DE102016104651A1

DE102016104651A1 - Verfahren und Rasterfluoreszenzlichtmikroskop zum dreidimensional hochauflösenden Abbilden einer mit Fluorophoren markierten Struktur einer Probe

Info

Publication number: DE102016104651A1
Application number: DE102016104651.5A
Authority: DE
Inventors: Matthias Reuss; Andreas SCHÖNLE; Lars KASTRUP; Gerald Donnert
Original assignee: Abberior Instruments GmbH
Current assignee: Abberior Instruments GmbH
Priority date: 2015-03-24
Filing date: 2016-03-14
Publication date: 2016-09-29

Abstract

Zum dreidimensional hochauflösenden Abbilden einer mit schaltbaren Fluorophoren markierten Struktur in einer Probe (3) werden nach dem Anordnen der Probe (3) vor einem Objektiv (4) wiederholt die Schritte ausgeführt: Richten von Fluoreszenzermöglichungslicht (34) längs der Fokalebene (5) des Objektivs (4) auf die Probe (3), um längs der Fokalebene (5) ein Lichtblatt (19) aus dem Fluoreszenzermöglichungslicht (34) auszubilden, Beaufschlagen von Teilbereichen des Lichtblatts (19) mit Fluoreszenzverhinderungslicht (35), das eine Nullstelle innerhalb des Lichtblatts (19) aufweist, wobei das Fluoreszenzverhinderungslicht (35) eine Komponente (13), die die Nullstelle in Richtung orthogonal zu der Fokalebene (5) begrenzt, und eine weitere Komponente (14) umfasst, die durch das Objektiv (4) auf die Probe (3) gerichtet wird und die die Nullstelle in mindestens einer Richtung der Fokalebene (5) des Objektivs (4) begrenzt; Messen von aus der Nullstelle von der Probe (3) emittiertem und mit dem Objektiv (4) erfasstem Fluoreszenzlicht (8); Zuordnen des gemessenen Fluoreszenzlichts (8) zu dem Ort der Nullstelle in der Probe (3) in Richtung orthogonal zu der Fokalebene (5) und in der mindestens einen Richtung der Fokalebene (5) des Objektivs (4); und Verlagern der Nullstelle gegenüber der Probe (3).

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und ein Rasterfluoreszenzlichtmikroskop zum dreidimensional hochauflösenden Abbilden einer mit Fluorophoren markierten Struktur einer Probe. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 und auf ein Rasterfluoreszenzlichtmikroskop mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 10.
Unter einem Fluorophor wird hier ein Molekül oder ein Komplex verstanden, das bzw. der zumindest einen fluoreszenten Zustand aufweist. Zum Erreichen der gewünschten räumlichen Hochauflösung kann das erfindungsgemäße Verfahren von schaltbaren Fluorophoren Gebrauch machen. Solche schaltbaren Fluorophore weisen neben ihrem fluoreszenten Zustand, in dem sie mit Fluoreszenzanregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar sind, einen Dunkelzustand auf, in dem sie nicht oder zumindest nicht in demselben Maße oder nicht mit demselben Fluoreszenzanregungslicht oder nicht zur Emission von Fluoreszenzlicht mit derselben Wellenlänge anregbar sind.
Unter Hochauflösung ist hier insbesondere eine räumliche Auflösung der mit den Fluorophoren markierten Struktur der Probe bei deren Abbildung gemeint, die besser als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des von den Fluorophoren emittierten Fluoreszenzlichts sowie des Fluoreszenzanregungslichts und jedes anderen Lichts ist, mit dem die Probe beaufschlagt wird.
STAND DER TECHNIK
Ein Verfahren und ein Rasterfluoreszenzlichtmikroskop zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer mit schaltbaren Fluorophoren markierten Struktur einer Probe sind aus der WO 2004/090617 A2 bekannt. Die Probe wird mit Fluoreszenzanregungslicht und mit Ausschaltlicht beaufschlagt, das die Fluorophore in ihren nicht fluoreszenten Dunkelzustand ausschaltet. Das Ausschaltlicht weist eine Nullstelle auf, in der es die Fluorophore in ihrem fluoreszenten Zustand belässt. Das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht wird für einen die Nullstelle umfassenden Bereich registriert und dem jeweiligen Ort der Nullstelle zugeordnet. Zusätzlich kann die Probe vor dem Ausschaltlicht mit Einschaltlicht beaufschlagt werden, das die Fluorophore aus ihrem Dunkelzustand in ihren fluoreszenten Zustand überführt. Das Einschaltlicht muss dabei ausdrücklich nicht auf einen bestimmten Bereich der Probe lokalisiert werden. Bei dem bekannten Verfahren und der bekannten Vorrichtung werden das Fluoreszenzanregungslicht, das Ausschaltlicht und das Einschaltlicht in z-Richtung über ein gemeinsames Objektiv auf die Probe gerichtet, mit dem auch das aus der Probe emittierte Fluoreszenzlicht auf eine CCD-Kamera als Detektor abgebildet wird.
Bei dem Verfahren und dem Rasterfluoreszenzlichtmikroskop, die in der WO 2004/090617 A2 beschrieben sind, liegt die räumliche Auflösung in z-Richtung weiterhin über der Beugungsgrenze. Selbst wenn die Nullstelle des Ausschaltlichts nicht nur in der Fokalebene des Objektivs sondern durch eine weitere Komponente des Ausschaltlichts auch in z-Richtung begrenzt wird, befinden sich in den Bereichen der Probe, die in z-Richtung vor und hinter der Fokalebene liegen und von dem über das Objektiv eingestrahlten Fluoreszenzanregungslicht durchleuchtet werden, Fluorophore in ihrem fluoreszenten Zustand. Das von diesen Fluorophoren infolge der Anregung durch das Fluoreszenzanregungslicht emittierte Fluoreszenz wird ebenso erfasst, als stamme es aus der Nullstelle des Ausschaltlichts. Dasselbe gilt bei zusätzlicher Verwendung von Einschaltlicht. Zudem werden die oberhalb und unterhalb der Fokalebene angeordneten Fluorophore, ohne dass sie zu dem gewünschten Fluoreszenzlicht aus dem Bereich der Nullstelle des Ausschaltlichts beitragen, mit dem Einschaltlicht und dem Ausschaltlicht hin- und her geschaltet und – soweit eingeschaltet – mit dem Fluoreszenzanregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt. Mit der häufigen Wiederholung dieser Vorgänge ist die Gefahr des Bleichens der Fluorophore verbunden, bevor sie beim Abtasten der Probe in z-Richtung in den Bereich der Nullstelle des Ausschaltlichts gelangen.
Das aus der WO 2004/090617 A2 bekannte Verfahren zählt zur RESOLFT(Reversible Saturable Optical Fluorescence Transitions)-Mikroskopie.
