KR20120039015A

KR20120039015A - 인간 배아 줄기 세포의 분화

Info

Publication number: KR20120039015A
Application number: KR1020127003766A
Authority: KR
Inventors: 쑤진
Original assignee: 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date: 2009-07-20
Filing date: 2010-07-19
Publication date: 2012-04-24
Also published as: EP2456862A4; CA2768643C; US20190030086A1; AR077325A1; RU2579278C2; MX2012000897A; US20110014163A1; BR112012001480A2; GB201202844D0; US10076544B2; JP6219568B2; RU2012105922A; CN102482643A; ZA201201219B; JP2012533629A; WO2011011300A2; US20200030382A1; US11369642B2; JP2016164190A; GB2484873B

Abstract

본 발명은 췌장 내분비 전구 세포 집단을 동물 내로 이식함으로써 동물에서 혈당 수준을 강하시키는 방법을 제공한다.

Description

인간 배아 줄기 세포의 분화{DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS}

관련 출원과의 상호 참조

본 발명은 2009년 7월 20일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/226,923호를 우선권으로 주장한다.

제1형 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포 대체 치료법의 발전으로, 생착(engraftment)에 적합한 인슐린 생산 세포, 또는 β 세포의 공급원을 개발하는 데 관심이 집중되어 왔다. 한 가지 접근법은 예를 들어, 배아 줄기 세포와 같은 만능 줄기 세포로부터 기능성 β 세포를 생성하는 것이다.

척추동물 배아 발생에서, 만능 세포는 낭배형성 (gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층 (three germ layers) (외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 예를 들어, 갑상선, 흉선, 췌장, 소화관, 및 간과 같은 조직은 중간 단계를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽의 형성이다. 완성 내배엽 세포는 예를 들어 HNF3 베타, GATA4, MIXL1, CXCR4 및 SOX17과 같은 많은 마커를 발현한다.

췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화로부터 생긴다. 췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스(homeobox) 유전자, Pdx1을 발현한다. Pdx1의 부재 하에서는, 췌장은 복측 원기(ventral bud) 및 배측 원기(dorsal bud)의 형성 이상으로는 발달하지 못한다. 따라서, Pdx1 발현이 췌장 기관형성에서 중요한 단계를 특징짓는다. 성숙한 췌장은 다른 세포형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 포함한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.

췌도 세포의 특징을 지닌 세포가 생쥐의 배아 세포로부터 유도된 것으로 보고되었다. 예를 들어, 루멜스키(Lumelsky) 등 (문헌[Science 292:1389, 2001])은 생쥐 배아 줄기 세포가 췌도와 유사한 인슐린 분비 구조로 분화한 것을 보고하였다. 소리아(Soria) 등(문헌[Diabetes 49:157, 2000])은 생쥐 배아 줄기 세포로부터 유도된 인슐린 분비 세포가 스트렙토조토신 유도된 당뇨 생쥐에서 혈당을 정상화시킴을 보고하였다.

한 예에서, 호리(Hori) 등 (문헌[PNAS 99: 16105, 2002])은 생쥐 배아 줄기 세포를 포스포이노시티드 3-키나아제의 억제제(LY294002)로 처리하여 β 세포와 닮은 세포를 생성하였음을 개시하였다.

다른 예에서는, 블리츠주크(Blyszczuk) 등 (문헌[PNAS 100:998, 2003])은 구성적으로 Pax4를 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포로부터 인슐린 생산 세포를 생성하는 것을 보고하였다.

미칼레프(Micallef) 등은 PDX1 양성 췌장 내배엽이 형성되게 하는 배아 줄기 세포의 책무(commitment)를 레틴산이 조절할 수 있음을 보고하였다. 레틴산은 배아에서 낭배형성의 마지막에 해당하는 기간 동안 배아 줄기 세포 분화의 4일째에 배양물에 첨가될 때 PDX1 발현을 유도하는 데 가장 효과적이다 (문헌[Diabetes 54:301, 2005]).

미야자키(Miyazaki) 등은 Pdx1을 과다 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포주를 보고한다. 그들의 결과는 외인성 Pdx1 발현이 생성된 분화된 세포에서 인슐린, 소마토스타틴, 글루코키나아제, 뉴로제닌3, P48, Pax6, 및 HNF6 유전자의 발현을 명확히 향상시켰음을 보여준다 (문헌[Diabetes 53: 1030, 2004]).

스쿠디(Skoudy) 등은 액티빈(activin) A(TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원)가 생쥐 배아 줄기 세포에서 외분비 췌장 유전자(p48 및 아밀라아즈) 및 내분비 유전자(Pdx1, 인슐린, 및 글루카곤)의 발현을 상향조절함을 보고한다. 최대 효과는 1 nM 액티빈 A를 이용할 때 관찰되었다. 그들은 또한 인슐린 및 Pdx1 mRNA의 발현 수준이 레틴산에 의해 영향을 받지 않지만, 3 nM FGF7 처리가 Pdx1의 전사체의 수준을 증가시킴을 관찰하였다 (문헌[Biochem. J. 379: 749, 2004]).

쉬라키(Shiraki) 등은 배아 줄기 세포의 PDX1 양성 세포로의 분화를 특이적으로 향상시키는 성장 인자들의 효과를 연구하였다. 이들은 TGF-β2가 재현가능하게 더 높은 비율의 Pdx1 양성 세포를 생성함을 관찰하였다 (문헌[Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16]).고든(Gordon) 등은 Wnt 시그널링 억제제와 함께 액티빈의 존재 하에 그리고 혈청의 부재 하에, 생쥐 배아 줄기 세포로부터 브라키어리(brachyury) [양성]/HNF3 베타 [양성] 내배엽 세포의 유도를 보여주었다 (미국 특허 공개 제2006/0003446A1호).

고든(Gordon) 등(문헌[PNAS, Vol 103, page 16806, 2006])은"Wnt 및 TGF-베타/ 노달(nodal)/ 액티빈 시그널링은 전방 원시선(anterior primitive streak)의 생성에 동시에 필요하였다"라고 진술한다.

그러나, 배아 줄기 세포 발생의 생쥐 모델은 예를 들어, 인간과 같은 고등 포유류에서의 발생 프로그램을 정확하게 모방하지 않을 수 있다.

톰슨(Thomson) 등은 인간 배반포로부터 배아 줄기 세포를 단리하였다 (문헌[Science 282:114, 1998]). 동시에, 기어하트(Gearhart)와 동료들은 태아 생식선 조직으로부터 인간 배아 배(human embryonic germ, hEG) 세포주를 유도하였다 (문헌[Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998]). 백혈병 억제 인자(LIF)와 함께 배양함으로써 간단하게 분화를 방지할 수 있는 생쥐 배아 줄기 세포와는 달리, 인간 배아 줄기 세포는 매우 특별한 조건 하에서 유지되어야 한다 (미국 특허 제6,200,806호; 국제특허 공개 WO 99/20741호; 국제특허 공개 WO 01/51616호).

드'아무르(D'Amour) 등은 고농도의 액티빈과 저 혈청의 존재 하에서 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽의 농축 배양물의 생성을 개시한다 (문헌[Nature Biotechnology 2005]). 생쥐의 신장 피막하에 이들 세포를 이식하면 일부 내배엽 기관의 특징을 가진 보다 성숙한 세포로의 분화가 야기되었다. 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽 세포는 FGF-10의 첨가 후에 Pdx1 양성 세포로 추가로 분화될 수 있다 (미국 특허 출원 공개 제2005/0266554A1호).

드'아무르 등 (문헌[Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)])은 "우리는 인간 배아 줄기 (hES) 세포를 췌장 호르몬 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드 및 그렐린(ghrelin)을 합성할 수 있는 내분비 세포로 전환시키는 분화 과정을 개발하였다. 이 과정은 도중에 완성 내배엽, 창자관 내배엽, 췌장 내배엽, 및 내분비 전구체를 닮은 단계들을 통해 세포를 내분비 호르몬 발현 세포가 되도록 함으로써 생체내 (in vivo) 췌장 기관형성을 모방한다고" 밝혔다.

다른 예에서, 피스크(Fisk) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터 췌도 세포를 생성하는 시스템을 보고하였다 (미국 특허 출원 공개 제2006/0040387A1호). 이 경우에, 분화 경로를 세 단계로 나누었다. 먼저, 인간 배아 줄기 세포는 부티르산나트륨과 액티빈 A의 조합을 사용하여 내배엽으로 분화되었다. 이어서, EGF 또는 베타셀룰린과 조합된 노긴(Noggin)과 같은 TGF-β 길항제를 이용하여 세포를 배양하여 Pdx1 양성 세포를 생성하였다. 마지막 분화는 니코틴아미드에 의해 유도되었다.

일 예에서, 벤베니스트리(Benvenistry) 등은 "우리는 Pdx1의 과다 발현이 췌장에 풍부한 유전자의 발현을 향상시켰으며 인슐린 발현의 유도는 생체내에서만 존재하는 추가의 시그널을 필요로 할 수 있다고 결론내린다"라고 진술한다 (문헌[Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24:1923-1930]).

다른 예에서, 미국 특허 공개 제2008/0241107A1호는 a) 인슐린을 생성하지 않는 세포를 얻는 단계; 및 b) 상기 세포를 고 글루코스를 함유하는 배지를 이용하여 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 인슐린을 분비하는 세포를 생성하는 방법을 청구하는데, 여기서 상기 세포는 인슐린을 분비한다.

