CN107937320A - 一株植物乳杆菌、该植物乳杆菌冻干粉及其制备方法 - Google Patents

一株植物乳杆菌、该植物乳杆菌冻干粉及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum LP4)，其微生物保藏编号为CGMCC No.14533。本申请还提供一种制备所述植物乳杆菌LP4冻干粉的方法及使用该方法制备的植物乳杆菌LP4冻干粉，所述方法在对所述植物乳杆菌LP4进行冻干前对所述植物乳杆菌LP4进行包被处理，组合使用多种保护剂，特别地，在对所述植物乳杆菌LP4表面进行首次包被后，再进行二次包被，从而弥补首次包被可能存在的包被不完全的缺陷，在所述植物乳杆菌LP4菌体表面形成至少完全的致密的保护层，并与所述菌体构成微囊结构，从而有效地将所述植物乳杆菌LP4菌体与外界环境隔离，并在微囊内部形成稳定地内环境，从而使得所述植物乳杆菌LP4在常温条件下也能够保持活力。

Description

一株植物乳杆菌、该植物乳杆菌冻干粉及其制备方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别涉及一株植物乳杆菌、该植物乳杆菌冻干粉及其制备方法。
背景技术
相比于乳酸菌深冷制剂，乳酸菌冻干粉由于具有便于贮藏和使用等优点被广泛使用。乳酸菌冻干粉中菌体的活菌数、存活率、活力等稳定性指标对其能否正常使用具有重要影响。
通常，乳酸菌冻干的方法为将含有液相组分的乳酸菌菌体在低温环境下急速冷冻，再按照程序升温获得乳酸菌冻干粉，这种方法在冻干过程中，菌体细胞由于遭遇冷冻冲击会导致细胞壁通透性改变和代谢损伤，从而造成菌体失活。在贮存期间，乳酸菌冻干粉中乳酸菌菌体则会因为与环境中水、氧和自由基接触造成损伤，进一步造成菌体失活。由于冻干过程和贮藏期间的双重损失，从而导致在实际使用时乳酸菌冻干粉中活菌数量低，存活率低，菌体活力不足等问题。
现有技术有大量研究来减少在冻干过程中乳酸菌活菌的损失，相比于直接进行冻干的方法，通过这些方法制备的冻干粉中活菌数量有所提高，但是，这些方法并不能解决贮藏阶段活菌的损失，制得的乳酸菌冻干粉仍需低温保藏，通过使乳酸菌休眠的方法来保持乳酸菌的活性。而在没有低温保藏设备的条件下，乳酸菌冻干粉则被置于常温环境中，从而导致乳酸菌冻干粉中的活菌存活率会急剧下降，表现为乳酸菌冻干粉失效，进而影响其功效，这为乳酸菌冻干粉的使用带来了极大的不便。
发明内容
本申请的目的之一是提供一株植物乳杆菌，本申请的目的之二是提供一种将所述植物乳杆菌制备成冻干粉的方法，以解决现有冻干方法制得的乳酸菌冻干粉中活菌数量低及常温贮藏菌体易失活，货架期内无法有效保证活菌数的问题。
为达到上述目的，本申请通过以下技术方案来实现：
植物乳杆菌LP4(Lactobacillus plantarum LP4)通过以下方法筛选得到：
所述植物乳杆菌LP4(Lactobacillus plantarum LP4)是从传统泡菜中分离得到的潜在益生特性的益生菌；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.14533；分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum LP4)；保藏时间：2017年8月18日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本申请所分离的植物乳杆菌LP4(Lactobacillus plantarum LP4)具有如下生物学特性：菌种为革兰氏样性菌，呈直杆状，单个、有时成对或成链状。MRS固体培养基上菌落直径1-3mm，乳白色，凸起，呈圆形，表面光滑。最适生长温度为30～37℃，厌氧或兼性厌氧，最适pH＝6.5左右，在MRS液体培养基中生长浑浊。
本申请提供一种制备所述植物乳杆菌LP4(Lactobacillus plantarum LP4)冻干粉的方法，包括：
步骤1-1，将湿菌体与抗氧化剂混合，搅拌；
步骤1-2，将步骤1-1制得的体系与多元醇混合，搅拌；
步骤1-3，将步骤1-2制得的体系与碱性多糖或其水分散体系混合，搅拌；
步骤1-4，将步骤1-3制得的体系与非碱性多糖或其水分散体系混合，搅拌；
步骤1-5，将步骤1-4制得的体系与蛋白质及小分子糖混合，搅拌；
步骤1-6，将步骤1-5制得的体系与碱性多糖或其水分散体系混合，搅拌；
步骤1-7，将步骤1-6制得的体系冷冻干燥。
本申请提供的方法在对所述植物乳杆菌LP4进行冻干前对所述植物乳杆菌LP4进行包被处理，组合使用多种保护剂，包括抗氧化剂、多元醇、碱性多糖、非碱性多糖、蛋白质、小分子糖等，特别地，在对所述植物乳杆菌LP4表面进行首次包被后，再进行二次包被，从而弥补首次包被可能存在的包被不完全的缺陷，在所述植物乳杆菌LP4菌体表面形成至少完全的致密的保护层，并与所述菌体构成微囊结构，从而有效地将所述植物乳杆菌LP4菌体与外界环境隔离，并在微囊内部形成稳定地内环境，从而使得所述植物乳杆菌LP4在常温条件下也能够保持活力。
