CN114174342A - 与gprc5d结合的抗体 - Google Patents

与gprc5d结合的抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN114174342A
CN114174342A CN202080054556.2A CN202080054556A CN114174342A CN 114174342 A CN114174342 A CN 114174342A CN 202080054556 A CN202080054556 A CN 202080054556A CN 114174342 A CN114174342 A CN 114174342A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antigen
seq
fab
heavy chain
binding portion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080054556.2A
Other languages
English (en)
Inventor
A·布约采克
T·克里斯托弗
T·福蒂
G·费蒂格
H·C·海格尔
C·克莱因
T·克拉夫特
S·洛伦兹
M·L·马约克斯
A·施耐德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN114174342A publication Critical patent/CN114174342A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Abstract

本发明总体上涉及与GPRC5D结合的抗体，其包括例如用于活化T细胞的双特异性抗原结合分子。此外，本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生产所述抗体的方法，以及涉及将所述抗体用于治疗疾病的方法。

Description

与GPRC5D结合的抗体
技术领域
本发明通常涉及与GPRC5D结合的抗体，其包括例如用于活化T细胞的双特异性抗原结合分子。此外，本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生产所述抗体的方法，以及涉及将其用于治疗疾病的方法。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)是最常见的血液学恶性肿瘤之一，在欧盟和美国每年有约75,000名新患者，其医疗需求仍未得到满足。多发性骨髓瘤的特征在于终末分化的浆细胞分泌非功能性单克隆免疫球蛋白。短期内，诸如来那度胺(lenalidomide)、泊马度胺(pomalidomide)等免疫调节药物，以及诸如卡非佐米(carfilzomib)或硼替佐米(bortezomib)等蛋白酶体抑制剂可能仍是多发性骨髓瘤第一线治疗的支柱(Moreau，P.和S.V.Rajkumar，multiple myeloma-translation of trial results intoreality.Lancet，2016.388(10040)：p.111-3)。然而，这些药物并不能特异性地靶向病变的肿瘤细胞，例如病变的浆细胞(PC)。已经朝着选择性地消耗多发性骨髓瘤的浆细胞的方向努力。缺乏特异性标记浆细胞的表面蛋白，已经阻碍了多发性骨髓瘤的抗体或细胞疗法的开发。到目前为止，仅极少数成功的生物制剂案例，其包括达雷木单抗(daratumumab)(抗CD38)和埃罗妥珠单抗(elotuzumab)(抗CD319)，但需要注意的是，这两种分子并非仅由浆细胞表达。因此，利用RNA测序从多发性骨髓瘤的浆细胞中发现了新的靶标，诸如G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)，其在多发性骨髓瘤的浆细胞相对于健康供体形成的浆细胞中表达不同。已经报道，GPRC5D与多发性骨髓瘤患者的预后和肿瘤负荷有关(Atamaniuk，J.等人，Overexpression of G protein-coupled receptor 5D in the bone marrow isassociated with poor prognosis in patients with multiple myeloma.Eur J ClinInvest，2012.42(9)：p.953-60；和Cohen，Y.等人，GPRC5D is a promising marker formonitoring the tumour load and to target multiple myeloma cells.Hematology，2013.18(6)：p.348-51)。
GPRC5D是一种孤儿受体，没有已知的配体，并且一般而言，在男性中、特别是在癌症中的生物学特性未知。GPRC5D编码基因，其图谱定位在染色体12p13.3上，该编码基因含有3个外显子并且横跨约9.6kb(Brauner-Osborne，H.等人，Cloning andcharacterization of a human orphan family C G-protein coupled receptorGPRC5D.Biochim Biophys Acta，2001.1518(3)：p.237-48)。大的第一外显子编码七个跨膜结构域(seven-transmembrane domain)。已经显示，GPRC5D参与动物毛囊中角蛋白的形成(Gao，Y.等人，Comparative Transcriptome Analysis of Fetal Skin Reveals KeyGenes Related to Hair Follicle Morphogenesis in Cashmere Goats.PLoS One，2016.11(3)：p.e0151118；和Inoue，S.，T.Nambu和T.Shimomura，The RAIG family member，GPRC5D，is associated with hard-keratinized structures.J Invest Dermatol，2004.122(3)：p.565-73)。
WO 2018/017786 A2公开了GPRC5D特异性抗体或抗原结合片段。
鉴于所有的标准护理治疗都无法治愈多发性骨髓瘤患者，显然需要开发有效并且特异性的新疗法。该方法之一包括结合GPRC5D的抗体、特别是结合靶细胞上的GPRC5D和活化T细胞抗原(诸如T细胞上的CD3)的双特异性抗体。当此类抗体与其两者靶标同时结合时，将形成T细胞突触，导致(细胞毒性)T细胞的活化和随后靶细胞的裂解。
本发明提供新型抗体，其包括特异性结合人GPRC5D的双特异性抗体。特别是，根据本发明的靶向GPRC5D的T细胞双特异性抗体具有治疗多发性骨髓瘤的效力。
发明内容
本案发明人开发了结合新型GPRC5D抗体的与GPRC5D和活化T细胞抗原结合的双特异性抗原结合分子。
本发明的第一方面提供一种双特异性抗原结合分子，其包含：
(a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分(first antigen binding moiety)，其中该第一抗原为GPRC5D，并且该第一抗原结合部分包含(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ IDNO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：84的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；(ii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：85的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；(iii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；(iv)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：96的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；或(v)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：92的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ IDNO：97的LCDR 3；以及b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中该第二抗原为CD3，并且该第二抗原结合部分包含(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：29的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：30的HCDR 2和SEQ ID NO：31的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQID NO：32的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：33的LCDR 2和SEQ ID NO：34的LCDR3；(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；或(ii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：106的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：107的HCDR 2和SEQ ID NO：108的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：109的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ IDNO：110的LCDR 2和SEQ ID NO：111的LCDR 3。
在另一实施例中，(i)该第一抗原结合部分的VH包含与SEQ ID NO：13的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且该第一抗原结合部分的VL包含与SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(ii)该第一抗原结合部分的VH包含与SEQ ID NO：15的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且该第一抗原结合部分的VL包含与SEQ IDNO：16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(iii)该第一抗原结合部分的VH包含与SEQ ID NO：48的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且该第一抗原结合部分的VL包含与SEQ ID NO：53的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(iv)其中该第一抗原结合部分的VH包含与SEQ ID NO：49的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中该第一抗原结合部分的VL包含与SEQ ID NO：52的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(v)该第一抗原结合部分的VH包含与SEQ ID NO：57的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且该第一抗原结合部分的VL包含与SEQ ID NO：64的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(vi)该第一抗原结合部分的VH包含与SEQ ID NO：58的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中该第一抗原结合部分的VL包含与SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在另一实施例中，该第二抗原结合部分的VH包含(i)与SEQ ID NO：35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且该第二抗原结合部分的VL包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO：104的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且该第二抗原结合部分的VL包含与SEQ ID NO：105的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(iii)与SEQ ID NO：112的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且该第二抗原结合部分的VL包含与SEQ ID NO：113的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某一实施例中，该第一抗原结合部分和/或该第二抗原结合部分为Fab分子。这代表该第一抗原结合部分可为Fab分子，或该第二抗原结合部分可为Fab分子，或者，该第一抗原结合部分和该第二抗原结合部分可为Fab分子。在另一实施例中，该第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1、特别是可变结构域VL和VH经彼此取代。在另一实施例中，该第一抗原结合部分为Fab分子，其中在恒定结构域中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代，并且在恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代。在另一实施例中，该第一抗原结合部分和该第二抗原结合部分彼此融合，任选地经由肽接头彼此融合。在另一实施例中，该第一抗原结合部分和该第二抗原结合部分各自为Fab分子，并且其中(i)该第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与该第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，或(ii)该第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与该第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在另一实施例中，该双特异性抗原结合分子包含第三抗原结合部分。在另一实施例中，该第三抗原部分与该第一抗原结合部分相同。在另一实施例中，该双特异性抗原结合分子包含含有第一亚基和第二亚基的Fc结构域。在另一实施例中，该第一抗原结合部分、该第二抗原结合部分和在存在时的第三抗原结合部分各自为Fab分子；并且其中(i)该第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与该第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且该第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基的N末端融合，或(ii)该第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与该第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且该第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基的N末端融合；并且其中该第三抗原结合部分(在存在时)在Fab重链的C末端与Fc结构域的第二亚基的N末端融合。在另一实施例中，该Fc结构域为IgG Fc结构域。在另一实施例中，该Fc结构域为IgG1 Fc结构域。在又另一实施例中，该Fc结构域为人Fc结构域。在另一实施例中，该Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起，该突起为可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且该Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在该第二亚基的CH3结构域内产生空腔，该第一亚基的CH3结构域内的突起为可定位在空腔内。在另一实施例中，该Fc结构域包含降低与Fc受体的结合和/或效应子功能(effector function)的一个或多个氨基酸取代。
本发明的另一方面提供一种或多种分离的多核苷酸，其编码如本文所述的双特异性抗原结合分子。本发明的又一方面提供一种或多种载体，特别是表达载体，其包含如本文所述的多核苷酸。本发明的另一方面提供一种宿主细胞，其包含如本文所述的多核苷酸或载体。
本发明的另一方面提供一种生产与GPRC5D结合的双特异性抗原结合分子的方法，该方法包括下列步骤：a)在适合表达该双特异性抗原结合分子的条件下培养如本文所述的宿主细胞，b)任选地，回收该双特异性抗原结合分子。
在另一方面，本发明提供一种与GPRC5D结合的双特异性抗原结合分子，其通过根据权利要求21所述的方法来生产。
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含如本文所述的双特异性抗原结合分子以及药用载体。
在另一方面，本发明提供如本文所述的双特异性抗原结合分子或如本文所述的药物组合物，其用作药物。
在另一方面，本发明提供如本文所述的双特异性抗原结合分子或如本文所述的药物组合物，其用于治疗疾病。
在另一方面，本发明提供如本文所述的双特异性抗原结合分子或药物组合物，其中该疾病为癌症或自身免疫性疾病。
在另一方面，本发明提供如本文所述的双特异性抗原结合分子或如本文所述的药物组合物，其中该疾病为多发性骨髓瘤。
在进一步的方面，本发明提供一种如本文所公开的双特异性抗原结合分子的用途，其用于制造治疗疾病的药物。
在另一方面，本发明涉及一种治疗个体中疾病、特别是癌症、更特别是多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，该组合物包含如本文所述的呈药用形式的双特异性抗原结合分子。可替代地，该疾病为自身免疫性疾病，诸如全身性红斑性狼疮和/或类风湿性关节炎。在任何上述实施例中，该个体优选为哺乳动物，特别为人。
附图说明
图1A至图1Z.本发明的双特异性抗原结合分子的示例性构型。(图1A、图2D)″1+1CrossMab″分子的图示。(图1B、图1E)″2+1 IgG Crossfab″分子的图示，具有Crossfab和Fab组成的顺序替换(″反向(inverted)″)。(图1C、图1F)″2+1 IgG Crossfab″分子的图示。(图1G、图1K)″1+1 IgG Crossfab″分子的图示，具有Crossfab和Fab组成的顺序替换(″反向(inverted)″)。(图1H、图1L)″1+1 IgG Crossfab″分子的图示。(图1I、图1M)″2+1 IgGCrossfab″分子的图示，具有两个CrossFab。(图1J、图1N)″2+1 IgG Crossfab″分子的图示，具有两个CrossFab以及Crossfab和Fab组成的顺序替换(″反向(inverted)″)。(图1O、图1S)″Fab-Crossfab″分子的图示。(图1P、图1T)″Crossfab-Fab″分子的图示。(图1Q、图1U)″(Fab)2-Crossfab″分子的图示。(图1R、图1V)″Crossfab-(Fab)2″分子的图示。(图1W、图1Y)″Fab-(Crossfab)2″分子的图示。(图1X、图1Z)″(Crossfab)2-Fab″分子的图示。黑点：Fc结构域中的任选修饰，其促进异二聚体化(heterodimerization)。++、--：在CH1和CL结构域中任选地引入相反电荷的氨基酸。Crossfab分子被描述为包含VH和VL区的交换，但可以(在其中CH1和CL结构域中没有引入电荷修饰的实施例中)交替地包含CH1和CL结构域的交换。
图2.通过RNAseq分析浆细胞和B细胞上肿瘤靶标的基因表达。
图3.本发明的5E11-双特异性抗原结合分子的示例性构型。黑点：Fc结构域中的任选修饰，其促进异二聚体化(heterodimerization)。++、--：在CH1和CL结构域中任选地引入相反电荷的氨基酸。
图4A至图4C.双特异性抗原结合分子5F11-TCB(图4A)和5E11-TCB(图4B)以及对照抗体ET150-5-TCB(图4C)与表达GPRC5D的多发性骨髓瘤细胞系AMO-1、L636、NCI-H929、RPMI-8226、OPM-2和对照细胞WSU-DLCL2的结合分析。
图5A至图5E.GPRC5D-TCB介导的T细胞毒性对多发性骨髓瘤细胞系AMO-1(图5A)、NCI-H929(图5B)、RPMI-8226(图5C)和L363(图5D)的分析。对照细胞系为WSU-DL CL2(图5E)。所测试的分子：5E11-TCB、5F11-TCB。对照分子：DP47-TCB(非靶向)和ET150-5-TCB。
图6.经GPRC5D-TCB活化的T细胞接合(engagement)与多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929和阴性对照细胞系WSU-DLCL2上调CD25和CD69的分析。
图7A至图7J.在存在AMO-1(图7A)、NCI-H929(图7B)、RPMI-8226(图7C)、L363(图7D)和WSU-DLCL2(图7E)的情况下，用浓度渐增的GPRC5D-TCB或阴性对照DP47-TCB孵育T细胞时，通过CD8+T细胞上的CD25上调来确定T细胞活化；以及在存在AMO-1(图7F)、NCI-H929(图7G)、RPMI-8226(图7H)、L363(图7I)和WSU-DLCL2(图7J)的情况下，用浓度渐增的GPRC5D-TCB或阴性对照DP47-TCB孵育T细胞时，通过CD8+T细胞上的CD69上调来确定T细胞活化。
图8A至图8B.通过荧光共焦显微镜可视化抗体定位和内化(图8A)以及分析胞膜与胞质的信号强度(图8B)。
图9.通过ELISA、利用表达人GPRC5D(克隆12)或食蟹猕猴GPRC5D(克隆13)、鼠GPRC5D(克隆4)或人GPRC5A(克隆30)的稳定转染CHO克隆，评估不同抗GPRC5D抗体与人、犬和鼠GPRC5D的结合。
图10A至图10G.通过共孵育(E∶T＝10∶1，人泛T细胞)20小时期间不同的GPRC5D靶向或BCMA靶向T细胞双特异性分子诱导T细胞介导的各种多发性骨髓瘤(MM)细胞系的裂解。所绘示的为重复数加上SD。
图11A至图11F.来自健康供体的同种异源(allogenic)人泛T细胞和未经处理的骨髓细胞(E∶T＝10∶1，人泛T细胞)共孵育约20小时期间，通过不同的GPRC5D靶向或BCMA靶向T细胞双特异性分子诱导的T细胞活化(图11A中的5E11-TCB；图11B中的5F11-TCB；图11C中的10B10-TCB；图11D中的BCMA-TCB；图11E中的B72-TCB；图11F中的DP47-TCB)。所描绘的为来自一个代表性供体的FACS点图，显示CD4 T细胞(上排)或CD8 T细胞(下排)上作为所有CD4各自的CD8 T细胞中阳性细胞的百分比的活化标志物CD69的上调。
图12A至图12B.来自健康供体的同种异源人泛T细胞和未经处理的骨髓细胞(E∶T＝10∶1，人泛T细胞)共孵育约20小时期间，通过不同的GPRC5D靶向或BCMA靶向T细胞双特异性分子诱导的T细胞活化。所描绘的为所有四个评估供体的总结，显示在选定的固定剂量的50nM的TCB(图12A)或5nM的TCB(图12B)处，CD8 T细胞上的活化标志物CD69上调。
图13A至图13D.通过不同的GPRC5D靶向T细胞双特异性分子(图13A中的5F11-TCB；图13B中的BCMA-TCB；图13C中的B72-TCB；图13D中的载剂)所诱导的体内疗效，在人源化NSG小鼠模型(经植入NCI-H929肿瘤细胞)中，通过肿瘤生长动力学随时间的变化来描绘。所绘制的为蜘蛛图，每条线指的是单一小鼠。
图14A至图14D.通过不同的GPRC5D靶向T细胞双特异性分子(图14A中的5F11-TCB；图14B中的5E11-TCB；图14C中的B72-TCB；图14D中的载剂)所诱导的体内疗效，在人源化NSG小鼠模型(经植入OPM-2肿瘤细胞)中，通过肿瘤生长动力学随时间的变化来描绘。所绘制的为蜘蛛图，每条线指的是单一小鼠。
