CN102455500A - 具有sted片光源的spim显微镜 - Google Patents
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Abstract
描述了一种具有y方向照明光源和z方向检测光照相机的SPIM显微镜(选择性平面照射显微镜)。x扫描仪通过在x方向上扫描照明光束产生连续片光源。通过选择性开启STED去活化光束,该片光源可选择性地变得更薄,由此可提高光学分辨率。
Description
技术领域
本发明涉及包括光源和照相机的SPIM显微镜,所述光源从y方向发出激发光束到要成像的对象上,所述照相机以z方向作为第一检测方向检测从所述对象上发出的荧光和/或反射光,其中z方向沿基本与y方向垂直的方向延伸。
背景技术
特别地,对生物样品的分析应是快速且不应对生物样品造成损伤。对很多应用来说,生成三维图像很有用。应该避免因照射光与样品的相互作用而发生的散射伪像和吸收伪像,特别是在荧光显微镜的视场下时,其中照射光具有用于激发荧光的激发光功能。
所谓的SPIM(选择性平面照射显微镜)技术特别适合于以高分辨率实现快速分析显微样品,且不损伤样品,其中照射光产生片光源(lightsheet),同时照相机在相对于照射方向相垂直的方向上检测由荧光和反射产生的检测光。
片光源为具有大体矩形截面的照射体积,其在第一截面方向上(此处为z方向)非常薄,而相对于第一截面方向,第二截面方向上(此处为x方向)明显更厚。照射方向(此处为y方向)基本垂直于第一截面方向(此处为z方向)延伸,且沿与第二截面方向(此处为x方向)基本垂直的方向延伸。片光源由圆柱状透镜聚焦且该片光源的焦距或焦长可被理解为照射方向(此处为y方向)上的特定范围,其中片光源特别薄,使得被照射体积的形状为片状,即在z方向上非常薄而在x和y方向上较厚。
根据现有SPIM技术,利用圆柱状透镜产生的片光源的缺点在于,该***很不灵活,例如其提供的是固定焦点,因此被照射体积是预确定的。为了实现高分辨率,尽可能薄且纵向延伸的焦距是有益的。可以在样品的一个方向上扫描该焦距以获得三维图像。由于长度增加也使宽度增加,z方向上的分辨率就降低了。这意味虽然选择了较低的照射光学器件的数值孔径而得到了长焦距,但结果也会使被照射体积的厚度较大。这意味着检测方向上沿光轴的光学分辨率也同样降低。根据实际应用,结果与目标却相互矛盾:如果应该使照射光穿透的深度大,那么就需要焦距长,然而焦距长又导致片光源更厚从而降低分辨率。照射光学器件的数值孔径小,所形成的焦距长。
除期望在照射光的穿透深度大的同时还能实现高分辨率,通常还期望能在照射体积上有灵活性。例如,一些应用要求照射体积更大,比如在需要观察发生在特定体积的对象内的化学反应时。相对而言,也有可能期望照射体积更小,例如特别是在通过更薄的片光源实现更薄的照射体积以使其具有更明确限定的层或平面从而用于例如确定对象内的扩散速度时。
发明内容
本发明的目的是首先提高被描述显微镜的灵活性,尤其提高在选择照射体积上的灵活性以及提高在选择显微镜类型上的灵活性。
根据本发明,上述目的通过第一x扫描仪实现,该扫描仪通过在x方向上扫描照明光束产生连续片光源,其中x方向沿与y方向和z方向基本垂直的方向延伸,且片光源在由x方向与y方向所限定的平面内连续形成;并且去活化光源从y方向发出至少一个去活化光束至物体上,使连续产生的片光源在z方向上更薄,其中去活化光束具有在z方向上相对于照明光束偏移的至少一个强度最大值,且去活化光束平行于照明光束在x方向上被扫描。
根据本发明的优选实施例,提供去活化光束调制器,其适于调制去活化光束,使得去活化光束的截面包括在z方向上的至少两个强度最大值,其中在强度最大值之间具有零点,该零点位于激发光束中心处。在可替代方案中,该去活化光束可被调制为使去活化光束的旁瓣(侧极值)也被去活化。在该情况下,如果激发光束的旁瓣与去活化光束的峰值相重合是有益的。可以调制激发光束使产生的旁瓣更强,这将使最大值更长、更细。在非去活化的情况下更强的旁瓣(侧极值)降低了z方向上的分辨率。然而如果侧最大值被去活化,就提高了分辨率。
另外,可变化地选择使用短TAG透镜中的“可调声梯度折射率指数透镜”来调制激励光束。该TAG透镜提供了一种用于产生贝塞尔光束的替代方法。在该TAG透镜中,在圆形压电元件中提供光折射流体,该流体被交流电激励从而产生变化的折射率。激励信号在振幅及频率上的变化使传输的图案发生快速改变。切换速率由允许形成稳定图案的切换动作间所需的时间来确定-这主要取决于流体的粘度。对于粘度在640cs和0.65cs之间的流体,切换时间可以为300和2000μs之间。
