CN104164459A

CN104164459A - 利用发酵提高糙米γ—氨基丁酸的方法

Info

Publication number: CN104164459A
Application number: CN201410349172.XA
Authority: CN
Inventors: 朱宇; 董玲; 姚英政; 黎剑
Original assignee: Saas Agro-Food Science & Technology Research Institute
Current assignee: Saas Agro-Food Science & Technology Research Institute
Priority date: 2014-07-22
Filing date: 2014-07-22
Publication date: 2014-11-26

Abstract

本发明为利用发酵提高糙米中γ—氨基丁酸的方法。解决糙米中γ—氨基丁酸含量低，己有发酵工艺复杂，不适于提高糙米中γ—氨基丁酸含量，增加糙米营养保健价值和口感的问题。本发明以糙米或添加了谷氨酸钠的糙米为原料，接种高产γ—氨基丁酸（GABA）乳酸菌P—14菌株，进行发酵，获得富含GABA的发酵糙米。该P—14菌株分离自传统泡菜，发酵原料为经过灭菌的糙米，发酵产物能达到食品安全级。经过发酵处理，糙米的营养性和保健性都可得到不同程度的提高，可以满足人民对食品营养和保健功能的需求。

Description

利用发酵提高糙米γ—氨基丁酸的方法

技术领域：

本发明涉及一种乳酸菌发酵提高糙米γ—氨基丁酸的方法。

背景技术：

γ—氨基丁酸（GABA）是一种重要的非蛋白氨基酸，具有增进脑活力、安神、调解激素分泌、改善脂质代谢、降血压、治疗癫痫和改善更年期综合症等重要的生理功能。GABA分布非常广泛，在动物、植物和微生物中均有存在，在各种谷类、蔬菜、水果和蘑菇中有微量的含量。通过化学法、植物富集法和微生物法均可制备GABA。与前两者相比，微生物发酵法具有条件温和、设备要求相对简单等优点。

目前国内主要是利用浸泡发芽来富集糙米中γ—氨基丁酸。通过糙米发芽富集能力有限，发芽对温湿度条件要求高，且发芽容易出现长霉现象，发芽条件难以控制。

《糙米酵素发酵工艺对γ—氨基丁酸和谷胱甘肽含量的影响研究》文章介绍了以糙米为原料接种酵母菌进行发酵研究发酵工艺对γ—氨基丁酸的影响；申请号为2008100686241的发明公开了以大米为原料接种红曲进行发酵制备富含GABA红曲米的方法。

申请号为2011101020988的发明公开了以糙米、葡萄糖、玉米粉、大豆粉等为主要原料接种乳酸菌进行发酵，获得富含GABA的发酵产物；《富含γ—氨基丁酸乳酸菌发酵功能饮料的研制》文章介绍了以糙米汁、黄豆芽汁和牛奶酶解液为培养基，研制乳酸菌发酵饮料；《γ—氨基丁酸的功能性及其在稻米制品中的富集利用》文章介绍日本大阪生物环境研究所向米糠抽屉液中加入碳源、氮源，接种乳酸菌和酵母菌进行发酵后获得富含GABA的产物；申请号为201010145627.8的发明专利公开了将米糠、谷氨酸及奶粉混合后接种商业型乳酸菌粉（嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌）发酵，获得富含GABA的产物。

上述报道发酵原料是由糙米或米糠与其他配料组成，最终发酵产物除糙米外还存在其他配料。

申请号为201210302371.6的发明专利公布了以小米糠、谷氨酸钠为原料，谷氨酸钠与米糠、蒸馏水混合后调节初始pH值为3—5，接种短乳杆菌CCTCC NO: M 209132进行发酵。该报道以小米糠为原料，提高了小米糠附加值，但小米糠和糙米的使用范围不同，小米糠使用范围相对糙米更窄，发酵初期需要进行pH值调整，增加了发酵工序。

而微生物发酵富集能力与微生物的性能相关，微生物发酵产γ—氨基丁酸能力越强，则富集能力越强，且发酵条件比发芽条件更易控制，发酵工艺更易操作。研究表明，大米经过发酵处理，营养性和保健性都得到了不同程度的提高，因此通过接种产γ—氨基丁酸乳酸菌发酵糙米不但可以提高糙米中γ—氨基丁酸，而且可以改善糙米风味、口感等其他品质。

发明内容：

本发明的目的是提供一种通过乳酸菌发酵提高糙米中γ—氨基丁酸含量，增加糙米营养保健价值，具有独特风味、口感，发酵工艺更简单，发酵产物组分单一的利用发酵提高糙米γ—氨基丁酸的方法。

为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

利用发酵提高糙米γ—氨基丁酸的方法，以糙米为原料，接种乳酸菌进行发酵，所述乳酸菌为短乳杆菌（Lactobacillus brevis）P—14菌株，保藏编号为CGMCC NO:9029，2014年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