采用本申请提供的方法，制得的植物乳杆菌LP4冻干粉中菌体的外表面包覆有两层包覆物，使包覆物及菌体形成微囊结构，在微囊内部具有隔氧、隔水、隔气并且相对稳定的内部环境，从而减小冻干过程对植物乳杆菌LP4菌体的冷冻冲击，降低冻干过程中菌体损失。而且，制得的植物乳杆菌LP4冻干粉保留有微囊结构，隔绝菌体与环境中水、氧、自由基等的接触，从而使得植物乳杆菌LP4冻干粉在常温条件下贮藏也能够长期保持菌体的活性。同时，本发明人发现，根据本申请提供的方法制备的植物乳杆菌LP4冻干粉，在使用时，包覆于菌体表面的包覆物能够较为容易地从菌体表面脱覆，使菌体裸露出来，发挥其功用。
本申请提供的方法不同于常见的真空冷冻干燥方案，片面追求新制备的冻干粉中活菌含量，而是在冷冻干燥前对菌体进行双重包被，形成微囊，从而对菌体进行隔离保护，解决了植物乳杆菌LP4冻干粉在常温贮藏过程中易失活，货架期内无法有效保证活菌数的问题，以便其在不同领域产品中的开发和应用。
本申请提供的制备植物乳杆菌LP4冻干粉的方法还可以应用于制备其它乳酸菌冻干粉。
本申请还提供一种根据上述方法制备的植物乳杆菌LP4冻干粉，所述植物乳杆菌LP4冻干粉中活菌含量为6015亿CFU/g以上，在25℃条件下贮藏6个月后活菌存活率为65％以上。
所述植物乳杆菌LP4冻干粉中菌体的表面包覆有致密的包覆物，与被包覆的菌体形成微囊结构，能够有效地将菌体与外界隔离，使得在常温下，植物乳杆菌LP4冻干粉也能够保持菌体的活性，而无需低温保存，使植物乳杆菌LP4冻干粉的保存条件更为温和，保存植物乳杆菌LP4冻干粉更为方便，进而使所述植物乳杆菌LP4冻干粉的货架期更长。
附图说明
图1为实施例1～4制备的植物乳杆菌LP4冻干粉6个月活菌存活率(％)结果图；
图2为实施例5～9制备的植物乳杆菌LP4冻干粉6个月活菌存活率(％)结果图；
图3为实施例10～13制备的植物乳杆菌LP4冻干粉6个月活菌存活率(％)结果图；
图4为实施例14～18制备的植物乳杆菌LP4冻干粉6个月活菌存活率(％)结果图；
图5为对比例1～2和实施例19制备的植物乳杆菌LP4冻干粉6个月活菌存活率(％)结果图。
具体实施方式
下面通过对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。
以下详述本发明。
本申请提供一株植物乳杆菌LP4(Lactobacillus plantarum LP4)，所述植物乳杆菌LP4(Lactobacillus plantarum LP4)是从传统泡菜中分离得到的潜在益生特性的的益生菌；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.14533；分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum LP4)；保藏时间：2017年8月18日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
所述植物乳杆菌LP4(Lactobacillus plantarum LP4)可以用于发酵食品，如发酵牛乳、豆乳、泡菜等，还可以用于制备健康食品，如制备固体饮料、胶囊等，还可以用于制备动物微生态制剂，如制备饲料添加剂、饲料发酵剂等，以及制备农业微生态制剂，如制备微生物肥料、有机肥发酵剂等。
本申请还提供一种制备植物乳杆菌LP4冻干粉的方法，所述方法包括：
步骤1-1，将湿菌体与抗氧化剂混合，搅拌。
在本申请步骤1-1中，所述湿菌体为植物乳杆菌LP4菌体，其中，所述植物乳杆菌LP4的保藏编号为CGMCC No.14533。
本发明人发现，向湿菌体中加入抗氧化剂能够清除自由基，有效保护菌体，预防干燥过程中的氧化损伤，减少菌体细胞膜损伤，提高植物乳杆菌LP4冻干粉的贮藏稳定性。
进一步地，所述抗氧化剂选自谷胱甘肽、茶多酚和维生素E中的一种或多种。本发明人发现，谷胱甘肽、茶多酚和维生素E等抗氧化剂能够迅速脱除菌体细胞膜上的氧自由基，降低菌体的氧化损伤。
在一种可实现的方式中，所述湿菌体与抗氧化剂的重量比为湿菌体的重量:抗氧化剂的重量＝1kg:(10～100)g，其中，湿菌体的重量以湿菌体的总重量计。本发明人发现，该重量份的抗氧化剂能够均匀分散于植物乳杆菌LP4菌体中，形成抗氧化内核，且迅速脱除菌体上的氧自由基，降低菌体的氧化损伤。
所述湿菌体中活菌的数量为6500亿CFU/g以上，在一种可实现的方式中，所述湿菌体可以根据包括以下步骤的方法制备：
步骤2-1，将-80℃冷冻保存的植物乳杆菌LP4(Lactobacillus plantarum LP4)接种于5ml MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24小时，如此传代培养2次得到活化的植物乳杆菌LP4菌种。
