CN102666566A - 聚谷氨酸的受控合成 - Google Patents

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Abstract

本文公开了获得聚谷氨酸的方法。本文公开的方法是用于获得具有期望的重均分子量的聚谷氨酸的受控方法。

Description

聚谷氨酸的受控合成
相关申请
本申请要求于2009年12月16日提交的第61/287,129号美国临时申请的权益，包括任何附图在内的所述申请以整体形式通过引用并入本文。
背景
领域
本文一般公开了用于获得聚谷氨酸的方法。更具体地，本文公开了用于获得具有期望的重均分子量的聚谷氨酸的受控方法。
描述
谷氨酸是商业可获得的。然而，价格较为昂贵，每克约$350-$500(Sigma Aldrich Chemical Company)。高价格与合成具有特定分子量的聚谷氨酸的难度有关。通常，使用引发剂引发N-羧酸酐的聚合来获得聚谷氨酸。当认为达到特定分子量时，终止聚合反应。然而，难以预测何时终止反应从而获得聚谷氨酸的特定分子量。此外，难以制备具有低的多分散系数的聚谷氨酸。还难以大规模制备聚谷氨酸。
概述
本文公开的一些实施方案涉及制备聚谷氨酸的方法，其能用于获得具有期望的重均分子量的聚谷氨酸，所述重均分子量在窄的千道尔顿(kDa)范围内。除了以相对精度获得聚谷氨酸的期望的重均分子量之外，在某些实施方案中，所述方法比目前可行的商用方法更廉价。此外，在一些实施方案中，所述方法能用于在10g至1000g规模水平上获得聚谷氨酸。
一些实施方案能包括：获得具有等于或大于80kDa的第一重均分子量的起始聚谷氨酸；选择小于80kDa的聚谷氨酸的靶第二重均分子量；选择将所述起始聚谷氨酸的第一重均分子量有效降低至所述选定的聚谷氨酸的靶第二重均分子量的水解条件；以及在所述水解条件下水解所述起始聚谷氨酸，由此获得产物聚谷氨酸，其中所述产物聚谷氨酸的重均分子量在所述选定的靶第二重均分子量的约±10kDa之内。
一些实施方案能包括：获得具有等于或大于185kDa的第一重均分子量的起始聚谷氨酸；选择小于185kDa的聚谷氨酸的靶第二重均分子量；选择将所述起始聚谷氨酸的第一重均分子量有效降低至所述选定的聚谷氨酸的靶第二重均分子量的水解条件；以及在所述水解条件下水解所述起始聚谷氨酸，由此获得产物聚谷氨酸，其中所述产物聚谷氨酸的重均分子量在所述选定的靶第二重均分子量的约±10kDa之内。
下面将更详细地描述这些和其它实施方案。
附图简述
图1示出表示聚谷氨酸的重均分子量的曲线图，通过在30℃下，在包含HBr-AcOH的水解条件下，将具有191kDa的起始重均分子量的聚谷氨酸苄酯水解几小时获得所述聚谷氨酸。
图2示出表示聚谷氨酸的重均分子量的曲线图，通过在30℃下，在包含HBr-AcOH的水解条件下，将具有130kDa的起始重均分子量的两种聚谷氨酸苄酯样品水解几小时获得所述聚谷氨酸。
发明详述
I.定义
除非另有规定，则本文所用的所有技术术语和科学术语可以具有与本领域技术人员通常理解的相同涵义。除非另有规定，则本文提及的所有专利、申请、公开的申请和其它公开以它们的整体形势通过引入并入本文。如果对于本文术语有多个定义，则除非另有规定，在该章节的那些是占优的。
术语“聚谷氨酸”或“PGA”在本文根据本领域技术人员通常理解的常用涵义而使用。本领域技术人员应理解，在某些pH水平(例如，pH＞7)下，能由诸如钠的适当阳离子取代聚谷氨酸的侧羧酸基团所连接的氢。因此聚谷氨酸包括由谷氨酸单体单元组成的聚合物，其中侧羧酸被质子化或去质子化。聚谷氨酸的去质子化谷氨酸单体单元包括谷氨酸盐，例如，钠盐、钾盐、锂盐、钙盐、镁盐和铵盐(例如，四丁铵(TBA)、四丙铵(TPA)、十六烷基三甲铵、十二烷基三乙铵、四甲铵、四乙铵和三(羟基甲基)氨基甲烷盐)及其组合。
在一些实施方案中，羧酸基团的端基氢能由适当的保护基团取代。因此，聚谷氨酸包括未保护的聚谷氨酸和受保护的聚谷氨酸。适当的保护基团对于本领域技术人员而言是已知的。酯保护基团包括但不限于C1-C14烷基酯、C6-C10芳基酯和C7-C14芳烷基酯。聚谷氨酸的示例性保护基团包括但不限于，苯基酯、苄酯、烷基酯(例如甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、丁酯、叔丁酯和庚酯)以及本领域已知的任意其他的酯保护基团。例如参见Wuts和Greene，Greene’s Protective Groups inOrganic Synthesis(Greene的有机合成中的保护基团)；John Wiley andSons，2007。在一些实施方案中，保护基团能够为苄酯，例如苄型酯。
因此，术语“聚谷氨酸”或“PGA”为包括诸如聚谷氨酸盐和聚谷氨酸的变体的一般性术语，其中羧酸基团的氢已被抗衡离子和/或合适的保护基团取代。聚谷氨酸包括聚-α-谷氨酸和聚-γ-谷氨酸。例如，术语“聚谷氨酸”包括聚-α-谷氨酸-γ-(苄基)酯和聚-α-谷氨酸-γ-(叔丁基)酯。聚谷氨酸包括其中大于或等于75％的单体单元为谷氨酸单体单元的聚合物。
如本文所用，术语“水解”和“水解的”是指保护基团从聚谷氨酸裂解和/或聚谷氨酸的酰胺骨架键裂解。
如本文所用，术语“水解条件”是指导致水解的化学反应参数。示例性的水解条件参数包括但不限于时间、温度、溶剂和水解剂。示例性的水解剂包括但不限于酸性试剂、碱性试剂和/或酶试剂。水解条件通常在本领域中已知。例如参见Smith和March，March’s AdvancedOrganic Chemistry(March的高等有机化学)，John Wiley & Sons，2007，第1400-1411页。