以添加了谷氨酸钠的糙米为原料。

其步骤如下：

1）糙米粉碎后得糙米粉，糙米粉与水按10g:90mL比例混合，

2）向糙米水混合物中添加谷氨酸钠，谷氨酸钠添加量为每10g糙米与90mL水混合后添加1g，

3）糙米、水和谷氨酸钠混合后，发酵原料pH值为自然pH值，

4）糙米、水和谷氨酸钠混合后，每10g糙米、90mL水、1g谷氨酸钠混合物接种5mL乳酸菌种子发酵剂，发酵3天后，获得富含GABA的发酵糙米。

步骤1）中糙米粉碎后过60目筛网，步骤3）中糙米、水和谷氨酸钠混合后，121℃灭菌30分钟，未进行pH值调节，发酵pH值为自然pH值，步骤4）中，发酵温度为30℃，每10g糙米、90mL水、1g谷氨酸钠混合物接种5mL乳酸菌种子发酵剂，发酵3天。

步骤3）中乳酸菌种子发酵剂制备方法为：将乳酸菌接种到5mL MRS液体培养基中18—24小时，以1mL/100mL接种量接种到MRS液体培养基中培养至菌液OD600值为0.8—1.2，6000转/分离心5分钟收集菌体，无菌生理盐水洗涤2遍，用MRS液体培养基1/10倍体积的无菌生理盐水重悬，制得高浓度菌液，所得高浓度菌悬液即为乳酸菌种子发酵剂。

上述P—14菌株的分离方法，采用梯度稀释混菌法从四川自然发酵泡菜水中分离。包括以下步骤：将1mL泡菜水用9mL无菌生理盐水进行梯度稀释,稀释到泡菜水浓度为10^—6—10^—8mL/mL，取1mL稀释液于无菌培养皿中，倾倒固体培养基并混匀，待培养基凝固后，置于30℃培养箱培养48—96小时，出现大量细菌菌落，挑取具有不同特征的单菌落，在分离培养基上划线纯化，并进一步培养，得到纯菌株。纯化的菌株采用2种方式保藏，用液体培养基在30℃培养24—36小时后，在培养好的液体培养基中添加甘油，使甘油终浓度为20g/100mL，—20℃冻存，每隔1年转接一次；将菌种穿刺接种在半固体培养基中，30℃培养48小时后，放于4℃冷藏，每隔4个月转接一次。

短乳杆菌P—14菌株接种在固体培养基上，30℃培养48小时后，观察菌落特征，菌落较大、圆形、突起，乳白色，表面湿润光滑，边缘整齐，与短乳杆菌形态相似；通过革兰氏染色后在显微镜下观察细胞特征，革兰氏染色阳性，细胞呈短杆状，无芽孢。过氧化氢酶试验阴性，在15℃生长，45℃不生长，氯化钠耐受范围为0—6%（v/w)，能利用***糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、木糖发酵产酸，能缓慢利用蜜二糖产酸，不能发酵苦杏仁苷、纤维二糖、七叶灵、乳糖、甘露醇、甘露糖、松三糖、棉子糖、鼠李糖、核糖、水杨苷、山梨醇、蔗糖、海藻糖。其生理生化特征与短乳杆菌（L.brevis）最相似，但也存在一定差异，其不能利用七叶灵、核糖、棉子糖产酸，而短乳杆菌标准菌株L.brevis DSM20054能发酵以上三类糖产酸。本发明中短乳杆菌P—14不能利用核糖产酸，这一性质与产GABA短乳杆菌L.brevis CCTCCM 208054不同。本发明中短乳杆菌P—14菌株不能利用甘露糖发酵，与高产GABA短乳杆菌L2保藏号为CCTCCM 209132不同。提取DNA后，用细菌通用引物27F，1492R扩增出其16S rDNA，送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，序列长度为1434bp，与短乳杆菌（L.brevis）相似性高达99%以上。鉴定该菌株为短乳杆菌（L.brevis）。本发明短乳杆菌P—14菌株与Genbank中短乳杆菌相似性为99%以上，而短乳杆菌L.brevis CCTCCM 208054和短乳杆菌CCTCCM 209132与短乳杆菌相似性为97%。

P—14菌株产GABA定性检测，采用薄层层析法，具体步骤包括：挑取适量冷藏的菌体接种到5mL液体培养基中，30℃静置发酵48小时，取1μL发酵液在硅胶薄层层析板上点样，以浓度为0.2%（w/w）的GABA标准溶液、添加有2% （w/w）GABA的液体培养基为对照。展层后于105℃显色5min，拍照。观察薄层层析结果，本发明的P—14菌株发酵液具有与GABA标品相同层析距离的条带。

