JP6234072B2 - 非線形光学顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、非線形光学顕微鏡装置に関し、特に、生体試料の観察に用いられる非線形光学顕微鏡装置に関する。

近年、生体機能を解明するために生体を生きたまま観察するin vivoイメージングに関する研究が盛んに行われている。in vivoイメージングでは、多光子励起顕微鏡など非線形光学現象を利用する様々の非線形光学顕微鏡が用いられる。

非線形光学顕微鏡においても、他の顕微鏡と同様に、その性能を十分に発揮して高い分解能を実現するためには、対物レンズの瞳を満たすようにレーザ光を対物レンズに入射させることが望ましい。一方で、より明るい画像を得るためには、ビーム径が対物レンズの瞳径よりも少し小さな状態でレーザ光を対物レンズに入射させることが望ましい。

このように、対物レンズの瞳径に対してビーム径を変化させることで明るさと分解能が変化することについては従来から知られている。これに関連する技術は、例えば、特許文献１で開示されている。

特開２０１０−０９６８１３号公報

特許文献１は、２光子励起顕微鏡では規格化ビーム径（ビーム径／対物レンズの瞳径）が０．８程度で蛍光の強度がピークを示す、というシミュレーション結果を開示している。しかしながら、実際の観察、特に標本深部の観察では、特許文献１に開示されるシミュレーション結果と乖離した結果が得られる場合も少なくない。
以上のような実情を踏まえ、本発明は、標本を深部まで明るく観察することができる非線形光学顕微鏡装置を提供することを目的とする。

本発明の第１の態様は、レーザ光を標本に照射する対物レンズと、前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径を変更するビーム径変更部と、前記標本の光学特性に基づいて、前記対物レンズの瞳径に対する前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径の比率である瞳充足率を、前記標本の光学特性毎に決定し、前記瞳充足率が前記決定された値になるように前記ビーム径変更部を制御する制御部と、を備え、前記制御部は、さらに観察面の深さである観察深さに基づいて、前記瞳充足率を、前記標本の光学特性毎に前記観察深さが深いほど小さくなるように決定し、前記瞳充足率が前記決定された値になるように前記ビーム径変更部を制御し、前記標本の光学特性は、前記標本中の発光体の大きさを含み、前記制御部は、前記観察深さが同じ場合には、前記瞳充足率を、前記標本中の発光体の大きさが前記レーザ光の観察面におけるスポット径よりも大きい場合に、前記発光体の大きさが前記スポット径よりも小さい場合と比較して小さくなるように決定する非線形光学顕微鏡装置を提供する。

本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の非線形光学顕微鏡装置において、前記標本の光学特性は、前記標本の散乱特性を含み、前記制御部は、前記観察深さが同じ場合には、前記瞳充足率を、前記標本の散乱特性が強いほど、小さくなるように決定する非線形光学顕微鏡装置を提供する。
本発明の第３の態様は、第１の態様または第２の態様に記載の非線形光学顕微鏡装置において、前記標本の光学特性は、前記標本の屈折率の均一性を含み、前記制御部は、前記観察深さが同じ場合には、前記瞳充足率を、前記標本の屈折率の均一性が低いほど、小さくなるように決定する非線形光学顕微鏡装置を提供する。

本発明の第４の態様は、第１の態様乃至第３ののいずれか１つの態様に記載の非線形光学顕微鏡装置において、前記制御部は、前記観察深さと前記標本の光学特性と前記レーザ光の波長とに基づいて、前記瞳充足率を、前記観察深さと前記標本の光学特性の組み合わせ毎に前記レーザ光の波長が短いほど小さくなるように決定し、前記瞳充足率が決定された値になるように前記ビーム径変更部を制御する非線形光学顕微鏡装置を提供する。

本発明の第５の態様は、第４の態様に記載の非線形光学顕微鏡装置において、さらに、前記標本の光学特性、前記観察深さ、前記レーザ光の波長、及び、前記瞳充足率を関連付けて記憶する記憶部を備え、前記制御部は、前記記憶部を参照して前記ビーム径変更部を制御する非線形光学顕微鏡装置を提供する。

本発明の第６の態様は、第５の態様に記載の非線形光学顕微鏡装置において、さらに、前記非線形応答光を検出する光検出器を備え、前記制御部は、前記ビーム径変更部と前記光検出器を制御して、前記瞳充足率毎に、前記光検出器からの信号に基づいて前記標本の画像を取得し、前記瞳充足率毎に取得した前記複数の標本の画像を所定の指標に基づいて比較して、最も評価が高い一の画像を決定し、決定された前記一の画像を取得したときの前記瞳充足率を、決定された前記一の画像を取得したときの前記標本の光学特性、前記観察深さ、及び前記レーザ光の波長と関連付けて、前記記憶部に記憶させる非線形光学顕微鏡装置を提供する。

本発明の第７の態様は、第６の態様に記載の非線形光学顕微鏡装置において、前記所定の指標は、画像の明るさである非線形光学顕微鏡装置を提供する。

本発明の第８の態様は、第５の態様に記載の非線形光学顕微鏡装置において、さらに、前記非線形応答光を検出する光検出器と、前記標本の画像を表示する表示部と、利用者が情報を入力するための入力部と、を備え、前記制御部は、前記ビーム径変更部と前記光検出器を制御して、前記瞳充足率毎に、前記光検出器からの信号に基づいて前記標本の画像を取得し、前記瞳充足率毎に取得した前記複数の標本の画像を前記表示部に表示させ、前記入力部から入力された、利用者が選択した画像に関する情報に従って、前記複数の標本の画像から一の画像を決定し、決定された前記一の画像を取得したときの前記瞳充足率を、決定された前記一の画像を取得したときの前記標本の光学特性、前記観察深さ、及び前記レーザ光の波長と関連付けて、前記記憶部に記憶させる非線形光学顕微鏡装置を提供する。

本発明の第９の態様は、第５の態様乃至第８の態様のいずれか１つに記載の非線形光学顕微鏡装置において、さらに、前記観察深さの変動により生じる球面収差を補正する球面収差補正部を備え、前記記憶部は、前記観察深さに関連付けて前記球面収差補正部の設定を記憶する非線形光学顕微鏡装置を提供する。

本発明の第１０の態様は、第１の態様乃至第９の態様のいずれか１つに記載の非線形光学顕微鏡装置において、前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径は、ガウシアン強度分布を有する前記レーザ光のピーク強度のｅ-2倍以上の強度を有する部分の光束径である非線形光学顕微鏡装置を提供する。

本発明の第１１の態様は、第１の態様乃至第１０の態様のいずれか１つに記載の非線形光学顕微鏡装置において、前記制御部は、前記瞳充足率が０．３以上１以下の値になるように前記ビーム径変更部を制御する非線形光学顕微鏡装置を提供する。

本発明の第１２の態様は、レーザ光を標本に照射する対物レンズと、前記対物レンズの瞳径に対する前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径の比率である瞳充足率の推奨値を格納した推奨瞳充足率テーブルが設けられた記憶装置であって、前記推奨値が観察深さと前記標本の光学特性とに関連付けられている、という記憶装置と、前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径を変更するビーム径変更部と、前記標本の光学特性と前記推奨瞳充足率テーブルに基づいて、前記対物レンズの瞳径に対する前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径の比率である瞳充足率の推奨範囲を前記標本中の発光体の大きさが前記レーザ光の観察面におけるスポット径よりも大きい場合に、前記発光体の大きさが前記スポット径よりも小さい場合と比較して小さくなるように決定する制御部と、前記制御部で決定された前記推奨範囲を表示する表示部と、利用者が設定すべき瞳充足率を指定するための入力部と、を備え、前記制御部は、前記瞳充足率が前記入力部により利用者が指定した瞳充足率になるように、前記ビーム径変更部を制御する非線形光学顕微鏡装置を提供する。
本発明の第１３の態様は、レーザ光を標本に照射する対物レンズと、前記対物レンズの瞳径に対する前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径の比率である瞳充足率の推奨値を格納した推奨瞳充足率テーブルが設けられた記憶装置であって、前記推奨値が観察深さと前記標本の光学特性とに関連付けられている、という記憶装置と、前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径を変更するビーム径変更部と、前記標本の光学特性と前記推奨瞳充足率テーブルに基づいて、前記対物レンズの瞳径に対する前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径の比率である瞳充足率を、前記標本の光学特性毎に、前記標本中の発光体の大きさが前記レーザ光の観察面におけるスポット径よりも大きい場合に、前記発光体の大きさが前記スポット径よりも小さい場合と比較して小さくなるように決定し、前記瞳充足率が前記決定された値になるように前記ビーム径変更部を制御する制御部と、を備え、前記制御部は、さらに観察面の深さである観察深さに基づいて、前記瞳充足率を、前記標本の光学特性毎に前記観察深さが深いほど小さくなるように決定し、前記瞳充足率が前記決定された値になるように前記ビーム径変更部を制御する非線形光学顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、標本を深部まで明るく観察することができる非線形光学顕微鏡装置を提供することができる。

