DE102013107297A1 - Anordnung zur Lichtblattmikroskopie - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Lichtblattmikroskopie. Eine solche Anordnung umfasst ein Probengefäß (1) zur Aufnahme einer in einem Medium (2) befindlichen Probe (3). Das Probengefäß (1) ist hinsichtlich einer ebenen Bezugsfläche ausgerichtet. Die Anordnung umfasst außerdem eine Beleuchtungsoptik mit einem Beleuchtungsobjektiv (6) zur Beleuchtung der Probe (3) mit einem Lichtblatt, wobei die optische Achse (7) des Beleuchtungsobjektivs (6) und das Lichtblatt in einer Ebene liegen, die mit der Normalen der Bezugsfläche einen von Null verschiedenen Beleuchtungswinkel β einschließt, sowie eine Detektionsoptik mit einem Detektionsobjektiv (8), dessen optische Achse (9) mit der Normalen der Bezugsfläche einen von Null verschiedenen Detektionswinkel δ einschließt. Bei einer solchen Anordnung ist ein Trennschichtsystem einer oder mehreren Schichten vorgegebener Dicken und aus vorgegebenen Materialien zur räumlichen Trennung des Mediums (2), in welchem sich die Probe (3) befindet, von dem Beleuchtungsobjektiv (6) und dem Detektionsobjektiv (8) vorgesehen, wobei das Trennschichtsystem mit einer parallel zur Bezugsfläche ausgerichteten Grenzfläche (11) zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv (6) und das Detektionsobjektiv (8) für die Beleuchtung und die Detektion zugänglichen Bereich mit dem Medium (2) in Kontakt steht. Dabei sind Beleuchtungswinkel β und Detektionswinkel δ anhand numerischer Aperturen NAD, NAB des Detektionsobjektivs (8) bzw. des Beleuchtungsobjektivs (6) vorgegeben.
Description
- Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Lichtblattmikroskopie. Eine solche Anordnung umfasst ein Probengefäß zur Aufnahme einer in einem Medium befindlichen Probe, wobei das Probengefäß hinsichtlich einer ebenen Bezugsfläche ausgerichtet ist. Die Anordnung umfasst außerdem eine Beleuchtungsoptik mit einem Beleuchtungsobjektiv zur Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt, wobei die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs und das Lichtblatt in einer Ebene liegen, die mit der Normalen der Bezugsfläche einen von Null verschiedenen Beleuchtungswinkel β einschließt. Die Anordnung umfasst schließlich eine Detektionsoptik mit einem Detektionsobjektiv, dessen optische Achse mit der Normalen der Bezugsfläche einen von Null verschiedenen Detektionswinkel δ einschließt. Beleuchtungsobjektiv und Detektionsobjektiv können dabei auch als sogenanntes Doppelobjektiv ausgestaltet sein, wie es beispielsweise in der
EP 0 866 993 B1 beschrieben ist. Beide Objektive sind dann in einer gemeinsamen Baueinheit zusammengefasst, die jeweiligen Optiken – d.h. Objektive mit zugehörigen Strahlengängen und darin angeordneten optischen Elementen – teilen sich dann einige Elemente. - Eine solche Vorrichtung wird insbesondere bei der Untersuchung von biologischen Proben eingesetzt, bei der die Beleuchtung der Proben mit einem Lichtblatt, dessen Ebene die optische Achse der Detektion in einem von Null verschiedenen Winkel schneidet, erfolgt. Üblicherweise schließt dabei das Lichtblatt mit der Detektionsrichtung, die in der Regel der optischen Achse des Detektionsobjektivs entspricht, einen rechten Winkel ein. Mit dieser auch als SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy) bezeichneten Technik lassen sich in relativ kurzer Zeit räumliche Aufnahmen auch dickerer Proben erstellen. Auf der Basis von optischen Schnitten kombiniert mit einer Relativbewegung in einer Richtung senkrecht zur Schnittebene ist eine bildliche, räumlich ausgedehnte Darstellung der Probe möglich.
- Die SPIM-Technik wird bevorzugt in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, wo sie dann auch als LSFM (Light Sheet Fluorescence Microscopy) bezeichnet wird. Gegenüber anderen etablierten Verfahren wie der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie oder der Zwei-Photonen-Mikroskopie weist die LSFM-Technik mehrere Vorzüge auf: Da die Detektion im Weitfeld erfolgen kann, lassen sich größere Probenbereiche erfassen. Zwar ist die Auflösung etwas geringer als bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, jedoch lassen sich mit der LSFM-Technik dickere Proben analysieren, da die Eindringtiefe höher ist. Darüber hinaus ist die Lichtbelastung der Proben bei diesem Verfahren am geringsten, was u.a. die Gefahr des Ausbleichens einer Probe reduziert, da die Probe nur durch ein dünnes Lichtblatt in einem von Null verschiedenen Winkel zur Detektionsrichtung beleuchtet wird.
- Dabei kann sowohl ein statisches Lichtblatt, welches beispielsweise mit Hilfe von Zylinderlinsen erzeugt wird, verwendet werden, als auch ein quasi-statisches Lichtblatt. Dieses kann erzeugt werden, in dem die Probe mit einem Lichtstrahl schnell abgetastet wird. Die lichtblattartige Beleuchtung entsteht, indem der Lichtstrahl einer sehr schnellen Relativbewegung zu der zu beobachteten Probe unterworfen wird und dabei zeitlich aufeinanderfolgend mehrfach aneinandergereiht wird. Dabei wird die Integrationszeit der Kamera, auf deren Sensor die Probe letztendlich abgebildet wird, so gewählt, dass die Abtastung innerhalb der Integrationszeit abgeschlossen wird. Anstelle einer Kamera mit 2D-Array kann auch ein Zeilensensor in Kombination mit einem erneuten Abtasten (Rescan) in der Detektionsoptik verwendet werden. Die Detektion kann außerdem auch konfokal erfolgen.