따라서, 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 또는 췌장 호르몬 분비 세포로 분화하는 잠재력을 보유하는 한편, 현재의 임상적 필요성에 대처하도록 확장될 수 있는 만능 줄기 세포주를 확립하기 위한 조건을 개발하는 것에 대한 상당한 필요성이 여전히 남아있다. 본 발명자들은 인간 배아 줄기 세포를 췌장 내분비 세포로 분화시키는 효율을 향상시키기 위해 대안적인 접근법을 취하였다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 췌장 내분비 전구 세포 집단을 동물 내로 이식함으로써 동물에서 혈당 수준을 강하시키는 방법을 제공한다.

<도 1>
도 1은 NKX6.1 (패널 a), PDX1 (패널 b), PTF1 알파 (패널 c) 및 NGN3 (패널 d)의 발현에 대한 상이한 기본 배지의 영향을 나타낸다. 이중 샘플을 제4기, 3일에 실시간 PCR 분석용으로 수집하였다. 도표는 DMEM/F12와 관련하여 각각의 유전자의 유도 배수를 나타낸다.
<도 2>
도 2는 실시예 1에 기재된 바와 같이 처리된, 제4기, 3일에 DMEM-고 글루코스 (패널 b, 패널 d, 패널 f 및 패널 h)로 처리된 세포 및 DMEM/F12 (패널 a, 패널 c, 패널 e 및 패널 g)로 처리된 세포에 있어서 췌장 마커 PDX1 (패널 a 및 패널 b), NKX6.1 (패널 c 및 패널 d), CDX2 (패널 e 및 패널 f) 및 NGN3 (패널 g 및 패널 h)의 면역형광 이미지를 나타낸다.
<도 3>
도 3은 실시예 2에 기재된 방법에 따라 처리된 세포의 샘플로부터의 PDX1 (패널 a), NKX6.1 (패널 b), PTF1 알파 (패널 c), NGN3 (패널 d), PAX4 (패널 e) 및 NKX2.2 (패널 f)의 발현을 나타낸다. 이중 샘플이 지시된 시점에서의 실시간 PCR 분석용으로 수집되었다. 도표는 제3기, 1일에서의 유전자의 발현에 관련된 각각의 유전자의 유도 배수를 나타낸다.
<도 4>
도 4는 실시예 2에 기재된 방법에 따라 처리된 세포에서의 인슐린 (INS), 글루카곤 (GCG), PDX1, NKX6.1, NGN3, MAFB 및 NEUROD의 발현을 나타낸다. 이중 샘플이 실시간 PCR 분석용으로 수집되었다. 도표는 제3기, 4일에서의 유전자의 발현에 관련된 각각의 유전자의 유도 배수를 나타낸다. 연한 회색 막대는 제3기, 4일에 수확된 세포로부터 취해진 샘플로부터의 데이터를 나타낸다. 진한 회색 막대는 제4기, 3일에 수확된 세포로부터 취해진 샘플로부터의 데이터를 나타낸다. 흑색 막대는 제5기, 5일에 수확된 세포로부터 취해진 샘플로부터의 데이터를 나타낸다.
<도 5>
도 5의 패널 a는 실시예 3에 기재된 방법에 따라 처리된 세포에서의 PDX1, NKX6.1, NGN, 및 PTF1 알파의 발현을 나타낸다. 이중 샘플은 제4기, 3일에 실시간 PCR 분석용으로 수집되었다. 도표는 제4기, 3일에 처리군 1의 유전자의 발현에 관련된 각각의 유전자의 유도 배수를 나타낸다. 연한 회색 막대는 T1 (처리 1) 군으로부터 수확된 세포로부터 취해진 샘플로부터의 데이터를 나타낸다. 백색 막대는 T2 (처리 2) 군으로부터 수확된 세포로부터 취해진 샘플로부터의 데이터를 나타낸다. 진한 회색 막대는 T3 (처리 3) 군으로부터 수확된 세포로부터 취해진 샘플로부터의 데이터를 나타낸다. 백색 막대는 T4 (처리 4) 군으로부터 수확된 세포로부터 취해진 샘플로부터의 데이터를 나타낸다. 패널 b는 실시예 3에 기재된 방법에 따라 처리된 세포에서의 인슐린의 발현을 나타낸다. 이중 샘플은 제4기, 3일, (S4, D3), 및 제4기, 8일 (S4, D8)에 실시간 PCR 분석용으로 수집되었다. 도표는 제4기, 3일에 처리군 1(T1)의 유전자의 발현에 관련된 각각의 유전자의 유도 배수를 나타낸다.
<도 6>
도 6은 이식된 내분비 전구 세포의 글루코스 자극된 인간 C-펩티드의 방출 동력학적 특성을 나타낸다. 구체적으로, 글루코스를 투여한지 60분 후 인간 C-펩티드 (y-축)의 수준이 나타내어져 있다. x-축은 동물 마리수 및 이식 후 일수를 나타낸다.
<도 7>
도 7은 이식된 내분비 전구 세포의 글루코스 자극된 인간 C-펩티드의 방출 동력학적 특성을 나타낸다. 구체적으로, 글루코스를 투여한지 60분 후 인간 C-펩티드 (y-축)의 수준 (패널 a), 및 글루코스를 투여하기 전후의 인간 C-펩티드의 수준 (패널 b)이 나타내어져 있다. x-축은 동물 마리수 및 이식 후 일수를 나타낸다.
<도 8>
도 8은 이식된 내분비 전구 세포의 글루코스 자극된 인간 C-펩티드의 방출 동력학적 특성을 나타낸다. 구체적으로, 글루코스를 투여한지 60분 후 인간 C-펩티드 (y-축)의 수준이 나타내어져 있다. x-축은 동물 마리수 및 이식 후 일수를 나타낸다.
<도 9>
도 9는 이식된 내분비 전구 세포의 글루코스 자극된 인간 C-펩티드의 방출 동력학적 특성을 나타낸다. 구체적으로, 글루코스를 투여한지 60분 후 인간 C-펩티드 (y-축)의 수준 (패널 a), 및 글루코스를 투여하기 전후의 인간 C-펩티드의 수준 (패널 b)이 나타내어져 있다. x-축은 동물 마리수 및 이식 후 일수를 나타낸다.
<도 10>
도 10은 이식된 내분비 전구 세포의 글루코스 자극된 인간 C-펩티드의 방출 동력학적 특성을 나타낸다. 구체적으로, 글루코스를 투여한지 60분 후 인간 C-펩티드 (y-축)의 수준 (패널 a), 및 글루코스를 투여하기 전후의 인간 C-펩티드의 수준 (패널 b)이 나타내어져 있다. x-축은 동물 마리수 및 이식 후 일수를 나타낸다.
<도 11>
도 11은 임플란트 후 3주에 이식체 샘플의 형태 및 면역형광 분석을 나타낸다. a) 인간 핵 항원 및 DAPI에 대한 염색; b) CK19 및 PDX1에 대한 염색에서의 연속 섹션으로부터의 현미경 사진이 나타내어져 있다.
<도 12>
도 12는 이식 후 3주 (패널 a), 10주 (패널 b) 및 13주 (패널 c)에서 인슐린 및 글루카곤에 대하여 염색된 이식체 샘플의 형태 및 면역형광 분석을 나타낸다. 패널 d는 이식 후 13주에 PDX1 및 인슐린에 대하여 염색된 이식체 샘플의 형태 및 면역형광 분석을 나타낸다. 패널 e는 이식 후 13주에 NEUROD1 및 인슐린에 대하여 염색된 이식체 샘플의 형태 및 면역형광 분석을 나타낸다.

개시내용을 분명하게 하고 제한되지 않기 위해, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본 발명의 소정 특징, 실시 형태 또는 응용을 기재 또는 예시하는 하기 세부 항목으로 나뉘어진다.

정의

줄기 세포는 단일 세포 레벨에서 자가 재생하고 분화하여 자가 재생 전구 세포, 비재생 전구 세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포 (progeny cell)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직을 발생시키며, 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.

줄기 세포는 그들의 발생 잠재력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배자외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (3) 세포 계통의 하위세트이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위세트가 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성(예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 조상세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 다능 줄기 세포보다 더 제한된 하위세트의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통(예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.

분화는 특화되지 않은 ("미결정된(uncommitted)") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화 유도된 세포는 세포 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된(committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 통상적인 환경하에서 특정 세포형 또는 세포형의 서브세트로 계속 분화할 것이며, 통상적인 환경하에서 다른 세포형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화는 세포가 세포 계통 내의 덜 특화된 (또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포 계통은 세포의 유전, 즉, 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포를 발생시킬 수 있는지를 규정한다. 세포 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 대상 계통의 세포 표현형과 특이적으로 관련되며, 미결정된 세포가 대상 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포", 또는 "제1기 세포", 또는 "제1기"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: SOX-17, GATA-4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달(Nodal), FGF8, 브라키우리(Brachyury), Mix-유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소더민(eomesodermin)(EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99, 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: PDX1, HNF-1 베타, PTF1 알파, HNF6, 또는 HB9. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포, 원시 장관(gut tube) 세포, 및 후방 전장 세포를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, MAFB, 인슐린, 글루카곤, 또는 소마토스타틴. 췌장 내분비 계통에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 및 췌장 호르몬 분비 세포, 및 β-세포 계통의 세포를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽"은 낭배의 외피(epiblast)로 인한 세포의 특징을 갖고 위장관로 및 그의 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커를 발현한다: HNF3 베타, GATA4, SOX17, 세르베루스(Cerberus), OTX2, 구스코이드(goosecoid), C-키트, CD99 및 MIXL1.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 레벨 증가 및 음성 마커의 레벨 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 레벨은 다른 세포에 비하여 대상 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 대상 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되어 구별될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 세포" 또는 "췌장 호르몬 발현 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 전구 세포"는 NGN3을 발현하며 췌도 호르몬-발현 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는 내분비계 세포로 추가로 분화될 수 있는 완성 내배엽 계통의 다능성 세포를 말한다. 내분비 전구 세포는 덜 특정하게 분화된 완성 내배엽 계통 세포, 예를 들어 PDX1 양성 췌장 내배엽 세포에 비교되는 만큼의 많은 상이한 세포, 조직 및/또는 기관 유형으로 분화될 수는 없다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 호르몬 생산 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 생산할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 호르몬 분비 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.