光線の開口数と散乱の関係を説明するための図である。 光線の開口数と収差の関係を説明するための図である。 ２光子励起顕微鏡装置における瞳充足率と観察深さと蛍光画像の明るさの関係の一例を示す図である。 スポットと蛍光発光体の関係の一例を示す図である。 ２光子励起顕微鏡装置における瞳充足率と観察深さと蛍光画像の明るさの関係の別の一例を示す図である。 スポットと蛍光発光体の関係の別の一例を示す図である。 本発明の実施例１に係る２光子励起顕微鏡装置の構成を示す図である。 本発明の実施例１に係る２光子励起顕微鏡装置の設定手順を示すフローチャートである。 本発明の実施例１に係る２光子励起顕微鏡装置の設定画面上に表示されるＧＵＩ部品を例示した図である。 本発明の実施例１に係る２光子励起顕微鏡装置の設定画面上に表示されるＧＵＩ部品の変形例を示した図である。 本発明の実施例１に係る２光子励起顕微鏡装置の設定画面上に表示されるＧＵＩ部品の別の変形例を示した図である。 励起波長９００ｎｍ用の推奨瞳充足率テーブルを例示した図である。 励起波長１０００ｎｍ用の推奨瞳充足率テーブルを例示した図である。 瞳充足率を調整するときに本発明の実施例１に係る２光子励起顕微鏡装置の設定画面上に表示されるＧＵＩ部品を示した図である。 ユーザ設定テーブルを例示した図である。 本発明の実施例１に係る２光子励起顕微鏡装置の推奨瞳充足率テーブル作成処理の手順を示すフローチャートである。 本発明の実施例２に係る２光子励起顕微鏡装置の設定画面上に表示されるＧＵＩ部品を例示した図である。 本発明の実施例３に係る２光子励起顕微鏡装置の構成を示す図である。

本願発明に係る非線形光学顕微鏡装置は、対物レンズに入射したレーザ光のすべてが非線形応答光の発生に寄与するわけではないことを考慮して、対物レンズの瞳径に対する対物レンズに入射するレーザ光のビーム径の比率（ビーム径／対物レンズの瞳径、以降、瞳充足率と記す）を適切な値に制御するというものである。
以下、非線形光学顕微鏡装置の一つである２光子励起蛍光顕微鏡装置を例にして、本願発明の特徴について説明する。

上述したように従来から、対物レンズに入射するレーザ光のビーム径を対物レンズの瞳径よりも小さくする、つまり、瞳充足率が１未満となるようにレーザ光を絞る、ことでビーム径を対物レンズの瞳径に合わせたときよりも、明るい画像を得ることができることが知られている。これは、ビーム径を対物レンズの瞳径に合わせると、レーザ光のガウシアン強度分布の裾野部分が対物レンズでケラレてしまい、ケラレた光量分だけ画像が暗くなってしまうからであると考えられている。なお、ビーム径は、例えば、ガウシアン強度分布を有するレーザ光のうちのピーク強度のｅ^-2倍以上の強度を有する部分の光束径として定義される。

このように、従来から知られている技術は、より多くのレーザ光を対物レンズに入射させることを意図してレーザ光を対物レンズの瞳径よりも細くなるように絞るというものである。これは、換言すると、対物レンズに入射するレーザ光の光量が変化しないまたは変化が小さい場合には、それ以上にビーム径を絞る必要はない、または、ビーム径を絞ることで分解能が劣化することを考慮すればそれ以上絞るべきではない、というものである。

これに対して、本願発明は、標本の光学特性及び観察深さによっては、対物レンズに入射するレーザ光の光量が変化しないまたは変化が十分に小さい場合であっても、さらに小さなビーム径に制御するというものである。これは、標本中では散乱や収差が発生するため対物レンズに入射したレーザ光のすべてが標本中の観察面に到達するわけではなく、対物レンズに入射するレーザ光の光量が一定であっても、観察面まで到達する光量がビーム径により異なるからである。

この点をより詳細に説明する。例えば、図１Ａに示すように、ＮＡ（Numerical Aperture:開口数）の大きな光線Ｂ１とＮＡの小さな光線Ｂ２では、光線Ｂ１の方が光線Ｂ２よりも対物レンズ１０を出射してから観察面ＶＰに到達するまでの光路長が長いため、標本Ｓ中で散乱しやすく、観察面ＶＰに到達しにくい。従って、標本Ｓ中での散乱を考慮すると、ビーム径を小さくした方が観察面ＶＰに到達するレーザ光の光量が増加する。

また、例えば、図１Ｂに示すように、対物レンズの収差が良好に補正されている場合であっても標本Ｓの屈折率の均一性が低い場合には、標本Ｓの屈折率分布によって収差が発生して結像性能が劣化する。この場合、光線Ｂ１の方が光線Ｂ２よりも大きな収差が発生するため、観察面ＶＰに到達しにくい。従って、標本Ｓ中で生じる収差を考慮すると、ビーム径を小さくした方が観察面ＶＰに到達するレーザ光の光量が増加する。

なお、観察面ＶＰが標本表面から深いほど、または、標本Ｓが散乱を起こしやすいほど、ビーム径の変更による観察面ＶＰに到達するレーザ光の光量の変化が大きくなる。このため、生体標本のような散乱しやすい標本をその深部まで観察することができる非線形光学顕微鏡では、ビーム径の調整が他の顕微鏡の場合よりも大きな効果をあげることが期待できる。

上述したようにビーム径を絞るほど標本中での散乱や収差の影響を受けにくくなるが、ビーム径を絞るほど明るい画像が得られるわけではない。ビーム径を絞ってＮＡを小さくすると集光位置でのスポット径が広がるので観察面ＶＰにおける光子密度及び二光子吸収効率が低下する。このため、ビーム径を絞りすぎると、観察面ＶＰに到達する光量が増加したにもかかわらず画像が暗くなってしまう。これを裏付ける計測結果が、図２に示されている。

図２は、２光子励起顕微鏡装置における瞳充足率と観察深さと蛍光画像の明るさの関係の一例を示す図である。図２には、瞳充足率と観察深さを変化させながら、光検出器で検出される標本からの蛍光の強度（以降、２光子励起蛍光強度）を測定した結果が示されている。なお、図２の横軸は瞳充足率であり、縦軸は各観察深さにおける瞳充足率が１のときの２光子励起蛍光強度（以降、基準２光子励起蛍光強度と記す）を１００％として規格化した２光子励起蛍光強度（以降、２光子励起蛍光強度比と記す）である。

図２に示すように、ビーム径を絞りすぎる、つまり、瞳充足率を小さくしすぎると、観察面ＶＰに到達する光量が増加しているにもかかわらず、２光子励起蛍光強度比（つまり、蛍光画像の明るさ）が低下してしまう。また、観察深さによらず１以下の瞳充足率で２光子励起蛍光強度比はピークに達するが、観察深さが深いほどそのピークは瞳充足率の低い方向にシフトする傾向がある。

