다. 또한 일본 통상성은 박테리얼 셀룰로오스의 대량생산 시스템의 확립 및 다양한 용도개발을 위해 활발한 연구가 진행되고 있다.

초산균이 셀룰로오스를 생산한다는 사실이 보고된 이래(Brown. A. J., J. Chem. Soc ., vol. 49, pp. 432-439, 1986), 미생물에 의해 생산되는 셀룰로오스(Bacterial Cellulose)는 신소재로서 끊임없는 연구 대상이 되어 왔다. 식물 유래의 셀룰로오스와 박테리얼 셀룰로오스(bacterial cellulose)는 구조적으로 커다란 차이를 나타내고 있다. 즉, 미생물 유래의 박테리얼 셀룰로오스는 리본형 섬유(ribbin-like bundles)로 구성되는 반면, 식물 유래의 셀룰로오스는 미세섬유(microfibrils)의 묶음(bundles) 형태로 구성된다.

초산균이 생성하는 셀룰로오스는 미세섬유(microfibrils)의 묶음(bundles) 형태로 구성되는 식물 유래의 셀룰로오스와는 달리 리그닌이나 헤미셀룰로오스가 전혀 포함되지 않은 순수상태로 생산되며, 고강도, 보수성, 유화 현탁 안정성 그리고 결착성 등이 뛰어난 특징(Ross R, et al., Microbiol . Reviews ., 325(15), 35-38, 1991)을 가질 뿐만 아니라 산업용 신소재로서 다양한 용도 개발이 가능하여 균주 개량에 의한 생산성 향상, 유전자 조작, 배양조건의 확립 등에 관한 연구결과, 고강도용 공업재료, 복합섬유, 의료용 재료 및 효소 고정화 등의 첨단 소재로 이용될 수 있다.

오늘날 셀룰로오스를 생산하는 균주로는 아세토박터 속(Acetobacter sp.), 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.), 리조비움 속(Rhizobium sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사르시나(Sarcina sp.) 속이 있으며, 특히 아세토박터 속(Acetobacter sp.) 중에 아세토박터 자이리눔(Acetobacter xylium), 아세토박터 파스테우리아누스(A. pasteurinanus) 및 아세토박터 한세니(A. hanseni)가 많이 알려져 있다. 최근 16S rRNA 염기서열을 이용하여 분자계통분류학적으로 재분류하고 있으며, 순도가 높은 셀룰로오스를 생성하는 균주의 특징은 형태학적으로 장간균이고, 내산성력이 약한 세균으로 균체에서 셀룰로오스를 분비하는 것으로 보고되어 있다.

글리세롤은 최근 바이오 디젤산업의 부산물로서 대량생산되고 있으며 폐기물로서 활용방법이 모색되어야 하는 실정이다.

종래의 셀룰로오스 생산에서 사용되는 탄소원은 포도당이 가장 대표적이 고(Masaoka S, et al., J. Fermen . Bioeng ., 75, 18-22, 1993), 다른 소재로 천연재료 중 감즙 및 감식초(Kim SY, et al., Appl Biochem Biotechnol ., 129-132, 705-15, 2006), 사과즙(Lee OS, et al., J. Kor . Soc . Food Sci . Nutr ., 31(4), 572-577, 2002), 포도즙(Son CJ, et al., J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 12(5), 722-728, 2002), 맥주폐액(Park JK, et al., Kor Chem Eng Res., 44(1), 52-57, 2006) 및 코코넛 부산물(Jonas R, et al., Polym Degrad Stab., 59, 101-106, 1998) 등이 활용되었으나 글리세롤로부터 셀룰로오스 생산에 관한 보고는 미비하며, 만일 글리세롤로부터 고부가가치의 셀루로오스 대량생산 방법이 확립되면 바이오디젤산업부산물인 폐글리세롤을 고부가가치화할 수 있을 것이다.