根据本发明另一个优选实施例,提供适于调制去活化光束的相移片。如果需要调制去活化光束,使得仅限于在两侧进行激发以产生更薄的片光源,那么一个独立的相移片就足够了。然而,在可替代方案中,还可以限制每侧上的各个激发点,例如涡流滤光片或圆形相移片,或者提供两个彼此呈90°角度的相移片,用于在x方向(扫描方向)和z方向(连续产生的片光源的厚度)上进行限制。
根据本发明又一个优选实施例,可提供激发光束调制器用于把激发光束调制成贝塞尔光束。
根据本发明另一个优选实施例,激发光束为可调声梯度折射率指数(TAG)透镜。另外,多光子激发的优点是被调制的激发光束的旁瓣被激发的可能性比用连续光(也称为连续波或CW激发)激发时低10的2次方,因此在检测时背景较暗。特别地,当用连续光激发时,调制去活化光束用于限制激发光束的旁瓣是有用的,其中去活化光束也可类似地使用TAG透镜来调制。
根据本发明另一个优选实施例,所述激发光束调制器为轴锥镜(Axicon)。
根据本发明另一个优选实施例,提供至少一个声光元件用以调节至少激发光束。
根据本发明另一个优选实施例,声光元件为声光偏转器(AOD)。通过AOD,照明光束被偏转,例如用于提供扫描功能。在可替代方案中,检流计可替代AOD用于提供扫描功能。
根据本发明另一个优选实施例,声光元件为声光可调谐滤波器(AOTF),用于选择激发光束的波长并调节其强度。使用AOT的特别优点在于其具有双重功能,也就是,既可以调节强度也可以调节波长。特别地,可以通过AOTF把输出强度控制在较宽的限界内,也就是,在AOFT输出侧的输出强度可以被调节为输入强度的几乎100%,也可以被控制为仅为输入强度的千分之几。
根据本发明另一个优选实施例,去活化光束具有恒定波长。其优点是可以免去例如通过AOTF来调制去活化光束的波长。为此,在多色荧光显微镜中,优选选择这样的染料,该染料具有不同的激发波长,但可由一个相同的去活化波长去活化。
根据本发明另一个优选实施例,提供至少一个强度控制器用于调节激发光束和去活化光束的强度。
根据本发明另一个优选实施例,强度控制器包括声光元件
根据本发明另一个优选实施例,提供适于在第一工作模式和第二工作模式间进行切换的切换器,所述第一工作模式为没加入去活化光束的正常SPIM模式,所述第二工作模式为其中另外开启去活化光束的SPIM加STED模式。
根据本发明另一个优选实施例,切换器适于在所述第一和第二工作模式间做永久选择。
根据本发明另一个优选实施例,切换器适于以特定切换频率在所述第一和第二工作模式间自动切换。
根据本发明另一个优选实施例,图像处理单元以该切换频率根据各自的第一和第二工作模式将由照相机在第一检测方向上检测的检测光分成两个数据流,所述数据流产生根据第一工作模式的图像和根据第二工作模式的图像。
根据本发明另一个优选实施例,提供照射光学元件,其包括提供在激发光束的光束路径中的光学变焦元件且包括彼此间能机械移动的透镜组以改变数值孔径,由此扩大或缩短连续产生的片光源的焦距,且由此在y照射方向上扩大或缩短由片光源照射到物体上的视场的长度。该照射光学元件优选包括照明物镜。通过该灵活的光学变焦元件,可调节片光源的长度(在y方向和z方向上)。如果仅需要照射一薄层,可以增大数值孔径,但结果是片光源的可用长度缩短了。本发明通过加入STED光束的去活化作用,使片光源更薄且由此使被照射体积变薄来克服上述矛盾,从而可在实现长焦距的同时具有薄的、连续产生的片光源。可以得到一系列高分辨率的沿z方向的图像。由于变焦光学元件的光学参数已知,通过仅在此范围内选择合适的图像处理来使用并组合,可以提供高分辨率图像。
根据本发明另一个优选实施例,提供光探测器用于检测由物体发出的与x方向相反的第二检测方向上的荧光和/或反射光。光探测器通常比照相机速度快,但不能提供定位,然而这完全不必要,因为可以通过多光子照明光束实现定位;特别是在多光子照明时,这更容易实现,因为这种类型的照明几乎可以及时准确地知道物体中哪部分特定体积在任何给定点处被照射了,从而检测到来自所有可能方向上的信号检测光。
根据本发明另一个优选实施例,通过应用SPIM技术在z方向上检测到2维宽视场图像的同时,并行生成物体的共焦一维图像,该共焦一维图像为在x方向上延伸的一行。二维图像成像的是由以上描述的片光源所照射的并由变焦光学元件控制的那个照射面,同时并行产生称为x-t的图像,即行图像,该行图像特别提供了在生物样品内的关于物体内特定单元的移动速度信息,例如分子或其他细胞(细胞器)的扩散。
根据本发明另一个优选实施例,扫描仪在z方向上移动物体,使得在z方向上生成多个彼此间隔的连续片光源,因此提供了多个照射面,其中各个片光源与照相机间的距离保持不变。其优点是可选择地开启整个照射光学元件、SPIM检测光学元件以及共焦检测光学元件,并保持在同一位置,而且照明光束不必由扫描仪在z方向上偏转,这也使照明光学元件得以简化。然而,在可替代方案中,还可以移动照明光学元件或在z方向上偏转照明光束,例如通过声光偏转器(AOD)或检流计。在该情况下,SPIM检测光学元件优选移动跟踪照明,这可以通过改变SPIM检测光学元件的物镜的位置或通过偏置包括照相机的整个SPIM检测光学元件来实现。