如本文所用，术语“重均分子量”或
Figure BDA00001737914800041
能用于描述聚合物的分子量。重均分子量是产品的各部分的摩尔质量和其重量分数的乘积的总和。例如参见Young，Introduction to Polymers(聚合物简介)，Chapmanand Hall，1981，第8页；以及Stevens，Polymer Chemistry：AnIntroduction(聚合物化学：简介)，Oxford University Press，第35-37页。
如本文所用，术语“数均分子量”或
Figure BDA00001737914800042
能用于描述聚合物的分子量。数均分子量是产物的各部分的摩尔质量和其摩尔分数的乘积的总和。例如参见Young，Introduction to Polymers(聚合物简介)，Chapmanand Hall，1981，第5页；以及Stevens，Polymer Chemistry：AnIntroduction(聚合物化学：简介)，Oxford University Press，第35-37页。
如本文所用，术语“多分散系数”是指重均分子量与数均分子量的比。能够将多分散系数数学地表达为
Figure BDA00001737914800043
应理解，当本文规定数值范围时，范围旨在包括所规定的数值范围内的各个整数。例如，应理解，对于具有20kDa至25kDa的分子量的聚合物，这描述了具有20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa和25kDa的分子量的各种聚合物。同样，应理解，对于20℃至40℃的温度，这描述了为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃和40℃的各种温度。
应理解，在本文所述的具有一个或多个手性中心的任何化合物中，如果绝对立体化学未明确地指出，则各个中心可以独立地为R-构型或S-构型或其混合物。因此，本文规定的化合物可以为纯对映异构的或为立体异构混合物。此外，应理解，在本文描述的具有一个或多个能被定义为E或Z的产生几何异构体的双键的任意化合物中，各个双键可以独立地为E或Z或其混合物。同样地，还旨在包含所有的互变异构形式。
II.聚谷氨酸
本文公开了用于制备聚谷氨酸的方法。本文公开的一些实施方案涉及用于制备聚谷氨酸的方法，其能包括：获得具有等于或大于185kDa的第一重均分子量的起始聚谷氨酸；选择小于185kDa的聚谷氨酸的靶第二重均分子量；选择将所述起始聚谷氨酸的第一重均分子量有效降低至所述选定的聚谷氨酸的靶第二重均分子量的水解条件；以及在所述水解条件下水解所述起始聚谷氨酸，由此获得产物聚谷氨酸，其中所述产物聚谷氨酸的重均分子量在所述选定的靶第二重均分子量的约±10kDa之内。
在一些实施方案中，制备聚谷氨酸的方法能包括选择具有50kDa至500kDa的第一重均分子量的起始聚谷氨酸的步骤。制备聚谷氨酸的方法能包括选择具有高达100,000kDa的第一重均分子量的起始聚谷氨酸的步骤。
制备聚谷氨酸的方法能够包括选择分子量小于起始聚谷氨酸分子量的靶第二分子量聚谷氨酸的步骤。
制备聚谷氨酸的方法能包括选择将起始聚谷氨酸的重均分子量有效降低至靶第二重均分子量的酸性、碱性或酶水解条件的步骤。
制备聚谷氨酸的方法能产生具有更低重均分子量的产物聚谷氨酸，所述更低重均分子量为选定的靶第二重均分子量的约±5kDa至±50kDa之内。制备聚谷氨酸的方法能产生具有更低重均分子量的产物聚谷氨酸，所述更低重均分子量为选定的靶第二重均分子量的±1％至±10％之内。
A.起始聚谷氨酸
起始聚谷氨酸能从多种来源获得。例如，起始聚谷氨酸能从诸如Sigma-Aldrich Chemical Co.的商业来源而获得。或者，起始聚谷氨酸能为合成的。合成起始聚谷氨酸的适当方法对于本领域技术人员是已知的。合成起始聚谷氨酸的一种方法为通过谷氨酸酯单体与适当的引发剂反应。在方案1A中示出谷氨酸酯单体和引发剂之间的适当反应的实例。
方案1A：
Figure BDA00001737914800061
其中R为酯保护基团。能够使用本领域已知的或本文先前提及的任何酯保护基团。在一些实施方案中，R为C1-C14烷基、C6-C10芳基或C7-C14芳烷基。在一些实施方案中，R为苄基、苯基、叔丁基、异丙基、乙基或甲基。
例如，苄酯谷氨酸N-羧酸酐能与胺引发剂反应以产生聚谷氨酸苄酯聚合物，如方案1B所示。胺引发剂能为三乙胺(TEA)。能够在室温下在二噁烷中进行反应。
方案1B：
Figure BDA00001737914800062
i.起始聚谷氨酸分子量
与由水解产生的产物聚谷氨酸相比，起始聚谷氨酸具有更高的重均分子量。在一些实施方案中，起始聚谷氨酸具有等于或大于80kDa的第一重均分子量。在一些实施方案中，起始聚谷氨酸具有等于或大于100kDa的第一重均分子量。在一些实施方案中，起始聚谷氨酸具有等于或大于130kDa的第一重均分子量。在一些实施方案中，起始聚谷氨酸具有等于或大于150kDa的第一重均分子量。在一些实施方案中，起始聚谷氨酸具有等于或大于170kDa的第一重均分子量。在一些实施方案中，起始聚谷氨酸具有等于或大于185kDa的第一重均分子量。测定起始聚谷氨酸的重均分子量的方法对于本领域技术人员是已知的。各种方法包括但不限于使用合适的分子量检测技术(例如光散射)的体积排斥色谱-高压液相色谱(SEC-HPLC)、小角度中子散射(SANS)、X光散射和沉积速率。SEC-HPLC还可以称为凝胶渗透色谱(GPC)。如果用于测定聚谷氨酸聚合物的重均分子量的两种或多种方法产生不同的分子量值，则优选由SEC-HPLC获得的重均分子量值。在一些实施方案中，起始聚谷氨酸能够具有等于或大于190kDa的第一重均分子量。在其它实施方案中，起始聚谷氨酸能够具有等于或大于200kDa的第一重均分子量。在其它实施方案中，起始聚谷氨酸能够具有等于或大于220kDa的第一重均分子量。在其它实施方案中，起始聚谷氨酸能够具有等于或大于230kDa的第一重均分子量。在一些实施方案中，起始聚谷氨酸能够具有等于或大于240kDa的第一重均分子量。