Aus Biophys J. 2011 Apr. 20; 100 (8): L43–L45 sind ein Verfahren zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer mit einem Fluorophor markierten Struktur einer Probe und ein entsprechendes Rasterfluoreszenzlichtmikroskop bekannt. Hier wird zur Erhöhung der räumlichen Auslösung von dem als STED (Stimulated Emission Depletion) bekannten Konzept Gebrauch gemacht, das auch zu der RESOLFT-Mikroskopie zählt. Bei der STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie wird die Probe nach dem Beaufschlagen mit Fluoreszenzanregungslicht und vor dem Registrieren des aus der Probe emittierten Fluoreszenzlichts mit STED-Licht beaufschlagt, das eine Nullstelle aufweist und das die in der Probe enthaltenen Fluorophore bis auf diejenigen in der Nullstelle durch stimulierte Emissionen wieder abregt. Das registrierte Fluoreszenzlicht kann damit nur aus der Nullstelle stammen und wird dem Ort dieser Nullstelle in der Probe zugeordnet. Bei der STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie muss das STED-Licht wegen der kurzen Lebensdauer des angeregten Zustands der Fluorophore mit hoher Intensität auf die Probe gerichtet werden, um die gewünschte Erhöhung der räumlichen Auflösung zu erzielen.
Zur Verbesserung der räumlichen Auflösung in z-Richtung in der STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie ist es aus Biophys J. 2011 Apr. 20; 100 (8): L43–L45 bekannt, das Anregungslicht und das STED-Licht orthogonal zur z-Richtung des Objektivs, mit dem das Fluoreszenzlicht auf eine Kamera abgebildet wird, auf die Probe aufzubringen. Das orthogonale Einstrahlen des Fluoreszenzanregungslichts entspricht der SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy), bei der die Anregung der jeweiligen Probe zur Fluoreszenz nur in der Fokalebene des Objektivs erfolgt, so dass über und unter der Fokalebene liegende Fluorophore keine Beiträge zu dem registrierten Fluoreszenzlicht leisten. Indem die Probe orthogonal zur z-Richtung zusätzlich mit dem STED-Licht beaufschlagt wird, das eine flächige Nullstelle im Bereich der Fokalebene des Objektivs aufweist, wird der Bereich in z-Richtung, aus dem Fluoreszenzlicht registriert wird, weiter eingegrenzt.
Aus der EP 2 444 832 A1 und der zu derselben Patentfamilie gehörigen DE 10 2010 060 121 A1 ist ein SPIM-Mikroskop mit einer eine Probe in y-Richtung beaufschlagenden Einschaltlichtquelle und einem das aus der Probe emittierte Fluoreszenzlicht in z-Richtung auf eine Kamera abbildenden Objektiv bekannt. Ein x-Scanner erzeugt durch Scannen eines Lichtstrahls aus Fluoreszenzanregungslicht in x-Richtung ein sequenzielles Lichtblatt. Durch wahlweises Hinzuschalten eines STED-Lichtstrahls wird die Dicke des Lichtblatts in z-Richtung wahlweise verringert und damit die optische Auflösung in z-Richtung erhöht. Der STED-Lichtstrahl wird von einer STED-Lichtquelle in y-Richtung parallel zu dem Fluoreszenzanregungslicht ausgesandt. Das wahlweise Zuschalten des STED-Lichtstrahls ist zeilenweise oder pixelweise in x-Richtung möglich, wodurch die Auflösung in z-Richtung nur für die Punkte der Probe erhöht wird, die die jeweiligen x-Koordinaten aufweisen, für die der STED-Lichtstrahl zugeschaltet wird.
Aus der WO 2009/100830 A1 sind ein Verfahren und ein Fluoreszenzlichtmikroskop zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer Struktur einer Probe bekannt, die mit schaltbaren Fluorophoren markiert ist. Von diesen schaltbaren Fluorophoren werden wechselnde Anteile in den fluoreszenten Zustand überführt, wobei der Abstand zwischen den fluoreszenten Molekülen größer oder gleich der beugungsbegrenzten optischen Auflösung des Fluoreszenzlichtmikroskops ist. Die in dem fluoreszenten Zustand befindlichen Fluorophore werden mit Fluoreszenzanregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt, und das Fluoreszenzlicht wird mit einem Objektiv auf einen räumlich auflösenden Detektor abgebildet. Aus der Verteilung des Fluoreszenzlichts über den räumlich auflösenden Detektor wird die Lage der einzelnen das Fluoreszenzlicht emittierenden einzelnen Fluorophore ermittelt. Dieses Konzept ist auch als PALM (Photo Activated Light Microscopy) bekannt und in der WO 2006/127692 beschrieben.
Gemäß der WO 2009/100830 A1 erfolgt mindestens das Überführen der Fluorophore in den fluoreszenten Zustand mit Einschaltlicht und/oder das Anregen der Fluorophore in dem fluoreszenten Zustand zur Emission von Fluoreszenzlicht mit Fluoreszenzanregungslicht orthogonal zur in z-Richtung ausgerichteten optischen Achse des zum Abbilden des Fluoreszenzlichts auf den räumlich auflösenden Detektor verwendeten Objektivs. Konkret kann das Überführen der Fluorophore in den fluoreszenten Zustand über ein Lichtblatt aus dem Einschaltlicht erfolgen, wobei anschließend ein Ausschalten der Fluorophore mittels eines in z-Richtung strukturierten weiteren Lichtblatts erfolgt, so dass die Schicht der noch eingeschalteten Fluorophore in z-Richtung weniger eingeengt ist. Das Lokalisieren der Fluorophore, das in x- und y-Richtung durch die Verteilung des registrierten Fluoreszenzlichts über den ortsauflösenden Detektor erfolgt, erfolgt in z-Richtung durch die Strukturierung des Ausschaltsignals.
Das Lokalisieren der Fluorophore in x- und y-Richtung durch die Verteilung des mit dem räumlich auflösenden Detektor registrierten Fluoreszenzlichts erlaubt zwar das Erreichen einer Auflösung jenseits der Beugungsgrenze, dafür muss aber für jeden einzelnen Fluorophor eine größere Zahl von Photonen registriert werden, die diesem einzelnen Fluorophor zugeordnet werden kann. Die jeweils noch eingeschalteten Fluorophore müssen dazu einen ausreichend großen Abstand untereinander aufweisen. Damit dieser Abstand bei im Wesentlichen allen in ihrem fluoreszenten Zustand befindlichen Fluorophoren eingehalten wird, muss deren mittlerer Abstand deutlich größer sein. Dies verlangsamt das bekannte Verfahren.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und ein Rasterfluoreszenzlichtmikroskop zum dreidimensionalen hochaufgelösten Abbilden einer mit Fluorophoren markierten Struktur einer Probe aufzuzeigen, die weniger Photonen von jedem Fluorophor benötigt, um den Fluorophor mit einer besseren räumlichen Auflösung als der Beugungsgrenze in allen drei Raumrichtungen abzubilden.
LÖSUNG
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und durch ein Rasterfluoreszenzlichtmikroskop mit dem Merkmal des unabhängigen Patentanspruchs 10 gelöst. Die abhängigen Patentansprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Rasterfluoreszenzlichtmikroskops.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Allgemein umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zum dreidimensional hochauflösenden Abbilden einer mit Fluorophoren markierten Struktur einer Probe nach dem Anordnen der Probe vor einem Objektiv, so dass eine Fokalebene des Objektivs durch die Probe verläuft, wiederholt die folgenden Schritte: Fluoreszenzermöglichungslicht wird längs der Fokalebene des Objektivs auf die Probe gerichtet, um ein längs der Fokalebene verlaufendes Lichtblatt aus dem Fluoreszenzermöglichungslicht auszubilden. Teilbereiche des Lichtblatts werden mit Fluoreszenzverhinderungslicht beaufschlagt, das eine Nullstelle innerhalb des Lichtblatts aufweist, wobei das Fluoreszenzverhinderungslicht eine Komponente, die die Nullstelle in Richtung orthogonal zu der Fokalebene begrenzt, und eine weitere Komponente umfasst, die durch das Objektiv auf die Probe gerichtet wird und die Nullstelle in mindestens einer Richtung der Fokalebene des Objektivs begrenzt. Aus der Nullstelle von der Probe emittiertes und mit dem Objektiv erfasstes Fluoreszenzlicht wird gemessen. Das gemessene Fluoreszenzlicht wird dem Ort der Nullstelle in der Probe in Richtung orthogonal zu der Fokalebene und in der mindestens einen Richtung der Fokalebene des Objektivs zugeordnet; und anschließend wird die Nullstelle für die nächste Messung von Fluoreszenzlicht gegenüber der Probe verlagert.