なお、図２に示す計測結果は、レーザ光によって観察面に形成されるスポット３（つまり、点像分布関数（ＰＳＦ：Point Spread Function）の広がり）よりも標本Ｓ中の蛍光発光体２が小さい図３に示すような場合の計測結果である。一方、図４は、観察面に形成されるスポット３よりも蛍光発光体２が大きい図５に示すような場合の計測結果である。図２と図４を比較すると、図４の方が図２に比べてより小さな瞳充足率に２光子励起蛍光強度比のピークを有することがわかる。

このような差異は、次のように説明できる。図３に示すように蛍光発光体２がスポット３よりも小さい場合には、スポット３の大小によらず蛍光発光体２全体が発光するため、スポット３を小さくするほど、即ち、ビーム径を太くしてＮＡを大きくするほど光子密度が高くなり２光子吸収率が高くなる。このため、スポット３を形成するレーザ光の光量が一定であれば、スポット３が小さいほど明るい画像が得られることになる。従って、図２に示すようにビーム径が大きく瞳充足率が高いところから瞳充足率を減らしていくと比較的大きな瞳充足率で２光子励起蛍光強度比がピークに達する。その後、ビーム径をさらに小さくして、瞳充足率が小さくなるとＮＡが低下してスポット３が広がるので、蛍光発光体２から外れる光量が増えて（図３右）、２光子励起蛍光強度比が低下する。

一方、図５に示すような蛍光発光体２がスポット３よりも大きい場合には、スポット３が小さいほど光子密度が高くなる点は図３に示す場合と同様であるが、スポット３が大きいほど蛍光発光体２中の発光部分の体積が大きくなる。このため、図３の場合とは異なり、スポット３が小さいほど２光子吸収率が高くなり明るい画像が得られるという単純な関係にはなく、図３の場合と比較するとＮＡが低下して、より大きなスポット径を有するスポット３になっても、蛍光発光体２から外れる光量が増えることはない（図５右）ので、より瞳充足率が小さくても、即ち、より細いビーム径でも明るい画像を得ることができる。従って、図４に示すように、２光子励起蛍光強度比がより小さな瞳充足率でピークに達する。

以上をまとめると、画像の明るさは、観察深さが深いほど小さな瞳充足率でピークに達する。また、発光体がレーザ光によって形成されるスポットより小さい場合よりも発光体がスポットより大きい場合に小さな瞳充足率でピークに達する。また、標本中での散乱や収差が生じやすいほど小さな瞳充足率でピークに達する。これを踏まえて、本願発明に係る非線形光学顕微鏡装置は、標本の光学特性（標本の散乱特性、発光体の大きさ、屈折率の均一性）に基づいて適切な瞳充足率を決定する。なお、観察深さ（標本表面からの深さ）と標本の光学特性とに基づいて適切な瞳充足率を決定してもよく、その際、観察深さが深いほど充足率を小さくしても良い。また、標本中での散乱はレーザ光の波長が短いほど生じやすいため、観察深さと標本の光学特性に加えてレーザ光の波長に基づいて適切な瞳充足率を決定してもよい。
以下、本願発明の各実施例を具体的に説明する。

図６は、本実施例に係る２光子励起顕微鏡装置１００の構成を示す図である。２光子励起顕微鏡装置１００は、瞳充足率を観察深さと標本の光学特性とに応じた適切な値に制御して良好な標本画像を得るものである。

まず、図６を参照しながら、２光子励起顕微鏡装置１００の構成について説明する。２光子励起顕微鏡装置１００は、図６に示すように、チタンサファイアレーザ１１を備える２光子励起顕微鏡１０と、制御装置３０と、表示装置４０と、入力装置５０と、記憶装置６０と、を備える非線形光学顕微鏡装置である。

２光子励起顕微鏡１０は、チタンサファイアレーザ１１から標本Ｓまでのレーザ光の光路上に、ビーム径可変光学系１２と、ガルバノミラー１３と、瞳投影リレーレンズ１４と、ミラー１５と、結像レンズ１６と、ミラー１７と、ダイクロイックミラー１８と、フォーカス移動部１９と、レーザ光を標本Ｓに照射する対物レンズ１を備えている。なお、２光子励起顕微鏡１０は、図示しないレボルバを備えていて、レボルバは対物レンズ１を含む複数の対物レンズを交換自在に保持している。

２光子励起顕微鏡１０は、さらに、標本Ｓからの蛍光を反射するダイクロイックミラー１８の反射光路（検出光路）上に、レンズ２０と、赤外線カットフィルタ（以降、ＩＲカットフィルタと記す）２１と、レンズ２２と、光電子増倍管２３（ＰＭＴ：Photomultiplier、以降、ＰＭＴと記す）を備えている。

チタンサファイアレーザ１１は、赤外域のレーザ光を出射する２光子励起用のレーザであり、ピコ秒オーダーのパルス幅を有するパルス光を出射する。チタンサファイアレーザ１１は、制御装置３０の制御下で、出射するレーザ光の強度や波長を変更する。

ビーム径可変光学系１２は、ビーム径可変光学系１２を構成するレンズが光軸方向に移動することによってビーム径を可変させる光学系であり、対物レンズ１に入射するレーザ光のビーム径を変更するビーム径変更部である。ビーム径可変光学系１２は、制御装置３０の制御下で、レーザ光のビーム径を変更する。

ガルバノミラー１３は、レーザ光で標本Ｓを走査するための走査手段である。ガルバノミラー１３は、対物レンズ１の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている。つまり、２光子励起顕微鏡１０では、瞳投影リレーレンズ１４及び結像レンズ１６により、ガルバノミラー１３の像が対物レンズ１の瞳位置に形成される。このため、ガルバノミラー１３が入射光を偏向することで、標本Ｓでの集光位置を光軸と直交する方向であるＸＹ方向に移動させることができる。

ダイクロイックミラー１８は、照明光路と検出光路とを分岐させる光路分岐手段であり、チタンサファイアレーザ１１からのレーザ光を透過させ、且つ、標本１２から生じる蛍光を反射する特性を有する。

フォーカス移動部１９は、標本Ｓと対物レンズ１との間の距離を変化させる手段であり、例えば、対物レンズ１を光軸方向に移動させる駆動装置や、標本Ｓを配置するステージを光軸方向に移動させる駆動装置である。フォーカス移動部１９は、制御装置３０の制御下で、標本Ｓとレーザ光の集光位置との位置関係を光軸方向に変化させる。
ＩＲカットフィルタ２１は、赤外域のレーザ光を遮断してＰＭＴ２３にレーザ光が入射することを防止するためのフィルタである。

ＰＭＴ２３は、非線形応答光である蛍光を検出する光検出器であり、対物レンズ１の瞳位置と光学的に共役な位置近傍に配置されている。つまり、２光子励起顕微鏡１０では、レンズ２０及びレンズ２２により、対物レンズ１の瞳がＰＭＴ２３近傍に投影される。このため、標本Ｓの任意の領域から生じ得る蛍光を検出することができる。

制御装置３０は、２光子励起顕微鏡装置１００全体を制御する制御部であり、例えば、パーソナルコンピュータである。制御装置３０は、入力装置５０から入力される情報である標本Ｓの光学特性に基づいて、より望ましくは、標本Ｓ中の観察面の深さと標本Ｓの光学特性とに基づいて、瞳充足率を決定し、決定された瞳充足率になるようにビーム径可変光学系１２を制御するように構成されている。なお、瞳充足率は、さらに望ましくは、観察深さと標本Ｓの光学特性とレーザ光の波長に基づいて決定される。

また、制御装置３０は、入力装置５０から入力される情報に基づいて、チタンサファイアレーザ１１、フォーカス移動部１９及びＰＭＴ２３を制御して、レーザ光の強度や波長、観察深さ、ＰＭＴ２３への印加電圧などを変更する。制御装置３０は、さらに、入力装置５０から入力される情報に基づいて、対物レンズ１を保持する図示しないレボルバやガルバノミラー１３を制御して、使用する対物レンズ、スキャンスピードなどを変更してもよい。