만능 줄기 세포의 단리, 팽창 및 배양

만능 줄기 세포의 특성화

만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다(문헌[Thomson et al., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현(존재하는 경우)의 손실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼라인 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사 (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories))가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때, Oct-4 및 TERT를 발현한다.

증식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 만능 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficient, SCID) 생쥐내로 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 이어서 삼배엽층으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 만능성은 배상체를 형성하고, 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배상체를 평가함으로써 결정될 수 있다.

증식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.

만능 줄기 세포의 공급원

사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 전-배아(pre-embryonic) 조직(예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 동안 그러나 전형적으로 약 10-12주 임신 전일 필요는 없는 임의의 시점에 취한 태아 조직을 비롯한, 임신 후 형성된 조직으로부터 유래된 만능 세포의 확립된 주를 포함한다. 비제한적인 예로는 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 배아 배 세포의 확립된 주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9 (WiCell)가 있다. 이러한 세포의 초기 수립 또는 안정화 시에 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 만능성 세포일 것이다. 영양세포의 부재하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BG01v (BresaGen (Athens, GA))가 또한 적합하다.

일 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 톰슨 (Thomson) 등에 의해 문헌 [참조: 미국 특허 제5,843,780호; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998]; 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995]에 기재된 바와 같이 제조된다.

만능 줄기 세포의 배양

일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 전형적으로 다양한 방식으로 만능 줄기 세포를 지지하는 영양 세포층 상에서 배양된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 본질적으로 영양 세포가 없지만, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양된다. 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지를 이용하여 지지된다. 대안적으로, 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.

예를 들어, 문헌[Reubinoff et al ., Nature Biotechnology 18: 399 - 404 (2000)] 및 문헌[Thompson et al, Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 - 1147]은 생쥐 배아 섬유아세포 영양 세포층을 사용하여 인간 배반포로부터 만능 줄기 세포주를 배양하는 것을 개시한다.

리차즈(Richards) 등 (문헌[Stem Cells 21: 546-556, 2003])은 인간 만능 줄기 세포 배양을 지지하는 능력에 대해 11가지 상이한 인간 성인, 태아 및 신생아 영양 세포층의 패널을 평가하였다. 리차즈 등은 "성인 피부 섬유아세포 영양세포 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포주는 인간 배아 줄기 세포 형태를 유지하며 만능으로 남아 있다"고 진술한다.

미국 특허 출원 공개 제20020072117호는 영양세포가 없는 배양에서 영장류 만능 줄기 세포의 성장을 지지하는 배지를 생성하는 세포주를 개시한다. 이용된 세포주는 배아 조직으로부터 얻어지거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유아세포-유사 세포주이다. 미국 특허 출원 공개 제20020072117호는 또한 일차 영양 세포층으로서의 당해 세포주의 사용을 개시한다.

다른 예에서는, 왕(Wang) 등 (문헌[Stem Cells 23: 1221-1227, 2005])은 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 영양 세포층 상에서 인간 만능 줄기 세포의 장기 성장을 위한 방법을 개시한다.

다른 예에서는, 스토코빅(Stojkovic) 등 (문헌[Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005])은 인간 배아 줄기 세포의 자발적 분화로부터 유래된 영양 세포 시스템을 개시한다.

추가 예에서, 미야모토(Miyamoto) 등 (문헌[Stem Cells 22: 433-440, 2004])은 인간 태반으로부터 얻은 영양 세포의 공급원을 개시한다.

아미트(Amit) 등 (문헌[Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003])은 인간 포피로부터 유래된 영양 세포층을 개시한다.

다른 예에서, 인준자(Inzunza) 등 (문헌[Stem Cells 23: 544-549, 2005])은 인간 출생후 포피 섬유아세포 유래의 영양 세포층을 개시한다.

미국 특허 제6642048호는 영양세포가 없는 배양에서 영장류 만능 줄기(primate pluripotent stem, pPS) 세포의 성장을 지지하는 배지 및 그러한 배지의 생성에 유용한 세포주를 개시한다. 미국 특허 제6642048호는 "본 발명은 배아 조직으로부터 얻어지거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유아세포-유사 세포주를 포함한다. 그러한 세포주를 유도하고, 배지를 가공하고, 조절된 배지를 이용하여 줄기 세포를 성장시키는 방법이 이 개시 내용에 기재되고 예시된다. "라고 진술한다.

다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005014799호는 포유류 세포의 유지, 증식 및 분화를 위한 조절된 배지를 개시한다. 국제특허 공개 WO2005014799호는 "본 발명에 따라 생성된 배양 배지는 쥐과 세포, 특히 MMH(Met 쥐과 간세포(Met Murine Hepatocyte))로 불리는, 분화되고 불멸화된 트랜스제닉(transgenic) 간세포의 세포 분비 활성에 의해 조절된다"고 진술한다.

다른 예에서, 수(Xu) 등 (문헌[Stem Cells 22: 972-980, 2004])은 인간 텔로머라아제 역전사효소를 과다 발현하도록 유전적으로 변형된 인간 배아 줄기 세포 유도체로부터 얻은 조절된 배지를 개시한다.

다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20070010011호는 만능 줄기 세포의 유지를 위한 화학적으로 규명된 배양 배지를 개시한다.

대안적인 배양 시스템은 배아 줄기 세포의 증식을 촉진할 수 있는 성장 인자로 보충된 무-혈청 배지를 이용한다. 예를 들어, 천(Cheon) 등 (문헌[BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005])은 배아 줄기 세포 자가-재생을 일으킬 수 있는 상이한 성장 인자로 보충된 비조절된 혈청 대체(serum replacement, SR) 배지에서 배아 줄기 세포가 유지되는 영양세포가 없는 무-혈청 배양 시스템을 개시한다.

다른 예에서, 레벤스타인(Levenstein) 등 (문헌[Stem Cells 24: 568-574, 2006])은 bFGF가 보충된 배지를 이용하여, 섬유아세포 또는 조절된 배지의 부재 하에서 인간 배아 줄기 세포의 장기 배양을 위한 방법을 개시하였다.

다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050148070호는 혈청 없이 그리고 섬유아세포 영양 세포 없이 규명된 배지에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 개시하였으며, 이 방법은 알부민, 아미노산, 비타민, 미네랄, 적어도 하나의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 적어도 하나의 인슐린 또는 인슐린 대체물을 함유한 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 배양 배지는 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없으며 적어도 약 100 ng/mL의, 섬유아세포 성장 인자 시그널링 수용체를 활성화시킬 수 있는 섬유아세포 성장 인자를 함유하며, 여기서 성장 인자는 단지 섬유아세포 영양세포층 이외의 공급원으로부터 공급되며, 배지는 영양 세포 또는 조절된 배지 없이 미분화된 상태로 줄기 세포의 증식을 지지한다.

다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050233446호는 미분화 영장류 원시 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포를 배양하는 데 유용한 규명된 배지를 개시한다. 용액에서, 배지는 배양되는 줄기 세포와 비교할 때 사실상 등장성이다. 주어진 배양물에서, 특정 배지는 기본 배지 및 원시 줄기 세포의 사실상 미분화된 성장을 지지하는 데 필요한 양의 bFGF, 인슐린 및 아스코르브산 각각을 포함한다.

다른 예에서, 미국 특허 제6800480호는 "일 실시 형태에서, 사실상 미분화된 상태의 영장류-유래 원시 줄기 세포를 성장시키기 위한 세포 배양 배지가 제공되며 이 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 저 삼투압, 저 내독소 기본 배지를 포함한다. 기본 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 영양 혈청과, 영양 세포 및 영양 세포로부터 유래된 세포외 매트릭스 성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 기질과 조합된다. 배지는 추가로 비필수 아미노산, 산화방지제, 및 뉴클레오시드와 피루베이트염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 성장 인자를 포함한다."고 진술한다.

다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050244962호는 "일 태양에서 본 발명은 영장류 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없는(바람직하게는 또한 본질적으로 임의의 동물 혈청이 없는) 배지에서 그리고 단지 섬유아세포 영양 세포층 이외의 공급원으로부터 공급된 섬유아세포 성장 인자의 존재하에서 줄기 세포를 배양한다. 바람직한 형태에서, 이전에는 줄기 세포 배양을 지속하기 위해 필요했던 섬유아세포 영양세포층이 충분한 섬유아세포 성장 인자의 첨가에 의해 불필요해지게 된다."고 진술한다.

추가의 예에서, 국제특허 공개 WO2005065354호는 본질적으로 영양세포가 없는 그리고 무혈청인 규명된 등장성 배양 배지를 개시하며, 이 배지는 a. 기본 배지; b. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 bFGF; c. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 인슐린; 및 d. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 아스코르브산을 포함한다.