- Die SPIM-Technik ist in der Literatur inzwischen vielfach beschrieben, beispielsweise in der
DE 102 57 423 A1 und der darauf aufbauendenWO 2004/053558 A1 - Eine der Hauptanwendungen der Lichtblattmikroskopie liegt in der Bildgebung mittelgroßer Organismen mit einer Größe von einigen 100 µm bis hin zu wenigen Millimetern. In der Regel werden diese Organismen in ein Agarose-Gel eingebettet, welches sich wiederum in einer Glaskapillare befindet. Die Glaskapillare wird von oben bzw. von unten in eine wassergefüllte Probenkammer eingebracht und die Probe ein Stück aus der Kapillare herausgedrückt. Die Probe in der Agarose wird mit einem Lichtblatt beleuchtet und die Fluoreszenz mit einem Detektionsobjektiv, dass senkrecht zum Lichtblatt und damit auch senkrecht zur Lichtblattoptik steht, auf eine Kamera abgebildet. Diese Methode der Lichtblattmikroskopie hat drei große Nachteile. Zum einen sind die zu untersuchenden Proben relativ groß, sie stammen aus der Entwicklungsbiologie. Außerdem ist aufgrund der Probenpräparation und der Abmessungen der Probenkammer das Lichtblatt relativ dick und somit die erzielbare axiale Auflösung eingeschränkt. Zusätzlich ist die Probenpräparation aufwendig und nicht kompatibel zur Standard-Probenpräparationen und zu Standard-Probenhalterungen, wie sie in der Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung einzelner Zellen üblich sind.
- Um diese Einschränkungen zumindest teilweise umgehen zu können, wurde in den letzten Jahren ein SPIM-Aufbau realisiert, bei dem das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv senkrecht zueinander stehen und unter einem Winkel von jeweils 45° von oben auf die Probe gerichtet sind. Zieht man als Bezugsfläche beispielsweise die Ebene eines Tisches heran, auf dem die Probenhalterung gelagert ist, oder eine andere, horizontale Ebene, so betragen der Beleuchtungswinkel β und der Detektionswinkel δ jeweils 45°. Ein solcher Aufbau wird beispielsweise in der
WO 2012/110488 A2 WO 2012/122027 A2 - Die Probe befindet sich bei solchen Aufbauten beispielsweise auf dem Boden einer Petrischale. Die Petrischale ist mit Wasser gefüllt, Beleuchtungsobjektiv und Detektionsobjektiv werden in die Flüssigkeit eingetaucht, das Wasser übernimmt auch die Funktion einer Immersionsflüssigkeit. Dieser Ansatz bietet den Vorteil einer höheren Auflösung in axialer Richtung, da ein dünneres Lichtblatt erzeugt werden kann. Aufgrund der höheren Auflösung können dann kleinere Proben untersucht werden. Auch ist die Probenpräparation bedeutend einfacher geworden. Dennoch entsprechen Probenpräparation und Probenhalterung weiterhin noch nicht dem Standard, wie er in der Fluoreszenzmikroskopie bei einzelnen Zellen derzeit gültig ist. So muss die Petrischale relativ groß sein, damit die beiden Objektive in die Schale eingetaucht werden können, ohne an den Rand der Schale anzustoßen. Mikrotiterplatten – auch als Multi-Well-Platten bezeichnet –, die Standard in vielen Bereichen der Biologie sind und gerade auch bei der fluoreszenzmikroskopischen Analyse einzelner Zellen eingesetzt werden, können mit diesem Verfahren nicht verwendet werden, da die Objektive nicht in die sehr kleinen Vertiefungen, welche rasterförmig auf der Platte angeordnet sind, eintauchen können. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass mit diesem Aufbau eine Analyse einer Vielzahl von Proben in kurzer Zeit (High-Throughput-Screening) nicht ohne weiteres möglich ist, da die Objektive beim Wechseln der Probe gereinigt werden müssen, um Kontaminierungen der verschiedenen Proben zu vermeiden.
- Die Aufgabe der Erfindung besteht daher darin, eine Anordnung zur Lichtblattmikroskopie der eingangs beschriebenen Art dahingehend weiterzuentwickeln, dass die Analyse insbesondere einer Vielzahl von Proben vereinfacht wird, indem beim Wechsel zwischen zwei Proben eine Kreuzkontaminierung effektiv verhindert wird.
- Diese Aufgabe wird bei einer Anordnung zur Lichtblattmikroskopie der eingangs beschriebenen Art dadurch gelöst, dass diese Anordnung ein Trennschichtsystem mit einer oder mehreren Schichten mit vorgegebenen Dicken und aus vorgegebenen Materialien zur räumlichen Trennung des Mediums, in welchem sich die Probe befindet, von dem Beleuchtungsobjektiv und dem Detektionsobjektiv umfasst. Dabei steht das Trennschichtsystem mit einer parallel zur Bezugsfläche ausgerichteten Grenzfläche zumindest in dem Bereich, der für das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv für die Beleuchtung der Probe und die Detektion von Licht, welches von der Probe kommt, zugänglich ist mit dem Medium in Kontakt – vollständig oder doch zumindest nahezu vollständig. Beleuchtungswinkel β und Detektionswinkel δ sind dabei anhand der numerischen Aperturen NAD des Detektionsobjektivs und NAB des Beleuchtungsobjektivs vorgegeben. Die Vorgabe erfolgt dabei in dem Sinne, dass die Komponenten zueinander so angeordnet werden, dass die vorhandenen Aberrationen ohne weitere Maßnahmen minimal sind. Selbstverständlich lassen sich auch andere Winkel einstellen, wenn man größere Aberrationen in Kauf nimmt, die Abbildungsqualität nimmt dann jedoch ab.
- Im einfachsten Fall besteht das Trennschichtsystem nur aus einer einzigen Schicht, diese Schicht kann auch eine Luftschicht sein, wobei Beleuchtungs- und Detektionsobjektiv als Trockenobjektive ausgestaltet werden. Das Trennschichtsystem kann aber auch mehrere Schichten umfassen, beispielsweise eine Glas- oder Kunststoffschicht, die als Folie oder Platte das Probengefäß gegenüber beiden Objektive abdeckt. Zwischen dieser Glas- oder Kunststoffschicht und den Objektiven befindet sich dann eine Luftschicht oder eine Schicht mit einer Immersionsflüssigkeit, mit welcher die beiden Objektive in Kontakt stehen. Das Trennschichtsystem kann aber auch aus einer einzigen Flüssigkeitsschicht bestehen, wenn sichergestellt ist, dass sich diese Flüssigkeitsschicht nicht mit dem Medium, in welchem sich die Probe befindet, vermischt. Diese Flüssigkeit kann dann ebenfalls als Immersionsmedium dienen.