根据本发明另一个优选实施例,切换器适于在以下工作模式间切换:
i)与y照明方向相反的检测光的共焦检测;
ii)z方向宽视场检测光的SPIM检测;
iii)z方向宽视场检测光的多光子检测;
iv)前述共焦检测与SPIM检测的同时检测;以及
v)前述共焦检测与多光子检测的同时检测。
根据本发明另一个优选实施例,所述工作模式i)-v)可选择地设置具有或不具有额外开启的STED去活化光束。可以按行或按像素执行开启或关闭,然后将数据流分开。这可以产生两个不同的图像,这两个图像的照射体积不同。还可以把这两个图像通过重叠方式相组合,例如用于观察在较大照射体积内的化学反应的同时,还可用于更准确地检测在较小照射体积内的扩散速率,例如通过二维FCS(荧光相关光谱)方法。
附图说明
以下参照附图对本发明内容进行讨论。其中,
图1为根据现有SPIM技术的示意性基本原理透视图;
图2为根据现有SPIM技术的照射光束路径与检测光束路径的示意图;
图3是根据现有技术描述的STED原理的示意图;
图4是根据本发明的显微镜的示意图;
图5是描述由通过相移片调制STED去活化光束(deactivation beam)的示意图;
图6是图4所示的根据本发明显微镜的从x扫描方向观察的示意图,包括激发光束,去活化光束和检测光束路径;
图7是图6所示的显微镜从y照射方向观察的示意图;
图8a示出了激发光束的截面以及在x、y和z坐标系中的相关强度分布;
图8b示出了激发光束与活化光束的相互比较,以及通过在x方向上的扫描生成的连续片光源和在x、y和z坐标系中的相关强度分布;以及
图9为本发明另一个实施例的示意图,其另外采用SPIM检测光学元件用于检测多光子信号。
具体实施方式
图1示出了根据现有技术的SPIM显微镜的简化后原理图,该显微镜的工作原理基于“有选择性的平面成像”技术。由片光源实现y方向上的照射,用于只照射物平面内的物体。检测方向基本垂直于片光源1(即在z方向上)延伸,其中对检测光的检测由物镜3实现。如图1所示,片光源1应该在其内部区域内特别薄,从而在z方向上获得高分辨率。当片光源1在物体中的聚焦较窄时,能实现高分辨率。
如下面将更详细解释,聚焦的长度是可控的使得被成像的视场更大,但这样会降低聚焦的清晰度,并降低片光源1的宽窄度,从而减低图片在z方向上的分辨率。根据特定场合的应用,也许有用的是基于更厚的片光源,降低z方向上的分辨率,但同时能看到更大的视场和更大的成像体积。如果生成的图像还能允许观察图像的关注区域,那么更大的成像体积也许是有用的,因为实现更大图像体积的优点在于,更容易确认被成像体积确实包含了所关注的区域。如果在形成被关注区域的图像时需要用更高的分辨率,可以借助变焦光学元件调节连续的片光源1的聚焦,使该聚焦更小但更清晰。
与共焦扫描显微技术相比,SPIM技术在对z方向上检测光进行检测时要求定位被检测光,因为SPIM技术是一种宽视场显微技术。该定位一般通过照相机来实现,例如CCD照相机或CMOS照相机。如果应该由SPIM技术生成物体的三维图像,可以在z方向上扫描片光源1或物体,然后把在不同照射面内获得的图像组合成三维图像。该成像过程也称为“重现”,此时为z方向上的重现。
图2示意性示出了根据现有SPIM技术的照射光束路径。激光器4产生照射光束5,其穿过扩束器传输到准直透镜6内,接着由柱面透镜7聚焦成片光源1至物体上。物镜透镜收集检测光束并将其导入照相机9。通过移动透镜组中的元件可以调节片光源的焦距,在图2的这个极其简化的示例中,可以相对准直透镜6移动柱面透镜7来进行调节。
根据本发明,可通过另外开启STED去活化光束(受激发射损耗)进一步窄化片光源1,即,使片光源1变得更薄以在z方向上实现更高分辨率。本领域已知的STED显微镜的基本结构如图3所示。激发光束31和去活化光束32由光束组合器组合成(在该实施例中例如为分色滤光器)共同光束路径34,然后导向穿过物镜3到物体2上。在该光路中可以提供数个其他光学元件,例如透镜、光导纤维或滤色片。一般可调制去活化光束的强度分布,例如可通过下面参照图5描述的相移片来调制,但还可以通过为此目的而具有特殊结构的透镜来实现。在调制时,使去活化光束的中心为零点,这意味着在零点处强度为零或非常低,而在该零点周围提供均匀、圆形的强度极值。在荧光显微技术中用以在特定激发波长和去活化波长处进行反应的染料也可以被用来激发荧光或去活化荧光。一般激发波长和去活化波长彼此是有区别的,而且通常以时间延迟的方式将激发光束和去活化光束分别传送到对象上。这被称为脉冲STED,但还发现存在以下可能的混合类型:
·具有被延迟的脉冲去活化的脉冲激发
·具有CW去活化的CW(连续波)激发
·具有CW去活化的脉冲激发
·具有脉冲去活化的脉冲MP(多光子)激发
·具有CW去活化的脉冲MP(多光子)激发
通过激发,具有特定尺寸的成像点受激发射出荧光,与此同时立即在该激发中心周围施加去活化,使得由物体的该成像点发出的荧光变窄而形成小成像点,由此提高分辨率。对于彩色荧光显微技术,可以使用各种不同的染料,这些染料通过不同的激发波长相区分,即,用于发射荧光的特定强激发的各种波长的激发光。优选地,可以选择染料进行组合,使得它们可以被共同且相同的去活化波长去活化,从而不必提供不同的去活化波长。
从物体返回的检测光35穿过物镜3,由分束器(此情况下为分光镜37)传送通过透镜和合适的孔径38至光检测器36上,所述孔径用于消除散射光。
在图3所示的示例中示意了STED显微镜的基本结构,其中激发光束和去活化光束被合成为共同光束路径。检测光束路径与激发光束同轴延伸一段距离,但检测光束路径与激发光束的方向相反,去活化光束向上延伸至分色镜37处并由分色镜37将去活化光束向外耦合至光检测器36。这样的布置是特别紧凑的,但应理解的是,也可以使用单独的去活化光束光学元件传送去活化光束,从而可独立于照射光学元件,更灵活地调节去活化光束。
图5示意了由相移片39调节去活化光束40。使用该相移片39可调节相位以及强度分布。为此,相移片被设计为调节去活化光束40,而不是激发光束41,即该调节取决于与激发光束41不同的去活化光束40的波长。
图4示出了根据本发明的SPIM显微镜的示意性结构,其中参考数字10表示照明光束路径,参考数字11表示SPIM-检测光束路径。照明光束路径10还包括提供共焦检测光束路径的功能,但是后者的延伸方向与照明方向相反。
首先描述一下照明光束路径;激光器4产生照明光,该照明光经扫描仪12传送至变焦光学元件13。扫描仪12产生连续片光源1用于照明物体2。为了连续产生片光源1,照明激光束在x方向上进行扫描,即分别沿图4所示的从外向里的方向或从里向外的方向扫描。激光束例如可以具有圆形截面,但在可替代的方案中,也可以调节截面的形状,例如为椭圆形截面,其中椭圆形的长轴在x方向上延伸。类似地,照明光束路径例如可以为矩形或任一其他可选择的形状。
SPIM检测光束路径11沿z方向延伸,即与照明光束路径10的延伸方向(y方向)基本垂直。使照明光束路径与检测光束路径间的垂直关系稍有偏离是有益的,例如两个路径间的夹角可比90°稍小或稍大,这样可为物体中的颗粒或局部产生背景照明。还可以从不同角度检测图像,然后将它们合成,例如与公知的SPIM技术相同。为了保持描述上的简化,下面描述的关系为矩形的,但应理解的是其还包含了偏离角度,即比90°稍大或稍小。由物体2发出的检测光(反射或发射荧光)被物镜3收集。对于多色检测来说,尤其需要在物镜下游提供滤光片14,其能够滤过特定波长的检测光,然后该检测光经管状透镜15被导向至照相机16,例如CCD照相机16。
提供另外的激光器46用于产生特定波长的去活化光。该去活化光的波长与激发光的波长不同。一般地,去活化光具有比激发光更长的波长。对于多色显微镜来说,染料被选择为具有不同的激发波长,但去活化波长基本相同。这带来的优点是,为了提供去活化波长,仅需要提供一个可准确产生去活化波长的独立激光器,且不需要进行波长调制,从而免去在波长调制上的花费,例如免去声光元件(声光可调谐滤波器,AOTF)以及用于驱动AOTF的频率发生器的花费。作为例子,对于已知STED的约20种染料,已知可在波长590nm处激发,在波长600nm处去活化,或在波长440nm处激发,在波长532nm处去活化。可由AOTF调节激发和去活化的频率和强度。
如以上关于图3所讨论,去活化光束既可以经过与激发光束相同的光学元件被传送,即光束路径相同,也可以如下面图6中所示的,经过单独的光束路径传送。在根据图4的实施例中,激光器4产生激发光束,激光器46产生去活化光束,经共同扫描仪12进行扫描。
为了生成三维图像,载物台17可在z方向上被扫描用于连续照射物体2内不同的照射面,每个照射面由在x方向上扫描的扫描激光束扫描且由在各个照射面内连续形成的片光源1连续照射。在z方向上连续形成的多个相邻的片光源1可通过z方向上的“重现”被合成。
如果需要通过z向驱动的“重现”生成三维图像,那么移动物体2的优点是,物体内每个相邻的照射面与物镜间的距离保持相同,因为照射光束的位置和照相机16的位置均没有变化。在可替代的方案中,可以由例如检流计(galvanometer)在z方向上扫描片光源1。然而,这也需要移动物镜3,使每个照射面与物镜间的距离保持相同。在可替代的方案中,可以移动包括物镜3、滤光片14、管状透镜15以及照相机16的整个SPIM检测光学组件。