In einer ersten konkreten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Verfahren zum dreidimensional hochauflösenden Abbilden einer mit schaltbaren Fluorophoren markierten Struktur einer Probe nach dem Anordnen der Probe vor einem Objektiv, so dass eine Fokalebene des Objektivs durch die Probe verläuft, wiederholt die folgenden Schritte auf: Einschaltlicht wird längs der Fokalebene des Objektivs auf die Probe gerichtet, um ein längs der Fokalebene verlaufendes Lichtblatt aus dem Einschaltlicht auszubilden, wobei das Einschaltlicht die in dem Bereich des Lichtblatts befindlichen schaltbaren Fluorophore in einen fluoreszenten Zustand einschaltet. Teilbereiche des Lichtblatts werden mit Ausschaltlicht beaufschlagt, das eine Nullstelle innerhalb des Lichtblatts aufweist, wobei das Ausschaltlicht im Umfeld der Nullstelle, aber nicht in der Nullstelle selbst die in den fluoreszenten Zustand eingeschalteten Fluorophore wieder aus dem fluoreszenten Zustand ausschaltet und wobei das Ausschaltlicht eine Komponente, die die Nullstelle in Richtung orthogonal zu der Fokalebene begrenzt, und eine weitere Komponente umfasst, die durch das Objektiv auf die Probe gerichtet wird und die Nullstelle in mindestens einer Richtung der Fokalebene des Objektivs begrenzt. Die Probe wird mit Fluoreszenzanregungslicht beaufschlagt, um die eingeschalteten Fluorophore in der Nullstelle des Ausschaltlichts zur Emission von Fluoreszenzlicht anzuregen. Aus der Nullstelle von der Probe emittiertes und mit dem Objektiv erfasstes Fluoreszenzlicht wird gemessen. Das gemessene Fluoreszenzlicht wird dem Ort der Nullstelle in der Probe in Richtung orthogonal zu der Fokalebene und in der mindestens einen Richtung der Fokalebene des Objektivs zugeordnet; und anschließend wird die Nullstelle für die nächste Messung von Fluoreszenzlicht gegenüber der Probe verlagert.
In einer alternativen konkreten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Verfahren zum dreidimensional hochauflösenden Abbilden einer mit Fluorophoren markierten Struktur einer Probe nach dem Anordnen der Probe vor einem Objektiv, so dass eine Fokalebene des Objektivs durch die Probe verläuft, wiederholt die folgenden Schritte auf: Fluoreszenzanregungslicht wird längs der Fokalebene des Objektivs auf die Probe gerichtet, um längs der Fokalebene ein Lichtblatt aus dem Fluoreszenzanregungslicht auszubilden, wobei das Fluoreszenzanregungslicht in dem Bereich des Lichtblatts befindliche fluoreszente Fluorophore zur Emission von Fluoreszenzlicht anregt. Teilbereiche des Lichtblatts werden mit auch als STED-Licht bezeichnetem Wiederabregungslicht beaufschlagt, das eine Nullstelle innerhalb des Lichtblatts aufweist, wobei das Wiederabregungslicht im Umfeld der Nullstelle, aber nicht in der Nullstelle selbst die angeregten Fluorophore wieder abregt und wobei das Wiederabregungslicht eine Komponente, die die Nullstelle in Richtung orthogonal zu der Fokalebene begrenzt, und eine weitere Komponente umfasst, die durch das Objektiv auf die Probe gerichtet wird und die die Nullstelle in mindestens einer Richtung der Fokalebene des Objektivs begrenzt. Das aus der Nullstelle von der Probe emittierte und mit dem Objektiv erfasste Fluoreszenzlicht wird gemessen. Das gemessene Fluoreszenzlicht wird dem Ort der Nullstelle in der Probe in Richtung orthogonal zu der Fokalebene und in der mindestens einen Richtung der Fokalebene des Objektivs zugeordnet; und anschließend wird die Nullstelle für die nächste Messung von Fluoreszenzlicht gegenüber der Probe verlagert.
Das Einschaltlicht der ersten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens und das Fluoreszenzanregungslicht der zweiten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens sind konkrete Ausführungsformen des Fluoreszenzermöglichungslichts und werden hier und insbesondere in den anhängenden Patentansprüchen auch so bezeichnet. Das Ausschaltlicht der ersten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens und das Wiederabregungslicht der zweiten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens sind konkrete Ausführungsformen des Fluoreszenzverhinderungslichts und werden hier und in den anhängenden Patentansprüchen ebenfalls so bezeichnet. Bei der ersten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens kommt zu dem Fluoreszenzermöglichungslicht und dem Fluoreszenzverhinderungslicht das extra Fluoreszenzanregungslicht hinzu.
Bei der ersten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich um ein schaltbare Fluorophore verwendendes RESOLFT-Verfahren, während es sich bei der zweiten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens um ein STED-Verfahren handelt.
In jedem Fall wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren aus dem Fluoreszenzermöglichungslicht ein Lichtblatt ausgebildet, wozu das Fluoreszenzermöglichungslicht längs der Fokalebene des Objektivs und damit orthogonal zu der die z-Richtung vorgebenden optischen Achse des Objektivs eingestrahlt wird. Dass mit dem Fluoreszenzermöglichungslicht ein Lichtblatt ausgebildet wird, bedeutet hier insbesondere, dass ein zusammenhängendes flächiges Lichtblatt und kein sequenzielles Lichtblatt ausgebildet wird. Weiter wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Dicke des Lichtblatts in z-Richtung zumindest im Umfeld der Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts durch die eine Komponente des Fluoreszenzverhinderungslichts eingeschränkt. Dazu kann die eine Komponente des Fluoreszenzverhinderungslichts längs der Fokalebene des Objektivs und damit insbesondere parallel zu dem Fluoreszenzermöglichungslicht auf die Probe gerichtet werden. Anders als das Fluoreszenzermöglichungslicht wird das Fluoreszenzverhinderungslicht aber so auf die Probe gerichtet, dass es eine Lichtintensitätsverteilung mit einer sich längs der Fokalebene des Objektivs erstreckenden blattförmigen Nullstelle ausbildet. Die blattförmige Nullstelle der Lichtintensitätsverteilung des Fluoreszenzverhinderungslichts wird hier auch als Dunkelblatt bezeichnet. Die Dicke dieses Dunkelblatts in z-Richtung, über die das Fluoreszenzverhinderungslicht die Emission von Fluoreszenzlicht durch die Fluorophore – anders als in den angrenzenden Teilbereichen des Lichtblatts – nicht verhindert, ist bei geeigneter Ausbildung des Dunkelblatts deutlich geringer als diejenige des Lichtblatts, womit die gewünschte hohe Ortsauflösung in z-Richtung erreicht wird.