- Durch die Einführung eines Trennschichtsystems lässt sich zwar eine Kontaminierung effektiv verhindern, jedoch treten aufgrund des Durchtritts von Beleuchtungs- und Detektionslicht durch die Grenzflächen des Trennschichtsystems bis zum Medium, in welchem sich die Probe befindet, schon bei niedrigen numerischen Aperturen wie 0,3 extreme Abbildungsfehler wie sphärische Aberrationen und Koma auf. Durch den schrägen Durchtritt kommen weitere, unsymmetrische Abbildungsfehler hinzu, bzw. werden die anderen verstärkt. Um diese Abbildungsfehler zu minimieren werden daher der Beleuchtungswinkel β und der Detektionswinkel δ anhand der numerischen Aperturen NAD, NAB des Detektionsobjektivs bzw. des Beleuchtungsobjektivs vorgegeben. Dabei wird das Objektiv mit der niedrigeren numerischen Apertur, welches in der Regel das Beleuchtungsobjektiv ist, unter einem größeren Winkel als das Detektionsobjektiv angeordnet wird. In seltenen Fällen kann auch das Detektionsobjektiv eine größere numerische Apertur als das Beleuchtungsobjektiv aufweisen. Oft werden auch symmetrische Konfigurationen verwendet, bei denen Beleuchtungsobjektiv und Detektionsobjektiv gleich aufgebaut sind und beide Objektive den gleichen Winkel mit der Normalen einschließen. Die Summe von Beleuchtungswinkel β und Detektionswinkel δ ist in allen Fällen idealerweise 90°. Wird davon abgewichen, weil beispielsweise beide Objektive unter einem spitzeren Winkel angeordnet werden können, so dass die Summe kleiner als 90° ist, so muss, da die Objektebene jetzt schief in Bezug auf die optische Achse des Detektionsobjektivs liegt, darauf geachtet werden, dass die Scheimpflugbedingung erfüllt ist – der Bildsensor der Kamera muss dann ebenfalls entsprechend schräg ausgerichtet sein. Es sind auch Anordnungen denkbar, bei denen Beleuchtungs- und Detektionsobjektiv in einem optischen Modul wie dem eingangs erwähnten Doppelobjektiv zusammengefasst sind.
- Sollte sich diese Art der einfachen Minimierung der Aberrationen, die mit Standardobjektiven vorgenommen werden kann, als nicht ausreichend erweisen, so sind weitere Maßnahmen möglich, um die Aberrationen weiter zu vermindern bzw. ganz auszuschließen.
- In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfassen die Beleuchtungsoptik und/oder die Detektionsoptik daher Korrekturmittel zur Verringerung der Aberrationen, insbesondere von solchen Aberrationen, welche durch den schrägen Durchtritt von Beleuchtungslicht und/oder zu detektierenden Licht durch Grenzflächen des Trennschichtsystems entstehen.
- In einer bevorzugten Ausgestaltung umfassen die Korrekturmittel daher Korrekturlinsen und/oder Korrekturelemente im Beleuchtungsobjektiv oder im Detektionsobjektiv. Die Korrekturlinsen können beispielsweise als Zylinderlinsen ausgestaltet sein, als gegen die jeweilige optische Achse verkippte Linsen oder als nicht axial angeordnete Linsen, deren Symmetrieachse also nicht auf der optischen Achse des Beleuchtungs- bzw. des Detektionsobjektivs liegt. Die Korrekturelemente können beispielsweise als Elemente mit asphärischen Flächen oder Freiformflächen ausgebildet sein. Verschiedene Korrekturlinsen/Korrekturelemente eines Typs oder verschiedener Typen können auch in einem Objektiv kombiniert werden.
- Für jedes Trennschichtsystem kann dann in Abhängigkeit von der Materialzusammensetzung und der Dicke des Trennschichtsystems ein eigener Satz von Beleuchtungs- und Detektionsobjektiven generiert werden, was jedoch sowohl mit einem hohen Kostenaufwand verbunden ist, da mehrere Sätze angeschafft werden müssen, als auch mit einem erhöhten Arbeitsaufwand, der mit dem Wechsel der Objektive beim Wechsel des Trennschichtsystems mit sich bringt, verbunden ist.
- In einer alternativen Ausgestaltung umfassen die Korrekturmittel daher im Beleuchtungsstrahlengang und/oder im Detektionsstrahlengang angeordnete adaptive optische Elemente zur Manipulation der Phasenfronten des Beleuchtungs- bzw. des Detektionslichts. Diese können beispielsweise als verformbare Spiegel, Phasenplatten oder räumliche Lichtmodulatoren ausgestaltet sein. Diese Elemente lassen sich bevorzugt ansteuerbar konfigurieren, so dass eine Adaption an eine Vielzahl möglicher Trennschichtsysteme mit ein und derselben Anordnung von Beleuchtungs- und Detektionsobjektiv möglich wird.
- Denkbar ist auch eine Kombination der beiden Alternativen in dem Sinne, dass beispielsweise durch die fest eingebauten Korrekturlinsen eine wesentliche Grundkorrektur für die am häufigsten verwendeten Trennschichtsysteme und ggf. auch für die sphärischen Aberrationen bei senkrechtem Durchtritt – wie es bei Mikroskopobjektiven für Standardgläser und -dicken oft der Fall ist – vorgenommen wird und mit Hilfe der adaptiven optischen Elemente im Strahlengang eine individuelle, an das jeweilige Trennschichtsystem angepasste Feinkorrektur vorgenommen wird.
- Das Trennschichtsystem umfasst bevorzugt, wie bereits erwähnt, eine das Probengefäß abschließende, plattenförmige oder folienförmige Abdeckung aus einem vorgegebenen Material und von einer vorgegebenen Dicke. Eine erste Großfläche dieser platten- oder folienförmigen Abdeckung steht dabei mit dem Medium, in welchem sich die Probe befindet, zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv für die Beleuchtung und die Detektion zugänglichen Bereich nahezu vollständig in Kontakt. Eine zweite Großfläche der Abdeckung steht bevorzugt mit einem Gas – beispielsweise Luft – oder einem Immersionsmedium als weitere Komponente des Trennschichtsystems zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv und dem Detektionsobjektiv für die Beleuchtung und Detektion zugänglichen Bereich in Kontakt. Alternativ oder in Ergänzung zu den genannten Korrekturmitteln in den Objektiven bzw. im Strahlengang kann auch das Trennschichtsystem entsprechend angepasst werden um die Aberrationen zu vermindern. Bei einer entsprechenden Anpassung der Trennschichtmaterialien kann auch eine weitergehende Korrektur der Objektive unter Umständen verzichtet werden, bzw. müssen diese Korrekturen nicht so stark ausfallen.