表示装置４０は、標本画像や２光子励起顕微鏡装置１００を操作するためのＧＵＩ（Graphical User Interface）画面を表示する表示部であり、例えば、液晶ディスプレイ装置や有機ＥＬ（Electroluminescence）ディスプレイ装置である。入力装置５０は、利用者が２光子励起顕微鏡装置１００へ情報を入力するための入力部であり、入力された情報は制御装置３０へ出力される。入力装置５０は、例えば、マウス、キーボード、表示装置４０のディスプレイに重ねて配置されたタッチパネルなどである。

記憶装置６０は、２光子励起顕微鏡装置１００の制御プログラムや制御プログラムで用いられる各種情報が格納される記憶部であり、例えば、ハードディスク装置である。記憶装置６０には、制御装置３０が入力装置５０からの入力に基づいて瞳充足率を決定するための情報として、観察深さ、標本の光学特性、レーザ光の波長及び瞳充足率を関連付けた情報が格納されている。なお、記憶装置６０は、制御装置３０内に設けられても良い。

図７は、２光子励起顕微鏡装置１００の設定手順を示すフローチャートである。図７を参照しながら、２光子励起顕微鏡装置１００で良好な標本画像を得るための設定手順について説明する。

まず、ステージに標本Ｓが設置されると、２光子励起顕微鏡装置１００は、標本Ｓの明視野観察画像を取得して、表示装置４０に取得した明視野観察画像を表示する（ステップＳ１）。２光子励起顕微鏡装置１００の利用者は、明視野観察画像を見ながら観察すべき部位（観察部位と記す）が視野内に位置するようにステージを移動させる。なお、２光子励起顕微鏡装置１００は、図６には図示しないが、標本Ｓを面照明する照明手段と標本面と光学的に共役な位置に配置された撮像素子を有していて、明視野観察画像はこれらを用いて取得される。

ステップＳ１の後、利用者が２光子励起顕微鏡装置１００の動作モードを、標本Ｓの２光子励起蛍光画像を取得するためのモード（以降、ＬＳＭモードと記す）に切り替えると、２光子励起顕微鏡装置１００は、ＬＳＭモードの各種設定情報を入力するための画面（以降、設定画面と記す）を表示装置４０に表示させる（ステップＳ２）。

図８は、設定画面上に表示されるＧＵＩ部品を例示した図である。図８に示すように、ステップＳ２で表示される設定画面には、観察深さを設定するためのテキストボックスを含むＧＵＩ部品４１と、標本Ｓの散乱特性を設定するためのラジオボタンを含むＧＵＩ部品４２と、標本Ｓ中の発光体の大きさを設定するためのラジオボタンを含むＧＵＩ部品４３が表示される。

利用者はＧＵＩ部品４１のテキストボックスに観察深さを示す値を入力することで、観察深さの設定を変更することができる。２光子励起顕微鏡装置１００は、テキストボックスへ入力された値を取得して、観察深さが取得した値が示す深さになるようにフォーカス移動部１９を制御する。これにより、標本Ｓ中の観察面の深さをテキストボックスで設定した観察深さに一致させることができる。なお、フォーカス移動部１９がテキストボックスに入力された値に基づいて自動的に観察深さを変更する例を示したが、フォーカス移動部１９は利用者の操作に基づいて観察深さを変更するように構成されてもよい。

利用者はＧＵＩ部品４２のラジオボタンを選択することで、標本Ｓの散乱特性を設定することができる。例えば、標本Ｓが例えば脳などの散乱しやすい標本である場合には「強」を、標本Ｓが透明に近い散乱しにくい標本である場合には「弱」を、標本Ｓでの散乱の程度がその中間くらいの場合には「中」を選択する。なお、ＧＵＩ部品４２の代わりに、図９Ａに示すスライダーを含むＧＵＩ部品４２ａにより標本の散乱特性を設定しても良い。

利用者はＧＵＩ部品４３のラジオボタンを選択することで、標本Ｓ中の発光体の大きさを設定することができる。例えば、標本Ｓ中の発光体の大きさがスポット径よりも大きい場合には「大」を、標本Ｓ中の発光体の大きさがスポット径と同程度の場合には「中」を、標本Ｓ中の発光体の大きさがスポット径よりも小さい場合には「小」を選択する。なお、ＧＵＩ部品４３の代わりに、図９Ｂに示すスライダーを含むＧＵＩ部品４３ａにより標本中の発光体の大きさを設定しても良い。

設定画面から入力する設定情報としては、図８には図示していないが、上記の設定情報の他に、レーザ光の強度や波長などのチタンサファイアレーザ１１に関する設定情報、印加電圧などのＰＭＴ２３に関する設定情報、スキャンスピードなどのガルバノミラー１３に関する設定情報、フィルタやミラーの選定を含む光学光路に関する設定情報、使用する対物レンズ（倍率と開口数）に関する設定情報などがある。

ステップＳ２の後、２光子励起顕微鏡装置１００は、ＬＳＭモード設定を変更する（ステップＳ３）。ここでは、設定画面から入力された設定情報を取得して各部の設定を変更する。ビーム径可変光学系１２の設定の変更について具体的に説明する。

まず、２光子励起顕微鏡装置１００（制御装置３０）は、記憶装置６０に設けられている瞳充足率の推奨値が格納された推奨瞳充足率テーブルを参照して、上記の設定情報のうちのレーザ光の波長、観察深さ、標本Ｓの散乱特性、発光体の大きさの情報に基づいて瞳充足率を決定する。

例えば、レーザ光の波長が９００ｎｍ、観察深さが１０００μｍ、標本Ｓの散乱特性が「強」、発光体の大きさが「大」であれば、２光子励起顕微鏡装置１００は、図１０Ａに示す励起波長９００ｎｍ用の推奨瞳充足率テーブルから瞳充足率の推奨値「０．３５」を取得し、設定する瞳充足率を取得した推奨値「０．３５」に決定する。

記憶装置６０には、レーザ光の波長（励起波長）毎に推奨瞳充足率テーブルが設けられている。図１０Ａは励起波長９００ｎｍ用の推奨瞳充足率テーブルであり、図１０Ｂは励起波長１０００ｎｍ用の推奨瞳充足率テーブルである。推奨瞳充足率テーブルは、各条件において最も明るい画像が得られる瞳充足率の推奨値が格納されたテーブルであり、後述する推奨瞳充足率テーブル作成処理によって予め作成されている。推奨瞳充足率テーブルに格納された瞳充足率の推奨値は、図１０Ａ及び図１０Ｂに示すように、標本の光学特性が同じ場合には、観察深さが深いほど小さく、また、観察深さが同じ場合には、標本の散乱特性が強いほど、標本中の発光体の大きさが大きいほど、小さな値である。さらに、観察深さと標本の光学特性が同じ場合には、レーザ光の波長（励起波長）が短いほど小さな値である。

なお、散乱による２光子励起効率の減衰値は、観察深さをｄ、散乱係数をμｓ（λ）、波長をλとするとき、ｅｘｐ（−μｓ（λ）・ｄ）・２で表される。例えば、この式によって算出される励起波長９００ｎｍでの減衰率に対する励起波長１０００ｎｍでの減衰率の比率（つまり、励起波長１０００ｎｍでの減衰率／励起波長９００ｎｍでの減衰率）が１／２であれば、励起波長１０００ｎｍでは９００ｎｍに比べて２倍減衰しにくいと判断することができる。このため、図１０Ｂに示すように、励起波長１０００ｎｍ用の推奨瞳充足率テーブルは、図１０Ａに示す励起波長９００ｎｍ用の推奨瞳充足率テーブルの観察深さを２倍にしたものとなる。このように、特定の波長用の推奨瞳充足率テーブルが存在するのであれば、他の波長用の推奨瞳充足率テーブルは、波長間の減衰値の比を用いて容易に作成することが可能である。従って、波長間の減衰比が既知である場合には、記憶装置６０に予め特定の波長用の推奨瞳充足率テーブルのみを作成しておけばよく、その後、必要に応じて必要な波長用の推奨瞳充足率テーブルを作成してもよい。

瞳充足率が決定されると、２光子励起顕微鏡装置１００（制御装置３０）は、瞳充足率が決定した値になるようにビーム径可変光学系１２を制御する。これにより、ビーム径可変光学系１２の設定が変更される。