다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005086845호에는 미분화 줄기 세포의 유지 방법이 개시되어 있는데, 상기 방법은 줄기 세포를 원하는 결과를 성취하기에 충분한 양의 시간 동안 미분화 상태로 유지하기에 충분한 양의 형질전환 성장 인자-베타 (transforming growth factor-beta, TGF-β) 패밀리의 단백질류의 구성원, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 패밀리의 단백질류의 구성원 또는 니코틴아미드 (NIC)에 줄기 세포를 노출시키는 것을 포함한다.

만능 줄기 세포는 적합한 배양 기재 상에 도말될 수 있다. 일 실시 형태에서, 적합한 배양 기재는 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막에서 유래되거나 또는 부착 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 하나의 실시 형태에서, 적합한 배양 기재는 매트리젤(MATRIGEL)(등록상표) (벡톤 디킨슨(Becton Dickenson))이다. 매트리젤(등록상표)은 실온에서 젤화하여 재구성된 기저막을 형성하는 엔젤브레스-홈-스왐(Engelbreth-Holm Swarm) 종양 세포 유래의 용해성 제제이다.

다른 세포외 매트릭스 성분 및 성분 혼합물이 대안으로서 적합하다. 증식되는 세포 유형에 따라, 이것은 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등을 단독으로 또는 다양한 조합으로 포함할 수 있다.

만능 줄기 세포는 적합한 분포로 그리고 세포 생존, 번식, 및 바람직한 특징의 보유를 촉진하는 배지의 존재하에서 기재상에 도말될 수 있다. 모든 이들 특성은 시딩 분포에 세심한 주의를 기울여 이익을 얻으며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

적합한 배양 배지는 하기 성분들, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM), 깁코(Gibco) # 11965-092; 넉아웃(Knockout) 둘베코 변형 이글 배지 (KO DMEM), 깁코 # 10829-018; 햄(Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, 깁코 # 15039-027; 비-필수 아미노산 용액, 깁코 11140-050; β-메르캅토에탄올, 시그마(Sigma) # M7522; 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 깁코 # 13256-029로부터 제조될 수 있다.

췌장 내분비 전구 세포의 형성

일 실시 형태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 췌장 내분비 전구 세포를 생성하는 방법을 제공한다:

a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,

b. 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,

c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계, 및

d. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 전구 세포로 분화시키는 단계.

본 발명에 사용하기에 적합한 만능 줄기 세포는 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H9 (NIH 코드: WA09), 인간 배아 줄기 세포주 H1 (NIH 코드: WA01), 인간 배아 줄기 세포주 H7 (NIH 코드: WA07), 및 인간 배아 줄기 세포주 SA002 (스웨덴 소재의 셀라르티스(Cellartis))를 포함한다.. 만능 세포의 하기 특징적인 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 또한 본 발명에 사용하기에 적합하다: ABCG2, 크립토(CRIPTO), CD9, FOXD3, 코넥신43(Connexin43), 코넥신45, OCT4, SOX2, 나노그(Nanog), hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.

완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소더민(EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-키트, CD99 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 다른 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 다른 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.

췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 PDX1, HNF1 베타, HNF6, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.

췌장 내분비 전구 세포의 특징적인 마커는 NGN3, NKX6.1, NeuroD, ISL1, PDX1, PAX4, NKX2.2, 또는 ARX로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내분비 전구 세포의 특징적인 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다.

완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성

만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662(2004)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[McLean et al, Stem Cells 25 , 29 - 38 (2007)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 액티빈 A와 혈청을 이용하여 세포를 배양하고, 이어서 상이한 농도의 액티빈 A와 혈청을 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 다른 농도의 혈청을 포함하는 액티빈 A를 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2005]에 개시된다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재하에서 액티빈 A와 Wnt 리간드를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 Wnt 리간드를 제거하고 혈청을 포함하는 액티빈 A를 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인크.(LifeScan, Inc.)에 양도된, 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인크.에 양도된, 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인크.에 양도된, 미국 특허 출원 제60/990,529호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인크.에 양도된, 미국 특허 출원 제61/076,889호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인크.에 양도된, 미국 특허 출원 제61/076,900호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인크.에 양도된, 미국 특허 출원 제61/076,908호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인크.에 양도된, 미국 특허 출원 제61/076,915호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 특성화

완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성은 특정 프로토콜을 이행하기 전후에 마커의 존재에 대해 시험함으로써 결정될 수 있다. 만능 줄기 세포는 전형적으로 그러한 마커를 발현하지 않는다. 따라서, 만능성 세포의 분화는 세포가 그들을 발현하기 시작할 때에 검출된다.

분화 효율은 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정될 수 있다.

배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치(in situ) 혼성화(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역분석, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.

만능 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 만능 줄기 세포의 추가의 특징은 계속 확인되고 있다. 만능 줄기 세포 마커는 예를 들어, 하기 중 하나 이상의 발현을 포함한다: ABCG2, 크립토, FOXD3, 코넥신43, 코넥신45, OCT4, SOX2, 나노그, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.

만능 줄기 세포를 본 발명의 방법으로 처리한 후, 분화된 세포는 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현된 CXCR4와 같은 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시켜 정제할 수 있다.

완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로부터의 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성

완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 섬유아세포 성장 인자 및 헤지호그 시그널링 경로 억제제 KAAD-사이클로파민으로 처리하고, 이어서 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 세포를 레틴산, 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.

본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 라이프스캔 인크.에 양도된, 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 레틴산 및 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 소정 기간 동안 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.

본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 미국 특허 출원 제60/990,529호에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.

췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 특성화

췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 추가의 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여, 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 특성을 획득한 것을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 췌장 내배엽 계통의 특정 마커는 예를 들어 HLXB9, PTF1 알파, PDX1, HNF6, HNF-1과 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다.

분화 효율은 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.

배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄 반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치 혼성화(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역분석, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.

췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로부터의 췌장 내분비 전구 세포의 형성

본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, BMP 및 TGF-β 수용체 I 키나아제 억제제를 억제할 수 있는 인자로 보충된 배지에서 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양함으로써 췌장 내분비 전구 세포로 분화된다.

일 실시 형태에서, BMP를 억제할 수 있는 인자는 노긴이다. 노긴은 약 100 pg/ml 내지 약 500 μg/ml의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 노긴은 100 ng/ml의 농도로 사용된다.

일 실시 형태에서, TGF-β 수용체 I 키나아제 억제제는 ALK5 억제제 II (칼바이오켐(Calbiochem), 미국 캘리포니아주)이다. ALK5 억제제 II는 약 0.1 μM 내지 약 10 μM의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, ALK5 억제제 II는 1 μM의 농도로 사용된다.

일 실시 형태에서, 배지는 4500 mg/l의 글루코스 및 1%의 B27을 함유하는 DMEM이다.

일 실시 형태에서, 세포는 약 4일 동안 배양 배지에서 배양된다.

분화의 효율은 췌장 내분비 전구 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.

본 발명의 방법으로 만능 줄기 세포를 처리한 후, 분화된 세포는, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현된 CXCR4와 같은 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시켜 정제할 수 있다.

췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 PDX1, HNF-1 베타, PTF1 알파, HNF6, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.

췌장 내분비 전구 세포의 특징적인 마커는 NGN3, NKX6.1, NEUROD, ISL1, PDX1, PAX4, NKX2.2, PAX6 또는 ARX로 이루어진 군으로부터 선택된다.

췌장 내분비 전구 세포로부터의 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성

일 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 췌장 내분비 전구 세포는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화될 수 있다.

췌장 내분비 전구 세포는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 또는 당업계의 임의의 방법에 의해 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내분비 전구 세포는, 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내분비 전구 세포를 배양하고, 이어서 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 엑센딘 1, IGF1 및 HGF를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.

예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내분비 전구 세포는, DAPT (미국 미주리주 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 및 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내분비 전구 세포를 배양함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.

예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 췌장 내분비 전구 세포는, 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내분비 전구 세포를 배양함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.

예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 세포인 췌장 내분비 전구 세포는, 라이프스캔 인크.에 양도된 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내분비 전구 세포를 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.

예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 세포인 췌장 내분비 전구 세포는, 라이프스캔 인크.에 양도된 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내분비 전구 세포를 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.

예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 세포인 췌장 내분비 전구 세포는, 라이프스캔 인크.에 양도된 미국 특허 출원 제60/953,178호에 개시된 방법에 따라 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내분비 전구 세포를 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.

예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 세포인 췌장 내분비 전구 세포는, 라이프스캔 인크.에 양도된 미국 특허 출원 제60/990,529호에 개시된 방법에 따라 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내분비 전구 세포를 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.

췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, PAX6, NGN3 및 NKX2.2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.

본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 PDX1, 및 하기의 전사 인자 중 적어도 하나를 발현한다: NGN-3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 beta, MAFA, PAX4, 및 PAX6. 본 발명의 일 태양에서, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.

치료법

일 태양에서, 본 발명은 제1형 당뇨병을 앓고 있거나 상기 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 만능 줄기 세포를 배양하는 단계, 만능 줄기 세포를 시험관 내에서 β-세포 계통으로 분화시키는 단계, 및 β-세포 계통의 세포를 환자 내로 이식하는 단계를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 본 방법은 만능 줄기 세포를 배양하는 단계, 만능 줄기 세포를 시험관 내에서 췌장 내분비 전구 세포로 분화시키는 단계, 및 췌장 내분비 전구 세포를 환자 내로 이식하는 단계를 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 제2형 당뇨병을 앓고 있거나, 상기 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 만능 줄기 세포를 배양하는 단계, 만능 줄기 세포를 시험관 내에서 β-세포 계통으로 분화시키는 단계, 및 β-세포 계통의 세포를 환자 내로 이식하는 단계를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 본 방법은 만능 줄기 세포를 배양하는 단계, 만능 줄기 세포를 시험관 내에서 췌장 내분비 전구 세포로 분화시키는 단계, 및 췌장 내분비 전구 세포를 환자 내로 이식하는 단계를 포함한다.