- In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung weist das Material für die Abdeckung daher einen Brechungsindex auf, welcher sich von dem Brechungsindex des Mediums, in welchem sich die Probe befindet, um weniger als 5 % unterscheidet. Weisen beide Materialien den gleichen Brechungsindex auf, so lassen sich Aberrationen an der Grenzfläche zwischen Medium und Abdeckung ganz vermeiden. Wenn als Medium, in welchem sich die Probe befindet, beispielsweise Wasser verwendet wird, welches eine Brechzahl nd = 1,33 bei einer Wellenlänge λd = 578,56 nm hat, so eignet sich als Material für die Abdeckung beispielsweise PTFE (Polytetrafluorethylen, nd = 1,35), CYTOP® (nd = 1,34), oder FEP (Perfluorethylenpropylen, nd = 1,34) ist. Auch perfluorodioxolane Polymere lassen sich verwenden, deren Brechungsindex ebenfalls in der Regel zwischen 1,33 und 1,36 liegt. Ein besonders gut geeignetes Material ist auch Teflon® AF, welches üblicherweise einen Brechungsindex nd = 1,32 aufweist. Bei diesem Material handelt es sich um ein amorphes Polymer, hier kann die Glasübergangstemperatur so eingestellt werden, dass das Polymer im erkalteten Zustand den Brechungsindex des Mediums, in welchem sich die Probe befindet, aufweist. Auch andere amorphe Polymere mit einstellbarer Glasübergangstemperatur lassen sich selbstverständlich verwenden.
- Stimmen die Brechungsindizes nicht exakt überein, so treten weiterhin Aberrationen auf, wenn auch im verringertem Maße. Um diese Aberrationen weiter zu vermindern, sollte die Trennschicht/Abdeckung daher so dünn wie möglich gewählt werden und nicht dicker als einige hundert µm sein. Dient die Abdeckung gleichzeitig als Boden des Probengefäßes, wie es bei einer inversen Anordnung der Fall ist, oder als Seitenwand bei einer liegenden Beobachtungsanordnung, so muss selbstverständlich auf eine ausreichende Stabilität gegenüber dem von dem Medium, in welchem sich die Probe befindet, ausgeübten Druck geachtet werden. Dies ist bei einer Abdeckung als Deckel des Probengefäßes für eine aufrechte Beobachtung nicht erforderlich, hier kann das Material noch wesentlich dünner ausgeformt werden mit Dicken von weniger als 100 µm.
- In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist das Material für die Abdeckung ein nanostrukturiertes Material, welches aus einer ersten und einer zweiten Komponente zusammengesetzt ist, wobei der Brechungsindex der ersten Komponente kleiner und der Brechungsindex der zweiten Komponente größer als der Brechungsindex des Mediums zur Aufnahme der Probe ist. Bei entsprechender Nanostrukturierung der zweiten Komponente mit Anteilen der ersten Komponente, bzw. bei geeigneten Materialien auch nur durch anteilige Mischung der beiden Komponenten lässt sich dann ein Material mit einem effektiven Brechungsindex herstellen, welcher in den bereits genannten Bereich von 5 % um den Brechungsindex des Mediums zur Aufnahme der Probe fällt. Bei einer Nanostrukturierung ist dabei jedoch Voraussetzung, dass die mittleren Strukturgrößen der Bereiche aus Material der ersten Komponente einen Durchmesser aufweisen, der geringer als die Lichtwellenlängen des zur Beleuchtung verwendeten und des zu detektierenden Lichts ist, da nur dann ein effektiver Brechungsindex in einem Bereich von 5% um den Brechungsindex des Mediums, beispielsweise Wasser, eingestellt werden kann. Hier lassen sich beispielsweise unterschiedliche Polymere verwenden, deren Mischungsverhalten bzw. Entmischungsverhalten, wenn sich die Materialien nicht mischen, ausgenutzt wird, oder auch nanoporöses Siliziumdioxid. In dem letzteren Fall ist die erste Komponente die Luft und die zweite Komponente Siliziumdioxid. Solcherart nanostrukturierte Materialien werden beispielsweise in dem Artikel „Optical thin-film materials with low refractive index for broadband elimination of Fresnel reflection" von J.-Q. Xi et al., erschienen im Jahre 2007 in Nature Photonics, Vol. 1, S.176–179 im Zusammenhang mit der Herstellung von Antireflexionsschichten beschrieben. Auch hier sollte die Dicke der Abdeckung so dünn wie möglich gewählt werden, es gelten die gleichen Randbedingungen wie bereits oben beschrieben.
- Das Trennschichtsystem einschließlich der Abdeckung kann beispielsweise einen Gefäßdeckel für übliche Mikrotiterplatten umfassen, hier lässt sich dann der bekannte aufrechte Aufbau eines Lichtblattmikroskops verwenden, wobei mit entsprechenden Positionierungsmitteln zur Positionierung der Probe im oberen Viertel des Probengefäßes, bezogen auf seine Tiefe, oder zur Positionierung im Gefäßdeckel sichergestellt wird, dass die Probe dem Mikroskopaufbau zugänglich ist.
- Die Anordnung zur Lichtblattmikroskopie kann aber auch ein inverses Lichtblattmikroskop umfassen, bei dem Beleuchtungs- und Detektionsobjektiv unterhalb des Probengefäßes angeordnet sind. In diesem Fall bildet die Abdeckung als Teil des Trennschichtsystems den Gefäßboden des Probengefäßes, es müssen also spezielle Probengefäße vorgehalten werden oder Standard-Multi-Well-Platten mit transparentem Gefäßboden.
- Daneben ist außerdem auch eine liegende Konfiguration möglich, bei der sich die optischen Achsen von Beleuchtungs- und Detektionsobjektiv in einer horizontalen Ebene befinden. Für diesen Fall und für den Fall der aufrechten Beobachtung umfasst das Probengefäß zweckmäßig Mittel zur Positionierung der Probe in einem seitlichen bzw. oberen Bereich des Probengefäßes innerhalb des Arbeitsabstandes von Beleuchtungsobjektiv und Detektionsobjektiv.
- Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
- Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
-
1 eine erste Anordnung zur Lichtblattmikroskopie mit aufrechter Beobachtung, -
2 eine Anordnung zur Lichtblattmikroskopie wie in1 , jedoch mit inverser Beobachtung, -
3 eine weitere Anordnung zur Lichtblattmikroskopie mit im Strahlengang angeordneten Korrekturmitteln, -
4 eine alternative Anordnung mit Korrekturmitteln zur Kompensation der Abbildungsfehler im Strahlengang und -
5 ein Beispiel für eine nanostrukturierte Abdeckung. -
1 zeigt zunächst eine für die aufrechte Beobachtung geeignete Anordnung zur Lichtblattmikroskopie. Diese umfasst ein Probengefäß1 zur Aufnahme einer in einem Medium2 befindlichen Probe3 . Das Probengefäß1 ist hinsichtlich einer ebenen Bezugsfläche ausgerichtet, die hier durch einen Probentisch4 definiert wird. Die Anordnung umfasst eine Beleuchtungsoptik mit einer Lichtquelle5 und einem Beleuchtungsobjektiv6 zur Beleuchtung der Probe3 mit einem Lichtblatt, wobei die optische Achse7 des Beleuchtungsobjektivs6 und das Lichtblatt in einer Ebene liegen, die mit der Normalen der Bezugfläche einen von Null verschiedenen Beleuchtungswinkel β einschließt. Die Anordnung umfasst außerdem eine Detektionsoptik mit einem Detektionsobjektiv8 , dessen optische Achse9 mit der Normalen der Bezugsfläche einen von Null verschiedenen Detektionswinkel δ einschließt. Von der Probe3 kommendes Licht wird auf einen Detektor10 geleitet, dort registriert; die registrierten Signale werden einer Weiterverarbeitung und/oder einer Darstellung auf einem Bildschirm zugänglich gemacht. - Die Anordnung umfasst außerdem ein Trennschichtsystem mit einer Schicht oder mehreren Schichten vorgegebener Dicken und aus vorgegebenen Materialien zur räumlichen Trennung des Mediums
2 , in welchem sich die Probe3 befindet, von dem Beleuchtungsobjektiv6 und dem Detektionsobjektiv8 . Das Trennschichtsystem weist eine parallel zur Bezugsfläche ausgerichtete Grenzfläche11 auf, mit der es zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv6 und das Detektionsobjektiv8 für die Beleuchtung und die Detektion zugänglichen Bereich vollständig oder zumindest nahezu vollständig mit dem Medium2 in Kontakt steht. Beleuchtungswinkel β und Detektionswinkel δ sind dabei anhand numerischer Aperturen NAD und NAB des Detektionsobjektivs8 bzw. des Beleuchtungsobjektivs6 vorgegeben. - Als Medium
2 kann beispielsweise Wasser verwendet werden, aber auch die Verwendung anderer Flüssigkeiten oder sogar von Gelen ist möglich. - Da Beleuchtungsobjektiv
6 und Detektionsobjektiv8 nun nicht mehr direkt mit dem Medium2 in Kontakt stehen, kann es nicht mehr zur Kontaminierung beim Wechsel zwischen zwei Probengefäßen mit verschiedenen Proben kommen. Durch das Trennschichtsystem, welches im einfachsten Fall aus einer Schicht Luft bestehen kann, kommt es jedoch aufgrund des Durchtritts von Licht durch die Grenzflächen zum Auftreten von Aberrationen, insbesondere von sphärischen Aberrationen und Koma. Um diese Aberrationen – bei schrägem Lichtdurchtritt in erster Linie Astigmatisums und Koma, in geringerem Umfang diese auch in höheren Ordnungen – zu verringern bzw. ganz zu vermeiden, sind verschiedene Maßnahmen möglich. - Eine erste, nicht zwingend notwendige, Maßnahme kann darin bestehen, den Beleuchtungswinkel β und den Detektionswinkel δ anhand der numerischen Aperturen des Beleuchtungsobjektivs
6 und des Detektionsobjektivs8 vorzugeben. Dies ist ebenfalls in1 gezeigt. Die numerische Apertur NAB des Beleuchtungsobjektivs6 ist kleiner als die numerische Apertur NAD des Detektionsobjektivs8 . Da sich die Aberrationen bei Objektiven mit großer NA stärker bemerkbar machen, ist für solche Objektive eine Positionierung ihrer optischen Achse möglichst nah an der Normalen der Bezugsfläche, also mit einem besonders kleinen Winkel zu dieser vorteilhaft, da die Aberrationen auch um so größer werden, je schräger der Lichteinfall ist, desto größer als der Winkel ist, den die optische Achse des Objektivs mit der Normalen der Bezugsfläche einschließt. Für die Beleuchtung kann andererseits ein Objektiv mit einer kleineren numerischen Apertur verwendet werden, da für die Erzeugung eines Lichtblatts in der Regel numerische Aperturen von weniger als 0.5 ausreichend sind, während für die Detektion aufgrund der hohen Auflösung eine möglichst hohe numerische Apertur von 1.0 oder höher notwendig ist. In der in1 dargestellten Situation ist dies der Fall, die numerische Apertur NAB des Beleuchtungsobjektivs6 ist kleiner als die numerische Apertur NAD des Detektionsobjektives8 . Der Beleuchtungswinkel β kann daher größer als der Detektionswinkel δ gewählt werden. Bevorzugt ist dabei, wie auch in1 gezeigt, die Summe von Beleuchtungswinkel β und Detektionswinkel δ 90°. Bei davon abweichenden Winkeln muss der Detektor10 entsprechend schief gestellt werden, so dass die sogenannte Scheimpflugbedingung erfüllt ist. - Das Trennschichtsystem weist hier eine das Probengefäß abschließende, plattenförmige Abdeckung
12 aus einem vorgegebenen Material und von einer vorgegebenen Dicke auf. Eine erste Großfläche der plattenförmigen Abdeckung12 , die hier mit der Grenzfläche11 zusammenfällt, steht mit dem Medium2 zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv6 und das Detektionsobjektiv8 für die Beleuchtung und die Detektion zugänglichen Bereich nahezu vollständig in Kontakt. Eine zweite Großfläche13 der Abdeckung12 steht hier mit einem Gas, beispielsweise Luft, in Kontakt und bildet eine weitere Grenzfläche. Anstelle des Gases kann auch ein Immersionsmedium als weitere Komponente des Trennschichtsystems verwendet werden, welches mit der zweiten Großfläche13 der Abdeckung ebenfalls zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv6 und das Detektionsobjektiv8 für die Beleuchtung für die Detektion zugänglichen Bereich in Kontakt steht. Die zweite Großfläche13 wirkt ebenfalls als Grenzfläche und wird im folgenden auch gelegentlich als solche bezeichnet. - Durch die Ausrichtung des Beleuchtungsobjektivs