이에, 본 발명자들은 글리세롤로부터 셀루로오스를 생산하는 방법을 개발하고자 연구한 결과, 감식초에서 분리한 신규한 글루콘아세토박터 속 C1 균주(Gluconacetobacter sp. C1)가 박테리아 셀룰로오스 생산 배지에 탄소원으로서 글루코스를 대신하여 글리세롤을 첨가한 배지에서 셀룰로오스의 생산으로 막형성하는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규한 글루콘아세토박터 속 C1(Gluconacetobacter sp. C1) 균주 및 상기 미생물을 이용한 글리세롤을 탄소원으로 셀룰로오스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 글루콘아세토박터 속 C1(Gluconacetobacter sp. C1) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물을 이용하여 글리세롤로부터 셀룰로오스를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 글루콘아세토박터 속 C1(Gluconacetobacter sp. C1) 균주를 이용한 박테리얼 셀룰로오스 생산방법은 탄소원으로 글리세롤과 에탄올을 포함하여 생산수율이 향상되고 분리공정이 용이한 셀룰로오스의 제조방법을 제공하는 효과가 있다. 또한, 폐 글리세롤을 이용하여 셀룰로오스를 생산하는 경우, 발효 산업체로부터 산업 폐기물의 처리비용을 줄일 것이며 셀룰로오스 생산에 소요되는 원가를 절감할 수 있어 셀룰로오스의 상업적 생산이 가능하다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 신규한 글루콘아세토박터 속 C1(Gluconacetobacter sp. C1) 균주를 제공한다.

상기 균주는 탄소원을 이용하여 셀룰로오스를 생산하며, 이때 탄소원으로 단당류, 이당류, 삼당류, 다당류, 알코올류 및 유기산으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 이용하는 것이 바람직하고, 글리세롤을 이용하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 균주는 발효식품으로부터 분리되는 것이 바람직하고, 감식초로부터 분리되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 재래식으로 제조된 감식초로부터 박테리아 셀룰로오스 생산 배지에서 탄소원으로 글루코스를 대신하여 글리세롤을 첨가한 배지에서 셀룰로오스를 생산하는 단일 균주를 분리하였다.

본 발명자들은 상기 분리된 단일 균주의 16S rRNA의 전체 염기서열을 결정하여(Juke TH, Cantor CR : Evolution of protein molecules. In mammalian protein metabolism, Edited by HN, Munro p21, Academic Press. New York, 1969) 퍼센트 유사도와 계통수를 분석한 결과, 글루콘아세토박터 인터메디우스(Gluconacetobacter intermedius) 및 글루콘아세토박터 오보에디언스(Gluconacetobacter oboediens) 균주와 99.8%가 유사한 것을 확인하였다(도 1 및 서열번호 1 참조). 따라서 상기 균주를 글루콘아세토박터 속 C1(Gluconacetobacter sp. C1)이라고 명명하였고, 2008년 3월 6일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 내 유전자 은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11298BP).

본 발명자들은 상기 분리 및 동정된 균주가 글리세롤을 탄소원으로 이용하여 셀룰로오스를 생산하는지 알아보기 위하여, 상기 균주를 전배양한 배양액을 글리세롤이 포함된 새로운 배지에 접종한 후 배양하여 셀룰로오스 막 형성을 조사하였다. 그 결과 글루코스를 탄소원으로 하는 배지에서와 같이 글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 셀룰로오스의 형태로 막을 형성하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명은