Längs der Fokalebene wird die gewünschte hohe Ortsauflösung dadurch erreicht, dass die weitere Komponente des Fluoreszenzverhinderungslichts die Nullstelle in der Fokalebene des Objektivs begrenzt, und zwar in mindestens einer Richtung der Fokalebene, vorzugsweise aber ringförmig, d. h. in beiden Richtungen der Fokalebene, die auch als x- und y-Richtung bezeichnet werden. Mit den beiden Komponenten des Fluoreszenzverhinderungslichts wird die Nullstelle also einerseits in z-Richtung und andererseits in x- und/oder y-Richtung eingegrenzt, so dass das gemessene Fluoreszenzlicht einem derart eingeschränkten Ort der Nullstelle zugeordnet werden kann. Hieraus wiederum kann die Konzentration der Fluorophore in der jeweiligen Nullstelle abgeleitet werden. Durch Abtasten der gesamten Probe mit der Nullstelle ist dann die räumliche Verteilung der Fluorophore in der Probe ermittelbar. Diese Verteilung gibt die mit den Fluorophoren markierte Struktur wieder.
Um das Abtasten der Probe mit der Nullstelle zu beschleunigen, kann das Fluoreszenzverhinderungslicht mehrere Nullstellen in dem Lichtblatt aufweisen, mit denen die Probe parallel abgetastet wird, wobei das aus jeder Nullstelle von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht getrennt gemessen wird.
Die mehreren Nullstellen können mit der weiteren Komponente des Fluoreszenzverhinderungslichts gleichzeitig begrenzt werden. Insbesondere bei der ersten konkreten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens, die von schaltbaren Proteinen mit einem langlebigeren fluoreszenten Zustand Gebrauch macht, können die mehreren Nullstellen mit der weiteren Komponente des Fluoreszenzverhinderungslichts aber auch nacheinander begrenzt werden. Auch dann besteht immer noch ein Unterschied zu dem Abtasten der Probe mit nur einer Nullstelle, weil das nacheinander Begrenzen der mehreren Nullstellen vor dem Beaufschlagen der Probe mit dem Fluoreszenzanregungslicht erfolgt, um das dann aus den einzelnen Nullstellen von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht zu messen.
Bei der ersten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, die von schaltbaren Fluorophoren Gebrauch macht, bei der das Fluoreszenzermöglichungslicht Einschaltlicht ist und das Fluoreszenzverhinderungslicht Ausschaltlicht ist, kann das zusätzlich aufgebrachte Fluoreszenzanregungslicht über das Objektiv oder längs zur Fokalebene des Objektivs auf die Probe aufgebracht werden. Grundsätzlich können auch beide Wege für das Aufbringen des Fluoreszenzanregungslichts genutzt werden. Wenn das Fluoreszenzanregungslicht durch das Objektiv auf die Probe gerichtet wird, können damit die eingeschalteten Fluorophore im Falle mehrerer Nullstellen des Ausschaltlichts gleichzeitig oder nacheinander zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt werden. Wenn hingegen das Fluoreszenzanregungslicht längs der Fokalebene des Objektivs auf die Probe gerichtet wird, wobei das Fluoreszenzanregungslicht ein weiteres sich längs der Fokalebene des Objektivs erstreckendes Lichtblatt, in das die Nullstellen des Ausschaltlichts fallen, ausbildet, werden die Fluorophore in allen Nullstellen des Ausschaltlichts zugleich angeregt.
Soweit hier von einer Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts, des Ausschaltlichts oder des Wiederabregungslichts die Rede ist, so ist damit nicht zwingend gemeint, dass die Intensität des jeweiligen Lichts in der Nullstelle vollständig auf null zurückgeht. Vielmehr ist mit der Nullstelle der Bereich der jeweiligen Lichtintensitätsverteilung gemeint, in dem das Ausschaltlicht zumindest nicht alle eingeschalteten Fluorophore wieder ausschaltet bzw. das Wiederabregungslicht zumindest nicht alle angeregten Fluorophore wieder abregt. Außerhalb der Nullstelle wird hingegen mit dem jeweiligen Fluoreszenzverhinderungslicht die Sättigung des die Fluoreszenz verhindernden Übergangs erreicht, d. h. mit dem Ausschaltlicht die eingeschalteten Fluorophore vollständig ausgeschaltet bzw. mit dem Wiederabregungslicht die angeregten Fluorophore vollständig wieder abgeregt. Unter diesen Bedingungen kann das aus einem jeweils eine der Nullstellen umfassenden Bereich der Probe emittierte Fluoreszenzlicht der Nullstelle räumlich zugeordnet werden, weil es nicht aus anderen Teilbereichen dieses Bereichs stammen kann.
Wie bereits angedeutet wurde, wird bei bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens das Lichtblatt aus dem Fluoreszenzermöglichungslicht effektiv auf die Abmessungen des Dunkelblatts aus dem Fluoreszenzverhinderungslicht eingeengt, um eine erhöhte Ortsauflösung in z-Richtung zu erreichen. Zusätzlich wird durch eine ringförmige Begrenzung jeder Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts in der Fokalebene des Objektivs durch über das Objektiv eingestrahltes Fluoreszenzverhinderungslicht auch eine über die Beugungsgrenze hinausgehende räumliche Auflösung in der x-/y-Ebene erreicht, die von dem Dunkelblatt des Fluoreszenzverhinderungslichts aufgespannt wird. Dafür reichen anders als bei einem PALM-Verfahren wenige Photonen von jedem einzelnen Fluorophor aus, um es über die jeweilige Lage der Nullstelle, in der es sich befindet, in der Probe zu lokalisieren.
Ein erfindungsgemäßes Rasterfluoreszenzlichtmikroskop weist ein Objektiv, eine Probenhalterung, die eine Probe, in der eine Struktur mit Fluorophoren markiert ist, so vor dem Objektiv hält, dass eine Fokalebene des Objektivs durch die Probe verläuft, eine Fluoreszenzermöglichungslichtquelle, die Fluoreszenzermöglichungslicht so längs der Fokalebene des Objektivs auf die Probe richtet, dass sich längs der Fokalebene ein Lichtblatt aus dem Fluoreszenzermöglichungslicht ausbildet, eine Fluoreszenzverhinderungslichtquelle, die Teilbereiche des Lichtblatts mit Fluoreszenzverhinderungslicht beaufschlagt, das eine Nullstelle innerhalb des Lichtblatts aufweist, wobei die Fluoreszenzverhinderungslichtquelle ausgebildet ist, um die Probe mit einer Komponente des Fluoreszenzverhinderungslichts zu beaufschlagen, die die Nullstelle in Richtung orthogonal zu der Fokalebene begrenzt, und die eine weitere Komponente des Fluoreszenzverhinderungslichts, die die Nullstelle in mindestens einer Richtung der Fokalebene des Objektivs begrenzt, durch das Objektiv auf die Probe richtet, einen Detektor, der das aus der Nullstelle von der Probe emittierte und mit dem Objektiv erfasste Fluoreszenzlicht misst, eine Codierungseinrichtung, die dem gemessenen Fluoreszenzlicht einen Code zuordnet, der den Ort der Nullstelle in der Probe in Richtung orthogonal zu der Fokalebene und in der mindestens einen Richtung der Fokalebene des Objektivs anzeigt, und einer Abtasteinrichtung auf, die die Nullstelle gegenüber der Probenhalterung verlagert.