6 und des Detektionsobjektivs8 hinsichtlich ihrer Winkel zur Normalen der Bezugsfläche lassen sich die Aberrationen, die insbesondere durch den schrägen Durchtritt des Lichts durch die Grenzflächen entstehen, zwar bis zu einem gewissem Grad minimieren, sind jedoch immer noch so stark, dass für detaillierte Aufnahmen insbesondere bei hohen numerischen Aperturen bei der Detektion weitere Korrekturen notwendig sind. Die Beleuchtungsoptik und/oder die Detektionsoptik umfasst daher Korrekturmittel zur Verringerung von solchen Aberrationen, welche durch den schrägen Durchtritt von Beleuchtungslicht und/oder zu detektierendem Licht durch Grenzflächen11 ,13 des Trennschichtsystems entstehen. - Diese Korrekturmittel können beispielsweise Korrekturlinsen und/oder Korrekturelemente im Beleuchtungsobjektiv
6 und/oder im Detektionsobjektiv umfassen. Beispielsweise können die Korrekturlinsen als Zylinderlinsen, als gegen die optische Achse verkippte und/oder nicht axial angeordnete Linsen und/oder als Korrekturelemente mit asphärischen Flächen oder Freiformflächen ausgebildet sein.1 zeigt als Beispiel eine nicht axial angeordnete Linse14 im Beleuchtungsobjektiv6 und eine außeraxial angeordnete Linse15 im Detektionsobjektiv8 . - In
2 ist eine Anordnung zur Lichtblattmikroskopie gezeigt, deren Komponenten ähnlich wie in1 aufgebaut und angeordnet sind, mit dem Unterschied, dass hier Beleuchtungsobjektiv6 und Detektionsobjektiv8 unterhalb des Probengefäßes1 angeordnet sind, es handelt sich also um eine Anordnung zur inversen Lichtblattmikroskopie. Die Abdeckung12 wird in diesem Fall durch den Boden des Probengefäßes1 gebildet. Eine solche inverse Anordnung eignet sich insbesondere auch für die Analyse von Proben in Mikrotiterplatten, da die Proben in der Regel aufgrund der Schwerkraft am Gefäßboden lokalisiert sind, so dass sie für einen inversen Aufbau leichter zugänglich sind als für einen aufrechten Aufbau, da die Vertiefungen sehr eng konzipiert und von oben der Beobachtung nur schwer zugänglich sind. Wenn Beleuchtungsobjektiv6 und Detektionsobjektiv8 oberhalb des Probengefäßes1 angeordnet sind, wird man daher zweckmäßig Probengefäße1 verwenden, welche Mittel zur Positionierung der Probe3 in oberen Bereich des Probengefäßes1 aufweisen, so dass die Probe3 auch von oben zugänglich wird. - In weiteren Ausgestaltungen der Anordnung zur Lichtblattmikroskopie, die in den
3 und4 dargestellt sind, umfasst die Anordnung Korrekturmittel, die im Beleuchtungsstrahlengang und/oder im Detektionsstrahlengang angeordnet sind, und bei denen es sich um adaptive optische Elemente zur Manipulation der Phasenfronten des Beleuchtungs- bzw. des Detektionslichts handelt. Bevorzugt werden als adaptive optische Elemente verformbare Spiegel, räumliche Lichtmodulatoren oder Phasenplatten eingesetzt. Diese Korrekturmittel lassen sich selbstverständlich mit korrigierten Objektiven, wie sie auch in den1 und2 gezeigt sind, kombinieren. In den3 und4 ist nur der inverse Aufbau der Anordnung zur Lichtblattmikroskopie gezeigt, in äquivalenter Weise zu den1 und2 lässt sich auch ohne weiteres ein Aufbau konstruieren, bei dem Beleuchtungsobjektiv6 und Detektionsobjektiv8 oberhalb des Probengefäßes1 angeordnet sind. Auch eine liegende Anordnung, bei der die optische Achse7 des Beleuchtungsobjektivs6 und die optische Achse9 des Detektionsobjektivs8 in einer horizontalen Ebene liegen und die Bezugsfläche vertikal ausgerichtet ist, ist realisierbar. Grundsätzlich ist auch eine schräge Anordnung denkbar. - In
3 ist eine Anordnung gezeigt, die zunächst ähnlich dem Aufbau in2 ist. Eine Probe3 ist in einem Probengefäß1 gelagert, welches auf einem Probentisch4 angeordnet ist. Die Probe befindet sich in einem Medium2 , beispielsweise Wasser. Der Einfachheit halber und nur beispielhaft sind Beleuchtungsobjektiv6 und Detektionsobjektiv8 hier identisch ausgeführt, sie können daher in einem Winkel von jeweils 45° zur Normalen der Bezugsfläche angeordnet werden. Im Beleuchtungsstrahlengang ist ein verformbarer Spiegel16 angeordnet, im Detektionsstrahlengang ein verformbarer Spiegel17 , auf den das zu detektierende Licht trifft, bevor es über eine Linse18 auf den Detektor10 abgebildet wird. Die verformbaren Spiegel16 und17 , die auch durch räumliche Lichtmodulatoren oder Phasenplatten an diesen Positionen ersetzt werden können, sind ansteuerbar und somit sowohl an verschiedene Beleuchtungswinkel β und Detektionswinkel δ, als auch an verschiedene Objektivkonfigurationen und verschiedene Trennschichtsysteme, insbesondere verschiedene Abdeckungen12 anpassbar. Auf diese Weise können die Aberrationen nahezu vollständig korrigiert werden. Verformbare Spiegel und räumliche Lichtmodulatoren lassen sich außerdem zusätzlich dazu verwenden, solche Aberrationen, die durch die Probe verursacht werden, zu korrigieren. - Ein etwas vereinfachter Aufbau, bei dem Beleuchtungsobjektiv
6 und Detektionsobjektiv8 identisch aufgebaut sind und Beleuchtungswinkel β und Detektionswinkel δ ebenfalls identisch sind, bei dem es jedoch ausreicht, nur einen verformbaren Spiegel19 zu verwenden, ist in4 dargestellt. Dazu ist vor der Lichtquelle5 ein Strahlteiler20 angeordnet, welcher für den Beleuchtungswellenlängenbereich durchlässig ist und für die zu detektierenden Wellenlängen des Fluoreszenzlichts reflektierend ausgestaltet ist. Auch vor dem Detektor10 ist ein Strahlteiler21 angeordnet, welcher seinerseits für den zu detektierenden Detektionswellenlängenbereich durchlässig ist, jedoch für den Beleuchtungswellenlängenbereich reflektierend ausgestaltet ist. Durch die Einsparung eines verformbaren Spiegels lässt sich die Anordnung kostengünstiger herstellen. - Eine weitere Möglichkeit zur Verminderung bzw. Vermeidung von Aberrationen, die mit den bereits genannten Möglichkeiten der Korrekturmittel in den Strahlengängen bzw. in den Objektiven kombiniert werden kann, besteht darin, für die Abdeckung