1) 신규한 글루콘아세토박터 속 C1(Gluconacetobacter sp. C1) 균주를 전배양하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 전배양된 배양액을 탄소원을 포함하는 배지에 접종한 후 배양하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)에서 배양된 배지에 형성된 셀룰로오스 막을 회수하여 세척 및 여과하는 단계를 포함하는 셀룰로오스 생산방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 전배양은 25 내지 35℃에서 5 내지 10일간 배양하는 것이 바람직하고, 30℃에서 7일간 배양하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 상기 단계 2)의 탄소원은 단당류, 이당류, 삼당류, 다 당류, 알코올류 및 유기산으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 이용하는 것이 바람직하고, 글리세롤을 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 탄소원으로 글리세롤은 전체 배지에 대해 1.5 내지 3.0%의 농도로 포함되는 것이 바람직하고, 2.0%의 농도로 포함되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 셀룰로오스 생산을 위한 최적의 글리세롤 농도를 확립하기 위하여, 다양한 농도의 글리세롤에 따른 셀룰로오스 생성량을 조사하였다. 그 결과, 글리세롤의 농도가 2%가 될 때까지 점차 셀룰로오스의 생성량이 증가하였고, 2% 이후부터 점차 감소하였다. 특히, 글리세롤의 농도가 2%일 때 셀룰로오스가 가장 많이 생성되었으며, 이때 pH는 pH 6.0 내지 7.0이었다. 따라서 셀룰로오스 생산을 위한 최적 조건은 글리세롤의 농도가 2%이고, pH 6.0 내지 7.0임을 알 수 있었다(도 2 참조).

상기 탄소원으로 글리세롤에 추가적으로 에탄올을 첨가하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 에탄올은 전체 배지에 대해 2.0 내지 5.0% 농도로 포함되는 것이 바람직하고, 2.5% 농도로 포함되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 셀룰로오스 생산을 위한 최적의 에탄올 농도를 확립하기 위하여, 일정한 글리세롤에 다양한 농도의 에탄올을 첨가함에 따른 셀룰로오스 생성량을 조사하였다. 그 결과, 에탄올의 농도가 0.5%에서 2.5%가 될 때까지 점차 셀룰 로오스의 생성량이 증가하였고, 2.5% 이후부터 점차 감소하였다. 특히, 에탄올의 농도 2.5%일 때 셀룰로오스가 최대로 가장 많이 생성되었으며, 이때 pH는 pH 7.0 내지 8.0이었다. 따라서 셀룰로오스 생산을 위한 최적 조건은 에탄올 농도 2.5% 및 pH 7.0 내지 8.0임을 알 수 있었다(도 3 참조).

또한, 본 발명자들은 셀룰로오스 생산 최적 조건을 확립하기 위하여, 탄소원으로 포도당, 글리세롤, 설탕 및 이들에 각 에탄올을 이용한 배지에서 셀룰로오스 생성량을 비교하였다. 그 결과, 탄소원으로 글리세롤을 이용한 경우, 포도당 및 설탕을 이용한 경우에 비해 셀룰로오스 생성량이 1.5 내지 2배 증가하였다. 또한, 포도당, 글리세롤 및 설탕만을 이용한 경우에 비해 이들에 에탄올을 추가로 포함시킨 경우 각각 1.1 내지 2배 증가하였다. 따라서, 따라서 셀룰로오스 생산을 위한 최적 조건은 글리세롤에 에탄올을 첨가한 배지를 이용하는 것임을 알 수 있었다(표 4 참조).

본 발명에 의하면 배양액 중에 에탄올을 함유함으로써 배양액 중 셀룰로오스를 생산하지 않는 돌연변이주의 발생을 억제하고 덩이 형태의 셀룰로오스 생성을 촉진하도록 유도하여 셀룰로오스 생산수율을 증대시키는 것이 가능하고, 셀룰로오스 생산을 위한 연속배양 공정을 수행함으로써 셀룰로오스의 생산성을 극대화하는 것이 가능하다.

본 발명자들은 상기 균주를 이용하여 글리세롤로부터 셀룰로오스의 대량생산이 가능한지 알아보기 위하여, 상기의 최적 조건에서 대량생산을 수행한 후 생성된 셀룰로오스의 무게를 측정하였다. 그 결과, 균체를 포함하는 셀룰로오스의 중량과 순수한 셀룰로오스의 중량이 각각 2236.9 g 및 1731.2 g인 셀룰로오스를 생산하였다(도 4 참조).

이전의 논문(Kim SY, et al., Appl Biochem Biotechnol, 2006 Spring; 129-132:705-715)에서는 글루콘아세토박터 RKY5가 글리세롤로부터 셀룰로오스를 생산하는 것을 보여주고 있다.