图15A至图15B.PGLALA-CAR-J活化后约16小时的孵育，由发光确定。后者为在GPRC5D IgG(图15A中的5F11-IgG；图15B中的5E11-IgG)与表达GPRC5D的多发性骨髓瘤细胞系L-363以及经PGLALA修饰的Fc结构域与Jurkat-NFAT报告细胞同时结合时诱导的，Jurkat-NFAT报道细胞为经基因工程改造以表达针对这些IgG分子Fc部分中PGLALA突变的TCR。所绘示的为重复数加上SD。
图16A至图16D.人源化TCB分子与亲本TCB结合至NCI-H929细胞上的人GPRC5D(图16A和16B)以及Jurkat细胞上的人CD3(图16C和16D)所表达的细胞。
图17A至图17G.在不同的GPRC5DxCD3双特异性TCB分子的存在下的Jurkat-NFAT活化测定(图17A至17G)与非靶向对照TCB，如所示。
图18A至图18D.肿瘤细胞裂解测定比较如本文中所提出的GPRC5D-TCB分子以及本技术领域中已知的靶向GPRC5D或BCMA的分子与非靶向的参考TCB分子。
图19.用不同的CD3参与的双特异性分子孵育初代MM样品时自体T细胞的活化。如本文中所提出的GPRC5D-TCB与本技术领域中已知的靶向GPRC5D或BCMA的分子与非靶向的参考TCB分子进行比较。
图20A至图20D.健康供体的PBMC与不同的CD3参与的双特异性分子孵育时B细胞的耗竭。如本文中所提出的GPRC5D-TCB与本技术领域中已知的靶向GPRC5D或BCMA的分子与非靶向的参考TCB分子进行比较。使用浓度为50nM(图20A)、5nM(图20B)、0.5nM(图20C)和0.05nM(图20D)的抗体。
图21A至图21B.健康供体的骨髓样品与不同的CD3参与的双特异性分子孵育时T细胞的活化。将如本文中所提出的GPRC5D-TCB与本技术领域中已知的分子进行比较。通过检测CD69+CD8+ T细胞(图21A)和CD69+CD4+ T细胞(图21B)在所有CD8+各自的CD4+ T细胞中的百分比来确定活化。
图22A至图22B.健康供体的人全血中细胞因子的释放(图22A中TNFa读数；图22B中IL6读数)。比较如在本文中所述的GPRC5D-TCB以及阳性(Gazyva，Lemtrada)和阴性(Erbitux)参考分子。
图23A至图23G.不同GPRC5DxCD3双特异性TCB分子在NCI-H929(hNSG小鼠)中的体内疗效，包括每个治疗组在治疗过程中的平均肿瘤体积(图23A)、第37天的肿瘤体积(图23B)以及肿瘤生长，针对分子，每一行代表单一小鼠(载剂：图23C；6623：图.23D；6624：图23E；6625：图.23F；6626：图23G)。
图24.hFcRn Tg和KO小鼠中体内SDPK和所指示的TCB分子的清除数据。
图25A至图25I.双特异性抗原结合分子5E11(6625)-TCB与表达人GPRC5D的多发性骨髓瘤细胞系OPM-2(图25A、图25D、图25G)、NCI-H929(图25B、图25E、图25H)和RPMI-8226(图25C、图25F、图25I)的结合分析代表实例。每个细胞系的GPRC5D抗体结合位点(ABS)的数量在括号中给出，并先前通过QSC确定(Quantum Simply Cellular，BangsLabs)。所描绘的为相对中位荧光值(MFI)，来自三重复结果加上SD。通过GraphPadPrism计算出结合的EC50值，并汇总于表14.2中。
具体实施方式
定义
定义除非在下文中另外定义，否则本文所用的术语为本技术领域中的一般使用。
如本文中所使用的术语″抗原结合分子″，在其最宽广意义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的实例为免疫球蛋白及其衍生物(例如片段)。
术语″双特异性″意指抗原结合分子能够特异性结合至少两个不同的抗原决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，该抗原结合位点中的每一者对不同抗原决定簇具有特异性。在某些实施例中，该双特异性抗原结合分子能够同时结合两个抗原决定簇，特别是在两种不同细胞上表达的两个抗原决定簇。
如本文中所使用的术语″价(valent)″，表示抗原结合分子中存在指定数量的抗原结合位点。因此，术语″单价结合抗原(monovalent binding to an antigen)″表示抗原结合分子中存在对抗原具有特异性的一个(并且不超过一个)抗原结合位点。
如本文中所使用的术语″抗原结合部分(antigen binding moiety)″，是指特异性结合抗原决定簇的多肽分子。在一个实施例中，抗原结合部分能够将其所附着的实体(例如第二抗原结合部分)引导至靶位点，例如引导至载有抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞。在另一个实施例中，抗原结合部分能够通过其靶抗原(例如T细胞受体复合抗原)活化信号传导。抗原结合部分包括如本文进一步定义的抗体及其片段。特定抗原结合部分包括抗体的抗原结合结构域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施例中，抗原结合部分可包括如本文进一步定义和本技术中已知的抗体恒定区。可用的重链恒定区包括五种同种型(isotype)中的任一者：α、δ、ε、γ或μ。可用的轻链恒定区包括两种同种型中的任一者：κ和λ。
如本文中所使用的术语″抗原决定簇(antigenic determinant)″与″抗原″和″表位(epitope)″同义，并且是指抗原结合部分结合的多肽大分子上的形成抗原结合部分-抗原复合物的位点(例如，氨基酸的连续延伸或由非连续氨基酸的不同区域构成的构象构型)。例如，可用的抗原决定簇可存在于肿瘤细胞的表面上、受病毒感染的细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上，不存在于血清中，并且/或者存在于细胞外基质(ECM)中。本文称为抗原的蛋白质(例如GPRC5D、CD3)可为源自任何脊椎动物(包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人)、非人的灵长类动物(例如食蟹猕猴)和囓齿动物(例如小鼠和大鼠))的蛋白质的任何天然形式，除非另有说明。在特定实施例中，该抗原为人类蛋白质。在本文中提及特定蛋白质的情况下，该术语涵盖″全长″、未经处理的蛋白质和由在细胞中处理所产生的任何蛋白质形式。该术语也涵盖天然生成的蛋白质变体，例如剪接变体或等位基因变体。适用作抗原的示例性人蛋白质为CD3，特别地CD3的ε亚基(参见UniProt编号P07766(第185版)、NCBI RefSeq编号NP_000724.1，就人序列而言，SEQ ID NO：40；或UniProt编号Q95LI5(第69版)、NCBI GenBank编号BAB71849.1，就食蟹猕猴序列而言，SEQID NO：41)或GPRC5D(参见UniProt编号Q9NZD1(第115版)；NCBI RefSeq编号NP_061124.1，就人序列而言，SEQ ID NO：45)。在某些实施例中，本发明的抗体或双特异性抗原结合分子结合来自不同物种的CD3或GPRC5D抗原中保守的CD3或GPRC5D的表位。在特定实施例中，本发明的抗体或双特异性抗原结合分子结合人GPRC5D。
″特异性结合″意指结合对抗原具有选择性并且可区分出非所需要或非特定的相互作用。抗原结合部分结合特异性表位的能力可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术，例如表面等离子体共振(SPR)技术(例如在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17，323-329(2000))和传统的结合测定(Heeley，Endocr Res28，217-229(2002))来测定。在一个实施例中，抗原结合部分结合不相关的蛋白质的程度小于抗原结合部分结合抗原的约10％，例如通过SPR测定。在某些实施例中，结合抗原的抗原结合部分或包含该抗原结合部分的抗原结合分子具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。
″亲和力″是指分子(例如受体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所使用的″结合亲和力″，是指反映结合对成员(例如，抗原结合部分和抗原或受体及其配体)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以以解离常数(KD)表示，其解离速率常数与结合速率常数(分别为koff和kon)之比。因此，等效亲和力可包括不同速率常数，只要速率常数比保持相同即可。可通过此项技术中已知的既定方法测定亲和力，包括本文所述的那些方法。用于测定亲和力的特定方法为表面等离子体共振(SPR)。
″减少结合″，例如减少结合Fc受体，是指例如通过SPR测得各自相互作用的亲和力降低。为清楚起见，该术语也包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测限度)，即相互作用完全废除。相反，″增加结合″是指各自相互作用的结合亲和力增加。
如本文中所使用的″活化T细胞抗原(activating T cell antigen)″，是指在T淋巴细胞(特别地细胞毒性T淋巴细胞)的表面上表达的抗原决定簇，其能够在与抗原结合分子相互作用时诱导T细胞活化。具体地，抗原结合分子与活化T细胞抗原的相互作用可通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联来诱导T细胞活化。在某一特定实施例中，该活化T细胞抗原为CD3，特别为CD3的ε亚基(参见UniProt编号P07766(第144版)，NCBI RefSeq编号NP_000724.1，就人序列而言，SEQ ID NO：40；或UniProt编号Q95LI5(第49版)，NCBIGenBank编号BAB71849.1，就食蟹猕猴序列而言，SEQ ID NO：41)。
如本文中所使用的″T细胞活化″，是指T淋巴细胞(特别地细胞毒性T淋巴细胞)的一种或多种细胞反应，其选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。测量T细胞活化的合适测定是本技术中已知的并在本文中描述。
如本文中所使用的″靶细胞抗原(target cell antigen)″，是指存在于靶细胞(例如肿瘤中的细胞，诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞)的表面上的抗原决定簇。在一特定实施例中，该靶细胞抗原为GPRC5D，特别地根据SEQ ID NO：45的人GPRC5D。
如本文中所使用的关于Fab分子等的术语″第一″、″第二″或″第三″，是用于方便区分每一类型的部分何时存在多于一个。除非明确说明，否则使用此类术语并非旨在赋予双特异性抗原结合分子特定的顺序或方向。
″融合″意指组分(例如Fab分子和Fc结构域亚基)经肽键直接或经由一个或多个肽接头连接。
″Fab分子″是指由重链(″Fab重链″)的VH和CH1结构域以及免疫球蛋白的轻链(″Fab轻链″)的VL和CL结构域组成的蛋白质。
″交换型(crossover)″Fab分子(也称为″Crossfab″)意指Fab分子，其中Fab重链和轻链的可变结构域或恒定结构域被交换(即彼此替换)，即，交换型Fab分子包含由轻链可变结构域VL和重链恒定结构域1CH1组成的肽链(VL-CH1，在N末端至C末端方向中)以及由重链可变结构域VH和轻链恒定结构域CL组成的肽链(VH-CL，在N末端至C末端方向中)。为清楚起见，在Fab轻链和Fab重链的可变结构域被交换的交换型Fab分子中，包含重链恒定结构域1CH1的肽链在本文中称为(交换型)Fab分子的″重链″。相反地，在Fab轻链和Fab重链的恒定结构域被交换的交换型Fab分子中，包含重链可变结构域VH的肽链在本文中称为(交换型)Fab分子的″重链″。
与此相反，″常规″Fab分子意指其自然形式(即包含由重链可变结构域和恒定结构域组成的重链(VH-CH1，在N末端至C末端方向中)和由轻链可变结构域和恒定结构域组成的轻链(VL-CL，在N末端至C末端方向中))的Fab分子。
术语″免疫球蛋白分子(immunoglobulin molecule)″是指具有天然生成的抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类的免疫球蛋白为约150,000道耳顿、由两条轻链和两条重链经二硫键键合所构成的异四聚体糖蛋白。从N末端至C末端，每条重链具有可变结构域(VH)，也称为重链可变结构域或重链可变区，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N末端至C末端，每条轻链具有可变结构域(VL)，也称为轻链可变结构域或轻链可变区，接着是轻链恒定(CL)结构域，也称为轻链恒定区。免疫球蛋白的重链可被归类为五种类型中的一种，称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中一些可进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可被归类为两种类型中的一种，称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。免疫球蛋白基本上由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。
本文中的术语″抗体″为在最广泛意义上使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要其展示出所需抗原结合活性即可。
如本文中所使用的术语″单克隆抗体(monoclonal antibody)″，是指获自实质上同源抗体群体的抗体，即群体中包含的个别抗体是相同的并且/或者结合相同表位，但不包括(例如)含有天然生成的突变或产生于单克隆抗体制剂生产过程中的可能的变体抗体，此类变体通常是以少量存在。与通常包括针对不同决定位(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体是针对于抗原上的单一决定位。因此，修饰词″单克隆″表示抗体的特征是获自实质上同质的抗体群体，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，意欲根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来制造，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述此类方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法。
″分离的(isolated)″抗体是与其自然环境的组分分离的分离的抗体，即不在其天然环境中的分离的抗体。不需要特定的纯化水平。例如，可从其天然或自然环境中移除分离的抗体。出于本发明的目的，在宿主细胞中表达的重组产生的抗体被视为经分离的，视为已通过任何合适技术分离、分级或部分或实质上纯化的天然或重组抗体。因此，本发明的抗体和双特异性抗原结合分子为经分离的。在一些实施例中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，通过(例如)电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)方法测定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
术语″全长抗体″、″完整抗体″和″全抗体″在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构实质上类似的结构的抗体。
″抗体片段″是指除完整抗体以外的分子，其包含结合完整抗体所结合抗原的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、双功能抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)和单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9，129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269页至第315页(1994)；也可参见WO 93/16185；以及美国专利第5,571,894号和第5,587,458号。关于包含补救受体结合表位残基并且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段的论述，参见美国专利第5,869,046号。双功能抗体为具有两个抗原结合位点(其可是二价或双特异性的)的抗体片段。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9，129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90，6444-6448(1993)。Hudson等人，Nat Med 9，129-134(2003)中也描述三功能抗体和四功能抗体。单结构域抗体为包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或者抗体的轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体为人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利第6,248,516 B1号)。抗体片段可通过多种技术制造，包括但不限于如本文所述的完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的产生。
术语″抗原结合结构域(antigen binding domain)″是指抗体的部分，其包含特异性结合抗原的部分或全部并且与其互补的区域。抗原结合结构域可由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。特别地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)。
术语″可变区(variable region)″或″可变结构域(variable domain)″是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域通常具有类似的结构，并且每个结构域均包含四个保守性框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。如在本文中结合可变区序列所使用的″Kabat编号″，是指Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)描述的编号***。
如本文中所使用的重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置，是根据描述于Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的Kabat编号***(在本文中称为″根据Kabat编号″或″Kabat编号″)编号。具体地，Kabat编号***(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的第647-660页)是用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且Kabat EU索引编号***(参见第661-723页)是用于重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2和CH3)，在此情况，在本文中通过参考″根据Kabat EU索引编号″进一步阐明。
如本文中所使用的术语″高变区(hypervariable region)″或″HVR″，是指抗体可变结构域的每个区，其在序列中是高变的(″互补决定区″或″CDR″；重链可变区/结构域的CDR缩写为例如HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链可变区/结构域的CDR缩写为例如LCDR1、LCDR2和LCDR3)并且/或者形成结构上限定的环(″高变环″)并且/或者含有抗原接触残基(″抗原接触″)。一般而言，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，以及三个在VL中(L1、L2、L3)。在本文中，示例性HVR包括：
(a)高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；
(b)CDR存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；
(c)抗原接触存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；以及
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另有说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)在本文中是根据Kabat等人(同前述)编号。
″框架(framework)″或″FR″是指除高变区(hypervariable region)(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以如下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
″人源化(humanized)″抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施例中，人源化抗体将包括实质上所有至少一个(并且通常两个)可变结构域，其中所有或实质上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，以及所有或实质上所有FR对应对于人抗体的那些。此类可变结构域在本文中称为″人源化可变区(humanized variable region)″。人源化抗体任选地可包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的对应残基取代，以例如恢复或改善抗体特异性或亲和力。抗体(例如非人抗体)的″人源化形式(humanized form)″是指已经历人源化的抗体。本发明所涵盖的″人源化抗体(humanized antibody)″的其他形式为其中恒定区已从原始抗体的形式另外修饰或改变，以产生根据本发明的性质、尤其关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的性质。
″人抗体(human antibody)″为具有氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应于由人或人体细胞产生或从利用人抗体谱系(antibody repertoire)或其他人抗体编码序列的非人来源衍生的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特定地排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。在某些实施例中，人抗体衍生自非人转基因哺乳动物，例如小鼠、大鼠或兔。在某些实施例中，人抗体衍生自杂交瘤细胞系。从人抗体库分离的抗体或抗体片段在本文中也被视作人抗体或人抗体片段。