步骤2-2，将步骤2-1活化的菌种，接种于经121℃灭菌20min的发酵培养基中，以植物乳杆菌LP4的活菌量计，总接种量为1×107CFU/mL，在37℃恒温厌氧条件下发酵，在发酵过程中自动控制流加氨水保持体系的pH＝5.9，至产酸停止，氨水不再流加时终止发酵，得到植物乳杆菌高密度培养液，所述高密度培养液中植物乳杆菌LP4活菌数为300亿CFU/mL以上，其中，所述发酵培养基由包括以下重量比的组分制备：蔗糖100kg，酵母粉10kg，大豆蛋白胨10kg，酪蛋白胨5kg，胰蛋白胨5kg，柠檬酸1.0kg，柠檬酸钠20kg，MgSO4·7H2O 1.5kg，MnSO4·5H2O 0.08kg，吐温-80 1.0kg，蒸馏水1000L。
步骤2-3，在温度为4-8℃条件下，将步骤2-2制得的高密度培养液冷却至4℃，经14000xg离心浓缩提取湿菌体，提取后的湿菌体与无菌生理盐水，其中，湿菌体与无菌生理盐水的重量之比为湿菌体重量:生理盐水重量＝1:2，混合搅拌30min，再经离心处理脱除原培养基质体系中残留的离子和色素，经此处理的湿菌体纯度高，色泽洁白。
在本申请步骤1-1中，保持体系的温度为2℃～8℃，优选为4℃。本发明人发现，该温度下植物乳杆菌LP4代谢活性降低，处于休眠状态，易于活性保持。
在步骤1-1中，所述混合可以为任意一种将两种物质混合均匀的方法，如使用乳化机乳化、均质机乳化、机械搅拌等，优选为机械搅拌5min。
步骤1-2，将步骤1-1制得的体系与多元醇混合，搅拌。
本发明人发现，多元醇可以清除自由基，预防干燥过程中的菌体的氧化损伤。
在本申请步骤1-2中，所述多元醇选自甘油、甘露醇、山梨醇中的一种或者多种，优选为甘油、甘露醇与山梨醇的组合物，如甘油的重量:甘露醇的重量:山梨醇的重量＝2:1:1的组合物。
在一种可实现的方式中，所述步骤1-1制得的体系与所述多元醇的重量比为步骤1-1制得的体系的重量:多元醇的重量＝1kg:(100～800)g，如1kg:400g，其中，步骤1-1制得的体系的重量以步骤1-1中湿菌体的重量计。本发明人发现，按照该重量比加入多元醇，加入的多元醇能够分散在将植物乳杆菌LP4菌体细胞的周围，形成抗冻保护层，降低冰晶对细胞膜的物理损伤，提高冷冻过程中干燥存活率20％以上，在本申请中，所述干燥存活率是指冷冻干燥后的活菌数与冷冻干燥前活菌数的百分比，用于评价保护剂对菌体的保护效果。
步骤1-3，将步骤1-2制得的体系与碱性多糖或其水分散体系混合，搅拌。
本发明人发现，碱性多糖能够与酸性的菌体发生电荷间的相互作用，而形成微囊结构，将菌体细胞保护起来，植物乳杆菌LP4菌体表面形成的低温微囊具有固定作用。
在本申请步骤1-3中，所述碱性多糖为水分散体系显碱性的多糖，如壳聚糖。
可选地，所述碱性多糖的水分散体系的浓度为1wt％～8wt％，优选为2.5wt％的壳聚糖溶液。
在本申请中，所述浓度是指每单位体积的分散体系中，溶质的重量份数，其中，以1L记为1单位体积，以1g记为1溶质重量份。例如，2.5wt％的壳聚糖溶液是指每升的壳聚糖分散体系中，壳聚糖的重量为25g。
本发明人发现，该浓度的壳聚糖能够在湿菌体中植物乳杆菌LP4菌体表面与所述植物乳杆菌LP4菌体发生凝聚反应，从而在植物乳杆菌LP4菌体表面形成致密的凝胶层，而凝胶持水性好，包覆有凝胶层的菌体无菌液析出，包覆效果好。
在步骤1-3中，所述步骤1-2制得的体系与碱性多糖或其水分散体系的重量比为步骤1-2制得的体系的重量:碱性多糖或其水分散体系的重量＝1kg:(12.5～50)g，优选为1kg:25g，其中，步骤1-2制得的体系的重量以步骤1-1中湿菌体的重量计，所述碱性多糖水分散体系的重量以其中所述碱性多糖的重量计。本发明人发现，按照该重量比加入碱性多糖，加入的碱性多糖能够在湿菌体中植物乳杆菌LP4菌体表面形成包覆层。
步骤1-4，将步骤1-3制得的体系与非碱性多糖或其水分散体系混合，搅拌。
本发明人发现，非碱性多糖能够与碱性多糖发生电荷凝聚反应，从而在已有的微囊表面继续形成凝胶聚合物，将植物乳杆菌LP4菌体细胞更为严密地保护起来。
所述非碱性多糖为水分散体系呈中性或者酸性的多糖，选自纤维素、麦芽糊精、海藻酸钠、明胶、果胶、黄原胶、普鲁兰多糖、大豆多糖、β-葡聚糖、刺云实胶、瓜尔豆胶、葫芦巴胶、槐豆胶、褐藻糖胶、***胶中的一种或者多种，优选为明胶、麦芽糊精、海藻酸钠和***胶组成的组合物，如明胶、麦芽糊精、海藻酸钠和***胶的等重量组合物。
在本步骤1-4中，所述非碱性多糖水分散体系的浓度为3wt％～8wt％，优选地，所述非碱性多糖水分散体系为浓度为5wt％的非碱性多糖组合物溶液，所述非碱性多糖组合物为明胶、麦芽糊精、海藻酸钠与***胶的等重量组合物。本发明人发现，该浓度的非碱性多糖能够与碱性多糖发生电荷凝聚反应，形成结构致密的凝胶聚合物，将植物乳杆菌LP4菌体细胞与外界隔绝开。