이에, 본 발명자들은 본 발명의 균주의 글리세롤로부터 박테리아 셀룰로오스 생성량과 상기 논문에 기재된 생성량을 비교하였다. 그 결과, 본 발명에서 생성된 박테리아 셀룰로오스 양은 DW 1 L에 글리세롤 20 g이 들어간 배지를 사용하여 1 L당 16 g의 박테리아 셀룰로오스를 생성하였으나, 상기 논문에서는 DW 1 L에 글리세롤 15 g의 배지로 4.59 g의 셀룰로오스를 생성하였다. 따라서 본 발명은 글리세롤에서 셀룰로오스의 전환비율이 80%였으며, 논문에서의 26%와 비교하여 3배 이상 높은 것을 알 수 있다.

따라서 본 발명의 미생물을 이용하여 글리세롤로부터 셀룰로오스 생산이 가능하여 폐 글리세롤을 배지로 이용함으로써 생산비용을 절감할 수 있다. 또한, 상기 글리세롤에 에탄올을 추가적으로 포함하고, 최적 조건을 확립함으로써 셀룰로오스 생산의 수율을 향상시킬 수 있어, 폐 글리세롤을 이용한 박테리얼 셀룰로오스의 대량생산에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 의해서 한정되지는 않는다.

< 실시예 1> 균주의 분리 및 동정

본 발명자들은 하기 표 1과 같은 조성의 pH 5.0의 배지용액을 준비하였으며, 배지 용액을 121℃에서 15분간 멸균한 후 250 ml 삼각플라스크에 50 ml씩 분주하고 재래식으로 제조된 감식초(청산농원, 경북 청도군)를 1% 첨가하여 30℃에서 정치배양시킨 후 셀룰로오스 막을 형성하는 배양액을 생리식염수에 희석하여 1차 균체 배양액으로 배지에 한천(Difco, 미국) 1.5%를 첨가하여 만든 고형 배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다. 고형 배지에 형성된 콜로니를 상기 방법과 동일하게 5회 이상 반복함으로써 미생물 셀룰로오스를 생산할 수 있는 단일 균주를 분리하였다.

성분	양(/L)
글리세롤(glycerol)(Difco 사, 미국)	20 ml
펩톤(Peptone)(Difco 사, 미국)	5 g
효모 추출물(Yeast extract)(Difco 사, 미국)	5 g
시트르산(citric acid)(대정, 한국)	1.115 g
인산수소이나트륨(Disodium hydrogenphosphate)(Junsei 사, 일본)	6.8 g

상기 분리된 단일 균주의 16S rRNA의 전체 염기서열을 결정하여(Juke TH, Cantor CR : Evolution of protein molecules. In mammalian protein metabolism, Edited by HN, Munro p21, Academic Press. New York, 1969) 퍼센트 유사도와 계통수를 분석한 결과, 글루콘아세토박터 인터메디우스(Gluconacetobacter intermedius) 및 글루콘아세토박터 오보에디언스(Gluconacetobacter oboediens) 균주와 99.8%가 유사하였으며, 도 1에서 보는 바와 같은 계통도로 나타낼 수 있었다(도 1 및 서열번호 1). 따라서 상기 균주를 글루콘아세토박터 속 C1(Gluconacetobacter sp. C1)이라고 명명하였고, 2008년 3월 6일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 내 유전자 은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11298BP).

< 실시예 2> 글리세롤에서 셀룰로오스 생산

121℃에서 15분간 멸균한 후 250 ml 삼각플라스크에 하기 표 1과 같은 배지용액(pH 5)을 100 ml씩 분주한 후, 상기 <실시예 1>에서 분리한 글루콘아세토박터 속 C1 균주를 접종하고 30℃ 배양기에서 7일간 전배양하였다. 상기 전배양 용액을 원심분리(10,000 rpm, 20 min)하여 얻은 균체를 50 ml의 증류수에 현탁하고, 글리세롤이 농도별(0, 0.5, 1.0, 2.0, 2.5 및 3.0%)로 첨가된 하기 표 2의 배지(용기크기: 7 cm × 7 cm × 5 cm, 용기양: 150 ml)를 100 ml씩 분주한 다음 현탁액을 1%씩 접종하여 30℃에서 14일간 정치 배양하였다.