抗体或免疫球蛋白的″类别(class)″是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可进一步分为亚类(同种型(isotype))，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文中的术语″Fc结构域″或″Fc区″，用于定义包含至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管IgG重链的Fc区的边界可能略有变化，但通常将人IgG重链的Fc区定义为从Cys226或Pro230延伸至该重链的羧基末端。但是，由宿主细胞产生的抗体可能经历重链C末端的一种或多种、特别是一种或两种氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子而产生的抗体可包括全长重链，或者可包括全长重链的切割变体(在本文中也称为″切割变体重链″)。重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，根据Kabat EU索引编号)。因此，可以存在或可以不存在Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)。除非另有说明，否则包括Fc结构域(或本文定义的Fc结构域的亚基)的重链的氨基酸序列在本文中表示不含C末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在本发明的一个实施例中，根据本发明所述的抗体或双特异性抗原结合分子中所含的重链(包含本文所指定的Fc结构域的亚基)包含额外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，根据本发明所述的抗体或双特异性抗原结合分子中所含的重链(包含本文所指定的Fc结构域的亚基)包含额外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)。本发明的组合物，如本文所述的药物组合物，包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的群体。抗体或双特异性抗原结合分子的群体可包含具有全长重链的分子和具有切割变体重链的分子。抗体或双特异性抗原结合分子的群体可由具有全长重链的分子和具有切割变体重链的分子的混合物组成，其中抗体或双特异性抗原结合分子的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％具有切割变体重链。在本发明的一个实施例中，包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的群体的组合物包含抗体或双特异性抗原结合分子，该抗体或双特异性抗原结合分子包含重链，该重链具有本文指定的Fc结构域的亚基和额外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的群体的组合物包含抗体或双特异性抗原结合分子，该抗体或双特异性抗原结合分子包含重链，该重链具有本文指定的Fc结构域的亚基和额外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)。在本发明的一个实施例中，此类组合物包含抗体或双特异性抗原结合分子的群体，该抗体或双特异性抗原结合分子的群体由以下分子组成：包含以下重链的分子，该重链包含本文所指定的Fc结构域的亚基；包含以下重链的分子，该重链包含本文所指定的Fc结构域的亚基和额外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)；以及包含以下重链的分子，该重链包含本文所指定的Fc结构域的亚基和额外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号根据EU编号***(也称为EU索引)进行，如Kabat等人所述(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)(另见上文)。如本文中所使用的Fc结构域的″亚基″，是指形成二聚体Fc结构域的两个多肽之一，即包含能够稳定自缔合的免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽。例如，IgGFc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。
″促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰″是对肽主链的操作或对Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或阻止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽的缔合形成同源二聚体。本文所用的促进缔合的修饰，特别包括对期望缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一亚基和第二亚基)中的每一个所进行的单独修饰，其中该修饰彼此互补，以便促进两个Fc结构域亚基的缔合。例如，促进缔合的修饰可改变一个或两个Fc结构域亚基的结构或电荷，以分别使其在空间或静电上有利。因此，(杂)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽与包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，其就进一步融合到每个亚基(例如，抗原结合部分)的组分而言可能有所不同。在一些实施例中，促进缔合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在一个特定实施例中，促进缔合的修饰包括Fc结构域的两个亚基的每一个中的单独的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。
术语″效应子功能″，是指归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、抗原呈递细胞摄取的免疫复合物介导抗原、细胞表面受体(例如，B细胞受体)下调和B细胞活化。
如本文中所使用的术语″工程改造(engineer、engineered、engineering)″，被认为包括对肽主链的任何操作或天然存在的或重组的多肽或其片段的转译后修饰。工程改造包括修改氨基酸序列、糖基化模式或单个氨基酸的侧链基团，以及这些方法的组合。
如本文所用的术语″氨基酸突变″，意指涵盖氨基酸取代、缺失、***和修饰。可实施取代、缺失、***和修饰的任意组合以得到最终构建体，前提条件为最终构建体具有所需的特征，例如，与Fc受体的结合减少或与另一种肽的缔合增加。氨基酸序列缺失和***包括氨基酸的氨基和/或羧基末端的缺失和***。特定的氨基酸突变为氨基酸取代。为改变例如Fc区的结合特征，特别优选非保守氨基酸取代，即将一种氨基酸取代为具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸。氨基酸取代包括用二十种标准氨基酸的非天然存在的氨基酸或天然存在的氨基酸衍生物(例如，4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)取代。可使用本领域中熟知的遗传或化学方法产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。预期通过遗传工程以外的方法诸如化学修饰改变氨基酸的侧链基团的方法也可能有用。本文可使用多种名称指示同一氨基酸突变。例如，Fc结构域位置329处的脯氨酸取代为甘氨酸，可表示为329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
相对于参考多肽序列所述的″百分比(％)氨基酸残基同一性″，是指候选序列中氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比，在比对序列并引入差异后(如有必要)，可实现最大的序列同一性百分比，并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分。为确定氨基酸百分比序列同一性的目的而进行的比对可通过本领域中技术范围内的多种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包实现。本领域的技术人员可确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。但是，出于本文的目的，使用FASTA包36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序和BLOSUM50比较矩阵来生成％氨基酸序列同一性值。FASTA程序包由以下作者开发：W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)(″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″，PNAS 85：2444-2448)；W.R.Pearson(1996)(″Effective protein sequence comparison″Meth.Enzymol.266：227-258)；和Pearson等人(1997)(Genomics 46：24-36)，并可从以下网址公开获得：http：//fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml。可替代地，可使用通过http：//fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi进入的公用服务器，使用ggsearch(global protein：protein)程序和默认选项(BLOSUM50；open：-10；ext：-2；Ktup＝2)比较序列，以确保执行全局比对而不是局部比对。氨基酸同一性百分比提供于输出比对标题中。
术语″多核苷酸″，是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病毒来源的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如酰胺键，诸如肽核酸(PNA)中所见)。术语″核酸分子″，是指任何存在于多核苷酸中的一个或多个核酸片段，例如DNA或RNA片段。
″分离的″核酸分子或多核苷酸，是指已从其天然环境中分离出的核酸分子(DNA或RNA)。例如，就本发明而言，编码载体中所含的多肽的重组多核苷酸被视为是经分离。分离的多核苷酸的更多实例包括在异源性宿主细胞中保持的重组多核苷酸或溶液中经纯化的(部分或基本上)多核苷酸。分离的多核苷酸包括通常包含多核苷酸分子的细胞中所含的多核苷酸分子，但是多核苷酸分子存在于染色体外或与自然染色***置不同的染色***置。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录本，以及正链和负链形式和双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以为或可以包括调控组件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
″分离的多核苷酸(或核酸)编码[例如本发明的抗体或双抗体抗原结合分子]″是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种多核苷酸分子，包括在单个载体或单独抗体中的此类多核苷酸分子，并且此类核酸分子存在于宿主细胞中的一个或多个位置。
术语″表达盒″是指重组或合成产生的多核苷酸，其具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的特定核酸组件。重组表达盒可被引入质粒、染色体、粒线体DNA、色素体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分除其他序列外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，表达盒包含多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段。
术语″载体″或″表达载体″是指用于在细胞中引入并指导与其可操纵地连接的特定基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入该宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体转录大量稳定的mRNA。一旦表达载体进入细胞内部，由基因编码的核糖核酸分子或蛋白质即通过细胞转录和/或翻译机制而产生。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，该表达盒包含多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段。
术语″宿主细胞″、″宿主细胞系″和″宿主细胞培养物″可互换使用，是指已向其中引入外源性核酸的细胞，包括此类细胞的子代细胞。宿主细胞包括″转化子″和″转化细胞″，其包括原代转化细胞和由其衍生的子代细胞，而与传代次数无关。子代细胞的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变子代。宿主细胞为可用于产生本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞***。宿主细胞包括培养的细胞，例如培养的哺乳动物细胞，诸如HEK细胞、CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞等，还包括转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内的细胞。
″活化Fc受体″为在抗体的Fc结构域参与之后引起刺激受体携带细胞执行效应子功能的信号转导事件的Fc受体。人活化Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)为一种免疫机制，其导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞。靶细胞为抗体或其衍生物包含Fc区的细胞，其通常通过作为N末端的蛋白质部分与Fc区特异性结合。如本文中所使用的术语″减少ADCC″，是指通过上文定义的ADCC机制在给定时间内以靶细胞周围的培养基中给定浓度的抗体在给定时间内裂解的靶细胞数量的减少，和/或通过ADCC机制在给定时间内实现给定数量的靶细胞的裂解所需的靶细胞周围的培养基中抗体浓度的增加。ADCC的减少相对于使用相同标准生产、纯化、配制和储存方法(本技术领域中技术人员已知的方法)由相同类型的宿主细胞所生产的相同抗体(但尚未工程化)所介导的ADCC。例如，由Fc结构域中包含减少ADCC的氨基酸取代的抗体所介导的ADCC的减少为相对于在Fc结构域中不含此氨基酸取代的相同抗体所介导的ADCC。用于测量ADCC的合适的测定法为本技术领域中熟知的(参见例如PCT公开号WO 2006/082515或PCT公开号WO 2012/130831)。
药剂的″有效量″是指在其所施用的细胞或组织中引起生理变化所需的量。
药剂例如药物组合物的″治疗有效量″是指在所需的施用剂量和时间段内有效实现所需的治疗或预防效果的量。药剂的治疗有效量例如消除、减少、延迟、最小化或防止疾病的不良反应。
″个体″或″受试者″为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人类灵长类动物诸如猴)、兔以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。特别地，个体或受试者为人。
术语″药物组合物″是指以下制剂，其形式为允许其中所含的活性成分的生物活性有效，并且不含对组合物将施用的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。
″药用载体″是指药物组合物中除对受试者无毒的活性成分以外的成分。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文中所使用的″治疗″(及其语法变体，诸如″治疗过程″或″治疗中″)，是指试图改变受治疗个体的疾病自然病程的临床干预，并且可进行预防或在临床病理过程中执行。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态、缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的抗体或双特异性抗原结合分子用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。
术语″包装插页″用于指涉通常包含在治疗性产品的商业包装中的说明，该说明包含有关使用此类治疗性产品的适应症、用法、剂量、施用途径、联合治疗、禁忌症和/或警告等信息。
具体实施方式
本发明提供了与GPRC5D、特别是人GPRC5D结合的抗体和双特异性抗原结合分子。此外，该分子具有用于治疗应用的其他有利特性，例如关于有效性和/或安全性以及可生产性。
GPRC5D抗体
本发明的第一方面提供与GPRC5D结合的抗体，该抗体包含：(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：84的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ IDNO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；(ii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：85的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ IDNO：89的LCDR 3；(iii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；(iv)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：96的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；或(v)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：92的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3。
在一些实施例中，抗体为人源化抗体。在一个实施例中，VH为人源化VH和/或VL为人源化VL。在一个实施例中，该抗体包含如上述任一实施例所述的CDR，并且进一步包含人受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个特定实施例中，(i)VH包含与SEQ ID NO：13的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(ii)VH包含与SEQ ID NO：15的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ IDNO：16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(iii)VH包含与SEQ ID NO：48的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO：53的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(iv)VH包含与SEQ ID NO：49的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO：52的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(v)VH包含与SEQ ID NO：57的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ IDNO：64的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或(vi)VH包含与SEQ ID NO：58的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个特定实施例中，抗体包含：(i)VH，其与SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和VL，其与SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或(ii)VH，其与SEQ ID NO：15的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和VL，其与SEQ ID NO：16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或(iii)VH，其与SEQ ID NO：48的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和VL，其与SEQ ID NO：53的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或(iv)VH，其与SEQ ID NO：49的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和VL，其与SEQ ID NO：52的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或(v)VH，其与SEQ ID NO：57的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和VL，其与SEQ ID NO：64的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；或(vi)VH，其与SEQ ID NO：58的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和VL，其与SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在另一个实施例中，抗体为IgG，特别为IgG1抗体。在一个实施例中，抗体为全长抗体。在另一个实施例中，抗体为选自Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab′)2分子的抗体片段。在一个实施例中，抗体为多特异性抗体。
在某些实施例中，具有至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性的VH或VL序列包含相对于参考序列的取代(例如保守取代)、***或缺失，但是包含该序列的抗体保留与GPRC5D结合的能力。在某些实施例中，SEQ ID NO：13中共有1至10个氨基酸被取代、***和/或缺失；和/或SEQ ID NO：14中共有1至10个氨基酸被取代、***和/或缺失；和/或SEQ IDNO：15中共有1至10个氨基酸被取代、***和/或缺失；和/或SEQ ID NO：16中共有1至10个氨基酸被取代、***和/或缺失；和/或SEQ ID NO：48中共有1至10个氨基酸被取代、***和/或缺失；和/或SEQ ID NO：53中共有1至10个氨基酸被取代、***和/或缺失；和/或SEQ ID NO：49中共有1至10个氨基酸被取代、***和/或缺失；和/或SEQ ID NO：52中共有1至10个氨基酸被取代、***和/或缺失；和/或SEQ ID NO：57中共有1至10个氨基酸被取代、***和/或缺失；和/或SEQ ID NO：64中共有1至10个氨基酸被取代、***和/或缺失；和/或SEQ ID NO：58中共有1至10个氨基酸被取代、***和/或缺失；和/或SEQ ID NO：63中共有1至10个氨基酸被取代、***和/或缺失。
在某些实施例中，取代、***或缺失发生在HVR以外的区域(即，在FR中)。任选地，抗体包含SEQ ID NO：13中的VH序列和/或SEQ ID NO：14中的VL序列，其包括该序列的翻译后修饰。任选地，抗体包含SEQ ID NO：15中的VH序列和/或SEQ ID NO：16中的VL序列，其包括该序列的翻译后修饰。任选地，抗体包含SEQ ID NO：448中的VH序列和/或SEQ ID NO：53中的VL序列，其包括该序列的翻译后修饰。任选地，抗体包含SEQ ID NO：49中的VH序列和/或SEQ ID NO：52中的VL序列，其包括该序列的翻译后修饰。任选地，抗体包含SEQ ID NO：57中的VH序列和/或SEQ ID NO：64中的VL序列，其包括该序列的翻译后修饰。任选地，抗体包含SEQ ID NO：58中的VH序列和/或SEQ ID NO：63中的VL序列，其包括该序列的翻译后修饰。
在一个实施例中，抗体包含：VH，该VH包含选自SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15的氨基酸序列；和VL，该VL包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗体包含选自SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：12的组的VH序列以及SEQ ID NO：16的VL序列。
在一个特定实施例中，抗体包含：VH，该VH包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列；和VL，该VL包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一个特定实施例中，抗体包含SEQ ID NO：13的VH序列和SEQ ID NO：14的VL序列。