如已提到,照明检测光束路径10还可提供共焦检测光束路径的功能,为此,提供检测器18用于检测y方向上的从物体反射的检测光和/或检测发出的荧光。在用SPIM技术通过检测光束路径11进行图像检测的同时,还可以平行地进行共焦图像检测,因为片光源1由x方向上的扫描连续地生成。该共焦生成的图像比由SPIM检测所检测到的图像少一个维度。例如,如果由SPIM生成的是二维图像,即只在一个独立像平面内的图像,那么还可以检测到称为x-t的图像,即一维行图像。这例如可用来确定特定分子的扩散速率,该特定分子可以由标记物所标记或被染色用于发出荧光,然而同时成像的二维SPIM图像可以提供不同的信息,例如关于在被成像物体的像平面内哪些分子与其他分子相结合的信息。
这同样可应用到通过SPIM检测用z驱动生成三维图像的情况,即可以生成共焦二维图像。通过这种方式可以例如用来确定在三维图像中的物体内哪些分子与其他分子相结合,并可同时确定穿过特定平面扩散的分子的扩散速率。对于在检测“n”维SPIM图像时同时检测到的并行共焦生成的“n-1”维图像,可以结合其额外的确定信息,例如结合其额外的速度信息来确定哪些独立单元(例如分子或其他单元)在物体2内移动。因此,在显微镜领域中,这可应用到有生命的有机体内。
图6示出了根据本发明的另一个实施例。使用之前附图中相同的参考数字来表示类似的元件。该图中,仍用参考数字10表示照明光束路径,参考数字11表示SPIM-检测光束路径。在该图6的实施例中,照明光束路径10还具有检测光束路径的额外功能,其中共焦检测光21穿过孔20,通过光电二极管19接收并实现信号检测,然后信号经过图像处理单元22传送至监视器23内。检测光由分色镜24反射至光电二极管19。可以提供其他光学传感器来替代光电二极管19,例如雪崩二极管、光电倍增管或照相机。因为这些与共焦图像检测相关联,所以不需要定位,原因是关于定位的信息由被扫描的照明光束提供,即如果及时知道在特定点处物体的哪个成像点被照射,那么就获知了这样的信息,即从该特定成像点接收的信号来自于正好在接收信号之前被照射的成像点的信号。因此,共焦检测不需要照相机。
为了改变连续产生的片光源1的焦点,可以在y方向上相对另一透镜26移动变焦透镜25。实际应用时,可以为此提供一透镜组,但为了简化,所讨论的实施例仅具有一个独立的变焦透镜25。变焦光学元件13与照明物镜(显宏物镜)组合,从而提供光学变焦以调节焦距范围27的长度。聚焦越清晰,可用的焦距长度越短,但同时片光源越薄。为了简化,图6中省去了SPIM检测光学元件的细节,因为这些光学元件在图4中已示出,包括物镜3、滤色片14和管状透镜15。图中示意性示出的CCD照相机16给接收到的z方向上的检测光提供了x-y平面内的定位。由CCD照相机接收的信号经SPIM图像处理单元28处理且转至SPIM监视器29。如果需要照射物体2内的多个平面,可沿z方向移动载物台17。从图6可以清楚地理解,表示照射面与CCD照相机间距离的长度L通常保持不变。如参照图4已说明,还可以在z方向上移动照射光束同时保持物体2的位置不变,从而替代移动CCD照相机,因为这更易于改变物镜3相对CCD照相机16的位置。
去活化光束已由激光器46产生——该光束还称为STED光束——根据该实施例,其通过单独的去活化光束路径47传送。与照明光束类似,去活化光束首先被放大,然后被共同的变焦光学元件聚焦。
随后,去活化光束的光束路径通过位于扫描模块12前面的分色镜偏转,使得去活化光束路径与激发光束路径共轴延伸。如以上参照图5的描述,通过相移片39调制去活化光束。下面参照图8a和图8b更详细地描述去活化光束的调制。
图7示出了从另一不同观察角度所观察到的图6的实施例,其中沿照明光束,也就是y方向观察。此处特别示意出照射点30和去活化点50,其中照射点30在x方向上被扫描以产生连续形成的片光源,通过扫描成行(该行与照射点相平行,即x方向)的去活化点50将去活化点50传送至物体上。分色镜24朝光电二极管19的方向偏转检测光。可在z方向上扫描载物台17,即,可以朝着CCD照相机16移动,也可以远离于CCD照相机移动,用于照射物体内不同的照射面。
还可以仅使用一个单独激光器4(白色激光器)产生激发光束和去活化光束。为此,将光束分离,使一部分光束穿过声光元件(例如声光可调谐滤波器,AOTF),其中可以选择所期望的波长。通过使用脉冲激光器,可以凭所谓的延迟阶段实现激发光束与去活化光束间的时间延迟。