在一些实施方案中，起始聚谷氨酸具有约50kDa至约500kDa的第一重均分子量。在一些实施方案中，起始聚谷氨酸具有约80kDa至约300kDa的第一重均分子量。在一些实施方案中，起始聚谷氨酸具有约80kDa至约130kDa的第一重均分子量。在一些实施方案中，起始聚谷氨酸具有约130kDa至约270kDa的第一重均分子量。在一些实施方案中，起始聚谷氨酸具有等于或大于80kDa的第一重均分子量。在一些实施方案中，起始聚谷氨酸具有等于或大于40kDa的第一重均分子量。
ii.聚合用引发剂
一般而言，方案1A所示的聚合引发剂为亲核试剂。此外，聚合引发剂优选具有物理性质，即能使引发剂与产物聚合物分离，或者另外使引发剂在完成聚合反应时从反应混合物中消除。示例性引发剂包括苄胺、正己胺、二乙胺、三乙胺、甲醇钠、N-苄基氨基甲酸钠、氢氧化钠、硼氢化钠、乙醇钠、丙醇钠、甲醇钾、乙醇钾、丙醇钾、叔丁醇钾、二异丙基乙胺、1，8-二氮杂二环[5，4，0]十一碳-7-烯(DBU)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、谷氨酸二甲酯和谷氨酸-γ-叔丁酯，或本领域已知的任意阴离子开环引发剂。
B.靶分子量
在一些实施方案中，选定的靶第二重均分子量等于或小于40kDa。在一些实施方案中，选定的靶第二重均分子量能为约40kDa至约12kDa。在其它实施方案中，选定的靶第二重均分子量能为约30kDa至约15kDa。在其它实施方案中，选定的靶第二重均分子量能为约25kDa至约20kDa。存在选择某一选定的靶重均分子量的多种理由。理由的非限制性的列举包括具有选定的靶重均分子量的聚谷氨酸的增加的溶解度，降低和/或防止聚谷氨酸从身体(例如，从肾脏)分泌，以及降低身体对聚谷氨酸的免疫应答。
此外，诸如体内降解时间、血液循环时间、生物相容性、毒性、抗原潜能、免疫原性刺激、生物稳定性、水解稳定性、酶稳定性、溶解度、渗透率、溶胀、玻璃化转变温度、熔融温度、分解分度、模量、抗张强度、弹性和扩散迁移的性能可以取决于选定的靶聚谷氨酸聚合物的分子量。
在一些实施方案中，选定的靶第二重均分子量能为约100kDa至约1kDa。在一些实施方案中，选定的靶第二重均分子量能为约100-80kDa、90-70kDa、80-60kDa、70-50kDa、60-40kDa、50-30kDa、40-20kDa、30-10kDa或20-1kDa。在一些实施方案中，选定的靶第二重均分子量能为约45-35kDa、40-35kDa、35-30kDa、30-25kDa、25-20kDa、22-17kDa、20-15kDa、15-10kDa、10-5kDa或5-2kDa。
在一些实施方案中，选定的靶第二重均分子量为30kDa±10％、29kDa±10％、28kDa±10％、27kDa±10％、26kDa±10％、25kDa±10％、24kDa±10％、23kDa±10％、22kDa±10％、21kDa±10％、20kDa±10％、19kDa±10％、18kDa±10％、17kDa±10％、16kDa±10％、15kDa±10％、14kDa±10％、13kDa±10％、12kDa±10％、11kDa±10％或10kDa±10％。
在一些实施方案中，选定的靶第二重均分子量为30kDa±5％、29kDa±5％、28kDa±5％、27kDa±5％、26kDa±5％、25kDa±5％、24kDa±5％、23kDa±5％、22kDa±5％、21kDa±5％、20kDa±5％、19kDa±5％、18kDa±5％、17kDa±5％、16kDa±5％、15kDa±5％、14kDa±5％、13kDa±5％、12kDa±5％、11kDa±5％或10kDa±5％。
在一些实施方案中，选定的靶第二重均分子量为约30kDa、29kDa、28kDa、27kDa、26kDa、25kDa、24kDa、23kDa、22kDa、21kDa、20kDa、19kDa、18kDa、17kDa、16kDa、15kDa、14kDa、13kDa、12kDa、11kDa或10kDa。
在一些实施方案中，选定的靶第二重均分子量小于40kDa。在一些实施方案中，选定的靶第二重均分子量小于30kDa。在一些实施方案中，选定的靶第二重均分子量小于20kDa。
C.水解条件
起始聚谷氨酸能水解产生产物聚谷氨酸。产物聚谷氨酸的重均分子量能够小于起始聚谷氨酸的重均分子量。水解起始聚谷氨酸的一种方法为通过使起始聚谷氨酸经过水解条件，如方案2所示。
方案2：
Figure BDA00001737914800091
其中，R表示酯保护基团；x和y表示整数；以及x大于y(即，x＞y)。
在一些实施方案中，产物谷氨酸能被质子化或去质子化。在一些实施方案中，产物聚谷氨酸包括谷氨酸盐残留物，例如钠盐、钾盐、锂盐、钙盐、镁盐和铵盐(例如，四丁铵(TBA)、四丙铵(TPA)、十六烷基三甲铵、十二烷基三乙铵、四甲铵、四乙铵和三(羟基甲基)氨基甲烷盐)。
在一些实施方案中，水解条件使保护基团从起始聚谷氨酸裂解。在一些实施方案中，水解条件使起始聚谷氨酸中的骨架酰胺键裂解。在一些实施方案中，水解条件使起始聚谷氨酸中的保护基团和骨架酰胺键都裂解。