在一个特定实施例中，抗体包含：VH，该VH包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；和VL，该VL包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在一个特定实施例中，抗体包含SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：16的VL序列。
在一个特定实施例中，抗体包含：VH，该VH包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列；和VL，该VL包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列。在一个特定实施例中，抗体包含SEQ ID NO：48的VH序列和SEQ ID NO：53的VL序列。
在一个特定实施例中，抗体包含：VH，该VH包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列；和VL，该VL包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列。在一个特定实施例中，抗体包含SEQ ID NO：49的VH序列和SEQ ID NO：52的VL序列。
在一个特定实施例中，抗体包含：VH，该VH包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列；和VL，该VL包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列。在一个特定实施例中，抗体包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：64的VL序列。
在一个特定实施例中，抗体包含：VH，该VH包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列；和VL，该VL包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列。在一个特定实施例中，抗体包含SEQ ID NO：58的VH序列和SEQ ID NO：63的VL序列。
在一个实施例中，抗体包含人恒定区。在一个实施例中，抗体为包含人恒定区的免疫球蛋白分子，特别为包含人CH1、CH2、CH3和/或CL结构域的IgG类免疫球蛋白分子。人恒定结构域的示例性序列在SEQ ID NO 37和38(分别为人K和λCL结构域)以及SEQ ID NO：39(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施例中，抗体包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含与SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：39的氨基酸序列、特别是SEQ ID NO：38的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体包含重链恒定区，该重链恒定区包含与SEQ ID NO：39的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，如本文所述，重链恒定区可在Fc结构域中包含氨基酸突变。
在一个实施例中，抗体为单克隆抗体。
在一个实施例中，抗体为IgG，特别为IgG1抗体。在一个实施例中，抗体为全长抗体。
在一个实施例中，抗体包含Fc结构域，特别是IgG Fc结构域，更特别是IgG1 Fc结构域。在一个实施例中，Fc结构域为人Fc结构域。抗体的Fc结构域可单独或组合地结合本文中相对于本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域所述的任何特征。
在另一个实施例中，抗体为选自Fv分子、scFv分子、Fab分子和F(ab′)2分子、特别是Fab分子的抗体片段。在另一个实施例中，抗体片段为双功能抗体、三功能抗体或四功能抗体。
在另一方面，如以下部分所述，根据以上任一实施例所述的抗体可单独或组合地结合任何特征。
糖基化变体
在某些实施例中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体发生糖基化的程度。抗体中添加或缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以使得产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
当抗体包含Fc区时，可改变与其相连的寡糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支化的双天线型寡糖，其通常通过N键连接至Fc区CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等人TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸以及在双天线型寡糖结构的″茎″中连接至GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可对本发明的抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施例中，提供了具有非岩藻糖基化寡糖的抗体变体，即缺少(直接或间接地)连接至Fc区的岩藻糖的寡糖结构。此类非岩藻糖基化寡糖(也称为″去岩藻糖基化″寡糖)特别在双天线型寡糖结构的茎中缺少与第一GlcNAc连接的岩藻糖残基的N-连接寡糖。在一个实施例中，提供了与天然或亲本抗体相比在Fc区中具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体变体。例如，非岩藻糖基化寡糖的比例可以为至少约20％、至少约40％、至少约60％、至少约80％或甚至约100％(即不存在岩藻糖基化寡糖)。非岩藻糖基化寡糖的百分比是缺少岩藻糖残基的寡糖相对于连接至Asn 297(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的所有寡糖的总和的(平均)量，该百分比通过MALDI-TOF质谱法测得，例如WO 2006/082515中所述。Asn 297是指位于Fc区位置297附近的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；但是，Asn297也可以位于位置297上游或下游大约±3个氨基酸处，即由于抗体的微小序列变化而介于位置294和300之间。此类在Fc区中具有增加的比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体可具有改善的FcγRIIIa受体结合和/或改善的效应子功能，特别是改善的ADCC功能。参见例如US 2003/0157108；US 2004/0093621。
能够产生具有减少的岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；US 2003/0157108；和WO 2004/056312，尤其是在实例11中)；和敲除细胞系，诸如敲除α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614-622(2004)；Kanda，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；和WO2003/085107)；或GDP-岩藻糖合成或转运蛋白活性降低或消失的细胞(参见例如US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在另一个实施例中，抗体变体被提供有二等分的寡糖，例如，其中连接至抗体的Fc区的双天线型寡糖被GlcNAc平分。此类抗体变体可具有如上文所述的减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如：Umana等人，Nat Biotechnol 17，176-180(1999)；Ferrara等人，Biotechn Bioeng 93，851-861(2006)；WO 99/54342；WO2004/065540、WO 2003/011878。
还提供了在寡糖上具有至少一个连接至Fc区的半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087、WO 1998/58964和WO1999/22764中。
半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施例中，可能希望创建半胱氨酸工程化抗体，例如″thioMAb″，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代残基出现在抗体的可进入的位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此被定位在抗体的可进入的位点，并可用于使抗体与其他部分(例如药物部分或接头-药物部分)缀合，以形成免疫缀合物，如本文进一步所述。半胱氨酸工程化抗体可以如例如美国专利号7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130或WO2016040856所述来产生。
抗体衍生物
在某些实施例中，可进一步修饰本文所提供的抗体，以使其包含本技术领域中已知并且容易获得的附加的非蛋白质部分。适用于抗体的衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)以及右旋糖酐或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其水中的稳定性而可能在制造中具有优势。该聚合物可具有任何分子量，并且可以为支链聚合物或非支链聚合物。连接至抗体的聚合物的数量可以变化，并且如果连接的聚合物超过一种，则它们可以为相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可基于以下考虑因素来确定，这些考虑因素包括但不限于待改善的抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的疗法中，等等。
在另一个实施例中，提供了可通过暴露于辐射而选择性加热的抗体和非蛋白质部分的缀合物。在一个实施例中，非蛋白质部分为碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于不损害普通细胞但是将非蛋白质部分加热至接近抗体-非蛋白质部分的细胞被杀死的温度的波长。
免疫缀合物
本发明还提供了包含如本文所述的抗GPRC5D抗体的免疫缀合物，其缀合(化学键合)至一种或多种治疗剂，例如细胞毒性剂、化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如来源于细菌、真菌、植物或动物的蛋白毒素、酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。
在一个实施例中，免疫缀合物为抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与上述一种或多种治疗剂缀合。通常使用接头将抗体连接至一种或多种治疗剂。ADC技术的概述(包括治疗剂和药物和接头的实例)陈述于Pharmacol Review 68：3-19(2016)中。
在另一个实施例中，免疫缀合物包括缀合至酶活性毒素或其片段的本文所述的抗体，该酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来源于铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思子毒素A链、莫迪素A链、α-八迭球菌、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制因子、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、米托菌素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族毒素。
在另一个实施例中，免疫缀合物包含缀合至放射性原子以形成放射性缀合物的本文所述的抗体。在另一个实施例中，多种放射性同位素可用于产生放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可能包含用于闪烁显像研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，例如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
抗体和细胞毒性剂的缀合物可使用多种双功能蛋白偶联剂进行制备，该双功能蛋白偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚胺基硫烷(IT)、亚氨基酸酯的双功能衍生物(例如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(例如双琥珀酰亚胺辛二酸)、醛(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可按照Vitetta等人(Science 238：1098(1987))所述的方法进行制备。用于将放射性核苷酸缀合至抗体的一种示例性螯合剂为碳-14标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)。参见WO94/11026。接头可以为促进细胞中细胞毒性药物释放的″可切割接头″。例如，可使用酸不稳定的接头、对肽酶敏感的接头、光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等人，CancerRes.52：127-131(1992)；美国专利第5,208,020号)。
本文的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于此类用交联剂制得的缀合物，该交联剂包括但不限于可商购获得(例如从Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，IL.，U.S.A)商购获得)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)。
多特异性抗体
在某些实施例中，本文提供的抗体为多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体为对至少两个不同位点(即不同抗原上的不同表位或同一抗原上的不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中，多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。在某些实施例中，结合特异性之一为对GPRC5D的结合特异性，而其他(两种或更多种)特异性则为针对任何其他抗原。在某些实施例中，双特异性抗体可结合至GPRC5D的两个(或更多个)不同表位。多特异性(例如，双特异性)抗体也可用于将细胞毒性剂或细胞定位于表达GPRC5D的细胞。多特异性抗体可制成全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达两个具有不同特异性的免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein和Cuello，Nature 305：537(1983))和″杵臼″(knob-in-hole)工程(参见例如美国专利号5,731,168，和Atwell等人J.Mol.Biol.270：26(1997))。多特异性抗体也可通过以下方法进行制备：用于制备抗体Fc-异二聚体分子的工程静电转向效应(参见例如WO 2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980；和Brennan等人，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)；和WO 201I/034605)；使用常用轻链技术回避轻链错配问题(参见例如WO 98/50431)；使用″双功能抗体″技术制备双特异性抗体片段(参见例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人，J.Immunol.，152：5368(1994))；以及按照例如Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)所述的方法制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或更多个抗原结合位点的工程化抗体，包括例如″章鱼抗体″(Octopus antibodies)或DVD-Ig(参见例如WO 2001/77342和WO 2008/024715)。具有三个或更多个抗原结合位点的多特异性抗体的其他实例可参见WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2013/026831中。双特异性抗体或其抗原结合片段还包括″双重作用FAb″或″DAF″，其包含与GPRC5D以及另一种不同抗原或GPRC5D的两个不同表位结合的抗原结合位点(参见例如US 2008/0069820和WO 2015/095539)。
多特异性抗体也可提供为不对称形式，其包含在一个或多个具有相同抗原特异性的结合臂中交叉的结构域，即通过交换VH/VL结构域(参见例如WO 2009/080252和WO 2015/150447)、CH1/CL结构域(参见例如WO 2009/080253)或完整的Fab臂(参见例如WO 2009/080251、WO 2016/016299，另见Schaefer等人，PNAS，108(2011)1187-1191，和Klein等人，MAbs 8(2016)1010-20)实现。还可通过将带电荷或不带电荷的氨基酸突变引入结构域界面引导正确Fab配对，从而设计不对称的Fab臂。参见例如WO 2016/172485。
用于多特异性抗体的各种其他分子形式为本技术领域中已知的并且包括在本文中(参见例如Spiess等人，Mol Immunol 67(2015)95-106)。
还包括本文中的特定类型的多特异性抗体为双特异性抗体，该双特异性抗体被设计为同时结合至靶细胞(例如肿瘤细胞)上的表面抗原以及T细胞受体(TCR)复合物的活化不变组分(例如Cd3)，用于重定向T细胞以杀死靶细胞。因此，在某些实施例中，本文中提供的抗体为多特异性抗体，特别为双特异性抗体，其中结合特异性之一针对GPRC5D，并且另一种结合特异性则针对CD3。
可用于此目的的双特异性抗体形式包括但不限于所谓″BiTE″(bispecific Tcell engager)分子，其中两个scFv分子通过柔性接头融合(参见例如WO2004/106381、WO2005/061547、WO2007/042261和WO2008/119567；Nagorsen和
Figure BDA0003492360380000361
Exp Cell Res317，1255-1260(2011))；双功能抗体(Holliger等人，Prot Eng 9，299-305(1996))及其衍生物，诸如串联双功能抗体(″TandAb″；Kipriyanov等人，J Mol Biol 293，41-56(1999))；″DART″(双亲和重定向)分子，其基于双功能抗体形式，但具有C末端二硫键以供进一步稳定(Johnson等人，J Mol Biol 399，436-449(2010))，以及所谓triomab，它们为完整的小鼠/大鼠IgG杂合分子(参见Seimetz等人的综述：Cancer Treat Rev 36，458-467(2010))。本文所包括的特定T细胞双特异性抗体形式描述于：WO 2013/026833；WO2013/026839；WO 2016/020309；和Bacac等人Oncoimmunology 5(8)(2016)e1203498。
与GPRC5D和第二抗原结合的双特异性抗原结合分子
本发明还提供了一种双特异性抗原结合分子，即包含至少两个能够与两种不同抗原决定簇(第一抗原和第二抗原)特异性结合的抗原结合部分的抗原结合分子。
根据本发明的特定实施例，包含在双特异性抗原结合分子中的抗原结合部分为Fab分子(即，由重链和轻链组成的抗原结合结构域，其中每一个均包含可变结构域和恒定结构域)。在一个实施例中，第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分为Fab分子。在一个实施例中，所述Fab分子为人Fab分子。在一个特定实施例中，所述Fab分子为人源化分子。在另一个实施例中，所述Fab分子包含人重链和轻链恒定结构域。
优选地，抗原结合部分中的至少一个为交叉Fab分子。此类修饰减少了来自不同Fab分子的重链和轻链的错配，从而提高重组生产本发明的双特异性抗原结合分子的产率和纯度。在用于本发明的双特异性抗原结合分子的特定交叉Fab分子中，交换了Fab轻链和Fab重链(分别为VL和VH)的可变结构域。但是，即使采用此结构域交换，由于错配的重链和轻链之间的所谓Bence Jones型相互作用，双特异性抗原结合分子的制备也可能包含某些副产物(参见Schaefer等人，PNAS，108(2011)11187-11191)。为进一步减少来自不同Fab分子的重链和轻链的错配，从而提高所需的双特异性抗原结合分子的纯度和产率，可在与第一抗原(GPRC5D)结合的Fab分子或与第二抗原(例如活化T细胞抗原诸如CD3)结合的Fab分子的CH1和CL结构域中特定的氨基酸位置引入带相反电荷的氨基酸，如本文中进一步所述。可在双特异性抗原结合分子中包含的常规Fab分子(例如图1 A-C、G-J所示)或在VH/VL交叉Fab分子中包含的常规Fab分子(例如图1 D-F、K-N所示)中(但不是两者兼有)进行电荷修饰。在特定实施例中，在双特异性抗原结合分子中包含的常规Fab分子中进行电荷修饰(在特定实施例中，其与第一抗原即GPRC5D结合)。
在根据本发明的一个特定实施例中，双特异性抗原结合分子能够同时与第一抗原(即GPRC5D)和第二抗原(例如活化T细胞抗原，特别是CD3)结合。在一个实施例中，双特异性抗原结合分子能够通过同时结合GPRC5D和活化T细胞抗原以使T细胞与靶细胞交联。在更具体的实施例中，此类同时结合导致靶细胞、特别是表达GPRC5D的肿瘤细胞裂解。在一个实施例中，此类同时结合导致T细胞活化。在其他实施例中，此类同时结合导致T淋巴细胞、特别是细胞毒性T淋巴细胞的细胞应答，该细胞应答选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。在一个实施例中，双特异性抗原结合分子与活化T细胞抗原、特别是CD3结合，而非同时与GPRC5D结合，并不导致T细胞活化。
在一个实施例中，双特异性抗原结合分子能够将T细胞的细胞毒活性重定向至靶细胞。在一个特定实施例中，所述重定向不依赖于靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。
特别地，根据本发明的任何实施例的T细胞为细胞毒性T细胞。在一些实施例中，T细胞为CD4+或CD8+细胞，特别为CD8+ T细胞。
第一抗原结合部分
本发明的双特异性抗原结合分子包含至少一个与GPRC5D(第一抗原)结合的抗原结合部分(特别是Fab分子)。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合部分，其特别是与GPRC5D结合的Fab分子。在一个特定的此类实施例中，这些抗原结合部分中的每一个与相同的抗原决定簇结合。在更具体的实施例中，所有这些抗原结合部分均相同，即它们包含相同的氨基酸序列，该氨基酸序列包括如本文所述的CH1和CL结构域中的相同的氨基酸取代(如果有)。在一个实施例中，双特异性抗原结合分子包含不超过两个抗原结合部分，其特别是与GPRC5D结合的Fab分子。
在特定实施例中，与GPRC5D结合的抗原结合部分为常规Fab分子。在此类实施例中，与第二抗原结合的抗原结合部分为本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换的Fab分子。
在替代实施例中，与GPRC5D结合的抗原结合部分为本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换的Fab分子。在此类实施例中，与第二抗原结合的抗原结合部分为常规Fab分子。