图8a和图8b示出了激发光束与去活化光束间的关系。图8a示出了激发光束41的圆形截面。图8a和图8b还示出了图4和图5中所示的x、y、z方向。图右侧示出的是激发光束的强度分布轮廓,该轮廓基本符合高斯分布-除了由于衍射效应旁瓣部分相对较低。图8b示出了去活化光束40,其被调制成在激发光束41两侧具有最大强度,而在这两个最大强度之间有一零点,即强度为零或至少非常低。从图8b中可以看出,位于零点两侧的该去活化光束40的最大强度处,光束的截面非圆形,与远离激发中心的一侧相比,截面中面向激发中心这一侧的曲率较平坦。由于连续产生的片光源1(如图8b中所示的虚线区域),去活化光束只有在中心部分内的一小条区域内没有去活化荧光。在挨着激发光束41、去活化光束40和连续产生的片光源1的截面的右侧,也就是图8b的右侧,示意出激发光束41和去活化光束40的强度I的分布。
图8b更显现出本发明的另一个优点,与现有共焦STED显微镜相比,本发明不需要把所有周边的照明点作为实现有效的去活化的边界,其仅仅需要把两侧的照明点作为边界,从而使连续产生的片光源1更薄。这就使在调制去活化光束时更加简单,例如,可以仅通过一个图5所示的单独的相移片39来实现。
根据一个具体实施例,还可以通过施加去活化光束使片光源的仅一侧更薄。通过对去活化光束的特殊调制,可以产生单侧去活化光束轮廓,包括在一侧的陡侧翼(steep flank)和最小强度值,后者优选在激发强度的最大值的区域内。对单侧去活化光束而言,如椭圆或矩形的其他截面形状也有优点。
可以理解,也可以用由多纳圈状的去活化光束来实现周围去活化作为替代,该多纳圈状的去活化光束例如可以由涡轮滤光片和圆形相移片产生。如以上所讨论的,在执行与照明方向呈90°的SPIM信号检测的同时还执行与照明方向相反的共焦检测时,这种方式能带来一定的优点。
可以另外有选择性地开启或关闭STED-去活化光束,例如可以只在x方向上的某行或某个像素上实现。由于当去活化光束打开或关闭时,已获知该信息,可以将各自的数据流分开,即分成第一数据流和第二数据流,所述第一数据流基于较厚的片光源产生图像且覆盖较大的照明区域(相比于照明焦点的截面)和较大的照明体积,所述第二数据流基于较薄的片光源产生图像且覆盖较小的照明区域(与照明焦点的截面相关)和较小的照明体积,这就同时产生了因加入STED光束而在z方向上形成的高分辨率图像,以及因没加入STED光束而在z方向上形成的低分辨率图像,但带来的优点是物体内照射的体积更大。
除可加入或关闭STED光束外,本发明的显微镜还可并行产生n维的SPIM显微镜图像和n-1维的共焦产生图像,然而通过另外开启或关闭STED光束也可以在z方向上并行产生具有高分辨率或低分辨率的这些图像。总而言之,可以同时产生4个独立的数据流,用以产生以下数据集:
i)高分辨率的二维图像(SPIM),但物体被成像部分的体积较小;
i)低分辨率的二维图像(SPIM),但物体被成像部分的体积较大;
iii)z方向上高分辨率的x-t一维共焦图像;以及
iv)z方向上低分辨率的x-t一维共焦图像。
片光源在z方向上的维度不取决于x方向上的维度,即,可以选择不同的图像格式,例如x方向上的像素数量为512,但z方向上的像素数量可以更多或更少。为了实现z方向上的连续数据集,需要在z方向上实现进给运动,从而保证有部分重叠(Nyquist原理)。
图9示出了本发明的另一个实施例,其中与图4相同的零部件由相同的参考数字表示。另外,除了变焦光学元件13外,还提供了照明物镜42。该照明物镜还可以是光学变焦的一部分,例如根据图6所示实施例的示例。
与带有连续激光器(连续波CW)的照明***相比,还可以使用脉冲激光器用于多光子荧光显微镜,从而传送长波长但能量相对较低的激发光子,这在避免对样品造成损伤(这对生物样品特别重要)时尤其适用。与检测SPIM信号类似,多光子信号可由可换向的镜43从沿z方向延伸的检测光束路径44中提取,且通过光电倍增管或雪崩光电二极管45检测。除此之外,SPIM信号可以由照相机16检测,如参考图4所描述。
如果照相机16工作速度足够快,作为图9所示的实施例的另一种变形,可以免去可换向的镜43,取而代之地用照相机16检测多光子信号。如果多光子照明与检测z方向上的信号(即垂直于照明方向)在一起,物体上的每个照明点在照相机16上成像为一行,并且通过在x方向上进行扫描,在x方向上延伸的物体的连续扫描行将在照相机16上连续照射成一区域,该区域需要用软件来缩小,以使数据缩小成一行。通过z方向上的连续扫描,物体的数行被检测并且被进一步处理成物体某一区域的图像。
简而言之,该SPIM信号检测结构的变形可用于具有快速照相机的多光子信号检测,该照相机的检测例如可以达到每秒1000张,每张格式为512x512。
用于多光子信号检测的SPIM信号检测结构的特殊有点是明显增强了信号强度,除其他原因外,主要有以下几点:为了产生片光源,使用数值孔径小的照明物镜,例如数值孔径在0.04NA范围内的物镜。如果现在用SPIM检测路径检测由多光子照射产生的信号,所得到的信号强度明显提高,因为所使用的物镜的数值孔径已经高得多(NA,例如1.0NA)。这意味着信号强度将增大超过20倍。