在步骤1-4中，所述步骤1-3制得的体系与非碱性多糖或其水分散体系的重量比为步骤1-3制得的体系的重量:非碱性多糖或其水分散体系的重量＝1kg:(25～100)g，优选为1kg:50g，其中，步骤1-3制得的体系的重量以步骤1-1中湿菌体的重量计，所述非碱性多糖水分散体系的重量以其中非碱性多糖的重量计。本发明人发现，该浓度的非碱性多糖能够与碱性糖发生等量的电荷凝聚反应，形成结构致密的凝胶聚合物，制备的冻干菌粉水分≤3％；而加入过多的非碱性多糖会导致体系粘度升高，冻干菌粉水分脱除困难，水分含量≥5％，不易于菌株活性保持。
步骤1-5，将步骤1-4制得的体系与蛋白质及小分子糖混合，搅拌。
本发明人发现，小分子糖能够渗透进入细胞内部，而蛋白质能够分散在细胞间隙，二者协同保护菌体，降低冷冻过程中冰晶对植物乳杆菌LP4菌体细胞结构的破坏。
所述蛋白质选自脱脂乳粉、大豆蛋白粉、脱盐乳清粉中的一种或者多种，优选为脱脂乳粉与脱盐乳清粉组成的组合物，如脱脂乳粉与脱盐乳清粉的等重量组合物。
所述小分子糖选自葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、果糖、低聚果糖、低聚半乳糖中的一种或者多种，优选为海藻糖、乳糖、蔗糖与果糖组成的组合物，如海藻糖、乳糖、蔗糖与果糖的等重量组合物。本发明人发现，加入小分子糖后，植物乳杆菌LP4的细胞膜和蛋白质等生物结构能够有效地被保护，增加菌体抵抗外界不良环境胁迫作用的能力。
在步骤1-5中，所述蛋白质与所述小分子糖的重量比为所述蛋白质的重量:所述小分子糖的重量＝(0.5～1.2):(0.5～1.2)，优选为(0.5～1.0):(0.8～1.0)，如1.0:1.0，其中，如果所述蛋白质为组合物，和/或所述小分子糖也为组合物，则所述蛋白质的重量以蛋白质组合物的总重量计，所述小分子糖以小分子糖组合物的总重量计。
在步骤1-5中，步骤1-4制得的体系与所述蛋白质及小分子糖的重量比为步骤1-4制得的体系的重量:蛋白质的重量:小分子糖的重量＝(1～3):(0.5～1.2):(0.5～1.2)，优选为(1～1.5):(0.5～1.0):(0.8～1.0)，如1.0:1.0:1.0，其中，步骤1-4制得的体系的重量以步骤1-1中湿菌体的重量计，如果所述蛋白质为组合物，和/或所述小分子糖也为组合物，则所述蛋白质的重量以蛋白质组合物的总重量计，所述小分子糖以小分子糖组合物的总重量计。本发明人发现，按照该重量比加入蛋白质及小分子糖能够减缓冷冻干燥过程中结晶冰晶形成的速度、减少冰晶数量和粒度，降低冷冻过程中冰晶对植物乳杆菌LP4菌体细胞结构的破坏，提高冷冻过程中干燥存活率30％以上。
步骤1-6，将步骤1-5制得的体系与碱性多糖或其水分散体系混合，搅拌。
本发明人发现，碱性多糖能够与步骤1-1、1-4中的菌体和非碱性多糖发生电荷凝聚反应形成凝胶，对植物乳杆菌LP4菌体进行多层次的，多重的包埋保护，彻底隔绝空气、温度等不良环境对菌株活性的影响
步骤1-6中所用的碱性多糖可以与步骤1-3中所用的碱性多糖相同，也可不同。如，步骤1-6中可以使用壳聚糖或者壳聚糖水分散体系。
可选地，所述碱性多糖的水分散体系的浓度为1wt％～5wt％的水分散体系，优选地，所述碱性多糖或其水分散体系为浓度为2.5wt％的壳聚糖溶液。本发明人发现，2.5wt％的壳聚糖能够与步骤1-4中的非碱性多糖等量地发生作用，形成凝胶，形成对植物乳杆菌LP4菌体的低温多重包埋处理。
在步骤1-6中，所述步骤1-5制得的体系与碱性多糖或其水分散体系的重量比为步骤1-5制得的体系的重量:碱性多糖或其水分散体系的重量＝1kg:(12.5～50)g，优选为1kg:25g，其中，步骤1-5制得的体系的重量以步骤1-1中湿菌体的重量计，所述碱性多糖水分散体系的重量以其中碱性多糖的重量计。本发明人发现，按照该重量比加入碱性多糖溶液能够与步骤1-4中的非碱性多糖等量地发生作用，形成凝胶，形成对植物乳杆菌LP4菌体的低温多重包埋处理。
本申请步骤1-1至步骤1-6均在温度为2℃-8℃条件下进行，使植物乳杆菌LP4菌体处于休眠状态，以保持菌体的活性。
步骤1-7，将步骤1-6制得的体系冷冻干燥。
在步骤1-7中，冷冻干燥所用方法可以为现有技术中任意一种对乳酸菌进行冷冻干燥的方法，如，将步骤1-6制备的体系液氮速冻至-50℃，后在真空度为≤30pa的环境下按照程序升温进行干燥，程序升温的温度梯度可以为-50℃—-15℃—-5℃—5℃—15℃—30℃，48h后制备成植物乳杆菌LP4冻干粉。
乳酸菌冻干粉的活性与制备过程环境中氧含量密切相关，简单地说，制备过程环境中氧含量越低，制得的乳酸菌冻干粉的活性越高。本发明人发现，制备过程环境中的氧气可以与菌株的细胞膜相互作用而损害菌株DNA的合成，并且会在菌株冻干前产生自由基。因此，本申请选择步骤1-1至步骤1-7均在厌氧的条件下进行，如在氮气保护或者二氧化碳气体保护的条件下进行，以减少自由基的产生，从而提高植物乳杆菌LP4冻干粉中活菌数量以及活菌存活率。