ステップＳ３でビーム径可変光学系１２の設定を含むＬＳＭモード設定が変更された後、利用者が２光子励起蛍光画像の取得指示を入力すると、２光子励起顕微鏡装置１００は標本Ｓの２光子励起蛍光画像を取得して表示装置４０に表示する（ステップＳ４）。利用者は、表示装置４０に表示された２光子励起蛍光画像を見ながら、瞳充足率の調整の要否を判断する。

２光子励起顕微鏡装置１００は、利用者による調整の指示の有無を判定する（ステップＳ５）。指示があると判定した場合には、ユーザの入力に従って瞳充足率を変更する（ステップＳ６）。一方、指示がないと判定した場合には、図７に示す設定処理を終了する。

ステップＳ６では、ユーザが瞳充足率を直接的に調整するための図１１に示すスライダーを含むＧＵＩ部品４４が設定画面上に表示される。そして、２光子励起顕微鏡装置１００は、ＧＵＩ部品４４のスライダーの位置に応じてビーム径可変光学系１２を制御して瞳充足率を変更する。より詳細には、２光子励起顕微鏡装置１００は、ユーザがＧＵＩ部品４４のスライダーを深部優先側に移動させるほど対物レンズ１の実効ＮＡが小さくなるように、つまり、瞳充足率が小さくなるように、ビーム径可変光学系１２を制御する。また、２光子励起顕微鏡装置１００は、ユーザがＧＵＩ部品４４のスライダーを浅部優先側に移動させるほど対物レンズ１の実効ＮＡが大きくなるように、つまり、瞳充足率が大きくなるように、ビーム径可変光学系１２を制御する。このため、利用者はＧＵＩ部品４４のスライダーを移動させることにより、瞳充足率の設定を直接的に調整することができる。

なお、設定画面に表示されるＧＵＩ部品４４のスライダーの初期位置は、現在の瞳充足率に対応する位置であることが望ましい。初期位置を現在の瞳充足率と対応させることで、ステップＳ４で表示された２光子励起蛍光画像の分解能が十分ではないと判断した場合には、ユーザはＧＵＩ部品４４のスライダーを浅部優先側に移動させればよく、調整が極めて容易になるからである。

ステップＳ６で瞳充足率が変更された後、２光子励起顕微鏡装置１００は、変更後の瞳充足率をユーザ設定として記憶する（ステップＳ７）。ここでは、２光子励起顕微鏡装置１００は、記憶装置６０に設けられたユーザ設定テーブルに、変更後の瞳充足率を観察深さ、標本の光学特性、レーザ光の波長等と関連付けて格納する。なお、ユーザ設定テーブルは、ユーザから指示がある場合には、ステップＳ２において、推奨瞳充足率テーブルの代わりに参照されてもよい。

記憶装置６０には、標本毎にユーザ設定テーブルが設けられている。図１２は、標本Ｓ用のユーザ設定テーブルである。なお、ユーザ設定テーブルの“深さ”、“散乱”、“標本大きさ”の欄には、それぞれ図８のＧＵＩ部品４１、ＧＵＩ部品４２、ＧＵＩ部品４３の設定値が格納される。“波長”の欄には、チタンサファイアレーザ１１から出射されるレーザ光の波長が格納される。“最適実効ＮＡ”の欄には、ステップＳ３で推奨瞳充足率テーブルを参照して決定した瞳充足率と対物レンズ１の開口数の積（例えば、瞳充足率の推奨値が０．３５で対物レンズ１の開口数が１であれば、０．３５）が格納される。“対物レンズ種類”の欄には、対物レンズ１の開口数が格納される。“スライダー位置”の欄には、ＧＵＩ部品４４のスライダーの位置が格納される。なお、スライダーが深部優先側の端部に位置するときが０であり、浅部優先側の端部に位置するときが１００である。“設定実効ＮＡ”の欄には、対物レンズ１の開口数とスライダー位置の値の積を１００で割った値（例えば、対物レンズ１の開口数が１でスライダー位置の値が４０であれば、０．４）が格納される。“瞳充足率”の欄には、スライダー位置の値を１００で割った値が格納される。

ステップＳ７のユーザ設定テーブルの更新処理が完了すると、２光子励起顕微鏡装置１００は、ステップＳ４に戻って、利用者が調整不要である旨を指示するまで、上述した処理を返す。

図１３は、２光子励起顕微鏡装置１００の推奨瞳充足率テーブル作成処理の手順を示すフローチャートである。図１３を参照しながら、推奨瞳充足率テーブル作成処理の手順について説明する。なお、図１３に示す推奨瞳充足率テーブル作成処理は、例えば、散乱特性の強、中、弱と発光体の大きさの大、中、小との組み合わせである計９種類の異なる光学特性を有する標本を用意し、それらの標本毎に実行される。

図１３に示す推奨瞳充足率テーブル作成処理が開始されると、２光子励起顕微鏡装置１００は、まず、ステージに配置された標本の光学特性とチタンサファイアレーザ１１から出射されるレーザ光の波長を取得する（ステップＳ１１）。ここでは、２光子励起顕微鏡装置１００は、利用者が入力装置５０を用いて入力する標本Ｓの光学特性（例えば、散乱特性が強、発光体の大きさが大）及びレーザ光の波長（例えば、９００ｎｍ）を取得する。

ステップＳ１１の後、２光子励起顕微鏡装置１００は、観察深さの範囲と深さ方向のピッチを取得する（ステップＳ１２）。ここでは、２光子励起顕微鏡装置１００は、利用者が入力装置５０を用いて入力する観察深さの範囲（例えば、０μｍから１２００μｍ）と深さ方向のピッチ（例えば、１００μｍ）を取得する。

ステップＳ１２の後、２光子励起顕微鏡装置１００は、観察深さを最小値に設定する（ステップＳ１３）。ここでは、２光子励起顕微鏡装置１００は、観察深さがステップＳ１２で取得した観察範囲の最小値（例えば、０μｍ）が示す深さになるように、フォーカス移動部１９を制御する。

ステップＳ１３の後、２光子励起顕微鏡装置１００は、瞳充足率毎に２光子励起蛍光画像を取得する（ステップＳ１４）。ここでは、２光子励起顕微鏡装置１００は、ビーム径可変光学系１２を制御して、瞳充足率毎にＰＭＴ２３からの信号及びガルバノミラー１３の走査位置情報に基づいて２光子励起蛍光画像を取得する。より具体的には、２光子励起顕微鏡装置１００は、瞳充足率を、例えば、０．３から１．０まで０．０５単位で変更して、それぞれの瞳充足率で２光子励起蛍光画像を取得する。

ステップＳ１４の後、２光子励起顕微鏡装置１００は、ステップＳ１４で取得した複数の２光子励起蛍光画像を所定の指標に基づいて比較して、最も評価が高い一の２光子励起蛍光画像を決定する（ステップＳ１５）。ここでは、２光子励起顕微鏡装置１００は、例えば、画像の明るさを指標にして比較する。即ち、画像の輝度情報に基づいて最も明るい２光子励起蛍光画像を決定する。

ステップＳ１５の後、２光子励起顕微鏡装置１００は、推奨瞳充足率テーブルを更新する（ステップＳ１６）。ここでは、２光子励起顕微鏡装置１００は、ステップＳ１５で決定した２光子励起蛍光画像を取得したときの瞳充足率（例えば、０．６）を、現在の観察深さ（例えば、０μｍ）と、ステップＳ１１で取得した標本の光学特性（例えば、散乱特性が強、発光体の大きさが大）及びレーザ波長（例えば、９００ｎｍ）とに関連付けて推奨瞳充足率テーブルに記憶させる。換言すると、２光子励起顕微鏡装置１００は、ステップＳ１５で決定した２光子励起蛍光画像を取得したときの瞳充足率をその２光子励起蛍光画像を取得したときの標本の光学特性、観察深さ、及びレーザ光の波長と関連付けて推奨瞳充足率テーブルに記憶させる。