如果用SPIM检测光束路径(z方向上)来检测荧光且该光被传送至光电倍增管、APD或APD阵列,或根据以上所描述的变形,被直接传送至快速照相机,那么通过照明光学元件实现的在y方向上的信号检测效率要高得多,这是因为照明***的数值孔径一般比SPIM布置的检测***的数值孔径小。
采用多光子检测具有诸多优点。几乎只有在焦点处才能激发出荧光,因为激发需要有数个光子大约同时到达,而这只有在焦点处才能发生,或者换言之,在焦点以外激发的可能性非常低。另一个优点是当使用红外范围内的波长时(散射较少),穿透深度较大。还有一个有点是不需要针孔,因为所有发射光都被分配至照明焦点。这还便于从各个方向收集光束。相反,共焦显微镜需要阻挡降低信号强度的散射光和反射光。除具有使信号强度增大、降低照明强度进而避免损伤样品的这些优点外,该方案还提供了结构上的优点,即,已提供用于检测的SPIM显微镜光学元件还可以被用来进行多光子信号检测,因此在不用再投入结构成本而仅投入相对较低的软件成本的情况下,可以具有所有这些优点。
通过采用STED技术,甚至还能进一步提高多光子照明的高分辨率,即,在检测方向上的分辨率可以从多光子模式下的大约300nm提高到在多光子加STED模式下的仅几个nm的分辨率。换句话说,通过把增强信号强度与高分辨率相结合实现了协同效应,所述信号强度的增强通过SPIM检测光学元件实现,所述高分辨率通过多光子模式加上采用STED模式额外增加的分辨率实现。本发明在结构上的具体优点是将三种类型的不同显微镜组合成一个独立结构,即,共焦显微镜、SPIM显微镜、多光子显微镜,同时可以在这三种类型的显微镜的工作模式中加入STED光束,使分辨率提高,因此总共有六种不同的工作模式。
从软件角度考虑,还可以把由照相机16检测的数据分成行和像素用以同时产生SPIM图像和多光子图像。甚至可以在SPIM模式和多光子模式间切换,或者在可替代的方案中,增加一种同时在SPIM模式和多光子模式下工作的切换选择。
综上所述,根据本发明的显微镜使用了共焦显微镜的一部分,即照明光学元件,用于产生基于SPIM技术的图像,其中照明光学元件还可以变成变焦光学元件。根据本发明,还可以生成比由SPIM技术生成的图像低一维的共焦图像,或者在可替代的方案中,除了共焦图像,还可以生成多光子图像,也可以用来替代由SPIM技术生成的图像。这样不仅能更灵活地控制由SPIM技术生成的图像,还可控制由共焦或多光子检测所获得的额外图像信息,并且根据具体应用,可以把SPIM和/或多光子图像的交叠组合成最终图像。通过增添或关闭STED光束,可以进一步控制光束,且可以产生能提供给各种图像的额外数据流,并且还具有同时产生的优点。由此,提供一种具有多方面应用的显微镜,该显微镜具有使调制图像与可大量分析的图像信息产生协同效应的可能性。
Claims (24)
1.一种STED-SPIM显微镜,包括:
激发光源,其从y方向发送激发光束至待成像的物体上,
照相机,其以z方向作为第一检测方向检测从所述物体上发出的荧光和/或反射光,其中z方向沿基本与y方向相垂直的方向延伸,
其特征在于:
第一x扫描仪,其通过在x方向上扫描激发光束产生连续片光源,其中x方向沿与y方向和z方向基本垂直的方向延伸,且片光源在由x方向和y方向所限定的平面内连续形成,
去活化光源,其从y方向发出至少一个去活化光束至物体上,使连续生成的片光源在z方向上更薄,其中去活化光束具有至少一个在z方向上偏离激发光束的强度最大值,并且去活化光束平行于激发光束在x方向上被扫描。
2.根据权利要求1所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,去活化光束调制器,其适于调制去活化光束,使得去活化光束的截面包括在z方向上的至少两个强度最大值,其中在所述强度最大值之间具有零点,该零点位于激发光束中心处。
3.根据权利要求2所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,适于调制去活化光束的相移片。
4.根据前述权利要求之一所述的STED-SPIM-显微镜,其特征在于,适于把激发光束调制成贝塞尔光束的激发光束调制器。
5.根据权利要求4所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,所述激发光束调制器为可调声梯度折射率指数(TAG)透镜。
6.根据权利要求4所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,所述激发光束调制器为轴锥镜。