Ein erfindungsgemäßes Rasterfluoreszenzlichtmikroskop ist damit zur Durchführung der ersten und/oder zweiten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgebildet. Beide Alternativen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind z. B. dann mit derselben Vorrichtung ausführbar, wenn bei der ersten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens das zusätzliche Fluoreszenzanregungslicht mit der Fluoreszenzanregungslichtquelle in Form eines weiteren längs der Fokalebene des Objektivs verlaufenden Lichtblatts auf die Probe aufgebracht wird und das Ausschaltlicht auch als Wiederabregungslicht verwendbar ist. Dann kann die Beaufschlagung der Probe mit dem Einschaltlicht weggelassen werden und die Reihenfolge zwischen der Beaufschlagung der Probe mit dem Fluoreszenzverhinderungslicht und dem Fluoreszenzanregungslicht vertauscht werden. Üblicherweise werden jedoch spezielle Rasterfluoreszenzlichtmikroskope für die Durchführung der ersten oder der zweiten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgebildet werden.
Das Objektiv, die Probenhalterung, die Fluoreszenzermöglichungslichtquelle, die Fluoreszenzverhinderungslichtquelle, ggf. die zusätzliche Fluoreszenzanregungslichtquelle, der Detektor, die Codierungseinrichtung und die Abtasteinrichtung des erfindungsgemäßen Rasterfluoreszenzlichtmikroskops kann der Fachmann aufgrund seines Fachwissens und des ihm zur Verfügung stehenden Stands der Technik so ausbilden, dass sie für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind.
Die Codierungseinrichtung des erfindungsgemäßen Rasterfluoreszenzlichtmikroskops, die dem gemessenen Fluoreszenzlicht einen Code zuordnet, der den Ort der Nullstelle in der Probe in Richtung orthogonal zu der Fokalebene und in der mindestens einen Richtung in der Fokalebene anzeigt, kann beispielsweise den Messwert des Fluoreszenzlichts an der Stelle in eine mehrdimensionale Matrize eintragen, die dem jeweiligen Ort der Nullstelle beim Messen des Fluoreszenzlicht entspricht. Auch jede andere wiederauflösbare Korrelation zwischen dem Ort der Ablage des Messwerts und dem zugehörigen Ort der Nullstelle kann der Code sein, den die Codierungseinrichtung dem gemessenen Fluoreszenzlicht zuordnet. Es ist aber auch möglich, dass jeder Messwert des gemessenen Fluoreszenzlichts zusammen mit den Koordinaten des zugehörigen Orts der Nullstelle in der Probe oder gegenüber der Probenhalterung abgelegt wird.
Zur Ausbildung einer ringförmigen Begrenzung jeder Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts kann bei einzelnen Nullstellen auf Phasenveränderungsmittel oder Phasenplatten zurückgegriffen werden, die einen sogenannten Donut aus dem Fluoreszenzverhinderungslicht formen. Um gleichzeitig mehrere Nullstellen des Fluoreszenzverhinderungslichts jeweils ringförmig in der Fokalebene des Objektivs zu begrenzen, können zwei durch Interferenz gebildete Linienmuster des Fluoreszenzverhinderungslichts in der Fokalebene des Objektivs ohne zusätzliche Interferenz zwischen den beiden Linienmustern überlagert werden.
Die Lichtblätter aus dem Einschaltlicht und/oder dem Fluoreszenzanregungslicht können ebenfalls auf eine dem Fachmann bekannte Weise ausgebildet werden, ebenso das Dunkelblatt aus dem Ausschaltlicht. Konkret sind dem eingangs gewürdigten Stand der Technik entsprechende Möglichkeiten zu entnehmen, die darin aber keinesfalls abschließend aufgezählt sind.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Ohne dass hierdurch der Gegenstand der beigefügten Patentansprüche verändert wird, gilt hinsichtlich des Offenbarungsgehalts der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents Folgendes: weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
Die in den Patentansprüchen und der Beschreibung genannten Merkmale sind bezüglich ihrer Anzahl so zu verstehen, dass genau diese Anzahl oder eine größere Anzahl als die genannte Anzahl vorhanden ist, ohne dass es einer expliziten Verwendung des Adverbs "mindestens" bedarf. Wenn also beispielsweise von einem Element die Rede ist, ist dies so zu verstehen, dass genau eine Nullstelle, zwei Nullstellen oder mehr Nullstellen vorhanden sind. Die in den Patentansprüchen angeführten Merkmale können durch andere Merkmale ergänzt werden oder die einzigen Merkmale sein, die das jeweilige Verfahren oder das jeweilige Rasterfluoreszenzlichtmikroskop aufweist.
Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Umfangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von bevorzugten Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert und beschrieben.
1 zeigt eine Ausführungsform eines Rasterfluoreszenzlichtmikroskop zur Durchführung der ersten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens in schematischer Darstellung.
2 zeigt in einem Schnitt in z-/y-Richtung (a) und einem Schnitt in x-/y-Richtung (b) die Intensitätsverteilungen von Fluoreszenzverhinderungslicht bei dem Rasterfluoreszenzlichtmikroskop gemäß 1.
3 zeigt schematisch eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Rasterfluoreszenzlichtmikroskops zur Durchführung der ersten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens in schematischer Darstellung; und
4 zeigt noch eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Rasterfluoreszenzlichtmikroskops zur Durchführung der zweiten Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens in schematischer Darstellung.