各种条件能用于水解起始聚谷氨酸。选择合适的水解条件的适当方法对本领域技术人员是已知的。在一些实施方案中，水解条件包括酸的使用。合适的酸对本领域技术人员是已知的。在一些实施方案中，酸能为质子酸。例如，酸能为氢溴酸、盐酸和硫酸。若需要和/或期望，则酸能在质子溶剂中稀释，所述质子溶剂例如水、乙酸和/或二氯乙酸。在实施方案中，酸能为HBr-乙酸(HBr-AcOH)。在一些实施方案中，酸能具有约20％至约60％的质量比组分百分数。在其它实施方案中，酸能具有约30％至约40％的质量比组分百分数。在其它实施方案中，酸能具有约33％的质量比组分百分数。在一些实施方案中，能基于由实验产生的曲线来选择水解条件，其中使重均分子量大于选定的靶第二重均分子量的聚谷氨酸经历多种水解条件。这类曲线的实例在图1中示出。在一些实施方案中，用于产生曲线的聚谷氨酸能为商业上获得的。在其它实施方案中，例如能使用本文所述的步骤合成用于产生曲线的聚谷氨酸。
i.选择水解条件
水解条件包括导致聚谷氨酸聚合物的保护基团裂解和/或酰胺骨架键裂解的反应参数。示例性的水解条件参数包括但不限于水解剂、温度、时间、溶剂和浓度。能调节各种水解条件参数以产生具有靶重均分子量的产物聚谷氨酸聚合物。因此，选择合适的水解条件参数将产生具有靶重均分子量的产物聚谷氨酸。
例如，更高的水解温度通常增加聚谷氨酸水解的速率和/或量。因此，与选择较低的温度相比，选择较高的水解温度将趋于产生具有更低的重均分子量的产物聚谷氨酸。
此外，增加其中聚谷氨酸聚合物经过水解条件的时间量通常将增加聚谷氨酸的水解量。因此，与选择较短的时间相比，选择较长的水解时间将趋于产生具有更低的重均分子量的产物聚谷氨酸。
同样，使用较强的水解剂通常增加聚谷氨酸水解的速率和/或量。因此，与选择较弱的水解剂相比，选择较强的水解剂将趋于产生具有更低的重均分子量的产物聚谷氨酸聚合物。例如，与较弱的酸性试剂相比，较强的酸性试剂将趋于产生更低重均分子量的产物聚谷氨酸。同样地，与较弱的碱性试剂相比，较强的碱性试剂将趋于产生更低重均分子量的产物聚谷氨酸。
ii.水解剂
方案2中示出的水解条件包括酸性、碱性和酶条件。各种试剂能用于实现选定的水解条件以从起始聚谷氨酸产生具有靶重均分子量的期望的产物聚谷氨酸。
在一些实施方案中，使用了酸性水解条件。能够在pH为6至1的溶液中产生酸性条件。能产生酸性水解条件的试剂包括但不限于HCl、HBr、HF、HClO4、HClO3、HClO2、HClO、H2SO4、HNO3、H3PO4、乙酸、HCO2H、Cl2CHCO2H、阳离子交换树脂或其任意组合。
例如，方案2中示出的水解条件包括HBr和乙酸的Cl2CHCO2H混合物。在一些实施方案中，水解条件包括HCl和乙酸的Cl2CHCO2H混合物。
在一些实施方案中，使用了碱性水解条件。能够在pH为8至14的溶液中产生碱性条件。能产生碱性水解条件的试剂包括但不限于碱金属氢氧化物(例如，NaOH、KOH、LiOH、Ba(OH)2、Cu(OH)2)、t-BuOK、NaH、阴离子交换树脂或其任意组合。
在一些实施方案中，使用了酶催化水解条件。能够使用的酶包括但不限于酯酶(例如猪肝酯酶和源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的酯酶)、脱水酶(例如碳酸酐酶)、脂肪酶(例如猪胰脂肪酶、嗜热蛋白酶，以及源自雪白根霉(Rhizopus niveus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、南极假丝酵母(Candida antarcitica)和爪哇毛霉(Mucor javanicus)的脂肪酶)以及已知水解化学键的任何其它酶。
iii.温度
除了使用一种或多种水解剂，水解条件能够包括使起始聚谷氨酸聚合物经过升高的温度。在一些实施方案中，能使起始聚谷氨酸聚合物经过大于或等于约60℃的温度。在其它实施方案中，能使起始聚谷氨酸聚合物经过大于或等于约50℃的温度。在其它实施方案中，能使起始聚谷氨酸聚合物经过大于或等于约40℃的温度。在一些实施方案中，能使起始聚谷氨酸聚合物经过约40℃至约60℃的温度。或者，能使起始聚谷氨酸聚合物在室温约25℃下经过水解条件。在一些实施方案中，水解条件能包括-40℃至300℃的温度。
iv.时间
能使起始聚谷氨酸经过水解条件以持续多种时间量。在一些实施方案中，使聚谷氨酸聚合物经过水解条件，持续1至120分钟的时间段。在一些实施方案中，使聚谷氨酸聚合物经过水解条件，持续1至24小时的时间段。在一些实施方案中，使聚谷氨酸聚合物经过水解条件，持续约1天至约3天的时间段。在一些实施方案中，使聚谷氨酸聚合物经过水解条件，持续大约3天。应理解，当本文公开时间范围时，所述范围包括在规定时间范围内包含的各个整数及其小数部分。例如，1至2小时的时间范围为1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2.0小时的时间描述。
在一些实施方案中，水解条件能包括使起始聚谷氨酸聚合物经过第一温度，持续第一时间段，并且经过第二温度，持续第二时间段。例如，能使起始聚谷氨酸聚合物经过上述第一温度，持续第一时间段，并且经过上述第二温度，持续第二时间段，其中所述第一温度和第二温度不同。在一些实施方案中，第二温度低于第一温度。在其它实施方案中，第二温度高于第一温度。在其它实施方案中，第一和第二温度能基本相同。例如，能使起始聚谷氨酸聚合物经过约40℃至约60℃的第一温度，持续第一时间段，并且经过室温，持续第二时间段。
