CN105505896A

CN105505896A - 一种转葡糖苷酶的制备方法

Info

Publication number: CN105505896A
Application number: CN201610086467.1A
Authority: CN
Inventors: 王方明; 谢永强; 徐保弟; 张宇
Original assignee: Jinan Kinfi Biotechnology Co Ltd; SHANGHAI KINRY FOOD INGREDIENTS CO Ltd
Current assignee: Jinan Kinfi Biotechnology Co Ltd; SHANGHAI KINRY FOOD INGREDIENTS CO Ltd
Priority date: 2016-02-16
Filing date: 2016-02-16
Publication date: 2016-04-20

Abstract

本发明涉及一种转葡糖苷酶的制备方法，主要解决低聚异麦芽糖生产中转苷率低的技术问题。为解决上述问题，本发明的技术方案为：以黑曲霉菌株（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC？No.3.6478）为原始菌株，采用液体发酵培养基，并特别添加诱导物，经斜面培养、摇瓶扩大培养、液体深层发酵、离心分离四个步骤诱导黑曲霉分泌大量的高效转葡糖苷酶，制得高密度转葡糖苷酶发酵液。产品可应用于低聚异麦芽糖生产的关键步骤-转化阶段。

Description

一种转葡糖苷酶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种转葡糖苷酶的制备方法，具体涉及一种高转苷能力的转葡糖苷酶的制备方法，属于酶制剂领域和食品添加剂领域。

背景技术

转葡糖苷酶（Glucosyltransferase，EC2.4.1.24），也称α-转移葡萄糖苷酶、α-葡萄糖转苷酶、某些场合也称作α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidase，EC3.2.1.20）、α-葡萄糖苷酶、麦芽糖酶。转葡糖苷酶可以切开麦芽糖和低聚麦芽糖等糖分子结构中α-1,4糖苷键，并将游离出来α-D-葡萄糖残基转移到另一个α-D-葡萄糖分子或麦芽糖分子中的α-1,6位上，是生产低聚异麦芽糖的关键酶制剂。

低聚异麦芽糖（IMO）是一种功能性低聚糖，具水溶性膳食纤维功能、低热量、预防龋齿等特性，现已成为大多数健康食品的必需成分，随着低聚糖需求量日益增加，同时转葡糖苷酶的用量也大幅度增加，对转葡糖苷酶的产量和质量等提出了更高的要求。

目前国内市场的转葡糖苷酶产品存在的两方面的不足：

第一，生产过程中使用的转葡糖苷酶制剂在国内生产领域几乎处于空白，主要依赖进口，价格昂贵、来源不稳定；第二，工业所用的转葡糖苷酶在低聚异麦芽糖生产中，转化率较低，一般在30%-50%，如日本天野制药-株式会社属首家生产转葡糖苷酶制剂，生产工艺及其成熟，但其转葡糖苷酶制剂对低聚异麦芽糖转化率也只有50%，工业上生产低聚异麦芽糖时，必须提取、纯化、加工转化产物产品，才能得到高纯度的低聚异麦芽糖。因此，国内低聚异麦芽糖产品只有50%纯度的IMO-500和90%纯度的IMO-900两种型号。

转葡糖苷酶催化生成低聚异麦芽糖的效率称为转苷率，企业用转葡糖苷酶的转苷率一般为30%-50%，因此高转苷率的转葡糖苷酶有利于降低生产成本，提高低聚麦芽糖的产量。因此急需开发一种可生产高纯度低聚异麦芽糖的转葡糖苷酶。

发明内容

本发明目的在于提供一种高转苷率的转葡糖苷酶的制备方法，使用该方法可制得转苷率高达65%的转葡糖苷酶粗液，以解决低聚异麦芽糖生产中转苷率低的问题。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：一种转葡糖苷酶的制备方法，

以黑曲霉菌株（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCCNo.3.6478）为出发菌株，采用液体发酵培养方式，经过大量发酵基配方优化实验，得到转苷率高的转葡糖苷酶制剂，具体操作步骤如下：

（1）斜面培养

在装有察氏固体培养基的试管中接入黑曲霉菌株，30℃静置培养7天，制得成熟孢子，加无菌水制得斜面孢子悬浮液；

（2）摇瓶扩大培养

在装有PDY培养基的摇瓶中接入斜面孢子悬浮液，在32℃、150r/min条件下培养，得摇瓶孢子悬浮液；

（3）液体深层发酵

按10%质量百分浓度摇瓶孢子悬浮液的量接种于经高压灭菌后的优化液体发酵培养基进行培养；其中：所述的优化发酵培养基配方由下述重量百分含量组成：蔗糖5-12%，蛋白胨2-8%，酵母提取物0.1-0.5%，K₂HPO₄0.1-1%，NaCl0.1-1%，MgSO₄0.01-0.05%，并特别添加诱导物N-甲基-D-葡萄糖胺0.01-0.05%，然后溶于纯水，经混合均匀制得；所述摇瓶发酵温度在28-32℃，180r/min；优选的配方为：蔗糖7%，蛋白胨5%，酵母提取物0.3%，K₂HPO₄0.5%，NaCl0.5%，MgSO₄0.02%，N-甲基-D-葡萄糖胺0.05%，余量纯水；