ステップＳ１６の後、２光子励起顕微鏡装置１００は、観察深さを変更する（ステップＳ１７）。ここで、２光子励起顕微鏡装置１００は、ステップＳ１２で決定したピッチだけ観察深さが深くなるように、フォーカス移動部１９を制御する。

ステップＳ１７の後、２光子励起顕微鏡装置１００は、現在の観察深さがステップＳ１２で決定した観察深さの範囲内であるか否かを判定する（ステップＳ１８）。範囲内であると判定した場合には、ステップＳ１４に戻って上記の処理を繰り返す。一方、範囲外であると判定した場合には、図１３に示す処理を終了する。

図１３の処理を予め用意した標本毎に行うことで、図１０Ａに示す推奨瞳充足率テーブルが作成される。なお、異なるレーザ波長の推奨瞳充足率テーブルは、レーザ波長を変更して図１３の処理を再度行うことで作成されてもよく、上述したように、図１３の処理を再度行うことなく波長間の減衰比に基づいて作成されてもよい。

本実施例に係る２光子励起顕微鏡装置１００では、標本の光学特性に基づいて、より望ましくは観察深さと標本の光学特性とに基づいて、瞳充足率が決定される。より詳細には、制御装置３０によって、観察深さが深いほど、標本の散乱特性が強いほど、発光体の大きさが大きいほど、瞳充足率が小さな値に決定される。このため、２光子励起顕微鏡装置１００によれば、任意の標本を深部まで明るく観察することができる。

また、２光子励起顕微鏡装置１００では、利用者が観察深さと標本の光学特性を指定するだけで、明るい画像を得るのに適した瞳充足率の推奨値が自動的に算出され、設定すべき瞳充足率が決定される。このため、２光子励起顕微鏡装置１００によれば、顕微鏡に関する専門的な知識を有しない利用者であっても、容易に標本Ｓを深部まで明るく観察することができる。

また、２光子励起顕微鏡装置１００では、簡単な操作で瞳充足率を推奨値から変更することができる。このため、２光子励起顕微鏡装置１００によれば、画質の微調整も容易に行うことができる。

本実施例では、標本の光学特性として、散乱特性及び発光体の大きさを考慮して瞳充足率を決定する例を示したが、標本の光学特性はこれらに限られず、例えば、屈折率の均一性を考慮してもよい。この場合、推奨瞳充足率テーブルに屈折率の均一性の情報を追加した上で、標本の光学特性として散乱特性と発光体の大きさと標本の屈折率の均一性から、瞳充足率を決定しても良い。なお、屈折率の均一性が低いほど大きなＮＡの光線において収差が発生するため、推奨瞳充足率テーブルに格納される瞳充足率の推奨値は、観察深さが同じ場合には、標本の散乱特性が強いほど、標本中の発光体の大きさほど、標本の屈折率の均一性が低いほど、小さな値となる。

また、本実施例では、図１３に示す推奨瞳充足率テーブル作成処理のステップＳ１５において、２光子励起顕微鏡装置１００が複数の２光子励起蛍光画像を比較し、画像の輝度情報に基づいて最も明るい画像を決定する例を示したが、２光子励起蛍光画像の決定方法は、この方法に限られない。

２光子励起顕微鏡装置１００は、瞳充足率毎に取得した複数の２光子励起蛍光画像を表示装置４０に表示させてもよい。そして、入力装置５０を用いてその複数の２光子励起蛍光画像から利用者が選択した画像をステップＳ１５で決定すべき一の２光子励起蛍光画像として決定してもよい。一般に、コンピュータによる画像の分解能の評価は画像の明るさの評価に比べて難しい。従って、利用者に画像を選択させることで、ステップＳ１５で明るさと分解能を両立した画像を決定することができる。

また、２光子励起顕微鏡装置１００は、画像の輝度情報と画像取得時の瞳充足率に基づいて画像を決定してもよい。例えば、まず、画像の輝度情報に基づいて、最も明るい画像と最も明るい画像との明るさの差が所定範囲内の画像とを特定する。そして、画像取得時の瞳充足率に基づいて、これらの特定された画像から最も大きな瞳充足率で取得された画像をステップＳ１５で決定すべき一の２光子励起蛍光画像として決定してもよい。これにより、明るさを重視しながら分解能が良好な画像を決定することができる。

また、図６には図示していないが、対物レンズ１は観察深さの変動により生じる球面収差を補正する補正環を備えていても良い。その上で、図１３に示す推奨瞳充足率テーブル作成処理において、観察深さが変更される度に利用者が補正環を操作して観察深さの変動に起因する球面収差が補正されてもよく、記憶装置６０が観察深さに関連付けて補正環の設定を記憶してもよい。なお、補正環の設定は、ステップＳ１６で観察深さや瞳充足率などの情報とともに推奨瞳充足率テーブルに格納されてもよい。

本実施例に係る２光子励起顕微鏡装置は、標本の光学特性に基づいてまたは観察深さと標本の光学特性とに基づいて瞳充足率の推奨値を決定する代わりに、標本の光学特性に基づいて瞳充足率の推奨範囲を利用者に提供して利用者が瞳充足率を決定する点が、実施例１に係る２光子励起顕微鏡装置１００と異なっている。なお、本実施例に係る２光子励起顕微鏡装置の構成は、図６に示す実施例１に係る２光子励起顕微鏡装置１００と同様である。

以下、図７及び図１４を参照しながら、本実施例に係る２光子励起顕微鏡装置で良好な標本画像を得るための設定手順について、実施例１に係る２光子励起顕微鏡装置１００の設定手順と異なる点を説明する。なお、図１４は、本実施例に係る２光子励起顕微鏡装置の設定画面上に表示されるＧＵＩ部品を例示した図である。

本実施例に係る２光子励起顕微鏡装置１００では、ステップＳ２において、図１４に示すように、標本Ｓの散乱特性を設定するためのラジオボタンを含むＧＵＩ部品４５と、標本Ｓ中の発光体の大きさを設定するためのラジオボタンを含むＧＵＩ部品４６と、瞳充足率を設定するためのスライダーを含むＧＵＩ部品４７とが、設定画面に表示される。

利用者はＧＵＩ部品４５のラジオボタンを選択することで、標本Ｓの散乱特性を設定することができる。例えば、標本Ｓが例えば脳などの散乱しやすい標本である場合には「強」を、標本Ｓが透明に近い散乱しにくい標本である場合には「弱」を、標本Ｓでの散乱の程度がその中間くらいの場合には「中」を選択する。

利用者はＧＵＩ部品４６のラジオボタンを選択することで、標本Ｓ中の発光体の大きさを設定することができる。例えば、標本Ｓ中の発光体の大きさがスポット径よりも大きい場合には「大」を、標本Ｓ中の発光体の大きさがスポット径と同程度の場合には「中」を、標本Ｓ中の発光体の大きさがスポット径よりも小さい場合には「小」を選択する。

設定画面から入力する設定情報としては、図１４には図示していないが、上記の設定情報の他に、レーザ光の強度や波長などのチタンサファイアレーザ１１に関する設定情報、印加電圧などのＰＭＴ２３に関する設定情報、スキャンスピードなどのガルバノミラー１３に関する設定情報、フィルタやミラーの選定を含む光学光路に関する設定情報、使用する対物レンズ（倍率と開口数）に関する設定情報などがある。

利用者がＧＵＩ部品４５及びＧＵＩ部品４６を用いて標本の光学特性を指定すると、２光子励起顕微鏡装置の制御装置３０は、記憶装置６０に設けられている推奨瞳充足率テーブルを参照して、レーザ光の波長、標本Ｓの散乱特性、発光体の大きさの情報に基づいて瞳充足率の推奨範囲を決定する。そして、瞳充足率の推奨範囲をＧＵＩ部品４６のスライダー上に表示する。

例えば、レーザ光の波長が９００ｎｍであり、標本Ｓの散乱特性が強であり、発光体の大きさが大である場合であれば、これらの条件に合致する瞳充足率の推奨値は、図１０Ａに示すように０．３から０．６の範囲内である。従って、２光子励起顕微鏡装置１００は、瞳充足率の推奨範囲を０．３から０．６の範囲に決定する。図１４では、スライダー上の網掛け部分は、瞳充足率の推奨範囲を示している。