使起始聚谷氨酸经过第一温度和第二温度的时间能变化。例如，第一温度的时间段能不同于第二温度的时间段。例如，能使起始聚谷氨酸聚合物经过第一温度，持续第一时间段，所述第一时间段能大于或小于与第二温度相关的第二时间段。或者，第一和第二温度的时间段能大致相等。在一些实施方案中，第一时间段能等于或小于3小时。在其它实施方案中，第一时间段能等于或小于2小时。在其它实施方案中，第一时间段能等于或小于1小时。在一些实施方案中，第二时间段能等于或大于1小时。在其它实施方案中，第二时间段能等于或大于2小时。在其它实施方案中，第二时间段能等于或大于3小时。在其它实施方案中，第二时间段能等于或大于4小时。
在一些实施方案中，第一时间段为1分钟至120分钟。在一些实施方案中，第一时间段为1小时至24小时。在一些实施方案中，第一时间段为1天至3天。在一些实施方案中，第一时间段为大于3天。
在一些实施方案中，第二时间段为1分钟至120分钟。在一些实施方案中，第二时间段为1小时至24小时。在一些实施方案中，第二时间段为1天至3天。在一些实施方案中，第二时间段为大于3天。
能使起始聚谷氨酸聚合物经过选定的水解条件的总时间能够变化。在一些实施方案中，起始聚谷氨酸能在选定的水解条件下水解至少总计2小时。在其它实施方案中，起始聚谷氨酸能在选定的水解条件下水解至少总计2.5小时。在其它实施方案中，起始聚谷氨酸能在选定的水解条件下水解至少总计3小时。在其它实施方案中，起始聚谷氨酸能在选定的水解条件下水解至少总计4小时。在一些实施方案中，起始聚谷氨酸能在选定的水解条件下水解至少总计5小时、至少总计6小时或至少总计7小时。在其它实施方案中，起始聚谷氨酸能在选定的水解条件下水解小于总计8小时。
v.规模
能使多种量的起始聚谷氨酸聚合物经过本文所述的水解条件。本文所述的方法特别用于大规模生产。在一些实施方案中，在任一特定批次中，经过水解条件的起始聚谷氨酸聚合物的量为10g至100g。在一些实施方案中，在任一特定批次中，经过水解条件的起始聚谷氨酸聚合物的量为100g至1000g。在一些实施方案中，在任一特定批次中，经过水解条件的起始聚谷氨酸聚合物的量为1kg至10kg。
vi.溶剂
能使用任何适于聚谷氨酸水解的溶剂。在一些实施方案中，水解溶剂选自：二噁烷、苯甲醚、苯、氯仿、氯苯、乙酸乙酯、硝基苯、乙腈、二甲基甲酰胺、硝基甲烷、甲醇、乙酸、丙酮、正丁醇、乙酸丁酯、四氯化碳、环己烷、1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、二甲亚砜、乙醇、***、庚烷、己烷、甲醇、甲基叔丁基醚、甲基乙基酮、戊烷、正丙醇、异丙醇、二异丙醚、四氢呋喃、甲苯、三氯乙烯、水、二甲苯及其任意混合物。
优选的溶剂包括极性溶剂，例如，极性质子溶剂或极性非质子溶剂。能在选自水性溶剂、醇溶剂或其任意混合物的溶剂中进行水解条件。示例性溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、水或其任意混合物。优选的溶剂包括乙酸、二氯乙酸以及乙酸和二氯乙酸的混合物。
vii.测量水解程度
在一些实施方案中，监测聚谷氨酸的水解。例如，能进行测量以监测起始聚谷氨酸聚合物的水解程度。测量能用于测定是否产生聚谷氨酸的靶重均分子量。测量还能用于测定在过程的任选阶段中水解溶液中包含的聚谷氨酸的重均分子量。
能使用用于监测聚谷氨酸水解的多种技术。例如，能通过下述技术监测聚谷氨酸的水解，所述技术包括但不限于使用合适的分子量检测技术(例如光散射)的体积排斥色谱-高压液相色谱(SEC-HPLC)、小角度中子散射(SANS)、X光散射、沉积速率、体积排斥色谱、高性能液相色谱、气相色谱-质谱(GC/MS)、液相色谱-质谱(LC/MS)、基质辅助激光解析/电离质谱(MALDI-MS)、电喷雾电离质谱(ESI/MS)、快原子轰击质谱(FAB-MS)、电感耦合等离子体-质谱(ICP-MS)、加速器质谱(AMS)、热电离-质谱(TIMS)、火花源质谱(SSMS)、渗透压测定、光散射、超速离心、冰点测定、沸点测定、端基分析、滴定、冰点降低、沸点升高、渗透压或本领域已知的测定聚合物分子量的任意其他方法。如果用于测定聚谷氨酸聚合物的分子量的两种或多种方法产生不同的分子量值，则通过SEC-HPLC获得的分子量值为优选的。
在一些实施方案中，进行整个水解溶液的测量。在一些实施方案中，测量水解溶液的样品或部分。在一些实施方案中，测量整个水解溶液和水解溶液的样品以测定起始聚谷氨酸的水解程度。
viii.多次测量
在一些实施方案中，进行多次测量以监测起始聚谷氨酸聚合物的水解程度。在一些实施方案中，进行多次测量以测定是否产生聚谷氨酸的靶平均分子量。测量次数能为2至40次，或多于40次。能在多个时间点进行多次测量。例如，测量能在约1分钟至约120分钟范围内的时间点间的间隔处。
ix.使水解时间与聚谷氨酸分子量相关联
上述多次测量能用于使其中聚谷氨酸经过水解条件的时间量与聚谷氨酸的重均分子量相关联。例如，在图1和2中示出聚谷氨酸的重均分子量对时间的曲线图。通过在各个时间间隔处从包含聚谷氨酸和水解剂的溶液进行聚谷氨酸重均分子量的测量，从而产生这些曲线图。这类曲线图能用于测定起始聚谷氨酸聚合物应经过水解条件以产生期望的具有选定的靶重均分子量的产物聚谷氨酸聚合物的时间量。
x.选择水解条件
基于水解条件和聚谷氨酸重均分子量的关联性，可以选择有效产生具有靶重均分子量的产物聚谷氨酸聚合物的水解条件。
在一些实施方案中，水解时间和聚谷氨酸重均分子量的关联性能用于选择有效产生具有靶重均分子量的产物聚谷氨酸聚合物的时间量。例如，根据用于产生图1的水解条件，可以选择约1小时的水解时间以产生具有约75kDa的重均分子量的产物聚谷氨酸。此外，根据图1，可以选择约2小时的水解时间以产生具有约50kDa的重均分子量的产物聚谷氨酸。根据图1，可以选择约3小时的水解时间以产生具有约40kDa的重均分子量的产物聚谷氨酸。根据图1，可以选择约4-5小时的水解时间以产生具有约34kDa的重均分子量的产物聚谷氨酸。根据图1，可以选择约6小时的水解时间以产生具有约26kDa的重均分子量的产物聚谷氨酸。根据图1，可以选择约7小时的水解时间以产生具有约20kDa的重均分子量的产物聚谷氨酸。