植物乳杆菌LP4湿菌体与不同种类物质之间的相互作用和混合顺序比例，对植物乳杆菌LP4冻干粉的贮藏稳定性影响存在巨大影响。碱性多糖，如壳聚糖优先与明胶、海藻酸钠、***胶等发生凝聚反应，如同时加入这些多糖类物质，不能够使得植物乳杆菌LP4菌体与抗氧化剂、碱性多糖凝聚形成微囊，形不成完整的包埋结构，不利于后期的冷冻干燥和冻干粉贮藏。
本申请还提供一种根据前述方法制备的，所述植物乳杆菌LP4冻干粉中活菌含量为6015亿CFU/g以上，25℃条件下贮藏6个月后活菌存活率为65％以上。
本发明提供的植物乳杆菌LP4冻干粉包被完全，无需在低温环境下通过使菌株休眠来保证菌株的活性，在食品、饲料及医药保健产品中常温贮藏过程也能够保持活性，货架期内能够有效保证活菌数。
实施例
本申请实施例中所用植物乳杆菌LP4的保藏编号为：CGMCC No.14533。
本申请中所用MRS液体培养基购自：广东环凯微生物科技有限公司，微生物检测用；
本申请中所用生理盐水自制。
(一)植物乳杆菌培养液的制备
a.菌种活化:将-80℃冷冻保存的植物乳杆菌LP4(Lactobacillus plantarumLP4)接种于5ml MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24小时，如此传代培养2次得到活化的菌种。
b.接种发酵：将种子培养液接种于121℃灭菌20min后的发酵培养基中，37℃恒温厌氧条件发酵，自动控制流加氨水保持pH5.9发酵至产酸停止，氨水不再流加时终止发酵，得到植物乳杆菌高密度培养液，培养液中Lactobacillus plantarum LP4活菌数为300亿CFU/mL。
发酵培养基由以下组分制备：蔗糖100kg，酵母粉10kg，大豆蛋白胨10kg，酪蛋白胨5kg，胰蛋白胨5kg，柠檬酸1.0kg，柠檬酸钠20kg，MgSO4·7H2O 1.5kg，MnSO4·5H2O 0.08kg，吐温-80 1.0kg，蒸馏水1000L。
c.将冷却至4℃的Lactobacillus plantarum LP4发酵液经14000g离心浓缩提取湿菌体，提取后的湿菌体与无菌PBS缓冲液(湿菌体重量：缓冲液重量＝1:2)混合搅拌30min，再经离心处理后脱除金属离子和残留培养基质提取备用，该操作过程料液温度控制为4-8℃。
实施例1～4菌体保护剂中小分子糖用量的选择
取(一)中制备的湿菌体1kg，添加蛋白质(脱脂乳粉与脱盐乳清粉的等重量组合物)1kg，添加不同用量的小分子糖(海藻糖、乳糖、蔗糖与果糖的等重量组合物)，在相同条件下冻干48小时制备成植物乳杆菌LP4冻干粉，并将制备的植物乳杆菌LP4冻干粉经25℃贮藏6个月，测定活菌存活率，具体如下表1所示：
表1
经比较分析发现，在植物乳杆菌LP4在真空冷冻干燥过程中，添加小分子糖(海藻糖、乳糖、蔗糖与果糖的等重量组合物)能够有效保护其菌体，减少冷冻损伤，提高冻干菌粉的贮藏稳定性。经优化，添加比例为1kg湿菌体添加1kg小分子糖较为合适，具体效果见图1。
在本申请以下的实施例中基于1kg湿菌体，小分子糖的添加量采用1kg/kg。
实施例5～9多元醇对植物乳杆菌LP4冻干粉的影响
取(一)中制备的湿菌体1kg，向其中添加蛋白质(脱脂乳粉与脱盐乳清粉的等重量组合物)1kg，小分子糖(海藻糖、乳糖、蔗糖与果糖的等重量组合物)1000g，在其基础上添加不同比例的多元醇(甘油的重量:甘露醇的重量:山梨醇的重量＝2:1:1的组合物)，在相同条件下真空冻干48小时制备成植物乳杆菌LP4冻干粉，经25℃贮藏6个月，测定活菌存活率，具体如下表2所示：
表2
经比较分析发现，在真空冷冻干燥过程中，添加多元醇(甘油的重量:甘露醇的重量:山梨醇的重量＝2:1:1组合物)能够有效保护其菌体，减少冷冻损伤，提高植物乳杆菌LP4冻干菌粉的贮藏稳定性。经优化，添加比例为1kg湿菌体添加0.4kg多元醇较为合适，具体效果见图2。
在本申请以下的实施例中基于1kg湿菌体，多元醇的添加量采用0.4kg/kg。
实施例10～13多糖用量对植物乳杆菌LP4冻干粉的影响
取(一)中制备的湿菌体1kg，向其中添加蛋白质(脱脂乳粉:脱盐乳清粉的等重量组合物)1kg，小分子糖(海藻糖、乳糖、蔗糖与果糖的等重量组合物)1000g，多元醇(甘油的重量:甘露醇的重量:山梨醇的重量＝2:1:1的组合物)400g，在其基础上添加不同比例的多糖，具体地，在加入多元醇后首次加入壳聚糖，然后加入非碱性多糖组合物(明胶、麦芽糊精、海藻酸钠、***胶的等重量组合物)，接着二次加入壳聚糖，在相同条件下真空冻干48h，制备成植物乳杆菌LP4冻干粉，经25℃贮藏6个月，测定活菌存活率，具体如下表3所示：
表3