GPRC5D结合部分能够将双特异性抗原结合分子引导至靶位点，例如引导至表达GPRC5D的特定类型的肿瘤细胞。
除非在科学上明显不合理或不可能，否则双特异性抗原结合分子的第一抗原结合部分可单独或组合结合本文相对于与GPRC5D结合的抗体所述的任何特征。
因此，本发明的一个方面提供了一种双特异性抗原结合分子，该双特异性抗原结合分子包含：(a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中该第一抗原为GPRC5D，并且该第一抗原结合部分包含重链可变区(VH)，该VH包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：84的HCDR2和SEQ ID NO：86的HCDR 3，和轻链可变区(VL)，该VL包含SEQ IDNO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；以及(b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分。本发明的另一方面提供了一种双特异性抗原结合分子，该双特异性抗原结合分子包含：(a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中该第一抗原为GPRC5D，并且该第一抗原结合部分包含重链可变区(VH)，该VH包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：85的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3，和轻链可变区(VL)，该VL包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；以及(b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分。本发明的另一方面提供了一种双特异性抗原结合分子，该双特异性抗原结合分子包含：(a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中该第一抗原为GPRC5D，并且该第一抗原结合部分包含重链可变区(VH)，该VH包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：91的HCDR 2和SEQ IDNO：93的HCDR 3，和轻链可变区(VL)，该VL包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；以及(b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分。本发明的另一方面提供了一种双特异性抗原结合分子，该双特异性抗原结合分子包含：(a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中该第一抗原为GPRC5D，并且该第一抗原结合部分包含重链可变区(VH)，该VH包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQID NO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3，和轻链可变区(VL)，该VL包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：96的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；以及(b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分。本发明的另一方面提供了一种双特异性抗原结合分子，该双特异性抗原结合分子包含：(a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中该第一抗原为GPRC5D，并且该第一抗原结合部分包含重链可变区(VH)，该VH包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：92的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3，和轻链可变区(VL)，该VL包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ IDNO：97的LCDR 3；以及(b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分。本发明的另一方面提供了一种双特异性抗原结合分子，该双特异性抗原结合分子包含：(a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中该第一抗原为GPRC5D，并且该第一抗原结合部分包含重链可变区(VH)，该VH包含SEQ ID NO：1的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：2的HCDR 2和SEQ ID NO：3的HCDR 3，和轻链可变区(VL)，该VL包含SEQ ID NO：4的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：5的LCDR 2和SEQ ID NO：6的LCDR 3；以及(b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分。本发明的另一方面提供了一种双特异性抗原结合分子，该双特异性抗原结合分子包含：(a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中该第一抗原为GPRC5D，并且该第一抗原结合部分包含重链可变区(VH)，该VH包含SEQ ID NO：7的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：8的HCDR 2和SEQ ID NO：9的HCDR 3，和轻链可变区(VL)，该VL包含SEQ ID NO：10的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：11的LCDR 2和SEQ ID NO：12的LCDR 3；以及(b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分。
在一些实施例中，第一抗原结合部分为(来源于)人源化抗体。在一个实施例中，VH为人源化VH和/或VL为人源化VL。在一个实施例中，第一抗原结合部分包含如上述任一实施例所述的CDR，并且进一步包含人受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个实施例中，第一抗原结合部分的VH包含与选自SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且第一抗原结合部分的VL包含与选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：63和SEQID NO：64的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，第一抗原结合部分包含与选自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH序列，以及与选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VL序列。
在一个实施例中，第一抗原结合部分包含：VH，其包含选自SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58的组的氨基酸序列；和VL，其包含选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64的组的氨基酸序列。
在一个实施例中，第一抗原结合部分包含选自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58的组的VH序列以及选自SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64的组的VL序列。
在一个特定实施例中，第一抗原结合部分包含：VH，该VH包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列；和VL，该VL包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一个特定实施例中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO：13的VH序列和SEQ ID NO：14的VL序列。
在一个特定实施例中，第一抗原结合部分包含：VH，该VH包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；和VL，该VL包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在一个特定实施例中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：16的VL序列。
在一个特定实施例中，第一抗原结合部分包含：VH，该VH包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列；和VL，该VL包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列。在一个特定实施例中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO：48的VH序列和SEQ ID NO：53的VL序列。
在一个特定实施例中，第一抗原结合部分包含：VH，该VH包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列；和VL，该VL包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列。在一个特定实施例中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO：49的VH序列和SEQ ID NO：52的VL序列。
在一个特定实施例中，第一抗原结合部分包含：VH，该VH包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列；和VL，该VL包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列。在一个特定实施例中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：64的VL序列。
在一个特定实施例中，第一抗原结合部分包含：VH，该VH包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列；和VL，该VL包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列。在一个特定实施例中，第一抗原结合部分包含SEQ ID NO：58的VH序列和SEQ ID NO：63的VL序列。在一个实施例中，第一抗原结合部分包含人恒定区。在一个实施例中，第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含人恒定区，特别是人CH1和/或CL结构域。人恒定结构域的示例性序列在SEQ ID NO 37和38(分别为人κ和λCL结构域)以及SEQ ID NO：39(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施例中，第一抗原结合部分包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含与SEQ ID NO：37或SEQID NO：38的氨基酸序列、特别是SEQ ID NO：37的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，轻链恒定区可包含如本文在″电荷修饰″下所述的氨基酸突变，和/或可在交叉Fab分子中包含一个或多个(特别是两个)N末端氨基酸的缺失或取代。在一些实施例中，第一抗原结合部分包含重链恒定区，该重链恒定区包含与包含在SEQ ID NO：39的氨基酸序列中的CH1结构域序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，重链恒定区(特别是CH1结构域)可包含如本文在″电荷修饰″下所述的氨基酸突变。
第二抗原结合部分
本发明的双特异性抗原结合分子包含至少一个抗原结合部分，特别是与第二抗原(不同于GPRC5D)结合的Fab分子。
在特定实施例中，与第二抗原结合的抗原结合部分为本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换的Fab分子。在此类实施例中，与第一抗原(即GPRC5D)结合的抗原结合部分优选为常规Fab分子。在其中存在一个以上与双特异性抗原结合分子中包含的GPRC5D结合的抗原结合部分特别是Fab分子的实施例中，与第二抗原结合的抗原结合部分优选的为交叉Fab分子，并且与GPRC5D结合的抗原结合部分为常规Fab分子。
在替代实施例中，与第二抗原结合的抗原结合部分为常规Fab分子。在此类实施例中，与第一抗原(即GPRC5D)结合的抗原结合部分为本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL彼此交换/替换的Fab分子。在其中存在一个以上与双特异性抗原结合分子中包含的第二抗原结合的抗原结合部分特别是Fab分子的实施例中，与GPRC5D结合的抗原结合部分优选的为交叉Fab分子，并且与第二抗原结合的抗原结合部分为常规Fab分子。
在一些实施例中，第二抗原为活化T细胞抗原(在本文中也称为″活化T细胞抗原结合部分或活化T细胞抗原结合Fab分子″)。在一个特定实施例中，双特异性抗原结合分子包含能够特异性结合至活化T细胞抗原的不超过一个抗原结合部分。在一个实施例中，双特异性抗原结合分子提供与活化T细胞抗原的单价结合。
在特定实施例中，第二抗原为CD3，特别为人CD3(SEQ ID NO：40)或食蟹猴CD3(SEQID NO：41)，并且最特别为人CD3。在一个实施例中，第二抗原结合部分与人和食蟹猴CD3交叉反应(即与之特异性结合)。在一些实施例中，第二抗原为CD3的ε亚基(CD3ε)。
在一个实施例中，第二抗原结合部分包含SEQ ID NO：29的HCDR 1、SEQ ID NO：30的HCDR 2、SEQ ID NO：31的HCDR 3、SEQ ID NO：32的LCDR 1、SEQ ID NO：33的LCDR 2和SEQID NO：34的LCDR 3。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含：VH，其包含SEQ ID NO：29的HCDR 1、SEQ ID NO：30的HCDR 2和SEQ ID NO：31的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO：32的LCDR 1、SEQ ID NO：33的LCDR 2和SEQ ID NO：34的LCDR 3。在一些实施例中，第二抗原结合部分为(来源于)人源化抗体。在一个实施例中，VH为人源化VH和/或VL为人源化VL。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含如上述任一实施例所述的CDR，并且进一步包含人受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含与SEQID NO：35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH序列。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VL序列。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH序列以及与SEQ IDNO：36的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VL序列。在一个实施例中，第二抗原结合部分的VH包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且第二抗原结合部分的VL包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含：VH，该VH包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列；和VL，该VL包含SEQID NO：36的氨基酸序列。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含SEQ ID NO：35的VH序列和SEQ ID NO：36的VL序列。
在一个实施例中，第二抗原结合部分包含SEQ ID NO：98的HCDR 1、SEQ ID NO：99的HCDR 2、SEQ ID NO：100的HCDR 3、SEQ ID NO：101的LCDR 1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含：VH，其包含SEQ ID NO：98的HCDR 1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和VL，其包含SEQ ID NO：101的LCDR 1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3。在一些实施例中，第二抗原结合部分为(来源于)人源化抗体。在一个实施例中，VH为人源化VH和/或VL为人源化VL。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含如上述任一实施例所述的CDR，并且进一步包含人受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含与SEQ ID NO：104的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH序列。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含与SEQ ID NO：105的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VL序列。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含与SEQ ID NO：104的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH序列以及与SEQ ID NO：105的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VL序列。在一个实施例中，第二抗原结合部分的VH包含与SEQ ID NO：104的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且第二抗原结合部分的VL包含与SEQ ID NO：105的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含：VH，该VH包含SEQ ID NO：104的氨基酸序列；和VL，该VL包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含SEQ ID NO：104的VH序列和SEQ ID NO：105的VL序列。
在一个实施例中，第二抗原结合部分包含SEQ ID NO：106的HCDR 1、SEQ ID NO：107的HCDR 2、SEQ ID NO：108的HCDR 3、SEQ ID NO：109的LCDR 1、SEQ ID NO：110的LCDR 2和SEQ ID NO：111的LCDR 3。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含：VH，其包含SEQ IDNO：106的HCDR 1、SEQ ID NO：107的HCDR 2和SEQ ID NO：108的HCDR 3；和VL，其包含SEQ IDNO：109的LCDR 1、SEQ ID NO：110的LCDR 2和SEQ ID NO：111的LCDR 3。
在一些实施例中，第二抗原结合部分为(来源于)人源化抗体。在一个实施例中，VH为人源化VH和/或VL为人源化VL。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含如上述任一实施例所述的CDR，并且进一步包含人受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含与SEQ ID NO：112的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH序列。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含与SEQ ID NO：113的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VL序列。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含与SEQ ID NO：112的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH序列以及与SEQ ID NO：113的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VL序列。在一个实施例中，第二抗原结合部分的VH包含与SEQ IDNO：112的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且第二抗原结合部分的VL包含与SEQ ID NO：113的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含：VH，该VH包含SEQ ID NO：112的氨基酸序列；和VL，该VL包含SEQ ID NO：113的氨基酸序列。在一个实施例中，第二抗原结合部分包含SEQ ID NO：112的VH序列和SEQ ID NO：113的VL序列。
在一个实施例中，第二抗原结合部分包含人恒定区。在一个实施例中，第二抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含人恒定区，特别是人CH1和/或CL结构域。人恒定结构域的示例性序列在SEQ ID NO 37和38(分别为人κ和λCL结构域)以及SEQ ID NO：39(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施例中，第二抗原结合部分包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含与SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38的氨基酸序列、特别是SEQ ID NO：37的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，轻链恒定区可包含如本文在″电荷修饰″下所述的氨基酸突变，和/或可在交叉Fab分子中包含一个或多个(特别是两个)N末端氨基酸的缺失或取代。在一些实施例中，第二抗原结合部分包含重链恒定区，该重链恒定区包含与包含在SEQ ID NO：39的氨基酸序列中的CH1结构域序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，重链恒定区(特别是CH1结构域)可包含如本文在″电荷修饰″下所述的氨基酸突变。
在一些实施例中，第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1、特别是可变结构域VL和VH彼此取代(即根据此类实施例，第二抗原结合部分为交叉Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域或恒定结构域发生交换)。在一个此类实施例中，第一(和第三，如果有)抗原结合部分为常规Fab分子。
在一个实施例中，双特异性抗原结合分子中存在不多于一个与第二抗原(例如活化T细胞抗原，例如CD3)结合的抗原结合部分(即双特异性抗原结合分子提供与第二抗原的单价结合)。
电荷修饰