12 ein Material zu wählen, welches einen Brechungsindex aufweist, der sich von dem Brechungsindex des Mediums2 , in welchem die Probe3 eingebettet ist, um weniger als 5% unterscheidet. Die Aberrationen werden dadurch bereits stark verringert, die Korrekturmittel müssen dann nicht mehr so stark in den Strahlengang eingreifen, wie ohne eine solche Maßnahme, was die Herstellung vereinfacht und kostengünstiger macht, beispielsweise indem anstelle von Freiformflächen auch asphärische Linsen eingesetzt werden können. Wird beispielsweise Wasser als Medium2 verwendet, in welchem sich die Probe3 befindet, so kann als Material für die Abdeckung12 beispielsweise PTFE, CYTOP®, FEP, Teflon® AF, oder ein perfluordioxolanes Polymer verwendet werden. Wird ein amorphes Polymer wie beispielsweise Teflon® AF verwendet, so ist dessen Glasübergangstemperatur bevorzugt so eingestellt, dass das Polymer im erkaltetem Zustand den Brechungsindex des Mediums2 , in welchem sich die Probe3 befindet, aufweist. - Wird zusätzlich noch Wasser als Immersionsmedium auf der anderen Seite der Abdeckung
12 verwendet, so kann, wenn die Brechungsindizes identisch sind oder sich nur im Promillebereich unterscheiden, das Auftreten von Aberrationen beim Lichtdurchtritt durch die Grenzflächen vollständig vermieden werden. - Eine andere Möglichkeit, das Auftreten von Aberrationen zu verringern bzw. zu vermeiden, besteht schließlich darin, als Material für die Abdeckung
12 ein nanostrukturiertes Material aus einer ersten Komponente22 und einer zweiten Komponente23 zu verwenden. Der Brechungsindex der ersten Komponente22 ist kleiner als der Brechungsindex des Mediums2 zur Aufnahme der Probe, der Brechungsindex der zweiten Komponente23 ist größer als der Brechungsindex des Mediums2 zur Aufnahme der Probe3 . Aus diesen beiden Komponenten22 und23 lässt sich ein nanostrukturiertes Material herstellen, welches einen effektiven Brechungsindex hat, der sich von dem Brechungsindex des Mediums2 um weniger als 5 % unterscheidet. Voraussetzung dafür ist, dass in dem nanostrukturierten Material die mittleren Strukturgrößen bzw. mittleren Durchmesser von Bereichen aus der ersten Komponente22 kleiner als die Lichtwellenlänge des zur Beleuchtung verwendeten und des zu detektierenden Lichts sind. In einfachster Näherung ergibt sich der effektive Brechungsindex aus dem Volumenverhältnis der beiden Komponenten. Im Falle von Wasser als Medium2 zur Aufnahme der Probe3 , welches einen Brechungsindex nd = 1,33 aufweist, eignet sich als erste Komponente22 besonders Luft, was die Verwendung von nanoporösen Materialien ermöglicht. - Ein Beispiel für ein solches nanostrukturiertes Material ist in
5 gezeigt, nanostrukturiertes Siliziumdioxid. Dort ist ein stark vergrößerter Ausschnitt aus einer Abdeckung12 , die beispielsweise den Gefäßboden oder den Gefäßdeckel bilden kann, dargestellt. Als zweite Komponente23 kann beispielsweise Siliziumdioxid gewählt werden, als erste Komponente22 lässt sich in diesem Fall Luft verwenden. Der Brechungsindex von Wasser liegt zwischen den Brechungsindizes der beiden Komponenten. Das Siliziumdioxid als zweite Komponente23 weist, wenn als erste Komponente22 Luft verwendet wird, beispielsweise zylinderförmige Öffnungen auf, deren Durchmesser kleiner als die verwendeten Lichtwellenlängen sind. Die Zeichnung dient dabei nur der Veranschaulichung, tatsächlich können die Öffnungen auch eher zufällige, beispielsweise durch Ätzen erzeugte, Formen aufweisen. Wesentlich ist das Volumenverhältnis sowie dass sichergestellt ist, dass die mittleren Öffnungsdurchmesser kleiner als die verwendeten bzw. zu detektierenden Lichtwellenlängen sind. - Anstelle eines nanostrukturierten Materials kann auch ein aus zwei Komponenten gemischtes Material oder entmischtes Material verwendet werden.
- Um die Aberrationen so gering wie möglich zu halten, ist es außerdem vorteilhaft, die Dicke der Abdeckung
12 in jedem der Fälle so gering wie möglich zu wählen, hier genügt eine Dicke von wenigen hundert µm für eine als Gefäßboden ausgestaltete Abdeckung12 und von wenigen µm für eine als Folie ausgestaltete Abdeckung12 , die als Deckel für das Probengefäß1 dient. - Mit den vorangehend beschriebenen Anordnungen für die Lichtblattmikroskopie lässt sich das Auftreten von Kontaminierungen beim Probenwechsel insbesondere im Rahmen eines Verfahrens, bei dem ein hoher Durchsatz erwünscht ist, vermeiden. Insbesondere im Falle einer Anordnung von Beleuchtungsobjektiv
6 und Detektionsobjektiv8 unterhalb des Probengefäßes1 lassen sich auch entsprechende Mikrotiterplatten mit flachen Gefäßböden und einer Vielzahl von Vertiefungen verwenden. - Bezugszeichenliste
-
- 1
- Probengefäß
- 2
- Medium
- 3
- Probe
- 4
- Probentisch
- 5
- Lichtquelle
- 6
- Beleuchtungsobjektiv
- 7
- optische Achse
- 8
- Detektionsobjektiv
- 9
- optische Achse
- 10
- Detektor
- 11
- Grenzfläche/erste Großfläche
- 12
- Abdeckung
- 13
- Grenzfläche/zweite Großfläche
- 14, 15
- nicht axiale Linse
- 16, 17
- verformbarer Spiegel
- 18
- Linse
- 19
- verformbarer Spiegel
- 20, 21
- Strahlteiler
- 22
- erste Komponente
- 23
- zweite Komponente
- ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
- Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
- Zitierte Patentliteratur
-
- EP 0866993 B1 [0001]
- DE 10257423 A1 [0005]
- WO 2004/053558 A1 [0005]
- WO 2012/110488 A2 [0007]
- WO 2012/122027 A2 [0007]
- Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- Selective Plane Illumination Microscopy Techniques in Developmental Biology“ von J. Huisken et al., erschienen im Jahr 2009 in der Zeitschrift Development, Bd. 136, S. 1963 [0005]
- „Optical thin-film materials with low refractive index for broadband elimination of Fresnel reflection“ von J.-Q. Xi et al., erschienen im Jahre 2007 in Nature Photonics, Vol. 1, S.176–179 [0022]
Claims (13)
- Anordnung zur Lichtblattmikroskopie, umfassend – ein Probengefäß (
