CN103981116A - 一株屎肠球菌的培养方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株屎肠球菌的培养方法及其应用。屎肠球菌WEI-9以1％接种量接于专用液体发酵培养基，在50L发酵罐条件下，37℃，50rpm，不通气条件下发酵10-12h，活菌数产量可达2×109-3×109CFU／mL。将发酵液通过高速管式离心机收集菌体后，与专用保护剂按照质量体积比1∶5混合均匀，于-70℃预冻2-3h，然后置于真空冷冻干燥机中真空冻干44h后结束，获得的干燥菌粉用粉碎机破碎后与同样粒度的麸皮按照一定比例混合，获得微生态制剂产品。该产品用作微生物饲料添加剂添加于畜禽饲料中，可以调节畜禽肠道微生态平衡，提高畜禽的生产性能和抗病能力，有望成为饲用抗生素的替代产品。
Description
技术领域
本发明涉及一株屎肠球菌的培养方法及其应用，属于微生物技术领域。
背景介绍
目前饲料和畜禽养殖中滥用抗生素、化学合成药物、激素、β-***、重金属、镇静剂等促生长保健剂，导致一系列问题和后果，包括：畜禽产品中药物残留严重；细菌耐药性增强、耐药菌株增多；各种耐药性病菌可以通过食品传给人，产生很难治愈的疾病。这些问题及其严重的后果极大地威胁着食品安全，影响着动物和人类的健康。
鉴于上述饲料和畜禽养殖中存在的诸多问题，中国已启动“饲料安全工程”，并禁用了一批毒性和残留较大的药物。国家《饲料工业“十二五”发展规划》明确指出要加快新型饲料添加剂的开发与生产，尤其是替代抗生素的饲料添加剂的生产。因此，微生态制剂作为一种绿色、安全的饲料添加剂成为产业化开发的热点，是替代抗生素的潜在产品之一。
作为消化道内固有菌群，乳酸菌具有调节肠道菌群平衡、抑制有害菌生长、增强免疫力等作用。目前市售微生态制剂产品在实际使用中具有提高畜禽生产性能，防治畜禽消化道疾病的功效，但是很多产品也存在一些缺陷：活菌数达不到产品标注的量，致使产品的功效大打折扣；后处理条件太过激烈导致干燥后的菌粉产品含有大量死亡菌体，微生物活性大量损失。
因此，研制出一种低成本、高产量并能长期保持活性的乳酸菌微生态制剂，对于发展绿色饲料，保证饲料安全具有重要的意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足提供了一株屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745的大规模发酵培养方法及其在生产微生态制剂中的应用。屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9，并于2013年6月19日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No.7745，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所邮编：100101。
本发明所提供的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745的大规模发酵 培养方法，是将屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745接种到该菌的专用液体培养基中，30-40℃下静置或不通气培养。所述专用液体培养基的配方为：每1000mL水中含有：乳清粉10-30g，蛋白胨10-30g，柠檬酸铵1-3g，三水合乙酸钠2-8g，七水合硫酸镁0.1-0.5g，一水合硫酸锰0.02-0.08g，三水合磷酸氢二钾1-3g，吐温80 0.5-1.5g，pH值为6.5-7.5。
在上述培养方法中，接种比例为1％；培养温度为37-40℃；静置或不通气培养，培养时间为10-12h。
优选的专用液体培养基的配方为：每1000mL水中含有：乳清粉21.34g，蛋白胨21.94g，柠檬酸铵2g，三水合乙酸钠5g，七水合硫酸镁0.2g，一水合硫酸锰0.05g，三水合磷酸氢二钾2g，吐温80 1g，pH值为7。
在50L发酵罐条件下，利用上述培养基在37℃，50rpm，不通气条件下发酵获得的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745发酵液活菌数达到2×109-3×109CFU/mL，而在同样条件下，屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745在MRS培养基中的活菌数为6.5×108CFU/mL，优化后的培养基使得活菌数提高3-4倍。
本发明所提供的屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745在微生态制剂制备中的应用，是将屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745按照上述培养基和培养条件发酵获得的发酵液通过高速管式离心机收集菌体后，与保护剂混合均匀，先于-70℃预冻，然后置于真空冷冻干燥机中干燥后获得活性菌粉，将菌粉用粉碎机破碎后与同样粒度的麸皮混合，获得微生态制剂产品。
所述高速管式离心机收集菌体的转速为15000-20000rpm。