经比较分析发现，在植物乳杆菌LP4真空冷冻干燥过程中，按照碱性多糖-非碱性多糖-碱性多糖的顺序依次添加多糖类物质能够有效保护其菌体，减少冷冻损伤，提高植物乳杆菌LP4冻干菌粉的贮藏稳定性。经优化，添加比例为基于1kg湿菌体，首次添加碱性多糖25g，非碱性多糖50g，二次添加碱性多糖25g较为合适，具体效果见图3。
在本申请以下的实施例中基于1kg湿菌体，首次碱性多糖的添加量采用25g/kg，非碱性多糖的添加量为50g/kg，二次碱性多糖的添加量采用25g/kg，在以下实施例中，简记为多糖添加总量为0.10kg。
实施例14～18抗氧化剂添加量对植物乳杆菌LP4冻干粉的影响
取(一)中制备的湿菌体1kg，向其中蛋白质(脱脂乳粉与脱盐乳清粉的等重量组合物，小分子糖(海藻糖、乳糖、蔗糖与果糖的等重量组合物)1000g，多元醇(甘油的重量:甘露醇的重量:山梨醇的重量＝2:1:1组合物)400g，多糖的添加总量为0.1kg，在其基础上添加不同比例的抗氧化剂(谷胱甘肽的重量:茶多酚的重量:维生素E的重量＝1:1:2的组合物)在相同条件下真空冻干48h，制备成植物乳杆菌LP4冻干菌粉，经25℃贮藏6个月，测定活菌存活率，具体如下表4所示：
表4
经比较分析发现，在植物乳杆菌LP4真空冷冻干燥过程中，添加抗氧化剂(谷胱甘肽的重量:茶多酚的重量:维生素E的重量＝1:1:2的组合物)能够有效保护其菌体，减少菌体细胞膜损伤，提高冻干菌粉的贮藏稳定性。经优化，添加比例为1kg湿菌体添加0.04kg抗氧化剂较为合适，具体效果见图4。
在本申请以下的实施例中基于1kg湿菌体，抗氧化剂的添加量采用0.04kg/kg。
实施例19低温多重微囊包被工艺制备植物乳杆菌LP4冻干粉
步骤1：取10g抗氧化剂(谷胱甘肽的重量:茶多酚的重量:维生素E的重量＝1:1:2的组合物)加入1kg(一)中制备的湿菌体中搅拌5min，再加入400g多元醇(甘油的重量:甘露醇的重量:山梨醇的重量＝2:1:1的组合物)继续搅拌5min；
步骤2：向步骤1制得的体系中加入到2.5wt％的壳聚糖溶液1000mL-中，搅拌15min，然后经均质机混合分散为均一液体；
步骤3：向步骤2制得的均一液体中5wt％的非碱性多糖(明胶、麦芽糊精、海藻酸钠与***胶的等重量组合物)溶液1000mL，搅拌15min，然后经均质机混合分散为均一液体；
步骤4：向步骤3制得的均一液体中加入蛋白质(脱脂乳粉与脱盐乳清粉的等重量组合物)1000g和小分子糖(海藻糖、乳糖、蔗糖与果糖的等重量组合物)1000g搅拌混合均匀；
步骤5：将步骤4制得的体系加入到2.5wt％的壳聚糖溶液1000mL中，搅拌15min，然后经均质机混合分散为均一的液体。
以上操作过程中物料及环境温度控制在2℃-8℃。
混合溶液经48h真空冷冻干燥后制得植物乳杆菌LP4冻干粉，所述植物乳杆菌LP4冻干粉中的活菌含量为6015亿CFU/g以上，25℃贮藏6个月后活菌存活率为67.149％。
对比例
对比例1室温一次混合制备植物乳杆菌LP4冻干粉
取抗氧化剂(谷胱甘肽的重量:茶多酚的重量:维生素E的重＝1:1:2的组合物)10g、多元醇(甘油的重量:甘露醇的重量:山梨醇的重量＝2:1:1的组合物)400g、非碱性多糖(明胶、麦芽糊精、海藻酸钠与***胶的等重量组合物)50g，蛋白质(脱脂乳粉与脱盐乳清粉的等重量组合物)1000g，小分子糖(海藻糖、乳糖、蔗糖与果糖的等重量组合物)1000g和1kg(一)中制备的湿菌体搅拌30min，然后经均质机混合分散为均一的液体。
将制得的体系经48h真空冷冻干燥后制得植物乳杆菌PL4冻干粉，所述植物乳杆菌PL4冻干粉在25℃贮藏6个月后活菌存活率为41.529％。
对比例2低温微囊固定制备植物乳杆菌LP4冻干粉
步骤1：取10g抗氧化剂(谷胱甘肽的重量:茶多酚的重量:维生素E的重＝1:1:2的组合物)加入(一)中制备的1kg湿菌体中，搅拌5min，再加入400g多元醇(甘油的重量:甘露醇的重量:山梨醇的重量＝2:1:1的组合物)继续搅拌5min；
步骤2：将步骤1中混合均匀的液体加入到2.5wt％的壳聚糖溶液1000mL中，搅拌15min，然后经均质机混合分散为均一的液体；
步骤3：将步骤2中的均一液体与5wt％的非碱性多糖(明胶、麦芽糊精、海藻酸钠与***胶的等重量组合物)溶液1000mL，搅拌15min，然后经均质机混合分散为均一的液体；
步骤4：将步骤3中的均一液体与蛋白质(脱脂乳粉与脱盐乳清粉的等重量组合物)1000g和小分子糖(海藻糖、乳糖、蔗糖与果糖的等重量组合物)1000g搅拌混合均匀。
以上操作过程中物料及环境温度控制2-8℃。
混合溶液经48h真空冷冻干燥后制得冻干菌粉，冻干菌粉25℃贮藏6个月后活菌存活率为52.372％。