本发明的双特异性抗原结合分子可在其中所包含的Fab分子中包含氨基酸取代，其特别有效地减少轻链与不匹配重链的错配(Bence-Jones型副产物)，该错配可能发生在基于Fab的双/多特异性抗原结合分子的制备中，其中在其结合臂的一个(或多个，如果分子包含两个以上的抗原结合Fab分子)中发生VH/VL交换(另见PCT公开号WO 2015/150447，特别是其中的实施例，其全部内容以引用方式并入本文)。所需的双特异性抗原结合分子与不希望的副产物、特别是在其结合臂的一中具有VH/VL结构域交换的双特异性抗原结合分子中发生的Bence Jones型副产物的比率可通过在CH1和CL结构域的特定氨基酸位置引入带有相反电荷的氨基酸来改善(有时在本文中称为″电荷修饰″)。
因此，在一些实施例中，其中双特异性抗原结合分子的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分均为Fab分子，并且在抗原结合部分之一(特别是第二抗原结合部分)中，Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，
i)在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被带正电荷的氨基酸(根据Kabat编号)取代，并且其中在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸被带负电荷的氨基酸(根据Kabat EU索引编号)取代；或
ii)在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被带正电荷的氨基酸(根据Kabat编号)取代，并且其中在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸被带负电荷的氨基酸(根据Kabat EU索引编号)取代。
双特异性抗原结合分子不包含i)和ii)下所述的两种修饰。具有VH/VL交换的抗原结合部分的恒定结构域CL和CH1未彼此取代(即保留未交换状态)。
在一个更具体的实施例中，
i)在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代；或
ii)在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代，并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代。
在一个此类实施例中，在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代。
在另一个实施例中，在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代。
在一个特定实施例中，在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据KabatEU索引编号)独立地取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据KabatEU索引编号)独立地取代。
在一个更特定的实施例中，在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据KabatEU索引编号)取代。
在一个甚至更特定的实施例中，在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代。
在特定实施例中，如果根据上述实施例的氨基酸取代发生在第一抗原结合部分的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中，则第一抗原结合部分的恒定结构域CL为κ同种型。
可替代地，根据上述实施例的氨基酸取代可发生在第二抗原结合部分的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中，而不是第一抗原结合部分的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中。在特定的此类实施例中，第二抗原结合部分的恒定结构域CL为κ同种型。
因此，在一个实施例中，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代，并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代。
在另一个实施例中，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代，并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代。
在另一个实施例中，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代，并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据KabatEU索引编号)独立地取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据KabatEU索引编号)独立地取代。
在一个实施例中，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代。
在另一个实施例中，在第二抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代，并且在第二抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代。
在一个特定实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D，并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含重链可变区(VH)，该VH包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：84的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3，和轻链可变区(VL)，该VL包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；以及
(b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代；
其中在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代(在一个特定实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代(在一个特定实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代。
在一个特定实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D，并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含重链可变区(VH)，该VH包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：85的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3，和轻链可变区(VL)，该VL包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；以及
(b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代；
其中在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代(在一个特定实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代(在一个特定实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代。
在一个特定实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D，并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含重链可变区(VH)，该VH包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：85的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3，和轻链可变区(VL)，该VL包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；以及
(b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代；
其中在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代(在一个特定实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代(在一个特定实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代。
在一个特定实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D，并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含重链可变区(VH)，该VH包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3，和轻链可变区(VL)，该VL包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；以及
(b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代；
其中在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代(在一个特定实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代(在一个特定实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代。
在一个特定实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D，并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含重链可变区(VH)，该VH包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3，和轻链可变区(VL)，该VL包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：96的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；以及
(b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代；
其中在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代(在一个特定实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代(在一个特定实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代。
在一个特定实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D，并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含重链可变区(VH)，该VH包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：92的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3，和轻链可变区(VL)，该VL包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；以及
(b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代；
其中在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代(在一个特定实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代(在一个特定实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代。
在一个特定实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D，并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含重链可变区(VH)，该VH包含SEQ ID NO：1的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：2的HCDR 2和SEQ ID NO：3的HCDR3，和轻链可变区(VL)，该VL包含SEQ ID NO：4的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：5的LCDR 2和SEQ ID NO：6的LCDR 3；以及
(b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代；
其中在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代(在一个特定实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代(在一个特定实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代。
在一个特定实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含
(a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D，并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含重链可变区(VH)，该VH包含SEQ ID NO：7的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：8的HCDR 2和SEQ ID NO：9的HCDR 3，和轻链可变区(VL)，该VL包含SEQ ID NO：10的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：11的LCDR 2和SEQ ID NO：12的LCDR 3；以及
(b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代；
其中在第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代(在一个特定实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代(在一个特定实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，并且在第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代。
双特异性抗原结合分子形式
根据本发明的双特异性抗原结合分子的组分可在各种构型中彼此融合。示例性构型如图1A-Z所示。
在特定实施例中，双特异性抗原结合分子中所包含的抗原结合部分为Fab分子。在此类实施例中，第一抗原结合部分、第二抗原结合部分、第三抗原结合部分等在本文中可分别称为地第一Fab分子、第二Fab分子、第三Fab分子等。
在一个实施例中，双特异性抗原结合分子的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分彼此融合，任选地经由肽接头彼此融合。在特定实施例中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自为Fab分子。在一个此类实施例中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在另一个此类实施例中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。另外，在其中(i)第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合或(ii)第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合的实施例中，第一抗原结合部分的Fab轻链可与第二抗原结合部分的Fab轻链彼此融合，任选地，可通过肽接头融合。
可使用能够与靶细胞抗原(诸如GPRC5D)特异性结合的具有单个抗原结合部分(诸如Fab分子)的双特异性抗原结合分子(例如，如图1A、1D、1G、1H、1K、1L所示)，特别是在预期高亲和力抗原结合部分结合后靶细胞抗原发生内化的情况下。在此类情况下，针对特定靶细胞抗原的一种以上的抗原结合部分的存在可增强靶细胞抗原的内化，从而降低其可用性。
但是，在其他情况下，具有包含两个或更多个针对特定靶细胞抗原的抗原结合部分(诸如Fab分子)的双特异性抗原结合分子(例如，如图1B、1C、1E、1F、1I、1J、1M或1N所示)将为有利的，例如有利于优化对靶标的靶向或使靶细胞抗原交联。
因此，在特定实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含第三抗原结合部分。
在一个实施例中，第三抗原结合部分与第一抗原即GPRC5D结合。在一个实施例中，第三抗原结合部分为Fab分子。
在一个实施例中，第三抗原部分与第一抗原结合部分相同。
除非在科学上明显不合理或不可能，否则双特异性抗原结合分子的第三抗原结合部分可单独或组合结合本文相对于与GPRC5D结合的第一抗原结合部分和/或抗体所述的任何特征。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：84的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ IDNO：89的LCDR 3。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：85的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ IDNO：89的LCDR 3。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ IDNO：97的LCDR 3。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：96的LCDR 2和SEQ IDNO：97的LCDR 3。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：92的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ IDNO：97的LCDR 3。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：1的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：2的HCDR 2和SEQ ID NO：4的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：5的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：6的LCDR 2和SEQ ID NO：7的LCDR 3。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：7的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：8的HCDR 2和SEQ ID NO：9的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：10的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：11的LCDR 2和SEQ IDNO：12的LCDR 3。
在一些实施例中，第三抗原结合部分为(来源于)人源化抗体。在一个实施例中，VH为人源化VH和/或VL为人源化VL。在一个实施例中，第三抗原结合部分包含如上述任一实施例所述的CDR，并且进一步包含人受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
在一个实施例中，第三抗原结合部分的VH包含与选自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且第三抗原结合部分的VL包含与选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：63和SEQID NO：64的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含：VH序列，其与选自SEQ ID NO：13、SEQID NO：15、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同；和VL序列，其与选自SEQ ID NO：14、SEQID NO：16、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64的组的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含：VH，其包含选自SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58的组的氨基酸序列；和VL，其包含选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64的组的氨基酸序列。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含选自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58的组的VH序列以及选自SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64的组的VL序列。
在一个特定实施例中，第三抗原结合部分包含：VH，其包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在一个特定实施例中，第三抗原结合部分包含SEQ ID NO：13的VH序列和SEQ ID NO：14的VL序列。
在一个特定实施例中，第三抗原结合部分包含：VH，其包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在一个特定实施例中，第三抗原结合部分包含SEQ ID NO：15的VH序列和SEQ ID NO：16的VL序列。
在一个特定实施例中，第三抗原结合部分包含：VH，其包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列。在一个特定实施例中，第三抗原结合部分包含SEQ ID NO：48的VH序列和SEQ ID NO：53的VL序列。
在一个特定实施例中，第三抗原结合部分包含：VH，其包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列。在一个特定实施例中，第三抗原结合部分包含SEQ ID NO：49的VH序列和SEQ ID NO：52的VL序列。
在一个特定实施例中，第三抗原结合部分包含：VH，其包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列。在一个特定实施例中，第三抗原结合部分包含SEQ ID NO：57的VH序列和SEQ ID NO：64的VL序列。
在一个特定实施例中，第三抗原结合部分包含：VH，其包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列。在一个特定实施例中，第三抗原结合部分包含SEQ ID NO：58的VH序列和SEQ ID NO：63的VL序列。