所述用于真空冷冻干燥处理的菌体保护剂配方为：每1000mL水中含有：脱脂奶粉100g，麦芽糊精10g，海藻糖15g，甘油5g，山梨醇20g。保护剂与离心后的菌泥按照体积质量比5∶1混合均匀，于-70℃预冻2-3h，然后置于真空冷冻干燥机中真空冻干44h后结束，冻干参数如下：真空度小于30Pa，冷阱温度为-40℃至-50℃，获得的干燥菌粉用粉碎机破碎后与同样粒度的麸皮按照一定比例混合，获得微生态制剂产品。冻干后的原菌粉活菌数为2×1011-3×1011CFU/g，以同样粒度的麸皮为载体可以稀释为含有不同活菌数的微生态制剂菌粉产品。
总之，按照上述培养方法和发酵液后处理方法可以制备出低成本、高活性的微生态制剂菌粉产品，用作畜禽微生物饲料添加剂，可以提高畜禽生产能力、抗病能力，最终减少饲用抗生素的使用。
附图说明
图1为屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745最适发酵初始pH值的优化。
图2为屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745最适发酵温度的优化。
图3为屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745最适工业级复合碳源的优化。
图4为屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745最适氮源的优化。
图5为屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745在50L发酵罐条件下的生长曲线。
具体实施方式
实施例一：屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745的最适发酵培养条件的优化
一、屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745的最适生长环境条件的优化
1、最适初始pH值的优化
考察不同初始pH值对屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745生长的影响。从屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745的保藏斜面(MRS培养基)挑一环菌苔接于装有100mL液体MRS培养基的250mL三角瓶中，于37℃，180rpm振荡培养11h，以1％的接种量分别接于装有300mL pH为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5的液体MRS培养基的500mL三角瓶中，于37℃，静置培养16h，开始培养后分别于2h、4h、6h、10h、12h、14h、16h取样测定OD600，并于培养结束时测定每个样品的活菌数。优化结果表明，屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745最适生长初始pH值范围为6.5-7.5。
2、最适发酵温度的优化
考察不同温度对屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745生长的影响。从屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745的保藏斜面(MRS培养基)挑一环菌苔接于装有100mL液体MRS培养基的250mL三角瓶中，于37℃，180rpm振荡培养11h，以1％的接种量接于装有300mL pH为7.0的液体MRS培养基的500mL三角瓶中， 分别于25℃、30℃、37℃、40℃、42℃、45℃、48℃，静置培养10h，开始培养后分别于2h、4h、6h、8h、10h取样测定OD600，并于培养结束时测定每个样品的活菌数。优化结果表明，屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745最适生长温度范围为37-40℃。
3、最适转速的优化
考察不同转速对屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745生长的影响。从屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745的保藏斜面(MRS培养基)挑一环菌苔接于装有100mL液体MRS培养基的250mL三角瓶中，于37℃，180rpm振荡培养11h，以1％的接种量接于装有300mL pH为7.0的液体MRS培养基的500mL三角瓶中，于37℃，转速分别调至50rpm、100rpm、200rpm，并以静置培养为对照，培养10h，开始培养后分别于2h、4h、6h、8h、10h取样测定OD600，并于培养结束时测定每个样品的活菌数。优化结果表明，不同转速对屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745生长的影响没有显著差异，表明屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745的生长对氧气的需求不显著，实际发酵过程中为了节省能源，可以在无需通气的条件下发酵。
二、屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745的最适发酵培养基组分的优化