1 ) zur Aufnahme einer in einem Medium (2 ) befindlichen Probe (3 ), wobei das Probengefäß (1 ) hinsichtlich einer ebenen Bezugsfläche ausgerichtet ist, – eine Beleuchtungsoptik mit einem Beleuchtungsobjektiv (6 ) zur Beleuchtung der Probe (3 ) mit einem Lichtblatt, wobei die optische Achse (7 ) des Beleuchtungsobjektivs (6 ) und das Lichtblatt in einer Ebene liegen, die mit der Normalen der Bezugsfläche einen von Null verschiedenen Beleuchtungswinkel β einschließt, – eine Detektionsoptik mit einem Detektionsobjektiv (8 ), dessen optische Achse (9 ) mit der Normalen der Bezugsfläche einen von Null verschiedenen Detektionswinkel δ einschließt, dadurch gekennzeichnet, dass – die Anordnung ein Trennschichtsystem mit einer oder mehreren Schichten mit vorgegebenen Dicken und aus vorgegebenen Materialien zur räumlichen Trennung des Mediums (2 ), in welchem sich die Probe (3 ) befindet, von dem Beleuchtungsobjektiv (6 ) und dem Detektionsobjektiv (8 ) umfasst, wobei das Trennschichtsystem mit einer parallel zur Bezugsfläche ausgerichteten Grenzfläche (11 ) zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv (6 ) und das Detektionsobjektiv (8 ) für die Beleuchtung und die Detektion zugänglichen Bereich mit dem Medium (2 ) in Kontakt steht, und dass – Beleuchtungswinkel β und Detektionswinkel δ anhand numerischer Aperturen NAD, NAB des Detektionsobjektivs (8 ) bzw. des Beleuchtungsobjektivs (6 ) vorgegeben sind. - Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die numerische Apertur NAB des Beleuchtungsobjektivs (
6 ) kleiner als die numerische Apertur NAD des Detektionsobjektivs (8 ) und der Beleuchtungswinkel β größer als der Detektionswinkel δ ist, oder dass Beleuchtungsobjektiv (6 ) und Detektionsobjektiv (8 ) identisch aufgebaut sind und der Beleuchtungswinkel β gleich dem Detektionswinkel δ ist, wobei die Summe von Beleuchtungswinkel β und Detektionswinkel δ jeweils bevorzugt 90° ist. - Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Beleuchtungsoptik und/oder die Detektionsoptik Korrekturmittel zur Verringerung von solchen Aberrationen umfasst, welche durch den schrägen Durchtritt von Beleuchtungslicht und/oder zu detektierendem Licht durch Grenzflächen (
11 ,13 ) des Trennschichtsystems entstehen. - Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass die Korrekturmittel Korrekturlinsen und/oder Korrekturelemente im Beleuchtungsobjektiv (
6 ) und/oder im Detektionsobjektiv (8 ) umfassen. - Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Korrekturlinsen als Zylinderlinsen, als gegen die optische Achse (
7 ,9 ) verkippte Linsen und/oder nicht axial angeordnete Linsen (14 ,15 ), und die Korrekturelemente als Elemente mit asphärischen Flächen oder Freiformflächen ausgebildet sind. - Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Korrekturmittel im Beleuchtungsstrahlengang und/oder im Detektionsstrahlengang angeordnete adaptive optische Elemente zur Manipulation der Phasenfronten des Beleuchtungs- und/oder des Detektionslichts umfassen, bevorzugt verformbare Spiegel (
16 ,17 ), räumliche Lichtmodulatoren, oder Phasenplatten. - Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Trennschichtsystem eine das Probengefäß (
1 ) abschließende, plattenförmige oder folienförmige Abdeckung (12 ) aus einem vorgegebenen Material und von einer vorgegebenen Dicke umfasst, wobei eine erste Großfläche der plattenförmigen oder folienförmigen Abdeckung (12 ) mit dem Medium (2 ) zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv (6 ) und das Detektionsobjektiv (8 ) für die Beleuchtung und die Detektion zugänglichen Bereich nahezu vollständig in Kontakt steht und eine zweite Großfläche der Abdeckung mit einem Gas, bevorzugt Luft, oder einem Immersionsmedium als weiterer Komponente des Trennschichtsystems zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv (6 ) und das Detektionsobjektiv (8 ) für die Beleuchtung und die Detektion zugänglichen Bereich in Kontakt steht. - Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Material für die Abdeckung (
12 ) einen Brechungsindex aufweist, welcher sich von dem Brechungsindex des Mediums (2 ), in welchem sich die Probe (3 ) befindet, um weniger als 5% unterscheidet. - Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium (
2 ), in welchem sich die Probe (3 ) befindet, Wasser ist, und dass das Material für die Abdeckung (12 ) PTFE, CYTOP®, FEP, Teflon® AF oder ein perfluorodioxolanes Polymer ist. - Anordnung zur Lichtmikroskopie nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Abdeckung (
12 ) aus einem amorphen Polymer ist, dessen Glasübergangstemperatur so eingestellt ist, dass das Polymer im erkalteten Zustand den Brechungsindex des Mediums (2 ), in welchem sich die Probe (3 ) befindet, aufweist. - Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, dass das Material für die Abdeckung (
12 ) ein nanostrukturiertes Material aus einer ersten Komponente (22 ) und einer zweiten Komponente (23 ) ist, wobei der Brechungsindex der ersten Komponente (22 ) kleiner und der Brechungsindex der zweiten Komponente (23 ) größer als der Brechungsindex des Mediums (2 ) ist, und wobei die mittleren Strukturgrößen von Bereichen aus der ersten Komponente (22 ) einen mittleren Durchmesser aufweisen, der geringer als die Lichtwellenlängen des zur Beleuchtung verwendeten und des zu detektierenden Lichts ist. - Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungsobjektiv (
6 ) und das Detektionsobjektiv (8 ) unterhalb des Probengefäßes (1 ) angeordnet sind. - Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungsobjektiv (
6 ) und das Detektionsobjektiv (8 ) oberhalb des Probengefäßes (1 ) angeordnet sind und das Probengefäß (1 ) Mittel zur Positionierung der Probe (3 ) im oberen Viertel des Probengefäßes (1 ), bezogen auf seine Tiefe, aufweist.
Priority Applications (6)
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---|---|---|---|
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