배양 후 상층의 셀룰로오스막을 회수하여 증류수 세척 및 여과(Filter paper No 2, 토요로시가이샤, 일본)하였고, 균체가 포함된 셀룰로오스의 건조중량을 먼저 구하였다. 그 후 균체가 포함된 셀룰로오스에 1 g당 5 ml의 0.3 N 수산화나트륨용액을 첨가하여 20분 동안 95℃에서 끓여 균체를 모두 용해시켜 셀룰로오스의 색깔이 반투명 흰색이 될 때까지 반복하였다. 균체가 제거된 순수 셀룰로오스는 중성이 될 때까지 충분히 세척한 후 다시 여과를 하고 그 무게를 측정하였다. 균체가 포함된 셀룰로오스의 중량과 셀룰로오스의 중량의 차이로 균체의 중량을 측정하였다.

성분	양(/L)
글리세롤(Sigma 사, 미국)	0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 ml
펩톤(Peptone)(Difco 사, 미국)	5 g
효모추출물(Yeast extract)(Difco 사, 미국)	5 g
시트르산(Citric acid)(대정, 한국)	1.115 g
인산수소이나트륨(Disodium hydrogenphosphate)(Junsei 사, 일본)	6.8 g

측정 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 글리세롤의 농도가 2%가 될 때까지 점차 셀룰로오스의 생성량이 증가하였고, 2% 이후부터 점차 감소하였다. 특히, 글리세롤의 농도가 2%일 때 최대인 3.6 g의 셀룰로오스가 생성되어 셀룰로오스 생산을 위한 최적조건은 글리세롤의 농도가 2%일 때임을 알 수 있었다. 한편, 이때 pH 값은 거의 일정하게 pH 6.0 ~ 6.5를 나타내었다(도 2).

< 실시예 3> 글리세롤 배지에 농도별 에탄올 첨가 효과

상기 표 1과 같은 배지용액을 121℃에서 15분간 멸균한 후 250 ml 삼각플라스크에 100 ml을 분주하고 상기 <실시예 1>에서 분리한 글루콘아세토박터 속 C1 균주를 접종하여 30℃ 배양기에서 7일간 정치하여 전배양하였다. 상기 전배양 용액을 원심분리(10,000 rpm, 20 min)하여 얻은 균체를 50 ml의 증류수로 현탁하여 에탄올을 농도별(0, 0.5, 1.0, 2.0, 2.5 및 3.0%)로 포함하는 표 3의 배지(용기크기: 7 cm × 7 cm × 5 cm, 용기양: 150 ml)를 100 ml씩 분주한 다음 현탁액을 1%씩 접종하여 30℃에서 14일간 정치 배양하였다.

배양 후 상층의 셀룰로오스 생성막을 회수하여 증류수 세척 및 여과(Filter paper No 2, 토요로시가이샤, 일본)하였고, 그 후 균체가 포함된 셀룰로오스의 중량을 먼저 구하였다. 그 후 균체가 포함된 셀룰로오스에 1 g당 5 ml의 0.3 N 수산화나트륨용액을 첨가하여 20분 동안 95℃에서 끓여 균체를 모두 용해시켜 셀룰로오스의 색깔이 반투명 흰색이 될 때까지 반복하였다. 균체가 제거된 순수 셀룰로오스는 중성이 될 때까지 충분히 세척한 후 다시 여과를 하고, 그 무게를 측정하였다. 균체가 포함된 셀룰로오스의 중량과 셀룰로오스의 중량의 차이로 균체의 중량을 측정하였다.