在一个实施例中，第三抗原结合部分包含人恒定区。在一个实施例中，第三抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含人恒定区，特别是人CH1和/或CL结构域。人恒定结构域的示例性序列在SEQ ID NO 37和38(分别为人K和λCL结构域)以及SEQ ID NO：39(人IgG1重链恒定结构域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施例中，第三抗原结合部分包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含与SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38的氨基酸序列、特别是SEQ ID NO：37的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，轻链恒定区可包含如本文在″电荷修饰″下所述的氨基酸突变，和/或可在交叉Fab分子中包含一个或多个(特别是两个)N末端氨基酸的缺失或取代。在一些实施例中，第三抗原结合部分包含重链恒定区，该重链恒定区包含与包含在SEQ ID NO：39的氨基酸序列中的CH1结构域序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。特别地，重链恒定区(特别是CH1结构域)可包含如本文在″电荷修饰″下所述的氨基酸突变。
在特定实施例中，第三和第一抗原结合部分各自为Fab分子，并且第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同。因此，在这些实施例中，第一抗原结合部分和第三抗原结合部分包含相同的重链和轻链氨基酸序列，并且具有相同排列的结构域(即常规或交叉)。此外，在这些实施例中，第三抗原结合部分包含与第一抗原结合部分相同的氨基酸取代(如果有)。例如，本文所述的″电荷修饰″氨基酸取代将在第一抗原结合部分和第三抗原结合部分中的每一者的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行。可替代地，所述氨基酸取代可在第二抗原结合部分(其在特定实施例中也为Fab分子)的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行，但是不在第一抗原结合部分和第三抗原结合部分的恒定结构域CL和恒定结构域CH1中进行。
与第一抗原结合部分类似，第三抗原结合部分特别是常规Fab分子。但是，也可以设想其中第一抗原结合部分和第三抗原结合部分为交叉Fab分子(并且第二抗原结合部分为常规Fab分子)的实施例。因此，在特定实施例中，第一抗原结合部分和第三抗原结合部分各自为常规Fab分子，并且第二抗原结合部分为本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换的Fab分子。在其他实施例中，第一抗原结合部分和第三抗原结合部分各自为交叉Fab分子，并且第二抗原结合部分为常规Fab分子。
如果存在第三抗原结合部分，在一个特定实施例中，第一抗原部分和第三抗原部分与GPRC5D结合，并且第二抗原结合部分与第二抗原、特别是活化T细胞抗原、更特别是CD3、最特别是CD3ε结合。
在特定实施例中，双特异性抗原结合分子包含Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基构成。Fc结构域的第一亚基和第二亚基能够稳定缔合。
根据本发明的双特异性抗原结合分子可具有不同的构型，即第一抗原结合部分、第二抗原结合部分(和任选地第三抗原结合部分)可彼此融合并以不同方式与Fc结构域融合。这些成分可直接彼此融合或优选地通过一个或多个合适的肽接头融合。在Fab分子与Fc结构域的亚基的N末端融合的情况下，其通常通过免疫球蛋白铰链区融合。
在一些实施例中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自为Fab分子，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基或第二亚基的N末端融合。在此类实施例中，第一抗原结合部分可在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端或Fc结构域的亚基中另一个的N末端融合。在特定的此类实施例中，所述第一抗原结合部分为常规Fab分子，并且第二抗原结合部分为本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换的Fab分子。在其他此类实施例中，所述第一Fab分子为交叉Fab分子，并且第二Fab分子为常规Fab分子。
在一个实施例中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自为Fab分子，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基或第二亚基的N末端融合，并且第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个具体实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一Fab分子和第二Fab分子组成，Fc结构域由第一亚基和第二亚基以及任选的一个或多个肽接头构成，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端与第二Fab分子的Fab重链的N末端融合，并且第二Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。图1G和图1K中示意性地描述了这种构型(在这些实例中，第二抗原结合结构域为VH/VL交叉Fab分子)。另外，任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可彼此融合。
在另一个实施例中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自为Fab分子，并且第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。在一个具体实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一Fab分子和第二Fab分子组成，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基以及任选的一个或多个肽接头构成，其中第一Fab分子和第二Fab分子各自在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。图1A和图1D中示意性地描绘了这种构型(在这些实例中，第二抗原结合结构域为VH/VL交叉Fab分子并且第一抗原结合部分为常规Fab分子)。第一Fab分子和第二Fab分子可直接或通过肽接头与Fc结构域融合。在一个特定实施例中，第一Fab分子和第二Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在一个具体实施例中，免疫球蛋白铰链区为人IgG1铰链区，特别地，其中Fc结构域为IgG1 Fc结构域。
在一些实施例中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自为Fab分子，并且第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基或第二亚基的N末端融合。在此类实施例中，第二抗原结合部分可在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端或(如上文所述)Fc结构域的亚基中另一个的N末端融合。在特定的此类实施例中，所述第一抗原结合部分为常规Fab分子，并且第二抗原结合部分为本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换的Fab分子。在其他此类实施例中，所述第一Fab分子为交叉Fab分子，并且第二Fab分子为常规Fab分子。
在一个实施例中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自为Fab分子，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基或第二亚基的N末端融合，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个具体实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一Fab分子和第二Fab分子组成，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基以及任选的一个或多个肽接头构成，其中第二Fab分子在Fab重链的C末端与第一Fab分子的Fab重链的N末端融合，并且第一Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。图1H和图1L中示意性描绘了这种构型(在这些实例中，第二抗原结合结构域为VH/VL交叉Fab分子并且第一抗原结合部分为常规Fab分子)。另外，任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可彼此融合。
在一些实施例中，第三抗原结合部分特别是第三Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基或第二亚基的N末端融合。在特定的此类实施例中，所述第一Fab分子和第三Fab分子各自为常规Fab分子，并且第二Fab分子为本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换的Fab分子。在其他此类实施例中，所述第一Fab分子和第三Fab分子各自为交叉Fab分子，并且第二Fab分子是常规Fab分子。
在一个特定的此类实施例中，第二抗原结合部分和第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合，并且第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个具体实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一Fab分子、第二Fab分子和第三Fab分子组成，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基以及任选的一个或多个肽接头构成，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端与第二Fab分子的Fab重链的N末端融合，并且第二Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基的N末端融合，并且其中第三Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的第二亚基的N末端融合。图1B和图1E(在这些实例中，第二抗原结合部分为VH/VL交叉Fab分子，并且第一抗原结合部分和第三抗原结合部分为常规Fab分子)以及图1J和1N(在这些实例中，第二抗原结合部分为常规Fab分子，并且第一抗原结合部分和第三抗原结合部分为VH/VL交叉Fab分子)中示意性描绘了这种构型。第二Fab分子和第三Fab分子可直接或通过肽接头与Fc结构域融合。在一个特定实施例中，第二Fab分子和第三Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在一个具体实施例中，免疫球蛋白铰链区为人IgG1铰链区，特别地，其中Fc结构域为IgG1 Fc结构域。另外，任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可彼此融合。
在另一个此类实施例中，第一抗原结合部分和第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个具体实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一Fab分子、第二Fab分子和第三Fab分子组成，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基以及任选的一个或多个肽接头构成，其中第二Fab分子在Fab重链的C末端与第一Fab分子的Fab重链的N末端融合，并且第一Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一亚基的N末端融合，并且其中第三Fab分子在Fab重链的C末端与Fc结构域的第二亚基的N末端融合。图1C和图1F(在这些实例中，第二抗原结合部分为VH/VL交叉Fab分子，并且第一和第三抗原结合部分为常规Fab分子)以及图1I和1M(在这些实例中，第二抗原结合部分为常规Fab分子，并且第一抗原结合部分和第三抗原结合部分为VH/VL交叉Fab分子)中示意性描绘了这种构型。第一Fab分子和第三Fab分子可直接或通过肽接头与Fc结构域融合。在一个特定实施例中，第一Fab分子和第三Fab分子各自通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在一个具体实施例中，免疫球蛋白铰链区为人IgG1铰链区，特别地，其中Fc结构域为IgG1 Fc结构域。另外，任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可彼此融合。
在其中Fab分子在Fab重链的C末端通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域的亚基的N末端融合的双特异性抗原结合分子的构型中，铰链区和Fc结构域基本上形成免疫球蛋白分子。在一个特别实施例中，免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白。在更具体的实施例中，免疫球蛋白为IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施例中，免疫球蛋白为IgG4亚类免疫球蛋白。在另一个特定实施例中，免疫球蛋白为人免疫球蛋白。在其他实施例中，免疫球蛋白为嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一个实施例中，免疫球蛋白包含人恒定区，特别是人Fc区。
在本发明的一些双特异性抗原结合分子中，第一Fab分子的Fab轻链与第二Fab分子的Fab轻链彼此融合，任选地，可通过肽接头融合。根据第一Fab分子和第二Fab分子的构型不同，第一Fab分子的Fab轻链可在其C末端与第二Fab分子的Fab轻链融合，或第二Fab分子的Fab轻链可在其C末端与第一Fab分子的Fab轻链融合。第一Fab分子和第二Fab分子的Fab轻链的融合进一步减少了Fab重链与轻链的错配，并且还减少了表达本发明的某些双特异性抗原结合分子所需的质粒数量。
抗原结合部分可融合至Fc结构域或直接彼此融合，或者通过肽接头融合，该肽接头包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸。肽接头为本领域中所公知的并且如本文所述。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头。″N″通常为1至10的整数，特别为2至4。在一个实施例中，所述肽接头的长度为至少5个氨基酸；在一个实施例中，长度为5至100个氨基酸；在另一个实施例中，长度为10至50个氨基酸。在一个实施例中，所述肽接头为(GxS)n或(GxS)nGm其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，并且(x＝3，n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3)或(x＝4，n＝2、3、4或5，并且m＝0、1、2或3)，在另一个实施例中，x＝4并且n＝2。在一个实施例中，所述肽接头为(G4S)2。一种用于使第一Fab分子和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合的特别合适的肽接头为(G4S)2。一种适用于连接第一Fab片段和第二Fab片段的Fab重链的示例性肽接头包含序列(D)-(G4S)2(SEQ ID NO 43和44)。另一个合适的此类接头包含序列(G4S)4。另外，接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，在其中Fab分子与Fc结构域亚基的N末端融合的情况下，可通过包含附加的肽接头或不含附加的肽接头的免疫球蛋白铰链区或其一部分融合。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含：多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，其继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))；和多肽，其中第一Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CHl(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含：多肽，其中第二Fab分子(VH(2)-CL(2))的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键；以及第一Fab分子(VL(1)-CL(1))的Fab轻链多肽。在某些实施例中，多肽通过例如二硫键共价连接。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含：多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，其继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4))；和多肽，其中第一Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含：多肽，其中第二Fab分子(VL(2)-CH1(2)的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键；以及第一Fab分子(VL(1)-CL(1))的Fab轻链多肽。在某些实施例中，多肽通过例如二硫键共价连接。
在一些实施例中，双特异性抗原结合分子包含多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，其继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，其继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在其他实施例中，双特异性抗原结合分子包含多肽，其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，其继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，其继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。
在这些实施例的一些中，双特异性抗原结合分子进一步包含：第二Fab分子(VH(2)-CL(2))的交叉Fab轻链多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键；和第一Fab分子(VL(1)-CL(1))的Fab轻链多肽。在这些实施例的另一些中，双特异性抗原结合分子进一步包含：多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键，其继而与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VL(1)-CL(1))；或多肽，其中第一Fab分子的Fab轻链多肽与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，其继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2))(在适当情况下)。
根据这些实施例的双特异性抗原结合分子可进一步包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)多肽，其中第三Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))，和第三Fab分子(VL(3)-CL(3))的Fab轻链多肽。在某些实施例中，多肽通过例如二硫键共价连接。
在一些实施例中，双特异性抗原结合分子包含多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，其继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，其继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在其他实施例中，双特异性抗原结合分子包含多肽，其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，其继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，其继而与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4))。
在这些实施例的一些中，双特异性抗原结合分子进一步包含：第二Fab分子(VL(2)-CH1(2))的交叉Fab轻链多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键；和第一Fab分子(VL(1)-CL(1))的Fab轻链多肽。在这些实施例的另一些中，双特异性抗原结合分子进一步包含：多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键，其继而与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1))；或多肽，其中第一Fab分子的Fab轻链多肽与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，其继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VL(1)-CL(1)-VL(2)-CH1(2))(在适当情况下)。
根据这些实施例的双特异性抗原结合分子可进一步包含(i)Fc结构域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)多肽，其中第三Fab分子的Fab重链与Fc结构域亚基共享羧基末端肽键(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))，和第三Fab分子(VL(3)-CL(3))的Fab轻链多肽。在某些实施例中，多肽通过例如二硫键共价连接。
在某些实施例中，双特异性抗原结合分子不包含Fc结构域。在特定的此类实施例中，所述第一Fab分子和(在存在时)第三Fab分子各自为常规Fab分子，并且第二Fab分子为本文所述的交叉Fab分子，即其中Fab重链和轻链的可变结构域VH和VL或恒定结构域CL和CH1彼此交换/替换的Fab分子。在其他此类实施例中，所述第一Fab分子和(在存在时)第三Fab分子各自为交叉Fab分子，并且第二Fab分子为常规Fab分子。
在一个此类实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一抗原结合部分和第二抗原结合部分组成，并且任选地包含一个或多个肽接头，其中第一抗原结合部分和第二抗原结合部分均为Fab分子，并且第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。图1O和图1S中示意性描绘了这种构型(在这些实例中，第二抗原结合结构域为VH/VL交叉Fab分子并且第一抗原结合部分为常规Fab分子)。
在另一个此类实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一抗原结合部分和第二抗原结合部分组成，并且任选地包含一个或多个肽接头，其中第一抗原结合部分和第二抗原结合部分均为Fab分子，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。图1P和图1T中示意性描绘了这种构型(在这些实例中，第二抗原结合结构域为VH/VL交叉Fab分子并且第一抗原结合部分为常规Fab分子)。