적절하다면, 환자는 이식된 세포의 생존과 기능을 촉진하는 약학 제제 또는 생물활성제로 추가로 처리될 수 있다. 이러한 제제는 다른 것들 중에서, 예를 들어, 인슐린, TGF-β 패밀리의 구성원(TGF-β1, 2, 및 3 포함), 골 형성 단백질(BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12, 및 -13), 섬유아세포 성장 인자-1 및 -2, 혈소판-유도 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부한 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II) 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -7, -8, -10, -15), 혈관 내피 세포-유도 성장 인자 (VEGF), 플레이오트로핀(pleiotrophin), 엔도텔린(endothelin)을 포함할 수 있다. 다른 약학적 화합물은 예를 들어, 니코틴아미드, 글루카곤 유사 펩티드-I (GLP-1) 및 II, GLP-1 및 2 미메티바디, 엑센딘-4, 레틴산, 부갑상선 호르몬, MAPK 억제제, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호 및 제2004/0132729호에 개시된 화합물을 포함할 수 있다.

만능 줄기 세포는 수령체 내로 이식하기 전에 인슐린-생성 세포로 분화될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 수여자에게 이식되기 전에, β-세포로 완전히 분화된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미분화 또는 부분 분화 상태로 수여자 내로 이식될 수 있다. 추가 분화는 수령체 내에서 일어날 수 있다.

완성 내배엽 세포 또는, 대안적으로, 췌장 내배엽 세포, 또는, 대안적으로, β 세포는 분산된 세포로서 이식되거나, 또는 간문맥으로 융합될 수 있는 클러스터로 형성될 수 있다. 대안적으로, 세포는 생체적합성 분해성 중합체성 지지체, 다공성 비분해성 장치로 제공되거나 또는 피막화되어 숙주 면역 반응으로부터 보호될 수 있다. 세포는 수령체에서 적절한 부위 내로 이식될 수 있다. 이식 부위는 예를 들어, 간, 천연 췌장, 신장 피막하 공간, 장막, 복막, 장막하 공간, 장, 위, 또는 피하 주머니를 포함한다.

추가 분화, 이식된 세포의 생존 또는 활성을 향상시키기 위하여, 성장 인자, 산화방지제 또는 항염증제와 같은 추가 인자를 세포의 투여 전에, 세포의 투여와 동시에, 또는 세포의 투여 후에 투여할 수 있다. 소정의 실시 형태에서, 성장 인자는 생체 내에서 투여된 세포를 분화시키기 위해 사용된다. 이들 인자는 내인성 세포에 의해 분비되어 원위치에서 투여된 세포에 노출될 수 있다. 이식된 세포는 내부 및 외부 투여된 당업계에 알려진 성장 인자의 임의의 조합에 의해 분화되도록 유도될 수 있다.

이식에 사용되는 세포의 양은 환자의 상태 및 치료법에 대한 반응을 비롯한 다양한 많은 인자에 의존하며, 당업자에 의해 결정될 수 있다.

일 태양에서 본 발명은 당뇨병을 앓고 있거나 상기 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 만능 줄기 세포를 배양하는 단계, 배양된 세포를 시험관 내에서 β-세포 계통으로 분화시키는 단계, 및 세포를 3차원 지지체 내로 혼입하는 단계를 포함한다. 세포는 환자 내로 이식되기 전에 이 지지체 상에서 시험관 내에서 유지될 수 있다. 대안적으로, 세포를 함유한 지지체는 추가의 시험관 내 배양 없이 환자에서 직접 이식될 수 있다. 지지체에는 이식된 세포의 생존과 기능을 촉진하는 적어도 하나의 약학 제제가 선택적으로 혼입될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해 사용하기에 적합한 지지체 물질은 조직 복구에 유용한 조직 주형, 도관, 장벽, 및 저장부를 포함한다. 구체적으로, 생물학적 조직을 재구성하거나 재생시키기 위해서뿐만 아니라 조직 성장을 유도하기 위한 주화성 제제를 전달하기 위해 시험관 내 및 생체 내에서 사용된 폼, 스펀지, 젤, 하이드로젤, 직물, 및 부직 구조체 형태의 합성 및 천연 물질이 본 발명의 방법의 실시에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 미국 특허 제5,770,417호, 미국 특허 제6,022,743호, 미국 특허 제5,567,612호, 미국 특허 제5,759,830호, 미국 특허 제6,626,950호, 미국 특허 제6,534,084호, 미국 특허 제6,306,424호, 미국 특허 제6,365,149호, 미국 특허 제6,599,323호, 미국 특허 제6,656,488호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0062753 A1호, 미국 특허 제4,557,264호 및 미국 특허 제6,333,029호에 개시된 물질을 참고한다.

약학 제제가 혼입된 지지체를 형성하기 위하여, 약학 제제는 지지체를 형성하기 전에 중합체 용액과 혼합될 수 있다. 대안적으로, 약학 제제는 바람직하게는 약학적 담체의 존재 하에서, 제작된 지지체 상에 코팅될 수 있다. 약학 제제는 액체, 미분 고체, 또는 임의의 다른 적절한 물리적 형태로 존재할 수 있다. 대안적으로, 부형제는 약학 제제의 방출 속도를 변경하기 위하여 지지체에 첨가될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 지지체에는 항-염증성 화합물인 적어도 하나의 약학적 화합물, 예컨대, 예를 들어 미국 특허 제6,509,369호에 개시된 화합물이 혼입된다.

지지체에는 예를 들어, 미국 특허 제6,793,945호에 개시된 화합물과 같은 항-아폽토시스 화합물인 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입될 수 있다.

지지체에는 예를 들어, 미국 특허 제6,331,298호에 개시된 화합물과 같은 섬유증 억제제인 적어도 하나의 약학적 화합물이 또한 혼입될 수 있다.

지지체에는 또한 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0220393호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호에 개시된 화합물과 같은 혈관신생을 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입될 수 있다.

지지체에는 또한 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0171623호에 개시된 화합물과 같은 면역억제 화합물인 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입될 수 있다.

지지체에는 또한, 성장 인자, 예컨대, 다른 것들 중에서도, 예를 들어, TGF-β 패밀리의 구성원(TGF-β1, 2, 및 3 포함), 골 형성 단백질(BMP-2, -3,-4, -5, -6, -7, -11, -12, 및 -13), 섬유아세포 성장 인자-1 및 -2, 혈소판-유도 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부한 혈장, 인슐린 성장 인자 (IGF-I, II) 성장 분화 인자 (GDF-5, -6, -8, -10, -15), 혈관 내피 세포-유도 성장 인자 (VEGF), 플레이오트로핀, 엔도텔린인 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입된다. 다른 약학적 화합물은 예를 들어, 니코틴아미드, 저산소증 유도성 인자 1-알파, 글루카곤 유사 펩티드-I(GLP-1), GLP-1 및 GLP-2 미메티바디, 및 II, 엑센딘-4, 노달, 노긴, NGF, 레틴산, 부갑상선 호르몬, 테나신-C, 트로포엘라스틴, 트롬빈-유래 펩티드, 카텔리시딘, 데펜신, 라미닌, 피브로넥틴 및 비트로넥틴과 같은 부착성 세포외 매트릭스 단백질의 세포- 및 헤파린-결합 도메인을 함유한 생물학적 펩티드, MAPK 억제제, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0132729호에 개시된 화합물을 포함할 수 있다.

스캐폴드(scaffold) 내로 본 발명의 세포를 혼입시키는 것은 스캐폴드 상에 세포를 간단히 침적시키는 것에 의해 성취될 수 있다. 세포는 간단한 확산에 의해 스캐폴드 내로 들어갈 수 있다 (문헌[J. Pediatr. Surg. 23 (1 Pt 2): 3-9 (1988)]. 세포 접종의 효율을 향상시키기 위하여 몇몇 다른 접근법이 개발되었다. 예를 들어, 스피너 플라스크(spinner flasks)가 폴리글리콜산 스캐폴드 상에 연골세포를 접종하는 데 사용되었다 (문헌[Biotechnol. Prog. 14(2): 193-202 (1998)). 세포를 접종하기 위한 다른 접근법은 원심분리를 사용하는 것이며, 이것은 접종된 세포에 대해 최소의 스트레스를 생성하며 접종 효율을 향상시킨다. 예를 들어, 양(Yang) 등은 세포 접종 방법을 개발하였다(문헌[J.Biomed. Mater. Res. 55(3): 379-86 (2001)]).

본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시하지만 하기 실시예에 의해 한정되지는 않는다.

실시예

실시예 1

췌장 내분비 전구 세포의 집단의 형성.