성분	양(/L)
글리세롤(Sigma 사, 미국)	20 ml
펩톤(Peptone)(Difco 사, 미국)	5 g
효모추출물(Yeast extract)(Difco 사, 미국)	5 g
시트르산(Citric acid)(대정, 한국)	1.115 g
인산수소이나트륨(Disodium hydrogenphosphate)(Junsei 사, 일본)	6.8 g
에탄올	0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 ml

측정 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 글리세롤을 2% 포함하는 배지에서, 에탄올의 농도가 0.5%에서 2.5%가 될 때까지 점차 셀룰로오스의 생성량이 증가하였고, 2.5% 이후부터 점차 감소하였다. 특히, 에탄올의 농도 2.5%일 때 최대인 25 g의 셀룰로오스가 생성되어 셀룰로오스 생산을 위한 최적조건은 글리세롤 농도 2%에 에탄올 농도 2.5%를 추가적으로 첨가했을 때임을 알 수 있었다. 한편, pH 값은 최대의 셀룰로오스가 생산될 때, pH 3.5 ~ 4.0인 것을 알 수 있었다(도 3).

< 실시예 4> 탄소원에 따른 배지에서의 셀룰로오스 생산량 측정

121℃에서 15분간 멸균한 후 250 ml 삼각플라스크에 상기 표 2와 같은 배지용액(pH 5)을 100 ml씩 분주하여 상기 <실시예 1>에서 분리한 글루콘아세토박터 속 C1 균주를 접종하여 30℃ 배양기에서 7일간 전배양하였다. 상기 전배양 용액을 원심분리(10,000 rpm, 20 min)하여 얻은 균체를 50 ml의 증류수에 현탁한 후 포도당, 글리세롤 및 설탕을 2% 포함하는 SH(Schenk 및 Hildebrandt) 배지(용기크기: 7 cm × 7 cm × 5 cm, 용기양: 150 ml)와 각각의 배지에 에탄올을 2% 함께 첨가한 배지를 100 ml씩 분주한 다음 현탁액을 1%씩 접종하여 30℃에서 14일간 정치 배양하였다.

상기 배양 후 상층의 셀룰로오스 생성막을 회수하여 증류수 세척 및 여과(Filter paper No 2, 토요로시가이샤, 일본)하였고, 그 후 균체가 포함된 셀룰로오스의 중량을 먼저 구하였다. 균체가 포함된 셀룰로오스에 1 g당 5 ml의 0.3 N 수산화나트륨용액을 첨가하여 20분 동안 95℃에서 끓여 균체를 모두 용해시켜 셀룰로오스의 색깔이 반투명 흰색이 될 때까지 반복하였다. 균체가 제거된 순수 셀룰로오스는 중성이 될 때까지 충분히 세척한 후 다시 여과를 하고 그 무게를 측정하였다. 균체가 포함된 셀룰로오스의 중량과 셀룰로오스의 중량의 차이로 균체의 중량을 측정하였다.

	중량(g)		최종 pH
	균체 포함 셀룰로오스	셀룰로오스	최종 pH
포도당	12.21 ±1.12	7.10 ± 0.59	6.45±0.21
글리세롤	18.39± 0.32	13.52 ±1.83	5.98±0.45
설탕	13.30± 0.59	7.69 ±1.58	6.42±0.03
포도당+에탄올	23.12± 3.29	16.90 ±0.60	4.19±0.05
글리세롤+에탄올	25.82± 1.61	20.37 ±0.87	5.12±0.17
설탕+에탄올	14.42± 0.93	12.56 ±2.29	4.25±0.06

측정 결과, 표 4에서 보는 바와 같이 균체 및 셀룰로오스의 중량과 셀룰로오스 중량은 각각 포도당의 경우 12.2 g과 7.1 g로 나타났고, 글리세롤의 경우는 18.4 g 와 13.5 g으로 나타났으며, 설탕의 경우는 13.0 g과 7.7 g로 나타나 글리세롤을 탄소원으로 2% 포함하는 배지에서 균체 포함 셀룰로오스 및 셀룰로오스와 셀룰로오스 중량이 컸다. 또한, 포도당, 글리세롤, 설탕 등의 탄소원을 2% 포함하고 에탄올을 2% 더 포함시킨 배지에서는 균체 포함된 셀룰로오스 및 셀룰로오스의 중량은 각각 포도당은 23.1 g 및 16.9 g 이었고, 글리세롤은 23.8 g 및 20.4 g로 나타났으며, 설탕은 14.4 g 및 12.0 g로 나타나 글리세롤과 에탄올을 2%씩 함유하는 배지에서 셀룰로오스 생성 정도가 가장 높은 것을 알 수 있었다(표 4).