P—14菌株产GABA定量检测，采用氨基酸自动分析仪（塞卡姆S—433D型）。挑取适量冷藏的菌体划线接种到固体培养基上，待长出单菌落，挑取一个单菌落菌体接种到100mL液体培养基中培养10小时，制成活菌体数约为10⁸个的种子发酵液，将种子发酵液以2%（v/v）的接种量接种在250mL装有100mL液体培养基的三角瓶中，30℃静置发酵72小时，所得发酵液于10000×g离心10min，取上清液经0.22μm膜过滤后用氨基酸自动分析仪分析其氨基酸组成，以未接种的液体培养基为对照。结果表明本发明的P—14菌株发酵液中GABA含量达到了501mg/100g

短乳杆菌P—14菌株活化后接种到液体培养基中，30℃培养，OD600为1.1—1.2，6000×g离心5min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤后制成OD600为10左右的浓菌悬液，添加3mL到20g辐照灭菌糙米粉中（糙米粉：无菌水=1:2；w/v），30℃静置发酵3三天，以未接种辐照糙米粉作对照，冻干后用氨基酸自动分析仪分析其GABA含量变化，接种发酵糙米粉中GABA含量为65mg/100g，未接种糙米粉中GABA含量为11mg/100g，GABA含量提高了5倍。

上述短乳杆菌P—14菌株保藏编号为：CGMCC NO:9029，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2014年4月9日。

上述液体培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉粉5g，酵母粉4g，葡萄糖20g，谷氨酸钠10g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1mL，蒸馏水 1000mL，pH6.2左右。

上述固体培养基为液体培养基添加1.7—2.0%（w/v）琼脂。

上述半固体培养基为液体培养基添加1（w/v）琼脂。

上述薄层层析展层剂组成：正丁醇：冰醋酸：水（v:v:v=4:1:3）, 展层剂中含0.4%茚三酮。

本发明采用乳酸菌发酵形成的糙米发酵物具有与酵母发酵和霉菌发酵不一样的特征，如风味、口感等，作为食品添加物，可丰富食品加工种类。本发明发酵菌株为从泡菜水中分离的短乳杆菌（Lactobacillus brevis）P—14菌株，保藏编号为CGMCC NO:9029，食用安全性有保证，且具有其特殊性。

种子发酵剂经过无菌生理盐水洗涤、重悬，不会将MRS液体培养基中其它成分带入发酵原料中。

本发明发酵原料为添加了一定量谷氨酸钠的糙米，发酵后产物为富含GABA的糙米，不含有其他配料，发酵产物组分单一，形成的糙米粉可以有更广泛的应用前景。

本发明发酵初期pH值为原料自然pH值，发酵工艺更简单。

具体实施方式

实施例1：

用接种环挑取一环短乳杆菌P—14接种到5mL MRS液体培养基中活化培养24小时，以1mL/100mL接种量接种到MRS液体培养基中培养至菌液OD600值为1.12，6000转/分离心5分钟收集菌体，无菌生理盐水洗涤2遍，用原培养液1/10倍体积的无菌生理盐水重悬，制得乳酸菌种子发酵剂。

糙米粉碎后过60目筛，筛下糙米粉与水按10g:90mL比例混合，向糙米水混合物中添加谷氨酸钠，每10g糙米与90mL水混合后添加1g谷氨酸钠，充分混匀后经过121℃灭菌处理30分钟，每10g糙米、90mL水、1g谷氨酸钠混合物接种5mL乳酸菌种子发酵剂，在30℃发酵3天。

发酵结束，糙米有其独特的发酵风味和口感，发酵产物经过冷冻干燥后采用氨基酸自动分析仪（塞卡姆S—433D型）测定GABA含量，其含量为1639 mg/100g（干重）。

实施例2：

糙米粉碎后过60目筛，筛下糙米粉与水按10g:90mL比例混合，充分混匀后经过121℃灭菌处理30分钟，每10g糙米、90mL水混合物接种5mL乳酸菌种子发酵剂，在30℃发酵3天。

发酵结束，糙米有其独特的发酵风味和口感，发酵产物经过冷冻干燥后采用氨基酸自动分析仪（塞卡姆S—433D型）测定GABA含量，其含量为22mg/100g（干重）。

实施例3：

用接种环挑取一环不产GABA乳酸菌接种到5mL MRS液体培养基中活化培养24小时，以1mL/100mL接种量接种到MRS液体培养基中培养至菌液OD600值为1.21，6000转/分离心5分钟收集菌体，无菌生理盐水洗涤2遍，用原培养液1/10倍体积的无菌生理盐水重悬，制得乳酸菌种子发酵剂。