利用者は、スライダー上に表示された瞳充足率の推奨範囲を参考にして、ＧＵＩ部品４６のスライダーを移動させる。また、利用者は、スライダーを移動させる代わりに、ＧＵＩ部品４６のテキストボックスに値を入力してもよい。制御装置３０は、その後、利用者が指定した瞳充足率になるように、ビーム径可変光学系１２を制御する。

２光子励起顕微鏡装置のその他の処理は、実施例１に係る２光子励起顕微鏡装置１００の場合と同様である。

以上のように、本実施例に係る２光子励起顕微鏡装置では、標本の光学特性に基づいて、瞳充足率の推奨範囲が決定される。より詳細には、標本の散乱特性が強いほど、発光体の大きさが大きいほど、瞳充足率の範囲が小さな値を含む範囲に決定される。そして、決定された推奨範囲は表示装置４０に表示されるため、利用者は、表示された推奨範囲を参考にしながら適切な瞳充足率を指定することができる。従って、本実施例に係る２光子励起顕微鏡装置によっても、実施例１に係る２光子励起顕微鏡装置１００と同様に、簡単な操作で任意の標本を深部まで明るく観察することができる。

図１５は、本実施例に係る２光子励起顕微鏡装置２００の構成を示す図である。２光子励起顕微鏡装置２００は、瞳充足率を、標本の光学特性に応じた、より望ましくは、標本の光学特性と観察深さに応じた、適切な値に制御して良好な標本画像を得るものであり、２光子励起顕微鏡１０の代わりに２光子励起顕微鏡２０１を備える点が、図６に示す実施例１に係る２光子励起顕微鏡装置１００と異なっている。

２光子励起顕微鏡２０１は、第２の照明手段を備える点と、対物レンズ１の代わりに補正環２１１を備える対物レンズ２１０を含む点が、２光子励起顕微鏡１０と異なっている。その他の点は、２光子励起顕微鏡１０と同様である。

第２の照明手段は、フェムト秒パルスレーザ２０２と、プリズム型ミラー２０３と、反射型ＬＣＯＳ（商標）（Liquid Crystal On Silicon）２０４と、ビーム径可変光学系２０５と、ミラー２０６とを備えている。第２の照明手段からのレーザ光は、ダイクロイックミラー２０７により、第１の照明手段（チタンサファイアレーザ１１、ビーム径可変光学系１２）からのレーザ光と同一の光路に導かれる。

フェムト秒パルスレーザ２０２は、チタンサファイアレーザ１１とは異なる波長域のレーザ光を出射するレーザであり、フェムト秒オーダーのパルス幅を有するパルス光を出射する。フェムト秒パルスレーザ２０２は、制御装置３０の制御下で、出射するレーザ光の強度や波長を変更する。

プリズム型ミラー２０３は、フェムト秒パルスレーザ２０２からのレーザ光を反射型ＬＣＯＳ２０４に向けて反射させ、反射型ＬＣＯＳ２０４からのレーザ光をミラー２０６に向けて反射させるように配置されている。

反射型ＬＣＯＳ２０４は、２次元のピクセル構造を有する位相変調型の空間光変調器であり、対物レンズ２１０の瞳共役位置に配置されている。反射型ＬＣＯＳ２０４は、制御装置３０からの制御信号に従ってレーザ光の位相をピクセル毎に変調するように構成されている。

ビーム径可変光学系２０５は、ビーム径可変光学系２０５を構成するレンズが光軸方向に移動することによってビーム径を可変させる光学系であり、対物レンズ２１０に入射するレーザ光のビーム径を変更するビーム径変更部である。ビーム径可変光学系２０５は、制御装置３０の制御下で、レーザ光のビーム径を変更する。

ダイクロイックミラー２０７は、チタンサファイアレーザ１１からのレーザ光の光路とフェムト秒パルスレーザ２０２からのレーザ光の光路を合成する光路合成手段であり、チタンサファイアレーザ１１からのレーザ光を透過させ、フェムト秒パルスレーザ２０２からのレーザ光を反射する特性を有する。

対物レンズ２１０は、インデックスミスマッチや観察深さの変動などにより生じる球面収差を補正する補正環２１１を備えた対物レンズである。対物レンズ２１０は、補正環２１１を回転させることで、対物レンズ２１０を構成するレンズの一部が光軸に移動するように構成されている。

以上のように構成された２光子励起顕微鏡装置２００では、実施例１に係る２光子励起顕微鏡装置１００と同様に、対物レンズ２１０の瞳径に対する対物レンズ２１０に入射するチタンサファイアレーザ１１からのレーザ光のビーム径の比率（以降、第１の瞳充足率と記す）が第１の照明手段を用いて観察すべき観察面の深さ（つまり、観察深さ）と標本Ｓの光学特性に基づいて決定した値になるように、制御装置３０がビーム径可変光学系１２を制御する。このため、２光子励起顕微鏡装置２００によれば、第１の照明手段を用いて任意の標本を深部まで明るく観察することができる。

また、２光子励起顕微鏡装置２００では、対物レンズ２１０の瞳径に対する対物レンズ２１０に入射するフェムト秒パルスレーザ２０２からのレーザ光のビーム径の比率（以降、第２の瞳充足率と記す）が第２の照明手段を用いて観察すべき観察面の深さ（つまり、観察深さ）と標本Ｓの光学特性に基づいて決定した値になるように、制御装置３０がビーム径可変光学系２０５を制御する。このため、２光子励起顕微鏡装置２００によれば、第２の照明手段を用いて任意の標本を深部まで明るく観察することができる。

また、２光子励起顕微鏡装置２００では、ビーム径可変光学系１２とビーム径可変光学系２０５を制御することで、第１の瞳充足率と第２の瞳充足率を別々に調整することができる。このため、異なる波長のレーザ光を出射する第１の照明手段と第２の照明手段を用いて、標本Ｓの異なる深さの部位を同時に明るく観察することができる。また、標本Ｓの同じ深さの部位を異なる波長で同時に明るく観察することもできる。

さらに、２光子励起顕微鏡装置２００の対物レンズ２１０は、補正環２１１を備えているため、観察深さに応じて補正環２１１を操作または制御することで観察深さの変動に起因する球面収差を補正することができる。なお、補正環２１１による球面収差の補正は、第１の照明手段を用いた観察と第２の照明手段を用いた観察のいずれに適用してもよい。

また、２光子励起顕微鏡装置２００第１の照明手段を用いた観察と第２の照明手段を用いた観察を同時に行う場合には、第１の照明手段を用いた観察で生じる球面収差を補正環２１１により補正し、第２の照明手段を用いた観察で生じる球面収差を反射型ＬＣＯＳ２０４により補正しても良い。なお、対物レンズ２１０の瞳共役位置に配置された位相変調型の空間光変調器により球面収差を補正する技術は、既知であるので詳細な説明は省略する。

上述した実施例は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。非線形光学顕微鏡装置は、特許請求の範囲により規定される本発明の思想を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。例えば、実施例１から３では、非線形光学顕微鏡装置として２光子励起顕微鏡装置を例示したが、３光子励起顕微鏡装置、ＳＨＧ（Second Harmonic Generation）顕微鏡装置、ＴＨＧ（Third Harmonic Generation）顕微鏡装置、ＣＡＲＳ（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering）顕微鏡装置などであってもよい。

なお、本願発明は、標本の光学特性を考慮して、より望ましくは観察深さ及び標本の光学特性を考慮して瞳充足率を決定するものであるが、本願発明者は、これらを考慮した場合には、従来考えられているよりも小さな瞳充足率が好ましいことがあるということを見出した。具体的には、標本の光学特性に応じて、または、観察深さ及び標本の光学特性に応じて、瞳充足率は０．３以上１以下の値とすることが望ましい。