7.根据前述权利要求之一所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,至少一个声光元件,通过其适于调节至少激发光束。
8.根据权利要求7所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,所述声光元件为声光偏转器(AOD)。
9.根据权利要求7所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,所述声光元件为声光可调谐滤波器(AOTF),用于调节激发光束的频率和强度。
10.根据权利要求7至9之一所述的STED-SPIM-显微镜,其特征在于,所述去活化光束具有恒定频率。
11.根据前述权利要求之一所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,至少一个强度控制器,通过其适于调节激发光束和去活化光束的强度。
12.根据权利要求11所述的STED-SPIM-显微镜,其特征在于,所述强度控制器包括声光元件。
13.根据权利要求2所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,所述去活化光束调制器为可调声梯度折射率指数(TAG)透镜。
14.根据权利要求2所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,所述去活化光束调制器为空间光调制器(SLM)。
15.根据前述权利要求之一所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,适于在第一工作模式和第二工作模式间进行切换的切换器,所述第一工作模式为未加入去活化光束的正常SPIM模式,所述第二工作模式为加入去活化光束的SPIM加STED模式。
16.根据权利要求15所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,所述切换器适于在所述第一和第二工作模式间做永久选择。
17.根据权利要求15所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,所述切换器适于以特定切换频率在所述第一和第二工作模式间自动切换。
18.根据权利要求17所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于图像处理单元,其以该切换频率根据各自的第一和第二工作模式将由照相机在第一检测方向上检测到的光分成两个数据流,所述数据流同时产生根据第一工作模式的图像和根据第二工作模式的图像。
19.根据前述权利要求之一所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,照射光学元件包括在激发光束的光束路径中提供的光学变焦元件,在该光学变焦元件中彼此间机械移动透镜组,并如此通过改变数值孔径扩大或缩短连续产生的片光源的焦距,由此在y照射方向上扩大或缩短由片光源照射到物体上的视场的长度。
20.根据前述权利要求之一所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,光探测器用于检测由物体发出的与x方向相反的第二检测方向上的荧光和/或反射光形式的检测光。
21.根据权利要求20所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,通过应用SPIM技术在z方向上检测到2维宽视场图像的同时,并行生成物体的共焦一维图像,该共焦一维图像为在x方向上延伸的一行。
22.根据权利要求20所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,扫描仪在z方向上移动物体,使得在z方向上在各自照射面内生成多个彼此间隔的连续片光源,其中各个片光源和照相机之间的距离保持不变。
23.根据权利要求20至22之一所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,切换器适于在以下工作模式间切换:
i)与y照明方向相反的检测光的共焦检测;
ii)z方向宽视场检测光的SPIM检测;
iii)z方向宽视场检测光的多光子检测;
iv)前述共焦检测与SPIM检测的同时检测;以及
v)前述共焦检测与多光子检测的同时检测。
24.根据权利要求20所述的STED-SPIM显微镜,其特征在于,所述工作模式i)-v)均可选择地设置形成具有或不具有额外开启的STED去活化光束。
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