인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리젤-코팅된 플레이트 상에서 배양하고 (1:30의 희석), 하기 프로토콜을 이용하여 췌장 내분비 전구 세포로 분화시켰다:

a. 1일 동안 2% BSA (카탈로그 번호 152401, 엠피 바이오메디칼, 미국 오하이오주) 및 100 ng/ml 액티빈-A(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 20 ng/ml WNT-3a(카탈로그 번호 1324-WN-002, 알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 8 ng/ml의 bFGF(카탈로그 번호 100-18B, 페프로테크(PeproTech), 미국 뉴저지주)가 보충된 RPMI 배지(카탈로그 번호 22400, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주), 이어서 2% BSA 및 100 ng/ml 액티빈-A에 더하여 8 ng/ml의 bFGF가 보충된 RPMI 배지로 추가 2일간 처리 (제1기), 이어서

b. 3일 동안 DMEM/F12 (카탈로그 번호 11330, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주)+ 2% BSA + 50 ng/ml FGF7 (제2기), 이어서

c. 1% B27 (#17504-044, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD (#239804, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) + 2 μM 레틴산(RA) (시그마, 미국 미주리주) + 100 ng/ml의 노긴 (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)으로 보충된, 표 1에 나타낸 상이한 기본 배지를 4일간 사용함 (제3기), 이어서

d. 1% B27 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주) + 100 ng/ml의 노긴 + 1 μM의 ALK5 억제제 II (카탈로그 번호 616452, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주)로 보충된, 표 1에 나타낸 상이한 기본 배지를 3일간 사용함 (제4기).

배양물을 분화의 제4기, 3일에 이중으로 샘플링하고, 실시간 PCR을 이용하여 췌장 마커의 발현에 대하여 분석하였다. 이와 병행하여, 제4기, 3일 배양물을 고정시키고, 하기 단백질에 대하여 염색하였다: NKX6.1 (카탈로그 번호 F64A6B4, 디벨롭멘탈 스터디즈 하이브리도마 뱅크(Developmental Studies Hybridoma Bank), 유니버시티 오브 아이오와(University of Iowa)), PDX1, NGN3 및 CDX2.

제4기, 3일 샘플을 DMEM 배지 (처리 1 및 처리 2, 표 1)에서 배양한 것은 PCR에 의하면 DMEM/F12 (처리 4, 표 1) 또는 CMRL (처리 3, 표 1)에서 배양한 세포와 비교하여 NKX6.1, NGN3 및 PTF1 알파 발현 수준의 유의한 증가를 나타냈다 (도 1). PDX1 발현 수준의 차이는 시험한 배양물들에서 관찰되지 않았다. 그러나, 면역조직화학에 의하면 DMEM/F12 배지에서 배양된 세포, 많은 비율의 PDX1 발현 세포가 장 내배엽의 마커인 CDX2를 또한 발현함이 나타났다 (도 2, 패널 a 및 패널 e). 이와는 대조적으로, DMEM 배지에서 처리한 세포는 PDX1 양성 세포와 CDX2 양성 세포의 분리를 제공하였으며 (도 2, 패널 b 및 패널 f), 여기서 큰 비율의 PDX1 발현 세포가 CDX2를 발현하지 않았다.

게다가, DMEM에서 처리한 세포로부터 얻어진 PDX1 발현 세포는 NKX6.1을 또한 발현하였다. 도 2에서 보는 바와 같이, PDX1 양성 세포의 50 내지 60%는 제4기 마지막까지 NKX6.1을 또한 발현하였으며 (도 2, 패널 d) PDX1 양성 세포의 20 내지 30%는 NGN3을 발현하였다 (도 2, 패널 h). 그러나, NKX6.1 및 NGN3의 동시 발현은 DMEM에서 배양한 세포에서 관찰되지 않았다. PDX1 및 NGN3의 동시 발현은 DMEM/F12 또는 CMRL 배지에서 배양한 세포에서 또한 관찰되었지만 (도 2, 패널 g), NKX6.1의 발현은 DMEM/F12 또는 CMRL 배지 중 어느 하나에서 처리한 세포에서 관찰되지 않았다 (도 2, 패널 c).

이들 데이터는 상이한 기본 배지가 상이한 췌장 내배엽 세포 집단의 생성을 용이하게 함을 시사하며, DMEM/F12를 사용하면 PDX1 및 CDX2를 동시 발현하는 집단이 생성되는 반면 DMEM을 사용하면 PDX1 및 NKX6.1은 발현하지만 CDX2는 발현하지 않는 집단이 생성되었다. 또한, 상기 데이터는 췌장 유전자 발현의 발현이 배양 배지의 글루코스 농도의 증가에 의해 증가되었음을 시사한다. 도 1 및 도 2를 참고하라.

실시예 2

인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 전구 세포로의 직접적인 분화.

a. 1일 동안 2 % BSA (카탈로그 번호 152401, 엠피 바이오메디칼, 미국 오하이오주) 및 100 ng/ml 액티빈-A(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 20 ng/ml WNT-3a(카탈로그 번호 1324-WN-002, 알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 8 ng/ml의 bFGF(카탈로그 번호 100-18B, 페프로테크(PeproTech), 미국 뉴저지주)가 보충된 RPMI 배지(카탈로그 번호 22400, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주), 이어서 2% BSA 및 100 ng/ml 액티빈-A에 더하여 8 ng/ml의 bFGF가 보충된 RPMI 배지로 추가 2일간 처리 (제1기), 이어서

c. 4일 동안 DMEM (고 글루코스) + 1% B27 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레틴산(RA) (시그마, 미국 미주리주) + 100 ng/ml의 노긴 (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주) (제3기), 이어서

d. 3일 동안 DMEM (고 글루코스) + 1% B27 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주) + 100 ng/ml 노긴 + 1 μM ALK5 억제제 II (카탈로그 번호 616452, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) (제4기), 이어서

e. 5일 동안 DMEM (고 글루코스)+0.5% ITS (인비트로겐, 미국 캘리포니아주)+0.1%BSA + 1 μM Alk5 억제제 II + 100 ng/ml의 노긴 + 20 ng/ml의 베타셀룰린(Betacellulin) (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주) (제5기).

배양물을 분화의 제2기, 3일로부터 제4기, 3일까지 매일 이중으로 샘플링하고, 실시간 PCR을 이용하여 췌장 마커의 발현에 대하여 분석하였다. 세포가 제4기에 들어간 후, PDX1, NKX6.1 및 PTF1 알파의 극적인 증가가 관찰되었다 (도 3, 패널 a, 패널 b 및 패널 c). 게다가, NGN3, PAX4, NKX2.2 및 NEUROD의 상당한 상향조절이 또한 관찰되었다 (도 3, 패널 d 내지 패널 f). PAX4, NKX2.2 및 NEUROD는 NGN3에 의해 직접적으로 조절되며, 이는 췌장 내배엽이 췌장 내분비 계통으로의 결정을 개시하였음을 시사한다.

시험관 내에서 췌장 내분비 전구 세포의 인슐린 발현 세포로의 추가의 분화는 TGF-β 수용체 억제제, 노긴 및 베타셀룰린의 첨가에 의해 성취하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 인슐린 발현의 상당한 증가가 5일 동안 Alk5 억제제 II (a TGF-β 수용체 억제제), 노긴 및 베타셀룰린을 첨가한 후 관찰되었다. NGN3 및 PAX4 발현 수준은 감소한 반면, PDX1, NKX6.1 MAFB 및 NEUROD의 발현 수준은 일정하게 남아있었다.

실시예 3

인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 전구 세포로의 다른 직접적인 분화 방법.

이 실시예는 Alk5 억제제 II (TGF-베타 수용체 패밀리의 억제제)를 낮은 용량의 외인성 레티노이드, 예를 들어 레티놀 (비타민 A) - 이는 B27과 같은 배지 보충제에 존재할 수 있음 - 과 함께 사용하여 인간 배아 줄기 세포를 췌장 내분비 전구체로 분화시키는 대안적인 방법을 보여준다.

45 계대의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리젤-코팅된 플레이트 상에서 배양하고 (1:30의 희석), 하기 프로토콜을 이용하여 췌장 내분비 전구 세포로 분화시켰다:

a. 1일 동안 2% BSA 및 100 ng/ml 액티빈-A에 더하여 20 ng/ml WNT-3a에 더하여 8 ng/ml의 bFGF가 보충된 RPMI 배지, 이어서 2% BSA 및 100 ng/ml 액티빈-A에 더하여 8 ng/ml의 bFGF가 보충된 RPMI 배지로 추가 2일간 처리 (제1기), 이어서

b. 3일 동안 DMEM/F12 + 2% BSA + 50 ng/ml FGF7 (제2기), 이어서

c. 4일 동안 DMEM (고 글루코스) + 1% B27 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 0.1 μM 레틴산 (RA)+100 ng/ml 노긴 (처리1, 제3기), 또는

d. 4일 동안 DMEM (고 글루코스) + 1% B27 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 0.1 μM 레틴산 (RA) + 1 μM Alk5 억제제 + 노긴 100ng/ml (처리 2, 제3기), 또는

e. 4일 동안 DMEM (고 글루코스) + 1% B27 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 1 μM Alk5 억제제 + 100 ng/ml의 노긴 (처리 3, 제3기), 또는

f. 4일 동안 DMEM (고 글루코스) + 1% B27 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레틴산 (RA)+ 100 ng/ml의 노긴 (처리 4, 제3기), 이어서

g. 8일 동안 DMEM (고 글루코스) + 1% B27 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주) + 100 ng/ml의 노긴 + 1 μM Alk5 억제제 II (제4기).

배양물을 분화의 제4기의 3일 및 8일에 이중으로 샘플링하고, 실시간 PCR을 이용하여 췌장 마커의 발현에 대하여 분석하였다.