糙米粉碎后过60目筛，筛下糙米粉与水按10g:90mL比例混合，向糙米水混合物中添加谷氨酸钠，每10g糙米与90mL水混合后添加1g谷氨酸钠，充分混匀后经过121℃灭菌处理30分钟，每10g糙米、90mL水、1g谷氨酸钠混合物接种5mL不产GABA乳酸菌种子发酵剂，在30℃发酵3天。

发酵结束，糙米有其独特的发酵风味和口感，发酵产物经过冷干燥后采用氨基酸自动分析仪（塞卡姆S—433D型）测定GABA含量，其含量为8.5 mg/100g（干重）。

实施例4：

糙米粉碎后过60目筛，筛下糙米粉与水按10g:90mL比例混合，充分混匀后经过121℃灭菌处理30分钟，每10g糙米、90mL水混合物接种5mL不产GABA乳酸菌种子发酵剂，在30℃发酵3天。

发酵结束，糙米有其独特的发酵风味和口感，发酵产物经过冷冻干燥后采用氨基酸自动分析仪（塞卡姆S—433D型）测定GABA含量，其含量为7.5mg/100g（干重）。

糙米粉碎后过60目筛，筛下糙米粉与水按10g:90mL比例混合，充分混匀后经过121℃灭菌处理30分钟，不接种乳酸菌，30℃条件下放置3天，冷冻干燥后采用氨基酸自动分析仪（塞卡姆S—433D型）测定GABA含量，其含量为10.41mg/100g。

不接种的糙米中GABA含量为10.41mg/100g；在添加和不添加谷氨酸钠的情况下接种不产GABA乳酸菌进行发酵，糙米中GABA含量都不超过10mg/100g；接种P—14进行发酵，不添加谷氨酸钠时，糙米中GABA含量为22mg/100g，添加谷氨酸钠时，糙米中GABA含量为1639mg/100g。因此接种不产GABA乳酸菌发酵，不能使糙米粉中GABA含量增加，而接种短乳杆菌（Lactobacillus brevis）P—14菌株，进行发酵，能显著提高糙米粉中GABA含量，尤其是添加1%（w/v）谷氨酸钠后，效果更显著。发酵后的糙米有其独特的发酵风味和口感。

本发明中GABA测定方法为：将发酵后的样品置于—20℃冻24小时后，冷冻干燥48小时。取适量样品，加10mL 6mol/L盐酸，排除空气后，在110℃下水解，取一定量定容过滤后的水解溶液，真空干燥后以0.02mol/L盐酸溶解定容后上机测试。Sykam氨基酸自动分析仪，阳离子树脂（150mm×4.6mm)；检测波长为570nm，440nm；柱温为57—74℃梯度温度；洗脱液流量为0.45ml/min；反应温度为130℃。

本发明中的MRS液体培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉粉5g，酵母粉4g，葡萄糖20g，谷氨酸钠10g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1mL，蒸馏水 1000mL，pH6.2左右。

无菌生理盐水制备方法：氯化钠8.5g定容至1L。

Claims

1.利用发酵提高糙米γ—氨基丁酸的方法，其特征在于以糙米为原料，接种乳酸菌进行发酵，所述乳酸菌为短乳杆菌（Lactobacillus brevis）P—14菌株，保藏编号为CGMCC NO：9029，2014年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.根据权利要求1所述的利用发酵提高糙米γ—氨基丁酸的方法，其特征在于以添加了谷氨酸钠的糙米为原料。

3.根据权利要求2所述的利用发酵提高糙米γ—氨基丁酸的方法，其特征在于其步骤如下：

1）糙米粉碎后得糙米粉，糙米粉与水按10g:90mL比例混合，

2）向糙米水混合物中添加谷氨酸钠，谷氨酸钠添加量为每10g糙米与90mL水混合后添加谷氨酸钠1g，

3）糙米、水和谷氨酸钠混合后，发酵原料pH值为自然pH值，

4.根据权利要求3所述的利用发酵提高糙米γ—氨基丁酸的方法，其特征在于步骤1）中糙米粉碎后过60目筛网，步骤3）中糙米、水和谷氨酸钠混合后，121℃灭菌30分钟，未进行pH值调节，发酵pH值为自然pH值，步骤4）中，发酵温度为30℃，每10g糙米、90mL水、1g谷氨酸钠混合物接种5mL乳酸菌种子发酵剂，发酵3天。

5.根据要求4所述的利用发酵提高糙米γ—氨基丁酸的方法，其特征在于步骤3）中乳酸菌种子发酵剂制备方法为：将乳酸菌接种到5mL MRS液体培养基中18—24小时，以1mL/100mL接种量接种到MRS液体培养基中培养至菌液OD600值为0.8—1.2，6000转/分离心5分钟收集菌体，无菌生理盐水洗涤2遍，用MRS液体培养基1/10倍体积的无菌生理盐水重悬，制得高浓度菌液，所得高浓度菌悬液即为乳酸菌种子发酵剂。