< 실시예 5> 글리세롤과 에탄올을 포함하는 배지에서의 셀룰로오스 대량생산

상기 표 1과 같은 배지 용액을 121℃에서 15분간 멸균한 후 250 ml 삼각플라스크에 100 ml을 분주하고 상기 <실시예 1>에서 분리한 글루콘아세토박터 속 C1 균주를 접종하여 30℃ 배양기에서 7일간 정치하여 전배양하였다. 상기 전배양 용액을 원심분리(10,000 rpm, 20 min)하여 균체를 50 ml의 증류수로 현탁한 다음, 29.5 × 21.5 × 8.5(4.7 L) 용기에 글리세롤 2%, 에탄올 2%를 포함하는 총량 2.5 L 배지에 분리한 균주를 1% 접종하여 30℃에서 14일간 정치 배양하였다.

배양 후 상층의 셀룰로오스 생성막을 회수하여 증류수 세척 및 여과(Filter paper No 2, 토요로시가이샤, 일본)하였고, 균체가 포함된 셀룰로오스의 중량을 먼저 구하고, 균체가 포함된 셀룰로오스 1 g당 5 ml 양의 0.3 N 수산화나트륨용액을 첨가하여 20분 동안 95℃에서 끓여 균체를 모두 용해시켜 셀룰로오스의 색깔이 반투명 흰색이 될 때까지 반복하였다. 균체가 제거된 순수 셀룰로오스는 중성이 될 때까지 충분히 세척한 후 다시 여과를 하고 그 무게를 측정하였다. 균체가 포함된 셀룰로오스의 중량과 셀룰로오스의 중량의 차이로 균체의 중량을 측정하였다.

측정 결과, 글리세롤을 포함하는 배지에서의 균체를 포함하는 셀룰로오스의 중량과 셀룰로오스의 중량은 각각 2236.9 g 및 1731.2 g으로 나타났으며, 최종 pH는 3.86으로 나타났다(도 4).

또한, 건조 셀룰로오스 중량으로는 계산했을 때 2.5 L 배지에 39.83 g이 생성된 것으로, 이는 이전의 논문(Kim SY, et al., Appl Biochem Biotechnol, 2006 Spring; 129-132:705-715)과 비교하면, 글리세롤로부터 박테리아 셀룰로오스 생성양에서 큰 차이를 보인다. 본 발명에서 생성된 박테리아 셀룰로오스 양은 DW 1L에 글리세롤 20g이 들어간 배지를 사용하여 1 L당 16 g의 박테리아 셀룰로오스를 생성하였다. 그러나, 상기 논문에서는 DW 1 L에 글리세롤 15 g의 배지로 4.59 g의 셀룰로오스를 생성하였다. 따라서 본 발명은 글리세롤에서 셀룰로오스의 전환비율이 80%였으며, 논문에서의 26%와 비교하여 3배 이상 높았다.

본 발명은 탄소원으로 글리세롤을 이용하여 셀룰로오스를 생산하여 발효 산업체로부터 산업 폐기물의 처리비용을 줄일 것이고 셀룰로오스 생산에 소요되는 원가를 절감할 수 있어 셀룰로오스의 상업적 생산이 가능하며, 상기 셀룰로오스 생산을 위한 최적 조건를 확립하여 생산수율을 향상시킬 수 있다.

도 1은 셀룰로오즈를 생성하는 분리 균주인 글루콘아세토박터 속 C1(Gluconacetobacter sp. C1)의 계통도를 나타내는 그림이다.

도 2는 글리세롤을 탄소원으로 이용하고, 이를 농도별로 첨가한 배지에서의 글루콘아세토박터 속 C1 균주의 셀룰로오스 생산량을 나타내는 그림이다.