根据用于产生图2的水解条件，可以选择约1小时的水解时间以产生具有约72kDa的重均分子量的产物聚谷氨酸。此外，根据图2，可以选择约2小时的水解时间以产生具有约50kDa的重均分子量的产物聚谷氨酸。根据图2，可以选择约3小时的水解时间以产生具有约36kDa的重均分子量的产物聚谷氨酸。根据图2，可以选择约4小时的水解时间以产生具有约28kDa的重均分子量的产物聚谷氨酸。根据图2，可以选择约5小时的水解时间以产生具有约23kDa的重均分子量的产物聚谷氨酸。根据图2，可以选择约6-8小时的水解时间以产生具有约20kDa的重均分子量的产物聚谷氨酸。根据图2，可以选择约9-10小时的水解时间以产生具有约16kDa的重均分子量的产物聚谷氨酸。根据图2，可以选择约11-12小时的水解时间以产生具有约13kDa的重均分子量的产物聚谷氨酸。根据图2，可以选择约13-15小时的水解时间以产生具有约12kDa的重均分子量的产物聚谷氨酸。
本文所述的水解条件和聚谷氨酸重均分子量之间的多种关联性能用于产生具有选定的靶重均分子量的聚谷氨酸聚合物。
xi.纯化
任选地，然后将产物聚谷氨酸分离和/或纯化。本领域技术人员已知的适当方法能用于分离和/或纯化产物聚谷氨酸。若需要和/或期望，则可以通过任何本领域技术人员已知的任意适当方法干燥产物聚谷氨酸。例如，能通过添加试剂使聚谷氨酸从溶液沉淀出。在一些实施方案中，试剂可以为丙酮。然后，能将形成的任何产物聚谷氨酸沉淀物过滤并洗涤，例如使用丙酮洗涤。任选地，能通过任何适当的方法纯化产物聚谷氨酸。例如，能将产物聚谷氨酸溶解在碳酸氢钠溶液中，使用纤维素膜在水中透析，并且能将产物聚谷氨酸冻干并分离。
如本文所述，由选定的水解条件获得的产物聚谷氨酸具有低于起始聚谷氨酸的重均分子量。本文描述了测定产物谷氨酸的重均分子量的方法。在一些实施方案中，产物聚谷氨酸的重均分子量能为约35kDa至约12kDa。
如上所述，在一些实施方案中，本文所述的方法的一个优势在于获得具有在相对窄的千道尔顿(kDa)范围内的期望重均分子量的产物聚谷氨酸的能力。在一些实施方案中，产物聚谷氨酸能具有为选定的靶第二重均分子量的约±5kDa之内的重均分子量。在其它实施方案中，产物聚谷氨酸能具有为选定的靶第二重均分子量的约±3kDa、±1.0kDa、±0.5kDa、±0.2kDa、±0.1kDa或±0.05kDa之内的重均分子量。
xii.多分散性
本文所述的水解条件能用于产生具有低的多分散系数的产物聚谷氨酸聚合物。在一些实施方案中，产物聚谷氨酸聚合物的多分散性能够为小于1.5、小于1.25或小于1.1。在一些实施方案中，产物聚谷氨酸聚合物的多分散性为约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0。在一些实施方案中，产物聚谷氨酸聚合物的多分散性为1.01至1.09。在一些实施方案中，产物聚谷氨酸聚合物的多分散性为约1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08或1.09。
实施例
为了进一步描述本文所述的实施方案而提供了下述实施例，并且其不限制权利要求的范围。
实施例1
商购的PGA的水解
从Sigma Aldrich Chemical Co.获得聚谷氨酸(PGA)，其具有17kDa的分子量。使用表1所示的水解条件处理商购PGA。还在表1中示出生成的产物PGA的重均分子量。
表1
Figure BDA00001737914800181
实施例2
PGA-苄型酯的合成
Figure BDA00001737914800182
向装备有特氟纶涂覆的搅拌棒的烘干的500mL圆底烧瓶中添加10g(38mmol，1当量)的5-苄酯谷氨酸-N-羧酸酐(NCA)和190mL的二噁烷。将生成的溶液用氩气吹扫5分钟。然后添加约0.106mL(0.76mmol，0.02当量)的刚蒸馏的三乙胺(0.02当量)。将反应混合物用氩气吹扫另外的5分钟，并且搅拌10分钟。然后，停止搅拌并使反应混合物静置72小时。然后，将反应混合物缓慢倒入1000mL的快速搅拌的无水乙醇中。产物析出为长的白色、纤维丝状物。将混合物过滤，并且将产物分离并用250mL的乙醇洗涤。真空除去任何残留溶剂。使用具有光散射分子量检测的GPC，测定生成的PGA样品(用作实施例3的起始PGA样品)的重均分子量。通过类似的过程获得两种其它的PGA样品。在表2中示出与条件和生成的PGA样品的重均分子量相关的其它细节。
表2
Figure BDA00001737914800191
实施例3
PGA的水解
Figure BDA00001737914800192
向装备有特氟纶涂覆的搅拌棒和气体适配器的烘干的100mL圆底烧瓶中添加1.0g(4.57mmol，1当量)的从实施例2获得的PGA-γ苄酯(具有191kDa的重均分子量)和40mL的二氯乙酸。将反应混合物放置在氩气环境中，并且搅拌15分钟以使酯部分溶解。通过注射器添加3.5mL(28.5mmol，6.24当量)的33％的HBr-AcOH溶液。然后将反应混合物搅拌约6小时。添加丙酮(50mL)，并且形成白色沉淀物。将生成的浆料过滤，并用丙酮(50mL)洗涤以获得固体。将固体溶解在1N的碳酸氢钠水溶液中，直至达到pH为约8(约20mL)。将溶液放置在透析管中并且在4L的去离子水中透析约1小时。在1小时之后，更换100％的水，并且使透析继续进行另外的一小时。将该过程再重复两次，然后将溶液透析过夜。通过0.45μm的醋酸纤维素膜过滤透析的溶液并将其冻干以除去水。获得的产物PGA为白色固体(0.18g，31％的产率，重均分子量为16.80kDa)。