FGF7, 노긴 및 사이클로파민- KAAD, Alk5 억제제 II로 그리고 낮은 용량의 레틴산 (0.1 μM) 으로 보충되거나, 또는 FGF7, 노긴 및 사이클로파민- KAAD, Alk5 억제제 II로 보충되고 외인성 레틴산은 없는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하면 NGN3의 발현이 유도되었고, PDX1 및 NKX6.1의 상향조절이 계속되었다 (도 5, 패널 a, 처리 3 및 처리 4). NGN3의 발현 수준은 높은 용량 (2 μM)의 레틴산으로 처리한 세포에서 유사하였다 (도 5, 패널 a, 각각 처리 4). 이들 데이터는, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 FGF7, 노긴 및 사이클로파민- KAAD로 처리할 때 Alk5 억제제 II의 첨가가 췌장 내분비 전구 세포의 형성을 유도하기에 충분함을 시사한다. 도 5, 패널 a를 참고하는데, 여기서 Alk5 억제제 II의 부재 하에 낮은 용량의 레틴산 (0.1 μM)으로 처리한 세포에서 NGN3의 발현이 관찰되지 않았다 (도 5, 패널 a, 처리 1). 상기 처리에 의해 형성된 췌장 내분비 세포는 시험관 내에서 인슐린 발현 세포를 형성하기에 적격성이었다. 도 5, 패널 b를 참고하는데, 여기서, 형성된 NGN3 발현 세포는 8일 동안 DMEM (고 글루코스) + 1% B27 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주) + 100 ng/ml 노긴 + 1 μM Alk5 II 억제제로 처리한 후 인슐린을 발현하였다.

실시예 4

췌장 내분비 전구 세포의 생체 내 성숙화 .

a. 1일 동안 RPMI 배지 + 2% BSA + 100 ng/ml 액티빈 A + 20 ng/ml WNT-3a + 8 ng/ml의 bFGF, 이어서 RPMI 배지 + 2% BSA + 100 ng/ml 액티빈 A + 8 ng/ml의 bFGF로 추가 2일간 처리 (제1기), 이어서

b. 3일 동안 DMEM/F12 + 2% BSA + 50 ng/ml FGF7 (제2기), 이어서

c. 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레틴산 (RA) + 100 ng/ml의 노긴 (제3기), 이어서

d. 3일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/ml 노긴 + 1 μM Alk5 억제제 II (제4기).

시험관 내에서 세포를 배양하는 상기 방법 (방법 1)을 동물 8번, 11번, 14번, 17번, 20번 및 23번에서의 이식에 이용하였다. 도 6을 참고하라.

다른 분화 프로토콜을 또한 시험하였으며, 여기서 45 계대의 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리젤-코팅된 플레이트 상에서 배양하고 (1:30의 희석), 하기 프로토콜을 이용하여 췌장 내분비 전구 세포로 분화시켰다:

b. 3일 동안 DMEM/F12 + 2% BSA + 50 ng/ml FGF7 (제2기), 이어서

c. 4일 동안 DMEM (고 글루코스)+ 1% B27 + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레틴산 (RA) + 100 ng/ml의 노긴 + Alk5 억제제 II 1 μM (제3기), 이어서

d. 3일 동안 DMEM (고 글루코스) + 1% B27 +100 ng/ml 노긴 + Alk5 억제제 II 1 μM (제4기).

제4기의 마지막의 세포를 1 ml 유리 피펫을 사용하여 기계적으로 스코어링하고, 후속적으로 하룻밤 배양을 위하여 비-부착성 플레이트로 옮겼다. 생성된 응집체를 수집하고, 500만개 내지 800만개의 세포를 포함하는 응집체를 면역-손상된 생쥐(SCID/Bg)인 생쥐의 신장 피막 내로 이식하였다. 이러한 시험관 내 세포 배양 방법 (방법 2)은 동물 324번, 326번, 329번, 331번, 333번에서의 이식에 이용하였다. 도 7, 패널 a 및 패널 b를 참고하라.

b. 3일 동안 DMEM/F12 + 2% BSA + 50 ng/ml FGF7 (제2기), 이어서

c. 세포를 4일 동안 DMEM(고 글루코스) + 1% B27 + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 μ M 사이클로파민- KAAD + 0.1 μM 레틴산 (RA) + 100 ng/ml의 노긴 + Alk5 억제제 II 1 μM에서 배양 (제3기), 이어서

d. 3일 동안 DMEM (고 글루코스) +1%B27 (제4기).

제4기의 마지막의 세포를 1 ml 유리 피펫을 사용하여 기계적으로 스코어링하고, 후속적으로 하룻밤 배양을 위하여 비-부착성 플레이트로 옮겼다. 생성된 응집체를 수집하고, 500만개 내지 800만개의 세포를 포함하는 응집체를 면역-손상된 생쥐(SCID/Bg)인 생쥐의 신장 피막 내로 이식하였다. 이러한 시험관 내 세포 배양 방법 (방법 3)을 동물 294번, 295번, 296번, 297번에서 이식에 이용하였다. 도 8을 참고하라.

b. 3일 동안 DMEM/F12 + 2% BSA + 50 ng/ml FGF7 (제2기), 이어서

c. 세포를 4일 동안 DMEM(고 글루코스)+ 1% B27 + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 0.1 μM 레틴산 (RA) + 100 ng/ml의 노긴+Alk5 억제제 II 1 μM에서 배양 (제3기), 이어서

d. 3일 동안 DMEM (고 글루코스) + 1%B27+ 100 ng/ml의 노긴+Alk5 억제제 II 1 μM (제4기).

제4기의 마지막의 세포를 1 ml 유리 피펫을 사용하여 기계적으로 스코어링하고, 후속적으로 하룻밤 배양을 위하여 비-부착성 플레이트로 옮겼다. 생성된 응집체를 수집하고, 500만개 내지 800만개의 세포를 포함하는 응집체를 면역-손상된 생쥐(SCID/Bg)인 생쥐의 신장 피막 내로 이식하였다. 이러한 시험관 내 세포 배양 방법 (방법 4)을 동물 336, 338, 340, 342, 344번에서의 이식에 이용하였다. 도 9, 패널 a 및 패널 b를 참고하라.

b. 3일 동안 DMEM/F12 + 2% BSA + 50 ng/ml FGF7 (제2기), 이어서

c. 세포를 4일 동안 DMEM (고 글루코스) + 1% B27 + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 100 ng/ml의 노긴+Alk5 억제제 II 1 μM에서 배양 (제3기), 이어서

d. DMEM (고 글루코스) +1%B27+100 ng/ml 노긴+Alk5 억제제 II (제4기).

제4기의 마지막의 세포를 1 ml 유리 피펫을 사용하여 기계적으로 스코어링하고, 후속적으로 하룻밤 배양을 위하여 비-부착성 플레이트로 옮겼다. 생성된 응집체를 수집하고, 500만개 내지 800만개의 세포를 포함하는 응집체를 면역-손상된 생쥐(SCID/Bg)인 생쥐의 신장 피막 내로 이식하였다. 이러한 시험관 내 세포 배양 방법 (방법 5)을 동물 335번, 337번, 339번, 341번, 343번에서의 이식에 이용하였다. See 도 10, 패널 a 및 패널 b를 참고하라.

5 내지 6주령 수컷 scid-베이지(beige) 생쥐 (C.B-Igh-1b/GbmsTac-Prkdc^scid-Lyst^bg N7)) 는 타코닉 팜스에서 구매하였다. 생쥐는 살균된 먹이와 물에 자유롭게 접근하게 하여 마이크로단리(microisolator) 케이지에 수용하였다. 수술 준비에서, 생쥐를 귀 태깅에 의해 식별하고, 그의 체중을 측정하고, 그의 혈당을 휴대용 혈당측정기(원터치(One Touch), 라이프스캔)로 측정하였다.

아이솔플루란 및 산소의 혼합물을 사용해 생쥐를 마취시키고 수술 부위를 작은 동물 클리퍼를 사용해 면도하였다. 수술전에 생쥐에 0.1 mg.kg 부프레넥스(Buprenex)를 피하 투여하였다. 70% 아이소프로필 알코올 및 10% 포비돈-요오다이드의 연속 세척에 의해 수술 부위를 준비하였다.

제4기의 마지막의 세포를 1 mg/ml의 디스파아제로 5분 동안 간단히 처리하고, 1 ml 유리 피펫을 사용하여 기계적으로 스코어링하고, 후속적으로 하룻밤 배양을 위하여 비-부착성 플레이트로 옮겼다. 생쥐의 수술전 준비 동안에, 세포는 1.5 ml 마이크로퓨즈 튜브에서 원심분리하고, 대부분의 상청액을 제거하여, 세포의 펠렛을 수집하기에 겨우 충분한 것을 남겨 두었다. 세포는 라이닌 포스-D(Rainin Pos-D) 용적형 피펫(positive displacement pipette) 내로 수집하고, 피펫은 세포가 중력에 의해 침강되도록 거꾸로 하였다. 여분의 배지를 디스펜스하여(dispensed) 이식용의 패킹된(packed) 세포 제제가 남게 하였다.