１、２１０ 対物レンズ
２ 蛍光発光体
３ スポット
１０、２０１ ２光子励起顕微鏡
１１ チタンサファイアレーザ
１２、２０５ ビーム径可変光学系
１３ ガルバノミラー
１４ 瞳投影リレーレンズ
１５、１７、２０６ ミラー
１６ 結像レンズ
１８、２０７ ダイクロイックミラー
１９ フォーカス移動部
２０、２２ レンズ
２１ ＩＲカットフィルタ
２３ ＰＭＴ
３０ 制御装置
４０ 表示装置
５０ 入力装置
６０ 記憶装置
４１、４２、４２ａ、４３、４３ａ、４４、４５、４６、４７ ＧＵＩ部品
１００、２００ ２光子励起顕微鏡装置
２０２ フェムト秒パルスレーザ
２０３ プリズム型ミラー
２０４ 反射型ＬＣＯＳ
２１１ 補正環
Ｂ１、Ｂ２ 光線
Ｓ 標本
ＶＰ 観察面

Claims (13)

1. レーザ光を標本に照射する対物レンズと、
   前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径を変更するビーム径変更部と、
   前記標本の光学特性に基づいて、前記対物レンズの瞳径に対する前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径の比率である瞳充足率を、前記標本の光学特性毎に決定し、前記瞳充足率が前記決定された値になるように前記ビーム径変更部を制御する制御部と、を備え、
   前記制御部は、さらに観察面の深さである観察深さに基づいて、前記瞳充足率を、前記標本の光学特性毎に前記観察深さが深いほど小さくなるように決定し、前記瞳充足率が前記決定された値になるように前記ビーム径変更部を制御し、
   前記標本の光学特性は、前記標本中の発光体の大きさを含み、
   前記制御部は、前記観察深さが同じ場合には、前記瞳充足率を、前記標本中の発光体の大きさが前記レーザ光の観察面におけるスポット径よりも大きい場合に、前記発光体の大きさが前記スポット径よりも小さい場合と比較して小さくなるように決定する
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡装置。
2. 請求項１に記載の非線形光学顕微鏡装置において、
   前記標本の光学特性は、前記標本の散乱特性を含み、
   前記制御部は、前記観察深さが同じ場合には、前記瞳充足率を、前記標本の散乱特性が強いほど、小さくなるように決定する
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡装置。
3. 請求項１または請求項２に記載の非線形光学顕微鏡装置において、
   前記標本の光学特性は、前記標本の屈折率の均一性を含み、
   前記制御部は、前記観察深さが同じ場合には、前記瞳充足率を、前記標本の屈折率の均一性が低いほど、小さくなるように決定する
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡装置。
4. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の非線形光学顕微鏡装置において、
   前記制御部は、前記観察深さと前記標本の光学特性と前記レーザ光の波長とに基づいて、前記瞳充足率を、前記観察深さと前記標本の光学特性の組み合わせ毎に前記レーザ光の波長が短いほど小さくなるように決定し、前記瞳充足率が決定された値になるように前記ビーム径変更部を制御する
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡装置。
5. 請求項４に記載の非線形光学顕微鏡装置において、さらに、
   前記標本の光学特性、前記観察深さ、前記レーザ光の波長、及び、前記瞳充足率を関連付けて記憶する記憶部を備え、
   前記制御部は、前記記憶部を参照して前記ビーム径変更部を制御する
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡装置。
6. 請求項５に記載の非線形光学顕微鏡装置において、さらに、
   前記非線形応答光を検出する光検出器を備え、
   前記制御部は、
   前記ビーム径変更部と前記光検出器を制御して、前記瞳充足率毎に、前記光検出器からの信号に基づいて前記標本の画像を取得し、
   前記瞳充足率毎に取得した前記複数の標本の画像を所定の指標に基づいて比較して、最も評価が高い一の画像を決定し、
   決定された前記一の画像を取得したときの前記瞳充足率を、決定された前記一の画像を取得したときの前記標本の光学特性、前記観察深さ、及び前記レーザ光の波長と関連付けて、前記記憶部に記憶させる
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡装置。
7. 請求項６に記載の非線形光学顕微鏡装置において、
   前記所定の指標は、画像の明るさである
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡装置。
8. 請求項５に記載の非線形光学顕微鏡装置において、さらに、
   前記非線形応答光を検出する光検出器と、
   前記標本の画像を表示する表示部と、
   利用者が情報を入力するための入力部と、を備え、
   前記制御部は、
   前記ビーム径変更部と前記光検出器を制御して、前記瞳充足率毎に、前記光検出器からの信号に基づいて前記標本の画像を取得し、
   前記瞳充足率毎に取得した前記複数の標本の画像を前記表示部に表示させ、
   前記入力部から入力された、利用者が選択した画像に関する情報に従って、前記複数の標本の画像から一の画像を決定し、
   決定された前記一の画像を取得したときの前記瞳充足率を、決定された前記一の画像を取得したときの前記標本の光学特性、前記観察深さ、及び前記レーザ光の波長と関連付けて、前記記憶部に記憶させる
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡装置。
9. 請求項５乃至請求項８のいずれか１項に記載の非線形光学顕微鏡装置において、さらに、
   前記観察深さの変動により生じる球面収差を補正する球面収差補正部を備え、
   前記記憶部は、前記観察深さに関連付けて前記球面収差補正部の設定を記憶する
   ことを特徴とする非線形光学顕微鏡装置。
10. 請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の非線形光学顕微鏡装置において、
    前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径は、ガウシアン強度分布を有する前記レーザ光のピーク強度のｅ-2倍以上の強度を有する部分の光束径である
    ことを特徴とする非線形光学顕微鏡装置。
11. 請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載の非線形光学顕微鏡装置において、
    前記制御部は、前記瞳充足率が０．３以上１以下の値になるように前記ビーム径変更部を制御する
    ことを特徴とする非線形光学顕微鏡装置。
12. レーザ光を標本に照射する対物レンズと、
    前記対物レンズの瞳径に対する前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径の比率である瞳充足率の推奨値を格納した推奨瞳充足率テーブルが設けられた記憶装置であって、前記推奨値が観察深さと前記標本の光学特性とに関連付けられている、という記憶装置と、
    前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径を変更するビーム径変更部と、
    前記標本の光学特性と前記推奨瞳充足率テーブルに基づいて、前記対物レンズの瞳径に対する前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径の比率である瞳充足率の推奨範囲を前記標本中の発光体の大きさが前記レーザ光の観察面におけるスポット径よりも大きい場合に、前記発光体の大きさが前記スポット径よりも小さい場合と比較して小さくなるように決定する制御部と、
    前記制御部で決定された前記推奨範囲を表示する表示部と、
    利用者が設定すべき瞳充足率を指定するための入力部と、を備え、
    前記制御部は、前記瞳充足率が前記入力部により利用者が指定した瞳充足率になるように、前記ビーム径変更部を制御する
    ことを特徴とする非線形光学顕微鏡装置。
13. レーザ光を標本に照射する対物レンズと、
    前記対物レンズの瞳径に対する前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径の比率である瞳充足率の推奨値を格納した推奨瞳充足率テーブルが設けられた記憶装置であって、前記推奨値が観察深さと前記標本の光学特性とに関連付けられている、という記憶装置と、
    前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径を変更するビーム径変更部と、
    前記標本の光学特性と前記推奨瞳充足率テーブルに基づいて、前記対物レンズの瞳径に対する前記対物レンズに入射する前記レーザ光のビーム径の比率である瞳充足率を、前記標本の光学特性毎に、前記標本中の発光体の大きさが前記レーザ光の観察面におけるスポット径よりも大きい場合に、前記発光体の大きさが前記スポット径よりも小さい場合と比較して小さくなるように決定し、前記瞳充足率が前記決定された値になるように前記ビーム径変更部を制御する制御部と、を備え、
    前記制御部は、さらに観察面の深さである観察深さに基づいて、前記瞳充足率を、前記標本の光学特性毎に前記観察深さが深いほど小さくなるように決定し、前記瞳充足率が前記決定された値になるように前記ビーム径変更部を制御する
    ことを特徴とする非線形光学顕微鏡装置。

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