FIGURENBESCHREIBUNG
Das in 1 schematisch dargestellte Rasterfluoreszenzlichtmikroskop 1 weist eine Probenhalterung 2 auf, um eine Probe 3 so vor einem Objektiv 4 zu positionieren, dass eine Fokalebene 5 des Objektivs 4 durch die Probe 3 verläuft. Über das Objektiv 4 wird die Probe 3 auf eine Kamera 6 abgebildet, die als Detektor 7 für aus der Probe emittiertes Fluoreszenzlicht 8 dient. Dieses Fluoreszenzlicht 8 wird von schaltbaren Fluorophoren emittiert, mit denen eine interessierende Struktur in der Probe 3 markiert ist. Damit die schaltbaren Fluorophore das Fluoreszenzlicht 8 emittieren, werden sie mit Einschaltlicht 9 von einer Einschaltlichtquelle 10 aktiviert und mit Fluoreszenzanregungslicht 11 von einer Fluoreszenzanregungslicht quelle 12 angeregt. Damit das Fluoreszenzlicht 8 ausschließlich aus Messpunkten der Probe 3 stammt, die geringere Abmessungen als die Beugungsgrenze bei den Wellenlängen des Fluoreszenzlichts 8, des Einschaltlichts 9 und des Fluoreszenzanregungslichts 11 haben, wird das Einschaltlicht 9 in bestimmter Weise auf die Probe 3 gerichtet und wird zudem Ausschaltlicht 25 von einer in zwei Teilquellen 15 und 16 aufgeteilten Ausschaltlichtquelle 17 auf die Probe 3 gerichtet, um die eingeschalteten Fluorophore bis auf jene in den gewünschten Messpunkten wieder auszuschalten. Konkret wird das Einschaltlicht 9 von der Einschaltlichtquelle 10 mit einer Optik 18 so längs der Fokalebene 5 auf die Probe 3 gerichtet, dass sich längs der Fokalebene 5 ein Lichtblatt 19 aus dem Einschaltlicht 9 ausbildet. Das Lichtblatt 19 erstreckt sich also in x-/y-Richtung. Um die Dicke des Lichtblatts in z-Richtung einzuengen, wird eine Komponente 13 des Ausschaltlichts 25 von der Teilquelle 15 ebenfalls über die Optik 18 längs der Fokalebene 5 auf die Probe 3 gerichtet. Zuvor werden die Wellenfronten des Ausschaltlichts 25 mit einer Phasenplatte 20 so deformiert, dass sich eine Lichtintensitätsverteilung des Ausschaltlichts 13 mit einer blattförmigen Nullstelle ausbildet, die sich längs der Fokalebene 5 erstreckt und damit parallel zu dem Lichtblatt 19. Bis auf die Fluorophore im Bereich dieser blattförmigen Nullstelle schaltet die Komponente 13 des Ausschaltlichts 25 alle zuvor mit dem Lichtblatt 19 eingeschalteten Fluorophore in der Probe 3 wieder aus. Mit einer weiteren Komponente 14 des Ausschaltlichts 25 von der Teilquelle 16 der Ausschaltlichtquelle 17 werden mehrere Nullstellen des Ausschaltlichts 25 in der Fokalebene 5 ringförmig begrenzt. Dazu wird die Komponente 14 des Ausschaltlichts 25 mit Gittern 21 in Teilstrahlen aufgespalten, die in der Fokalebene 5 so überlagert werden, dass sich zwei zueinander orthogonale Interferenzstreifenmuster ergeben. Dies ist in 1 nur für eines dieser beiden Interferenzstreifenmuster angedeutet. Nur die in den voneinander getrennten Nullstellen des Anregungslichts 25 befindlichen Fluorophore verbleiben in ihrem eingeschalteten Zustand und senden das Fluoreszenzlicht 8 aus, wenn sie mit dem Fluoreszenzanregungslicht 11 angeregt wurden. Das Fluoreszenzanregungslicht 11 von der Fluoreszenzanregungslichtquelle 12 wird hier ebenso wie die Komponente 14 des Ausschaltlichts 25 von der Teilquelle 16 der Ausschaltlichtquelle 17 durch das Objektiv 4 auf die Probe 3 gerichtet. Um das Fluoreszenzanregungslicht 11 mit dem Ausschaltlicht 14 zusammenzuführen und um das Einschaltlicht 9 mit dem Ausschaltlicht 13 zusammenzuführen, sind Strahlteiler 22 vorgesehen. Dabei kann es sich um Polarisationsstrahlteiler handeln, um Leistungsverluste zu minimieren. Dann sind die Polarisationsrichtungen des einfallenden Lichts mit hier nicht dargestellten Phasenplatten auf die transmittierten bzw. reflektierten Polarisationsrichtungen der Polarisationsstrahlteiler abzustimmen. Das Fluoreszenzanregungslicht 11 tritt ebenfalls durch die Gitter 21 hindurch. Dabei werden relative Phasen von Teilstrahlen des Fluoreszenzanregungslichts 11 so abgestimmt, dass das Fluoreszenzanregungslicht 11 in jeder Nullstelle der Komponente 14 des Anregungslichts 25 ein Intensitätsmaximum in der Fokalebene 5 aufweist. Hinter dem Objektiv 4 koppelt ein dichroitischer Spiegel 23 das von der Probe 3 kommende Fluoreszenzlicht 8 aus. Eine Abtasteinrichtung 24 ist vorgesehen, um die Probe 3 mit der Probenhalterung 2 gegenüber den Nullstellen des Ausschaltlichts 25 zu verlagern. Obwohl hier angedeutet ist, dass die Abtasteinrichtung 24 die Probenhalterung 2 mit der Probe 3 gegenüber dem Objektiv 4 verlagert, kann die Abtasteinrichtung 24 beispielsweise auch nur eine relative Phasenverschiebung von Teilstrahlen der Komponente 14 des Ausschaltlichts 25 bewirken. Die Abtasteinrichtung 24 tastet die Probe 3 mit den Nullstellen des Ausschaltlichts 25 in allen drei Raumrichtungen ab und erstellt so eine dreidimensionale Abbildung der interessierenden Struktur in der Probe 3. Eine Steuerung 30 steuert die Abtasteinrichtung 24 und die Kamera 6 so aufeinander abgestimmt an, dass die für die einzelnen Nullstellen des Ausschaltlichts 25 registrierten Intensitäten des Fluoreszenzlichts 8 bestimmten Positionen der Nullstellen in der Probe 3 zugeordnet werden können.
2(a) zeigt einen Schnitt in y-/z-Richtung, also längs der Zeichenebene von 1, durch die Lichtintensitätsverteilung des Ausschaltlichts 25 im Bereich der Fokalebene 5. Die Komponente 13 des Ausschaltlichts 25 begrenzt die blattförmige Nullstelle 26, die sich längs der Fokalebene 5 erstreckt. Diese blattförmige Nullstelle 26 wird durch die Komponente 14 des Ausschaltlichts 25 in einzelne punktförmige Nullstellen 27 unterteilt, wobei jede der Nullstellen 27 in der Fokalebene 5 ringförmig von der Komponente 14 des Ausschaltlichts 25 begrenzt ist. 2(b) ist ein Schnitt durch die Intensitätsverteilung des Ausschaltlichts 25 längs der Fokalebene 5, d. h. in x-/y-Richtung. Hier ist zu sehen, wie die beiden orthogonal überlagerten Interferenzstreifengitter 28 und 29 der Komponente 14 des Ausschaltlichts 25 die Nullstellen 27 ringförmig begrenzen. Dabei sind die Ringe aus der Komponente 14 des Ausschaltlichts 25 um die einzelnen Nullstellen 27 zwar nicht rund, sondern quadratisch. In den Ecken weisen sie aber eine doppelte Intensität des Ausschaltlichts 25 auf, so dass die einzelnen Nullstellen 27 in allen Richtungen der Fokalebene 5 im Wesentlichen gleiche Abmessungen aufweisen.
Das Rasterfluoreszenzlichtmikroskop 1 gemäß 3 unterscheidet sich von demjenigen gemäß 1 dadurch, dass hier auch das Fluoreszenzanregungslicht 11 von der Fluoreszenzanregungslichtquelle 12 längs der Fokalebene 5 auf die Probe 3 gerichtet wird und ein weiteres Lichtblatt längs der Fokalebene 5 ausbildet. Entsprechend wird hier nur die Komponente 14 des Ausschaltlichts 25 über das Objektiv 4 auf die Probe 3 gerichtet. Zudem erfasst das Objektiv 4 weiterhin das Fluoreszenzlicht 8 von der Probe 3 und führt es dem Detektor 7 zu.