进行实施例3的过程，其中在添加了33％的HBr-AcOH之后，在1、2、3、4、5、6和7小时从反应混合物中采集等分部分。使用实施例3所述的过程，将源自等分部分的产物PGA纯化并分离。测定源自等分部分的产物PGA的重均分子量，并且在表3中示出。
表3
*MW＝通过GPC-光散射检测所测定的重均分子量
使用表3中的数据产生图1所示的曲线图。本领域技术人员能选择靶重均分子量并且使用该曲线图测定水解起始聚谷氨酸以获得产物聚谷氨酸所需要的时间，其中产物聚谷氨酸具有的重均分子量为选定的靶第二重均分子量的约±10kDa之内。
实施例4
PGA的水解
在氩气环境下，向装备有特氟纶磁力搅拌棒的烘干的500mL圆底烧瓶中添加具有130kDa的起始重均分子量的PGA苄型酯(5.0g，22.85mmol，1当量)和二氯乙酸(200mL)的第一样品。将烧瓶沉入预热30℃的油浴中。使生成的悬浮液搅拌15分钟以使酯部分溶解。通过注射器添加HBr-AcOH溶液(17.5mL，100.1mmol，4.37当量)。在添加HBr-AcOH溶液之后一小时，通过注射器移除2.0mL的等分溶液(在该时间，所有的PGA酯进入溶液)。将等分部分置入离心管，并且用33mL的丙酮洗涤，并且涡旋以将聚合物均匀分散在溶剂混合物中。然后在20℃下，以3000rpm将管离心5分钟。聚合物在管底部形成密实的栓塞。将上清液倾析并向管添加另外的33mL的丙酮。然后，如前所述，将管涡旋并离心。在倾析生成的上清液之后，将聚合物栓塞溶解在10mL的1N碳酸氢钠水溶液中。随后，每小时移除2.0mL的等分反应混合物，持续另外的14小时，并且如上所述进行操作。通过具有光散射探测器的凝胶渗透色谱来表征聚合物的重均分子量。测定产物PGA的重均分子量。
根据上述相同的过程，水解具有130kDa的初始重均分子量的PGA苄型酯的第二样品。表4示出源自第一和第二样品的产物PGA的重均分子量。
表4
  样品1   样品2
  时间(hr)   MW(kDa)   MW(kDa)
  1   72.14   72.14
  2   49.21   49.21
  3   36.15   36.15
  4   27.78   27.78
  5   23.44   23.44
  6   19.71   19.71
  7   20.37   20.37
  8   18.4   18.4
  9   15.61   15.61
  10   15.7   15.7
  11   13.34   13.34
  12   13.59   13.59
  13   11.53   11.53
  14   11.67   11.67
  15   11.08   11.08
*MW＝通过GPC-光散射检测所测定的重均分子量
使用表4中的数据产生图2所示的曲线图，并且表示在数小时内在水解条件下的两种样品聚谷氨酸的重均分子量。本领域技术人员能选择靶重均分子量并且使用该曲线图测定水解起始聚谷氨酸以获得产物聚谷氨酸所需要的时间，其中产物聚谷氨酸具有的重均分子量为选定的靶第二重均分子量的约±10kDa之内。
实施例5
PGA的水解
通过水解具有130kDa的起始重均分子量的PGA聚合物的八个样品来表明水解条件的再现性。简言之，在氩气环境下，向装备有特氟纶磁力搅拌棒的烘干的500mL圆底烧瓶中添加样品PGA苄型酯(5.0g，22.85mmol，1当量)和二氯乙酸(200mL)。将烧瓶沉入预热30℃的油浴中。将生成的悬浮液搅拌15分钟以使酯部分溶解。添加HBr-AcOH溶液(17.5mL，100.1mmol，4.37当量)。将反应搅拌6小时。将反应倾入1500mL的10％己烷的乙酸乙酯的快速搅拌混合物中。在15分钟内，产物析出为透明凝胶状固体。通过54级滤纸过滤生成的混合物。收集生成的固体，并且2×250mL的乙酸乙酯洗涤。将材料转移至装备有搅拌棒的锥形烧瓶。向烧瓶添加250mL的1N碳酸氢钠溶液，并且溶解材料。将溶液放置在分液漏斗中，并且将水相(较低层)从上部有机层(溴苄副产物和一些残留的乙酸乙酯)分离。将水层放置在透析薄膜中，并且针对4L的DI水透析1小时。进行100％的水的改变，然后透析另外一小时。将该过程再重复两次，然后透析过夜。通过第50号等级的滤纸过滤溶液并且冻干以除去水。通过1H-NMR光谱和具有光散射探测器的凝胶渗透色谱来表征生成的聚合物的组成和重均分子量。测定八个样品的每一个的产物PGA的重均分子量，并且在表5中示出。
表5
  样品   规模   起始MW   产率   产物MW
  1   5g   130kDa   44％   20.53kDa
  2   5g   130kDa   61％   19.34kDa
  3   5g   130kDa   71％   21.27kDa
  4   5g   130kDa   79％   19.71kDa
  5   5g   130kDa   74％   21.21kDa
  6   5g   130kDa   87％   21.34kDa
  7   5g   130kDa   83％   18.27kDa
  8   5g   130kDa   94％   19.56kDa
实施例6
PGA的水解