（4）发酵液经高速离心，取上清液即得转葡糖苷酶粗酶液。

利用本发明制得的转葡糖苷酶有如下特征：

1、pH稳定性：该酶在温度55℃，pH范围4.5-7.0时可稳定30min，最适pH6.5；

2、热稳定性：该酶在pH值6.0条件下，分别以不同温度处理30min所得结果：55℃时该酶仍保留其初始活性的90%，而在70℃时则为70%。

本发明的有益效果：本发明特别添加诱导物N-甲基-D-葡萄糖胺，可刺激黑曲霉大量分泌转葡糖苷酶。该酶可应用于低聚异麦芽糖生产的关键步骤-转化阶段，明显提高了反应速率，低聚异麦芽糖转化率约为65%，远高于一般转葡糖苷酶的50%转化率，缩短了反应时间，也为后续的提纯工序节约了成本，减少生产时间，降低了企业生产成本，解决了低聚异麦芽糖生产中转化率低的问题。

附图说明

图1为本发明制备方法流程图。

图2为低聚异麦芽糖生产工艺流程示意图。

具体实施方式

实施例1

如图1所示，一种转葡糖苷酶的制备方法，按发明内容所述的生产步骤，黑曲霉经斜面培养7天后，制得成熟孢子，加无菌水制得斜面孢子悬浮液，接入装有PDY培养基摇瓶中，在32℃，150r/min条件下培养48h，按10%的比例在装有100ML液体培养基的500ML摇瓶中接入摇瓶孢子悬浮液。其中优化液体发酵培养基组分的重量百分含量如下：蔗糖10%，蛋白胨2%，酵母提取物0.3%，K₂HPO₄0.5%，N-甲基-D-葡萄糖胺0.05%，NaCl0.15%，MgSO₄0.02%，其余为水，经混合均匀制得，初始pH6.05，分别在28℃、29℃、30℃、31℃、32℃，180r/min条件下培养60h，取发酵液离心5000r/min，2分钟，取上清液检测酶活力，如表1。酶活检测方法（依据QB2525-2001《食品添加剂α-葡萄糖转苷酶》）（下同）进行测定。

表1不同温度下发酵培养对酶活的影响

酶活//培养温度	28℃	29℃	30℃	31℃	32℃
						酶活（u/ml）	19890	20558	21012	21050	21229

从表1可以看出，温度在28-32℃培养对酶活无明显差别，培养的温度可以控制在28-32℃

实施例2

如图1所示，一种转葡糖苷酶的制备方法，按发明内容所述的生产步骤，黑曲霉经斜面培养7天后，制得成熟孢子，加无菌水制得斜面孢子悬浮液，接入装有PDY培养基摇瓶中，在32℃，150r/min条件下培养48h，按10%的比例在装有100ML液体培养基的500ML摇瓶中接入摇瓶孢子悬浮液。其中优化液体发酵培养基组分的重量百分含量如下：蔗糖12%，蛋白胨2%，酵母提取物0.1%，K₂HPO₄0.1%，N-甲基-D-葡萄糖胺0.05%，NaCl0.5%，MgSO₄0.02%，其余为水，经混合均匀制得，初始pH6.02，在32℃，180r/min条件下培养60h。取发酵液离心5000r/min，2分钟，取上清液检测酶活力，同时采用不同诱导物N-甲基-D-葡萄糖胺用量（重量百分含量）作对照实验，如表2，

表2发酵配方中不同诱导物用量对发酵酶活的影响

酶活//诱导物量	0%	0.01%	0.02%	0.03%	0.04%	0.05%
							酶活（u/ml）	1500	18920	19935	20565	21980	22410

从表1可以看出，不同诱导物N-甲基-D-葡萄糖胺用量对发酵培养产酶有很大影响，用量在0.01~0.05%之间都可大幅提高酶活力。

实施例3

如图1所示，一种转葡糖苷酶的制备方法，按发明内容所述的生产步骤，黑曲霉经斜面培养7天后，制得成熟孢子，加无菌水制得斜面孢子悬浮液，接入装有PDY培养基摇瓶中，在32℃，150r/min条件下培养48h，按10%的比例在装有100ML液体培养基的500ML摇瓶中接入摇瓶孢子悬浮液。其中优化液体发酵培养基组分的重量百分含量如下：蔗糖5%，蛋白胨8%，酵母提取物0.5%，K₂HPO₄1%，N-甲基-D-葡萄糖胺0.05%，NaCl1%，MgSO₄0.05%，其余为水，经混合均匀制得，初始pH6.01，在32℃，180r/min条件下培养60h，取发酵液离心5000r/min，2分钟，取上清液检测酶活力，制得的粗酶液活力为20850u/ML。