이식에 있어서, 24G x 1.9 cm (¾") I.V. 카테터를 사용하여 신장 피막을 관통하고, 니들을 제거하였다. 다음, 카테터를 신장 피막 아래에서 신장의 원위부 극 쪽으로 전진시켰다. 포스-D 피펫 팁을 카테터의 허브에 단단하게 놔두었고, 500만개의 세포를 신장 피막 아래에서 카테터를 통하여 피펫으로부터 디스펜스하여 신장의 원위부 극에 전달하였다. 신장 피막을 저온 소작에 의해 밀봉하고, 신장을 그의 원래의 해부학적 위치에 되돌려 놓았다. 이와 병행하여, 500만개의 세포를 포함하는 세포 응집체를 포스트-D 피펫 팁을 이용하여 50 μl 기구 내로 로딩하였다. 50 μl 기구를 테라사이트, 인크(TheraCyte, Inc) (미국 캘리포니아주 어바인)로부터 구매하였다. 상기 기구는 로딩 후 의료용 접착제 실리콘 타입 A (다우 코닝(Dow Corning), 카탈로그 번호 129109)로 밀봉하고, SICD/Bg 생쥐 (동물 3번 및 4번) 내로 피하 임플란트하였다. 근육을 5-0 바이크릴을 사용하여 연속 봉합사로 닫고, 피부를 창상용 클립을 사용하여 닫았다. 수술후에 1.0 mg.kg 메타캄을 생쥐에 피하 투약하였다. 생쥐에서 마취를 없애고, 생쥐를 완전히 회복시켰다.

이식 후, 생쥐를 1주 당 1회 칭량하고, 혈당을 1주에 2회 측정하였다. 이식 후 다양한 간격에서 3g/kg 글루코스를 생쥐에 복강내 투약하고, 소량의 헤파린이 든 마이크로퓨즈 튜브에 후안구동을 통해 글루코스를 주사한 지 60분째에 혈액을 빼내었다. 혈액을 원심분리하고, 혈장을 제2 마이크로퓨즈 튜브 내에 넣고, 드라이아이스에서 냉동시키고, 이어서 인간 c-펩티드 분석을 수행할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 제조업자의 지시에 따라 메르코디아/알프코 다이아그노스틱스(Mercodia/ALPCO Diagnotics) 초민감 C-펩티드 ELISA (카탈로그 번호 80-CPTHU-E01, 알프코 다이아그노스틱스(Alpco Diagnostics), 미국 뉴햄프셔주)를 사용하여 인간 c-펩티드 수준을 결정하였다.

인간 C-펩티드는 이식 후 4주만큼 이른 시점에 동물 혈청에서 검출되었으며, 이는 시간이 지남에 따라 증가하였다. 3개월의 마지막까지, 동물을 약 15 내지 20시간 동안 절식시키고, 그 후 혈액 샘플 (글루코스 전)을 후안와에서 채혈하였다. 이어서 각각의 동물은 30% 덱스트로스 용액 중 약 3 g/kg의 글루코스의 복강내 주사 용량을 받았으며, 글루코스 주입 후 약 60분에 혈액을 채혈하였다. 마이크로-용기에서의 원심분리를 통하여 혈청을 혈액 세포로부터 분리하였다. 초민감성 인간 특이적 C-펩티드 ELISA 플레이트 (카탈로그 번호 80-CPTHU-E01, 알프코 다이아그노스틱스, 미국 뉴햄프셔주)를 사용하여 이중의 25 μl의 혈청에서 ELISA 분석을 실시하였다. 인간 C-펩티드의 검출은 인슐린 분비가 그래프팅된 세포로부터 유래됨을 나타낸다.

이식한지 60일 후, 췌장 내분비 전구 세포를 포함하는 이식물을 받은 모든 동물에서 글루코스 자극에 반응하여 낮은 혈청중 수준의 인간 C-펩티드 (0.5 ng/ml 미만)가 검출되었다. 이식 후 2 내지 3개월 사이에, 글루코스-자극된 인간의 혈청중 수준은 상기 동물에서 급속하게 증가하였다 (도 6 내지 도 10). 일반적으로, 세포 클러스터 이식물을 받은 동물도 글루코스에 반응하였다 (도 7의 패널 b, 도 9의 패널 b 및 도 10의 패널 b).

상이한 시점에서 수확한 이식물의 조직학적 조사에 의하면 생쥐 신장 피막 아래에서 인간 세포의 존재가 나타났다 (인간 핵 항원 염색을 이용하여 검출되는 바와 같음). 도 11, 패널 a 및 패널 b를 참고하라. 신장 피막 아래에 이식된 세포는 임플란트한지 3주 후에 관-유사 구조체를 형성하는 것으로 관찰되었다. 도 11, 패널 a를 참고하라. 관-유사 구조체의 수는 시간이 지남에 따라 증가하였다. 대부분의 관-유사 구조체는 높은 수준의 PDX1 및 CK19를 포함하였다 (도 11, 패널 b). 이는 췌장 내분비 전구 세포가 생체 내에서 추가로 분화될 수 있었음을 시사한다.

관에서의 PDX1 발현은 결국 내분비성 췌장을 형성하는 특정 선구체 집단에 중요하기 때문에, 이식물에서 PDX1과 인슐린 또는 글루카곤의 동시 발현을 결정하였다. 인슐린 및 글루카곤 발현 세포는 이식 후 3주만큼 이른 시점에 이식물에서 관찰되었다 (도 12, 패널 a). 내분비 호르몬 발현 세포 대부분은 PDX1 세포가 관 구조체 밖으로 이동했을 때 형성되었다. 상당히 많은 인슐린 양성 세포가 대략 10주의 시점에서 이식물에서 검출되었으며, 대부분의 인슐린 양성 세포는 PDX1 및 NKX6.1을 발현하였다 (도 12, 패널 b). 이들 데이터는 상기에 보고한 C-펩티드 발현일과 상관관계가 있다. 20주에서, 인슐린 양성 세포의 수는 유의하게 증가하여서, 단독으로 인슐린을 발현하는 상당한 수의 단일 세포가 이식물에서 검출되었다. 또한 대부분의 인슐린 발현 세포는 PDX1 (도 12, 패널 c), NKX6.1 (도 12, 패널 b), 및 NEUROD (도 12, 패널 e)를 발현하였다. PDX1 및 NKX6.1은 성숙 베타 세포의 글루코스-자극된 인슐린 방출의 유지에 유익한 것으로 보고되었다.

별도의 대조 실험에서, 동물은 실시예 1에 설명한 방법에 따라 DMEM/F12에서 제4기의 마지막까지 분화시킨 세포를 받았다. 이식 후 최대 3개월 동안, 상기 세포를 받은 임의의 동물의 혈청에서 인간 C-펩티드가 관찰되지 않았다. 또한, PCR 및 면역조직화학 분석에 의하면 인슐린, PDX1 또는 NKX6.1의 발현이 나타나지 않았다. 그러나, 상당한 양의 글루카곤 양성 세포가 이식한지 3개월에 이식물에서 관찰되었다.

실시예 5

이식물의 조직학적 조사

이식체를 받은 동물로부터 수확한 이식물의 조직학적 조사를 사실상 이전의 실시예에서 설명한 바와 같이 실시하였다.

이전의 실시예에서 처리한 동물 유래의 이식물을 동물로부터 절개하고, PBS-/- (Mg++ 및 Ca++를 함유하지 않음, 인비트로겐)로 2회 세척하고, 이어서 4% 파라포름알데히드/PBS로 옮기고, 4℃에서 약 2 내지 3시간 동안 고정시키고, 1시간 후에 PBS (-)를 교환하였다. 이어서 이식물을 4℃에서 하룻밤 30% 수크로스/PBS (-)에서 평형화하고, OCT 화합물 (사쿠라(SAKURA), #4583) 내에 놓고, 드라이아이스로 냉동시켰다. 이식 조직을 냉각기를 사용하여 10 마이크로미터 섹션으로 절단하고, 섹션을 -80℃에서 보관하였다.

분석에 있어서, 냉동 섹션을 실온으로 해동시키고, 일단 해동되면 섹션을 샨던(Shandon) 슬라이드 카세트에서 PBS로 2회 세척하였다. 조직 섹션에 PBS+0.5% 트리톤(Triton)-X를 20분 동안 투과시키고, 이어서 2 ml PBS로 세척하였다. 이어서 섹션을 4% 닭 혈청/PBS를 함유하는 차단 용액과 함께 인큐베이션하였다. 슬라이드를 실온에서 약 1시간 동안 인큐베이션하였다. 차단 용액을 2 ml PBS를 이용한 3회 세척에 의해 제거하였다. 상기 섹션은 4% 닭 혈청에 희석시킨 일차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 샨던 슬라이드 카세트에서 다시 인큐베이션하였다.

일차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 슬라이드를 이어서 2 ml PBS로 3회 세척하였다. 상기 섹션은 4% 닭 혈청에 희석시킨 적절한 이차 항체와 함께 실온에서 샨던 슬라이드 카세트에서 다시 인큐베이션하였다. 약 30분 내지 1시간 후에, 상기 섹션을 2 ml PBS로 3회 세척한 후, 이를 샨던 슬라이드 카세트로부터 꺼내고, 이것에 DAPI를 포함하는 벡타쉴드(Vectashield)를 놓았다. 전사 인자 PDX1을 포함하여 췌장 호르몬 분비 세포에 전형적인 다른 마커에 대한 추가의 항체를 분석하였다. 하기 표 2를 참고하라.

본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 태양은 실시예 및 바람직한 실시 형태를 참조로 하여 상기 예시되었음에도, 본 발명의 범주는 전술한 상세한 설명에 의해서가 아니라 본 특허 법칙의 원칙 하에 적절하게 의도되는 하기 청구항에 의해 정의되는 것으로 생각될 것이다.

Claims

췌장 내분비 전구 세포 집단을 동물 내로 이식하는 단계에 의해 동물에서 혈당 수준을 강하시키는 방법.