Die in 4 gezeigte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Rasterfluoreszenzlichtmikroskops 1 weist keine Einschaltlichtquelle 10 auf. Hier ist vielmehr eine Fluoreszenzanregungslichtquelle 31 als Pendant zu der Einschaltlichtquelle 10 in den Rasterfluoreszenzlichtmikroskopen gemäß den 1 und 3, d. h. als Fluoreszenzermöglichungslichtquelle 32, vorgesehen. Von der Fluoreszenzanregungslichtquelle 31 wird Fluoreszenzanregungslicht 33 längs der Fokalebene 5 als Fluoreszenzermöglichungslicht 34 in Form des Lichtblatts 19 auf die Probe 3 gerichtet. Als dem Ausschaltlicht 25 entsprechendes Fluoreszenzverhinderungslicht 35 wird hier Wiederabregungslicht 36 von einer Wiederabregungslichtquelle 38 als Fluoreszenzverhinderungslichtquelle 39 unter Ausbildung einer Nullstelle im Bereich der Fokalebene 5 auf die Probe 3 gerichtet. Dabei sind auch hier zwei Teilquellen 15 und 16 vorgesehen. Die Komponente 14 des Fluoreszenzverhinderungslichts 35 wird nach Deformation ihrer Phasenfronten durch eine Phasenplatte 20 über das Objektiv 4 auf die Probe gerichtet, um die Nullstelle in der Fokalebene 5 ringförmig zu begrenzen. Die weitere Komponente 13 kann hier entweder als weiteres Lichtblatt längs der Fokalebene 5 auf die Probe 3 gerichtet werden oder ebenfalls durch das Objektiv 4, um das Lichtblatt 19 aus dem Fluoreszenzanregungslicht 33 im Bereich der Nullstelle in z-Richtung einzuengen. Letztere Variante ist in 4 mit gestrichelten Linien eingezeichnet. Als Abtasteinrichtung 24 ist hier ein Strahlscanner 37 vorgesehen. Als Detektor 7 dient ein Punktdetektor 40 mit davor angeordneter Lochblende 41. Die Messwerte des Punktdetektors 40 für das Fluoreszenzlicht 8 werden in einer Codierungseinrichtung 42 so codiert, dass ihnen die jeweilige Position der Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts 35 in der Probe 3 zugeordnet wird. Dies geschieht mit Hilfe der die Abtasteinrichtung 24 ansteuernden Steuerung 30.
Bezugszeichenliste

1: Rasterfluoreszenzlichtmikroskop
2: Probenhaltung
3: Probe
4: Objektiv
5: Fokalebene
6: Kamera
7: Detektor
8: Fluoreszenzlicht
9: Einschaltlicht
10: Einschaltlichtquelle
11: Fluoreszenzanregungslicht
12: Fluoreszenzanregungslichtquelle
13: Komponente des Ausschaltlichts 25
14: Komponente des Ausschaltlichts 25
15: Teilquelle
16: Teilquelle
17: Ausschaltlichtquelle
18: Optik
19: Lichtblatt
20: Phasenplatte
21: Gitter
22: Strahlteiler
23: dichroitischer Spiegel
24: Abtasteinrichtung
25: Ausschaltlicht
26: blattförmige Nullstelle / Dunkelblatt
27: Nullstelle
28: Liniengitter
29: Liniengitter
30: Steuerung
31: Fluoreszenzanregungslichtquelle
32: Fluoreszenzermöglichungslichtquelle
33: Fluoreszenzanregungslicht
34: Fluoreszenzermöglichungslicht
35: Fluoreszenzverhinderungslicht
36: Wiederabregungslicht
37: Strahlscanner
38: Wiederabregungslichtquelle
39: Fluoreszenzverhinderungslichtquelle
40: Punktdetektor
41: Lochblende
42: Codierungseinrichtung

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2004/090617 A2 [0004, 0006]
WO 2004090617 A2 [0005]
EP 2444832 A1 [0009]
DE 102010060121 A1 [0009]
WO 2009/100830 A1 [0010, 0011]
WO 2006/127692 [0010]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Biophys J. 2011 Apr. 20; 100 (8): L43–L45 [0007]
Biophys J. 2011 Apr. 20; 100 (8): L43–L45 [0008]

Claims

Verfahren zum dreidimensional hochauflösenden Abbilden einer mit Fluorophoren markierten Struktur einer Probe (3), wobei das Verfahren nach dem Anordnen der Probe (3) vor einem Objektiv (4), so dass eine Fokalebene (5) des Objektivs (4) durch die Probe (3) verläuft, wiederholt die Schritte aufweist: – Richten von Fluoreszenzermöglichungslicht (34) längs der Fokalebene (5) des Objektivs (4) auf die Probe (3), um längs der Fokalebene (5) ein Lichtblatt (19) aus dem Fluoreszenzermöglichungslicht (34) auszubilden; – Beaufschlagen von Teilbereichen des Lichtblatts (19) mit Fluoreszenzverhinderungslicht (35), das eine Nullstelle (27) innerhalb des Lichtblatts (19) aufweist, wobei das Fluoreszenzverhinderungslicht (35) eine Komponente (13) umfasst, die die Nullstelle (27) in Richtung orthogonal zu der Fokalebene (5) begrenzt; – Messen des aus der Nullstelle (27) von der Probe (3) emittierten und mit dem Objektiv (4) erfassten Fluoreszenzlichts (8); – Zuordnen des gemessenen Fluoreszenzlichts (8) zu dem Ort der Nullstelle (27) in der Probe (3) in Richtung orthogonal zu der Fokalebene (5); und – Verlagern der Nullstelle (27) gegenüber der Probe (3); dadurch gekennzeichnet, – dass eine weitere Komponente (14) des Fluoreszenzverhinderungslichts (35), die die Nullstelle (27) in mindestens einer Richtung der Fokalebene (5) des Objektivs begrenzt (4), durch das Objektiv (4) auf die Probe (3) gerichtet wird; und – dass das gemessene Fluoreszenzlicht (8) weiterhin dem Ort der Nullstelle (27) in der Probe (3) in der mindestens einen Richtung der Fokalebene (5) des Objektivs (4) zugeordnet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Fluorophore mit denen die Struktur in der Probe (3) markiert ist, schaltbar sind, dadurch gekennzeichnet, – dass das Fluoreszenzermöglichungslicht (34) in dem Bereich des Lichtblatts (19) befindliche schaltbare Fluorophore in einen fluoreszenten Zustand einschaltet; – dass das Fluoreszenzverhinderungslicht (35) im Umfeld der Nullstelle (27) aber nicht in der Nullstelle (27) die in den fluoreszenten Zustand eingeschalteten Fluorophore wieder ausschaltet; und – dass die Probe (3) mit Fluoreszenzanregungslicht (11) beaufschlagt wird, um die eingeschalteten Fluorophore in der Nullstelle (27) zur Emission von Fluoreszenzlicht (8) anzuregen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, – dass das Fluoreszenzermöglichungslicht (34) die in dem Bereich des Lichtblatts (19) befindlichen Fluorophore zur Emission von Fluoreszenzlicht (8) anregt; und – dass das Fluoreszenzverhinderungslicht (35) im Umfeld der Nullstelle (27) aber nicht in der Nullstelle (27) die angeregten Fluorophore wieder abregt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, – dass die weitere Komponente (14) des Fluoreszenzverhinderungslichts (35) die Nullstelle (27) in der Fokalebene (5) des Objektivs (4) ringförmig begrenzt; und – dass das gemessene Fluoreszenzlicht (8) weiterhin dem Ort der Nullstelle (27) in der Probe (3) in beiden Richtungen der Fokalebene (5) des Objektivs (4) zugeordnet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die eine Komponente (13) des Fluoreszenzverhinderungslichts (35) längs der Fokalebene (5) des Objektivs (4) auf die Probe (3) gerichtet wird und eine Lichtintensitätsverteilung mit einer sich längs der Fokalebene (5) des Objektivs (4) erstreckenden blattförmigen Nullstelle (26) ausbildet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzverhinderungslicht (35) mehrere Nullstellen (27) in dem Lichtblatt (19) aufweist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die mehreren Nullstellen (27) mit der weiteren Komponente (14) des Fluoreszenzverhinderungslichts (35) gleichzeitig oder nacheinander begrenzt werden.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, soweit rückbezogen auf Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die eingeschalteten Fluorophore in den mehreren Nullstellen (27) mit dem durch das Objektiv (4) auf die Probe (3) gerichteten Fluoreszenzanregungslicht (11) gleichzeitig oder nacheinander zur Emission von Fluoreszenzlicht (8) angeregt werden.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, soweit rückbezogen auf Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die eingeschalteten Fluorophore in den mehreren Nullstellen (27) mit dem längs der Fokalebene (5) des Objektivs (4) auf die Probe (3) gerichteten Fluoreszenzanregungslicht (11) gleichzeitig zur Emission von Fluoreszenzlicht (8) angeregt werden, wobei das Fluoreszenzanregungslicht (11) ein weiteres sich längs der Fokalebene (5) des Objektivs (4) erstreckendes Lichtblatt ausbildet.