通过水解具有130kDa或270kDa的起始重均分子量以及5g至50g的样品尺寸的PGA聚合物的六个样品来表明本文所述的水解条件的多功能性。简言之，在氩气环境下，向装备有特氟纶磁力搅拌棒的烘干的圆底烧瓶添加样品PGA苄型酯和二氯乙酸。将烧瓶沉入预热30℃的油浴中。将生成的悬浮液搅拌15分钟以使酯部分溶解。添加HBr-AcOH(4.37当量)溶液。将反应搅拌6小时。将反应倾入10％己烷的乙酸乙酯的快速搅拌混合物中。在15分钟内，产物析出为透明凝胶状固体。通过54级滤纸过滤生成的混合物。收集生成的固体并且用乙酸乙酯洗涤两次。将材料转移至装备有搅拌棒的锥形烧瓶。然后向烧瓶添加1N碳酸氢钠溶液，并且溶解材料。将溶液放置在分液漏斗中，并且将水相(较低层)从上部有机层(溴苄副产物和一些残留的乙酸乙酯)分离。将水层放置在透析膜中，并且针对DI水透析1小时。进行100％的水的改变，然后透析另外一小时。将该过程再重复两次，然后透析过夜。通过第50号等级的滤纸过滤溶液并且冻干以除去水。通过1H-NMR光谱和具有光散射探测器的凝胶渗透色谱来表征生成的聚合物的组成和重均分子量。测定六个样品的每一个的产物PGA的重均分子量，并且在表6中示出。
表6
  样品   规模   起始MW   产率   产物MW
  1   5g   130kDa   44％   20.53kDa
  2   5g   130kDa   61％   19.34kDa
  3   15g   270kDa   61％   19.46kDa
  4   20g   130kDa   51％   20.09kDa
  5   50g   270kDa   52％   20.52kDa
  6   50g   270kDa   54％   19.22kDa
本领域技术人员应理解能进行许多的和各种的修改而不背离本申请的精神。因此，应清楚地明白，本申请公开的形式仅为示例性的，并且不旨在限制权利要求的范围。

Claims (20)

1.制备聚谷氨酸的方法，其包括：
获得具有等于或大于80kDa的第一重均分子量的起始聚谷氨酸；
选择小于80kDa的聚谷氨酸的靶第二重均分子量；
选择将所述起始聚谷氨酸的第一重均分子量有效降低至所述选定的聚谷氨酸的靶第二重均分子量的水解条件；以及
在所述选定的水解条件下水解所述起始聚谷氨酸，由此获得产物聚谷氨酸，其中所述产物聚谷氨酸的重均分子量为所述选定的靶第二重均分子量的约±10kDa之内。
2.制备聚谷氨酸的方法，其包括：
获得具有等于或大于185kDa的第一重均分子量的起始聚谷氨酸；
选择小于185kDa的聚谷氨酸的靶第二重均分子量；
选择将所述起始聚谷氨酸的第一重均分子量有效降低至所述选定的聚谷氨酸的靶第二重均分子量的水解条件；以及
在所述选定的水解条件下水解所述起始聚谷氨酸，由此获得产物聚谷氨酸，其中所述产物聚谷氨酸的重均分子量为所述选定的靶第二重均分子量的约±10kDa之内。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述产物聚谷氨酸的重均分子量为所述选定的靶第二重均分子量的约±5kDa之内。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述产物聚谷氨酸的重均分子量为所述选定的靶第二重均分子量的约±3kDa之内。
5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述起始聚谷氨酸的第一重均分子量等于或大于190kDa。
6.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述起始聚谷氨酸的第一重均分子量等于或大于220kDa。
7.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述起始聚谷氨酸的第一重均分子量等于或大于240kDa。
8.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述起始聚谷氨酸的第一重均分子量为80kDa至约300kDa。
9.如权利要求1至8中任一权利要求所述的方法，其中所述起始聚谷氨酸为谷氨酸酯和胺的反应产物。
10.如权利要求1至9中任一权利要求所述的方法，其中所述选定的靶第二重均分子量等于或小于40kDa。
11.如权利要求1至9中任一权利要求所述的方法，其中所述选定的靶第二重均分子量为约35kDa至约15kDa。
12.如权利要求1至11中任一权利要求所述的方法，其中在所述选定的水解条件下，将所述起始聚谷氨酸水解至少总计2小时。
13.如权利要求1至11中任一权利要求所述的方法，其中在所述选定的水解条件下，将所述起始聚谷氨酸水解至少总计3小时。
14.如权利要求1至11中任一权利要求所述的方法，其中在所述选定的水解条件下，将所述起始聚谷氨酸水解至少总计5小时。
15.如权利要求1至11中任一权利要求所述的方法，其中在所述选定的水解条件下，将所述起始聚谷氨酸水解小于总计8小时。
16.如权利要求1至15中任一权利要求所述的方法，其中所述选定的水解条件包括使所述起始聚谷氨酸与酸反应。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述酸为HBr-乙酸。
18.如权利要求1至17中任一权利要求所述的方法，其中所述选定的水解条件包括使所述起始聚谷氨酸经历大于25℃的第一温度。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述选定的水解条件还包括使所述起始聚谷氨酸经历不等于所述第一温度的第二温度。
20.如权利要求19所述的方法，其中在所述第一温度下水解所述起始聚谷氨酸第一时间段，并且在所述第二温度下水解所述起始聚谷氨酸第二时间段。
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