经比较分析发现，在植物乳杆菌PL4真空冷冻干燥过程中，不采用微囊技术(对比例1)、仅一次包被的微囊化工艺处理菌体(对比例2)以及本申请提供的二次包被微囊化工艺处理菌体(实施例19)，能够有效减少菌体对外界不良环境，如温度、氧气的胁迫作用，减少细胞损伤，提高植物乳杆菌PL4冻干粉的贮藏稳定性。经优化，低温多重微囊包被工艺适合高贮藏稳定性植物乳杆菌PL4冻干粉的加工制备，具体效果见图5。
采用低温多重微囊包被工艺-制备的植物乳杆菌LP4冻干菌粉，避免了乳酸菌冻干粉剂在常温贮藏过程中易失活，货架期内无法有效保证活菌数，影响其功效的弊端，可以广泛应用于食品、饲料及医药产品中，稳定产品品质和发挥其健康功效。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。
序列表
<110> 金华银河生物科技有限公司
<120> 一株植物乳杆菌、该植物乳杆菌冻干粉及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1478
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
caatctctgt caccttaggc ggctggttcc taaaaggtta ccccaccgac tttgggtgtt 60
acaaactctc atggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc 120
atgctgatcc gcgattacta gcgattccga cttcatgtag gcgagttgca gcctacaatc 180
cgaactgaga atggctttaa gagattagct tactctcgcg agttcgcaac tcgttgtacc 240
atccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc 300
caccttcctc cggtttgtca ccggcagtct caccagagtg cccaacttaa tgctggcaac 360
tgataataag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctyacgac asgagctgay 420
gayaaccatg caccacmtgt atccatgtcc cygragggar sgtstaatmt yttagatttg 480
catagtatgt caagacstgg taaggttctt cgcgtagctt cgaattaaac cacatgctcc 540
acsgyttgtg cgggcscccg tcaattcctt tgagtttcag ccttgcggcc gtactcccca 600
ggcggaatgc ttaatgcgtt agctgcagca ytgaagggcg gaaaccctcc aacacttagc 660
attcatcgtt tacggtatgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctac ccatactttc 720
gagcctcagc gtcagttaca gaccagacag ccgccttcgc cactggtgtt cttccatata 780
tctacgcatt tcaccgctac acatggagtt ccactgtcct cttctgcact caagtttccc 840
agtttccgat gcacttcytc ggtkgagccg aaggctttca catcaractt aaaaaaccgc 900
ctgcgctcgc tttacgccca ataaatccgg acaacgcttg scwcctacrt attaccgcgs 960
ctgctggcac gtarttagcc gwggctttct ggttaaatac cgtcaatacc tgaacagtta 1020
ctctcagata tgttcttctt taacaacaga gttttacgag ccgaaaccct tcttcactca 1080
cgcggcgttg ctccatcaga ctttcgtcca ttgtggaaga ttccctactg ctgcctcccg 1140
taggagtttg ggccgtgtct cagtcccaat gtggccgatt accctctcag gtcggctacg 1200
tatcattgcc atggtgagcc gttaccccac catctagcta atacgccgcg ggaccatcca 1260
aaagtgatag ccgaagccat ctttcaagct cggaccatgc ggtccaagtt gttatgcggt 1320
attagcatct gtttccaggt gttatccccc gcttctgggc aggtttccca cgtgttactc 1380