实施例4

如图1所示，一种转葡糖苷酶的制备方法，按发明内容所述的生产步骤，黑曲霉经斜面培养7天后，制得成熟孢子，加无菌水制得斜面孢子悬浮液，接入装有PDY培养基摇瓶中，在32℃，150r/min条件下培养48h，按10%的比例在装有100ML液体培养基的500ML摇瓶中接入摇瓶孢子悬浮液。其中优化液体发酵培养基组分的重量百分含量如下：蔗糖7%，蛋白胨5%，酵母提取物0.3%，K₂HPO₄0.5%，N-甲基-D-葡萄糖胺0.05%，NaCl0.5%，MgSO₄0.02%，其余为水，经混合均匀制得，初始pH6.02，在32℃，180r/min条件下培养60h。制得的粗酶液经实测活力为22550u/ML。

实施例5

如图1所示，一种转葡糖苷酶的制备方法，按发明内容所述的生产步骤，黑曲霉经斜面培养7天后，制得成熟孢子，加无菌水制得斜面孢子悬浮液，接入装有PDY培养基摇瓶中，在32℃，150r/min条件下培养48h，按10%的比例将摇瓶孢子悬浮液接入发酵罐中。其中优化液体发酵培养基组分的重量百分含量如下：蔗糖7%，蛋白胨5%，酵母提取物0.3%，K₂HPO₄0.5%，N-甲基-D-葡萄糖胺0.05%，NaCl0.5%，MgSO₄0.02%，其余为水，经混合均匀制得，初始pH6.02，在32℃，180r/min，罐压0.05Mpa条件下培养72h。酶粗液的纯化浓缩依照下面步骤进行：

1）压滤：孔径1μm，操作压力为0.20MPa，温度20℃，取滤液；

2）微滤：孔径0.25μm，操作压力为0.25MPa，温度20℃，取滤液；

3）超滤：截留分子量为100KDa，操作压力为0.20MPa，温度20℃，取截留液，即纯化的浓缩酶液；经检测活力为311500u/ML。

实施例6

成品分析：取实施例5制备得到的转葡糖苷酶，另取市售同类产品作对照，采用现有常规生产流程，如图2所示以玉米淀粉为原料，制成30%（重量百分比）淀粉乳，pH6.0，加入耐高温α-淀粉酶，用量为10单位／克干淀粉，在105℃下液化至DE值为10，在130℃灭酶5分钟后，调节pH值为5.5，温度为58℃，加入真菌α-淀粉酶用量为20单位／克干淀粉和转葡糖苷酶（实施例5）300单位／克干淀粉，反应48小时，即得粗酶制品，在130℃灭酶5分钟后，添加硅藻土助滤剂后用板框过滤，滤液再经活性炭脱色，用板框过滤除炭、取滤液进强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂D001，收集流出液，再先后通过弱碱性苯乙烯系阴离子树脂D201和弱碱性苯乙烯系阴离子树脂D301、收集流出液，进行真空浓缩温度为55℃±3℃，糖液含量浓缩至75％即得低聚异麦芽糖浆，将精制后的糖液直接喷雾干燥即得粉末低聚异麦芽糖，根据GB/T20881-2007中低聚异麦芽糖含量测定方法，对粉末低聚异麦芽糖的含量进行检测，实验结果表明：优化工艺得到的转葡糖苷酶的低聚异麦芽糖转化率为60-65%；而市售产品中低聚异麦芽糖转化率仅为50%。

以上所述仅为本发明的优选实施案例和应用案例而已，并不局限于本发明，对于本领域及相关领域的科研与技术人员来说，本发明很容易有各种更改和变化。凡在本发明的思路和原则之内，所作的任何修改、等同替换、方法改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种转葡糖苷酶的制备方法，其特征是包括以下步骤：

（1）斜面培养

在装有察氏固体培养基的试管中接入黑曲霉菌株，静置培养制得成熟孢子，加无菌水制得斜面孢子悬浮液；

（2）摇瓶扩大培养

在装有PDY培养基的摇瓶中接入斜面孢子悬浮液，摇动培养，得摇瓶孢子悬浮液；

（3）液体深层发酵

按10%质量百分浓度摇瓶孢子悬浮液的量接种于经高压灭菌后的优化液体发酵培养基进行培养；其中：所述的优化发酵培养基配方由下述重量百分含量组成：蔗糖5-12%，蛋白胨2-8%，酵母提取物0.1-0.5%，K₂HPO₄0.1-1%，NaCl0.1-1%，MgSO₄0.01-0.05%，N-甲基-D-葡萄糖胺0.01-0.05%，余量纯水；

（4）发酵液经离心，取上清液即得转葡糖苷酶粗酶液。

2.根据权利要求1所述的一种转葡糖苷酶的制备方法，其特征是优化的发酵培养基配方由下列组分按照重量百分含量组成：蔗糖7%，蛋白胨5%，酵母提取物0.3%，K₂HPO₄0.5%，NaCl0.5%，MgSO₄0.02%，N-甲基-D-葡萄糖胺0.05%，余量纯水。