1、最适碳源的优化
采用上述最适生长条件，考察了屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745对单一碳源，包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘油和工业上常用的复合碳源，包括糖蜜、乳清粉、葡萄糖浆、低聚异麦芽糖和糊精的利用情况。采用与上述同样的接种方法，固定氮源为蛋白胨10g/L，牛肉粉5g/L，酵母粉5g/L，含有不同碳源(含量均为20g/L)的培养基的pH值均为7.0，培养温度为37℃，静置培养10h，开始培养后分别于2h、4h、6h、8h、10h取样测定OD600，并于培养结束时测定每个样品的活菌数。综合考虑原料成本和菌体生长情况，最终确定屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745生长的最适碳源为乳清粉。
2、最适氮源的优化
采用上述最适生长条件，考察了屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745对蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、玉米浆粉、酵母膏、尿素、硝酸钠和硫酸铵等几种氮源的利用情况。采用与上述同样的接种方法，固定碳源为乳糖20g/L，含有不同氮源(含量按照每种氮源的含氮量与MRS培养基中的含氮量一致的原则进行换算)的培养基的pH值均为7.0，培养温度为37℃，静置培养10h，开始培养后分别于2h、4h、6h、8h、10h取样测定OD600，并于培养结束时测定每个样品的活菌数。综合考虑原料成本和菌体生长情况，最终确定屎肠 球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745生长的最适氮源为蛋白胨。
3、Plackett-Burman试验
用于培养屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745的发酵培养基中含有8种组分，利用Plackett-Burman设计从8种原料中筛选出对活菌产量有显著影响的因素。各因素及其水平见表1，Plackett-Burman试验设计及结果见表2，数据的回归分析及显著性分析见表3。表3的分析结果表明，蛋白胨是影响屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745发酵活菌产量的最显著因素，其余因素的影响作用依次为乳清粉、三水合乙酸钠、吐温80、七水合硫酸镁、三水合磷酸氢二钾、柠檬酸铵、一水合硫酸锰。其中蛋白胨、乳清粉、一水合硫酸锰和三水合磷酸氢二钾对活菌数的影响是正相关，柠檬酸铵、三水合乙酸钠、七水合硫酸镁、吐温80对活菌数的影响是负相关。选取乳清粉、蛋白胨和三水合乙酸钠做进一步优化试验。
表1Plackett-Burman试验设计因子水平
表2Plackett-Burman试验设计及结果
表3回归系数及影响因子的显著性分析
3、最陡爬坡试验
响应面拟合方程只有在考察的临近区域里才能充分近似真实情况，故应先逼近最大产区后再建立有效的拟合方程。根据Plaekett-Burman试验筛选出的3个影响屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745活菌数的重要因素，运用最陡爬坡试验找出活菌产量最大的区域。最陡爬坡试验结果见表4。由表4可知，当乳清粉浓度为20g/L、蛋白胨浓度为20g/L、三水合乙酸钠浓度为5g/L时，活菌数产量最大，当条件处于其两边或更远时活菌数产量逐渐下降。由此可以确定活菌数达到最大值的发酵培养基中三种主要影响因素的浓度应当为乳清粉20g/L、蛋白胨20g/L、三水合乙酸钠5g/L附近的区域。
表4最陡爬坡实验结果
4、Box-Behnken优化设计实验结果
根据最陡爬坡试验结果，将乳清粉浓度为20g/L、蛋白胨浓度为20g/L、三水合乙酸钠浓度为5g/L作为中心条件采用Box-Behnken法进一步优化，各因素水平见表5，优化设计结果见表6。采用Design-Expert软件对表6中的活菌数数据进行分析，得到模拟曲线，对应的模拟方程为：
Y＝16.24+0.91X1+1.45X2-0.11X4+0.5X1X2-0.025X1X4+0.2X2X4-2.06X12-2.03X22-2.11X42。
对模拟方程进行方差分析，结果见表7。由表7可知，模拟方程的P＜0.05，说明模拟方程对活菌数的影响是显著的。模拟方程的交叉项对活菌数的影响均不显著，而乳清粉和蛋白胨的一次项及三个因素的二次项对活菌数影响显著，其中三个因素的二次项为极显著影响，这说明各因素与活菌数的关系并不是简单的线性关系，而是一个复杂的二次关系。
通过利用Design-Expert软件绘制的响应面曲线分析，响应面曲线存在着活菌数的最大值，运用软件预测出活菌数达到最大值的条件为：乳清粉21.34g/L，蛋白胨21.94g/L，三水合乙酸钠5g/L，活菌数最大为16.64×108CFU/mL。
为了验证上述优化结果的可靠性，根据筛选出的最佳发酵培养基和发酵条件，进行了两次平行实验，活菌数分别为15.89×108CFU/mL和16.52×108CFU/mL。实验值和理论值基本一致，说明上述优化方法具有较好的实用性和可靠性。