accagttcgc cactcactca aatgtaaatc atgatgcaag caccaatcaa taccagagtt 1440
cgttcgactt gcatgtatag cacgccgcca gcgtcgcc 1478

Claims (10)

1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum LP4)，其特征在于，其微生物保藏编号为CGMCC No.14533。
2.一种制备植物乳杆菌LP4冻干粉的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1-1，将湿菌体与抗氧化剂混合，搅拌，其中，所述湿菌体为植物乳杆菌LP4的菌体，其微生物保藏编号为CGMCC No.14533；
步骤1-2，将步骤1-1制得的体系与多元醇混合，搅拌；
步骤1-3，将步骤1-2制得的体系与碱性多糖或其水分散体系混合，搅拌；
步骤1-4，将步骤1-3制得的体系与非碱性多糖或其水分散体系混合，搅拌；
步骤1-5，将步骤1-4制得的体系与蛋白质及小分子糖混合，搅拌；
步骤1-6，将步骤1-5制得的体系与碱性多糖或其水分散体系混合，搅拌；
步骤1-7，将步骤1-6制得的体系冷冻干燥。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1-1至步骤1-7均在温度为2℃-8℃，厌氧的条件下进行。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤1-1中，
所述氧化剂选自谷胱甘肽、茶多酚和维生素E中的一种或多种；和/或
所述湿菌体与抗氧化剂的重量比为湿菌体的重量:抗氧化剂的重量＝1kg:(10～100)g，其中，湿菌体的重量以湿菌体的总重量计。
5.根据权利要求2至4任一项所述的方法，其特征在于，在步骤1-2中，
所述多元醇选自甘油、甘露醇、山梨醇中的一种或者多种；和/或
所述步骤1-1制得的体系与所述多元醇的重量比为步骤1-1制得的体系的重量:多元醇的重量＝1kg:(100～800)g，其中，步骤1-1制得的体系的重量以步骤1-1中湿菌体的重量计。
6.根据权利要求2至5任一项所述的方法，其特征在于，在步骤1-3中，
所述碱性多糖为水分散体系显碱性的多糖，优选为壳聚糖；
所述碱性多糖的水分散体系的浓度为3wt％～8wt％；
所述步骤1-2制得的体系与碱性多糖或其水分散体系的重量比为步骤1-2制得的体系的重量:碱性多糖或其水分散体系的重量＝1kg:(12.5～50)g，优选为1kg:25g，其中，步骤1-2制得的体系的重量以步骤1-1中湿菌体的重量计，所述碱性多糖水分散体系的重量以其中所述碱性多糖的重量计。
7.根据权利要求2至6任一项所述的方法，其特征在于，在步骤1-4中，
所述非碱性多糖为水分散体系呈中性或者酸性的多糖，优选选自纤维素、麦芽糊精、海藻酸钠、明胶、果胶、黄原胶、普鲁兰多糖、大豆多糖、β-葡聚糖、刺云实胶、瓜尔豆胶、葫芦巴胶、槐豆胶、褐藻糖胶、***胶中的一种或者多种；
所述非碱性多糖水分散体系的浓度为3wt％～8wt％；
所述步骤1-3制得的体系与非碱性多糖的重量比为步骤1-3制得的体系的重量:非碱性多糖或其水分散体系的重量＝1kg:(25～100)g，其中，步骤1-3制得的体系的重量以步骤1-1中湿菌体的重量计，所述非碱性多糖水分散体系的重量以其中非碱性多糖的重量计。
8.根据权利要求2至7任一项所述的方法，其特征在于，在步骤1-5中，
所述蛋白质选自脱脂乳粉、大豆蛋白粉、脱盐乳清粉中的一种或者多种；
所述小分子糖选自葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、果糖、低聚果糖、低聚半乳糖中的一种或者多种；
所述蛋白质与所述小分子糖的重量比为所述蛋白质的重量:所述小分子糖的重量＝(0.5～1.2):(0.5～1.2)，其中，如果所述蛋白质为组合物，和/或所述小分子糖也为组合物，则所述蛋白质的重量以蛋白质组合物的总重量计，所述小分子糖以小分子糖组合物的总重量计。
9.根据权利要求2至8任一项所述的方法，其特征在于，在步骤1-6中，
所述步骤1-5制得的体系与碱性多糖或其水分散体系的重量比为步骤1-5制得的体系的重量:碱性多糖或其水分散体系的重量＝1kg:(12.5～25)g，其中，步骤1-5制得的体系的重量以步骤1-1中湿菌体的重量计，所述碱性多糖水分散体系的重量以其中碱性多糖的重量计。
10.一种根据权利要求2至9任一项所述方法制备的植物乳杆菌LP4冻干粉，其特征在于，所述植物乳杆菌LP4冻干粉中活菌含量为6015亿CFU/g以上，25℃条件下贮藏6个月后活菌存活率为65％以上。
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