Rasterfluoreszenzlichtmikroskop (1) zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit: – einem Objektiv (4); – einer Probenhalterung (2), die ausgebildet ist, um eine Probe (3), in der eine Struktur mit Fluorophoren markiert ist, so vor dem Objektiv (4) zu halten, dass eine Fokalebene (5) des Objektivs (4) durch die Probe (3) verläuft; – einer Fluoreszenzermöglichungslichtquelle (32), die ausgebildet ist, um Fluoreszenzermöglichungslicht (34) so längs der Fokalebene (5) des Objektivs (4) auf die Probe (3) zu richten, dass sich längs der Fokalebene (5) ein Lichtblatt (19) aus dem Fluoreszenzermöglichungslicht (34) ausbildet; – einer Fluoreszenzverhinderungslichtquelle (39), die ausgebildet ist, um Teilbereiche des Lichtblatts (19) mit Fluoreszenzverhinderungslicht (35) zu beaufschlagen, das eine Nullstelle (27) innerhalb des Lichtblatts (19) aufweist, wobei die Fluoreszenzverhinderungslichtquelle (39) ausgebildet ist, um die Probe (3) mit einer Komponente (13) des Fluoreszenzverhinderungslichts (35) zu beaufschlagen, die die Nullstelle (27) in Richtung orthogonal zu der Fokalebene (5) begrenzt; – einem Detektor (7), der ausgebildet ist, um das aus der Nullstelle (27) von der Probe (3) emittierte und mit dem Objektiv (4) erfasste Fluoreszenzlicht (8) zu messen; – einer Codierungseinrichtung (42), die ausgebildet ist, um dem gemessenen Fluoreszenzlicht (8) einen Code zuzuordnen, der den Ort der Nullstelle (27) in der Probe (3) in Richtung orthogonal zu der Fokalebene (5) anzeigt; und – einer Abtasteinrichtung (24), die ausgebildet ist, um die Nullstelle (27) gegenüber der Probenhalterung (2) zu verlagern; dadurch gekennzeichnet, – dass die Fluoreszenzverhinderungslichtquelle (39) ausgebildet ist, um eine weitere Komponente (14) des Fluoreszenzverhinderungslichts (35), die die Nullstelle (27) in mindestens einer Richtung der Fokalebene (5) des Objektivs (4) begrenzt, durch das Objektiv (4) auf die Probe (3) zu richten; und – dass die Codierungseinrichtung (42) ausgebildet ist, um dem gemessenen Fluoreszenzlicht (8) einen weiteren Code zuzuordnen, der das gemessene Fluoreszenzlicht (8) weiterhin dem Ort der Nullstelle (27) in der Probe (3) in der mindestens einen Richtung der Fokalebene (5) des Objektivs (4) anzeigt.
Rasterfluoreszenzlichtmikroskop (1) nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine zusätzliche Fluoreszenzanregungslichtquelle (12) vorgesehen und ausgebildet ist, um die Probe (3) mit Fluoreszenzanregungslicht (11) zu beaufschlagen.
Rasterfluoreszenzlichtmikroskop (1) nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, – dass die Fluoreszenzverhinderungslichtquelle (39) so ausgebildet ist, dass die weitere Komponente (14) des Fluoreszenzverhinderungslichts (35) die Nullstelle (27) in der Fokalebene (5) des Objektivs (4) ringförmig begrenzt; und – dass die Codierungseinrichtung (42) so ausgebildet ist, dass der weitere Code das gemessene Fluoreszenzlicht (8) weiterhin dem Ort der Nullstelle (27) in der Probe (3) in beiden Richtungen der Fokalebene (5) des Objektivs (4) zuordnet.
Rasterfluoreszenzlichtmikroskop (1) nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzverhinderungslichtquelle (39) eine Teilquelle (15) aufweist, die so ausgebildet ist, dass sie die eine Komponente (13) des Fluoreszenzverhinderungslichts (35) längs der Fokalebene (5) des Objektivs (4) auf die Probe (3) richtet und sich eine Lichtintensitätsverteilung der einen Komponente (13) des Fluoreszenzverhinderungslichts (35) mit einer sich längs der Fokalebene (5) des Objektivs (4) erstreckenden blattförmigen Nullstelle (26) ausbildet.
Rasterfluoreszenzlichtmikroskop (1) nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzverhinderungslichtquelle (39) so ausgebildet ist, dass das Fluoreszenzverhinderungslicht (35) mehrere Nullstellen (27) in dem Lichtblatt (19) aufweist.
Rasterfluoreszenzlichtmikroskop (1) nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzverhinderungslichtquelle (39) eine weitere Teilquelle (16) aufweist, die so ausgebildet ist, dass mit der weiteren Komponente (14) des Fluoreszenzverhinderungslichts (35) mehrere Nullstellen (27) nacheinander begrenzt werden.
Rasterfluoreszenzlichtmikroskop (1) nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzverhinderungslichtquelle (39) eine weitere Teilquelle (16) aufweist, die so ausgebildet ist, dass die weitere Komponente (14) des Fluoreszenzverhinderungslichts (35) mehrere Nullstellen (27) gleichzeitig begrenzt, indem die weitere Teilquelle (16) zwei sich in der Fokalebene (5) des Objektivs (4) orthogonal kreuzende Liniengitter (28, 29) aus dem Fluoreszenzverhinderungslicht (35) ausbildet.
Rasterfluoreszenzlichtmikroskop (1) nach einem der Ansprüche 14 bis 16, soweit rückbezogen auf Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzanregungslichtquelle (12) so ausgebildet ist, dass sie die eingeschalteten Fluorophore in den mehreren Nullstellen (27) mit dem durch das Objektiv (4) auf die Probe (3) gerichteten Fluoreszenzanregungslicht (11) gleichzeitig oder nacheinander zur Emission von Fluoreszenzlicht (8) anregt.
Rasterfluoreszenzlichtmikroskop (1) nach einem der Ansprüche 14 bis 16, soweit rückbezogen auf Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzanregungslichtquelle (12) so ausgebildet ist, dass sie die eingeschalteten Fluorophore in den mehreren Nullstellen (27) mit dem längs der Fokalebene (5) des Objektivs (4) auf die Probe (3) gerichteten Fluoreszenzanregungslicht (11) gleichzeitig zur Emission von Fluoreszenzlicht (8) anregt, wobei das Fluoreszenzanregungslicht (11) ein weiteres sich längs der Fokalebene (5) des Objektivs (4) erstreckendes Lichtblatt ausbildet.