表5Box-Behnken设计各因素水平
表6Box-Behnken设计及结果
表7模拟方程中各参数的回归系数
实施例二：屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745的发酵培养
从屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745的保藏斜面(MRS培养基)挑一环菌苔接于装有300mL上述优化好的专用发酵培养基的500mL三角瓶中，于37℃， 静置培养10-12h，以1％的接种量接于装有30L pH为7.0的专用液体发酵培养基的50L发酵罐中，于37℃进行发酵培养，发酵过程中，转速控制在50rpm，不通气培养10-12h，pH降至4.2左右，发酵结束，发酵液活菌数大于2×109CFU/mL，而在同样条件下，屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745在优化前的MRS培养基中的活菌数为6.5×108CFU/mL，优化后的培养基使得活菌数提高3-4倍。所述专用液体发酵培养基为实施例一中优化获得的最优发酵培养基，配方为：每1000mL水中含有：乳清粉21.34g，蛋白胨21.94g，柠檬酸铵2g，三水合乙酸钠5g，七水合硫酸镁0.2g，一水合硫酸锰0.05g，三水合磷酸氢二钾2g，吐温80 lg，pH值为7。
实施例三：屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745的发酵液的真空冷冻干燥处理
按照实施例二制作的屎肠球菌（Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745的发酵液经过高速管式离心机，在15000-20000rpm的条件下离心收集菌体。为了降低真空冷冻干燥处理成本，提高冻干后菌粉产品的存活率，选择了4种保护剂配方(见表8)加以比较。将4种经灭菌的保护剂按照体积质量比5∶1与离心后的菌体均匀混合，置于-70℃预冻2-3h，放入温度已经降至-40℃--50℃的真空冷冻干燥仪的冷阱中，打开真空泵，抽真空度至10Pa，冻干44h左右。取出菌粉，测定活菌数，计算存活率，结果表明，保护剂3适合用于屎肠球菌(Enterococcus faecium）WEI-9CGMCC No.7745发酵液的真空冷冻干燥处理，存活率可达90％，菌粉活菌数大于2×1011CFU/g。
表8保护剂编号及配方
Claims (8)
1.一株屎肠球菌的培养方法及应用，其特征在于，所述的屎肠球菌(Enterococcus faecium)为WEI-9，保藏编号为CGMCC No.7745。
2.权利要求1所述的培养方法，其特征在于：将屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745接种到该菌的专用液体培养基中，30-40℃下静置或不通气培养。所述专用液体培养基的配方为：每1000mL水中含有：乳清粉10-30g，蛋白胨10-30g，柠檬酸铵1-3g，三水合乙酸钠2-8g，七水合硫酸镁0.1-0.5g，一水合硫酸锰0.02-0.08g，三水合磷酸氢二钾1-3g，吐温800.5-1.5g，pH值为6.5-7.5。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述专用液体培养基的优选配方为：每1000mL水中含有：乳清粉21.34g，蛋白胨21.94g，柠檬酸铵2g，三水合乙酸钠5g，七水合硫酸镁0.2g，一水合硫酸锰0.05g，三水合磷酸氢二钾2g，吐温801g，pH值为7。
4.根据权利要求2-3所述培养方法，其特征在于：接种比例为1％；培养温度为37-40℃；静置或不通气培养，培养时间为10-12h。
5.权利要求1所述的屎肠球菌的培养方法及应用，其特征在于：应用是以以屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745为主要原料制备微生态制剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述微生态制剂的制备方法为：屎肠球菌(Enterococcus faecium)WEI-9CGMCC No.7745经一级种子摇瓶和50L发酵罐富集后的发酵液通过高速管式离心机收集，与保护剂混合均匀，先于-70℃预冻，然后置于真空冷冻干燥机中干燥后获得活性菌粉，将菌粉用粉碎机破碎后与同样粒度的麸皮混合，获得微生态制剂产品。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述高速管式离心机收集菌体的转速为15000-20000rpm；保护剂配方为：每1000mL水中含有：脱脂奶粉100g，麦芽糊精10g，海藻糖15g，甘油5g，山梨醇20g。
8.根据权利要求6-8所述的应用，其特征在于：将保护剂与离心后的菌泥按照体积质量比5∶1混合均匀，于-70℃预冻2-3h，然后置于真空冷冻干燥机中真空冻干44h后结束，冻干参数如下：真空度小于30Pa，冷阱温度为-40℃至-50℃。
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