도 3은 글리세롤을 탄소원으로 이용하고, 에탄올을 농도별로 첨가한 배지에서의 글루콘아세토박터 속 C1 균주의 셀룰로오스 생산량을 나타내는 그림이다.

도 4는 글리세롤을 포함하는 배지에서의 최적 조건에 따라 생성된 셀룰로오스를 나타내는 그림이다:

A: 0.3N 수산화나트륨 처리 전; 및

B: 0.3N 수산화나트륨 처리 후.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel Gluconacetobacter sp. C1 strain and a production method of cellulose using thereof <130> 8p-05-002 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 905 <212> DNA <213> Gluconacetobacter sp. C1 <400> 1 agtcgcacga acctttcggg gttagtggcg gacgggtgag taacgcgtag ggatctatcc 60 atgggtgggg gataactttg ggaaactgaa gctaataccg catgacacct gagggtcaaa 120 ggcgcaagtc gcctgtggag gaacctgcgt tcgattagct agttggtggg gtaaaggcct 180 accaaggcga tgatcgatag ctggtctgag aggatgatca gccacactgg gactgagaca 240 cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gcaagcctga 300 tccagcaatg ccgcgtgtgt gaagaaggtt ttcggattgt aaagcacttt cagcggggac 360 gatgatgacg gtacccgcag aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat 420 acgaaggggg caagcgttgc tcggaatgac tgggcgtaaa gggcgcgtag gcggttgaca 480 cagtcagatg tgaaattccc gggcttaacc tgggggctgc atttgatacg tggcgactag 540 agtgtgagag agggttgtgg aattcccagt gtagaggtga aattcgtaga tattgggaag 600 aacaccggtg gcgaaggcgg caacctggct catgactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg 660 ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgctgta aacgatgtgt gctggatgtt 720 gggtgacttt gtcattcagt gtcgtagtta acgcgataag cacaccgcct ggggagtacg 780 gccgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgt 840 ttaattcgaa gcaacgcgca gaccttacca ggcttgacat gcggaggccg tgtcagagat 900 gggca 905

Claims

탄소원으로부터 셀룰로오스를 생산하는 수탁번호 KCTC 11298BP로 기탁된 글루콘아세토박터 속 C1(Gluconacetobacter sp. C1) 균주.
제 1항에 있어서, 상기 균주는 탄소원으로 글리세롤(glycerol)을 이용하는 것을 특징으로 하는 글루콘아세토박터 속 균주.
제 1항에 있어서, 상기 균주는 감식초로부터 분리된 것을 특징으로 하는 글루콘아세토박터 속 균주.
1) 제 1항의 균주를 전배양하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 전배양된 배양액을 탄소원을 포함하는 배지에 접종한 후 배양하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)에서 배양된 배지에 형성된 셀룰로오스 막을 회수하여 세척 및 여과하는 단계를 포함하는 셀룰로오스 생산방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 1)의 전배양은 25 내지 35℃에서 5 내지 10일간 배양하는 것을 특징으로 하는 셀룰로오스 생산방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 2)의 탄소원은 글리세롤인 것을 특징으로 하는 셀룰로오스 생산방법.
제 6항에 있어서, 상기 글리세롤은 전체 배지에 대해 1.5 내지 3.0%의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 셀룰로오스 생산방법.
제 7항에 있어서, 상기 글리세롤은 전체 배지에 대해 2.0%의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 셀룰로오스 생산방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 2)의 탄소원은 글리세롤에 추가적으로 에탄올을 첨가한 것을 특징으로 하는 셀룰로오스 생산방법.
제 9항에 있어서, 상기 에탄올은 전체 배지에 대해 2.0 내지 5.0% 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 셀룰로오스 생산방법.
제 10항에 있어서, 상기 에탄올은 전체 배지에 대해 2.5% 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 셀룰로오스 생산방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 2)의 배양은 25 내지 35℃에서 10 내지 15일간 배양하는 것을 특징으로 하는 셀룰로오스 생산방법.