在一些实施例中，第一Fab分子在Fab重链的C末端与第二Fab分子的Fab重链的N末端融合，并且双特异性抗原结合分子进一步包含第三抗原结合部分、特别是第三Fab分子，其中所述第三Fab分子在Fab重链的C末端与第一Fab分子的Fab重链的N末端融合。在某些此类实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一Fab分子、第二Fab分子和第三Fab分子组成，并且任选地包含一个或多个肽接头，其中第一Fab分子在Fab重链的C末端与第二Fab分子的Fab重链的N末端融合，并且第三Fab分子在Fab重链的C末端与第一Fab分子的Fab重链的N末端融合。图1Q和1U(在这些实例中，第二抗原结合结构域为VH/VL交叉Fab分子，并且第一抗原结合部分和第三抗原结合部分为常规Fab分子)以及图1X和1Z(在这些实例中，第二抗原结合结构域为常规Fab分子，并且第一抗原结合部分和第三抗原结合部分各自为VH/VL交叉Fab分子)中示意性描绘了这种构型。
在一些实施例中，第二Fab分子在Fab重链的C末端与第一Fab分子的Fab重链的N末端融合，并且双特异性抗原结合分子进一步包含第三抗原结合部分、特别是第三Fab分子，其中所述第三Fab分子在Fab重链的N末端与第一Fab分子的Fab重链的C末端融合。在某些此类实施例中，双特异性抗原结合分子基本上由第一Fab分子、第二Fab分子和第三Fab分子组成，并且任选地包含一个或多个肽接头，其中第二Fab分子在Fab重链的C末端与第二Fab分子的Fab重链的N末端融合，并且第三Fab分子在Fab重链的N末端与第一Fab分子的Fab重链的C末端融合。图1R和1V(在这些实例中，第二抗原结合结构域为VH/VL交叉Fab分子，并且第一抗原结合部分和第三抗原结合部分为常规Fab分子)以及图1W和1Y(在这些实例中，第二抗原结合结构域为常规Fab分子，并且第一抗原结合部分和第三抗原结合部分各自为VH/VL交叉Fab分子)中示意性描绘了这种构型。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含多肽，其中第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，其继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含：多肽，其中第二Fab分子(VH(2)-CL(2))的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键；以及第一Fab分子(VL(1)-CL(1))的Fab轻链多肽。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，其继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含：多肽，其中第二Fab分子(VH(2)-CL(2))的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键；以及第一Fab分子(VL(1)-CL(1))的Fab轻链多肽。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，其继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含：多肽，其中第二Fab分子(VL(2)-CH1(2))的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键；以及第一Fab分子(VL(1)-CL(1))的Fab轻链多肽。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，其继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含：多肽，其中第二Fab分子(VH(2)-CL(2))的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键；以及第一Fab分子(VL(1)-CL(1))的Fab轻链多肽。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含多肽，其中第三Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，其继而与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，其继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含：多肽，其中第二Fab分子(VH(2)-CL(2))的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键；以及第一Fab分子(VL(1)-CL(1))的Fab轻链多肽。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子(VL(3)-CL(3))的Fab轻链多肽。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含多肽，其中第三Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，其继而与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，其继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含：多肽，其中第二Fab分子(VL(2)-CH1(2))的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键；以及第一Fab分子(VL(1)-CL(1))的Fab轻链多肽。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子(VL(3)-CL(3))的Fab轻链多肽。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含多肽，其中第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，其继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，其继而与第三Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含：多肽，其中第二Fab分子(VH(2)-CL(2))的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键；以及第一Fab分子(VL(1)-CL(1))的Fab轻链多肽。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子(VL(3)-CL(3))的Fab轻链多肽。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，其继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，其继而与第三Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含：多肽，其中第二Fab分子(VL(2)-CH1(2))的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键；以及第一Fab分子(VL(1)-CL(1))的Fab轻链多肽。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子(VL(3)-CL(3))的Fab轻链多肽。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含多肽，其中第二Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，其继而与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，其继而与第三Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，其继而与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)(VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-VL(3)-CH1(3)。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含：多肽，其中第一Fab分子(VH(1)-CL(1))的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键；和第二Fab分子(VL(2)-CL(2))的Fab轻链多肽。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含多肽，其中第三Fab分子(VH(3)-CL(3))的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含多肽，其中第二Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，其继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，其继而与第三Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，其继而与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)(VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-VH(3)-CL(3))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含：多肽，其中第一Fab分子(VL(1)-CH1(1))的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键；和第二Fab分子(VL(2)-CL(2))的Fab轻链多肽。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含多肽，其中第三Fab分子(VL(3)-CH1(3))的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含多肽，其中第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，其继而与第一Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，其继而与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链可变区被轻链可变区替换)，其继而与第二Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VL(3)-CH1(3)-VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2)。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含：多肽，其中第一Fab分子(VH(1)-CL(1))的Fab重链可变区与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键；和第二Fab分子(VL(2)-CL(2))的Fab轻链多肽。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含多肽，其中第三Fab分子(VH(3)-CL(3))的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键。
在某些实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子包含多肽，其中第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，其继而与第一Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，其继而与第一Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(即第一Fab分子包含交叉Fab重链，其中重链恒定区被轻链恒定区替换)，其继而与第二Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键(VH(3)-CL(3)-VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2))。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含：多肽，其中第一Fab分子(VL(1)-CH1(1))的Fab轻链可变区与第一Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键；和第二Fab分子(VL(2)-CL(2))的Fab轻链多肽。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子进一步包含多肽，其中第三Fab分子(VL(3)-CH1(3))的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键。
在一个特定实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQID NO：84的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)与第一抗原结合的第三抗原结合部分，并且该第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同；以及d)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与在b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分与在c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与在a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分与在c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个特定实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQID NO：85的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)与第一抗原结合的第三抗原结合部分，并且该第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同；以及d)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与在b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分与在c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与在a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分与在c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个特定实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQID NO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)与第一抗原结合的第三抗原结合部分，并且该第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同；以及d)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与在b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分与在c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与在a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分与在c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个特定实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQID NO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：96的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO∶102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)与第一抗原结合的第三抗原结合部分，并且该第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同；以及d)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与在b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分与在c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与在a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分与在c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个特定实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQID NO：92的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)与第一抗原结合的第三抗原结合部分，并且该第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同；以及d)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与在b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分与在c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与在a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分与在c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个特定实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：1的重链互补决定区(HCDR)1、SEQID NO：2的HCDR 2和SEQ ID NO：3的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：4的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：5的LCDR 2和SEQ ID NO：6的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)与第一抗原结合的第三抗原结合部分，并且该第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同；以及d)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与在b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分与在c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与在a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分与在c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个特定实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：7的重链互补决定区(HCDR)1、SEQID NO：8的HCDR 2和SEQ ID NO：9的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：10的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：11的LCDR 2和SEQ ID NO：12的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)与第一抗原结合的第三抗原结合部分，并且该第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同；以及d)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与在b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分与在c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与在a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分与在c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在另一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：84的HCDR2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分与在b)下所述的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在另一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：85的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分与在b)下所述的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在另一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分与在b)下所述的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在另一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：96的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分与在b)下所述的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在另一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：92的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分与在b)下所述的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在另一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：1的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：2的HCDR 2和SEQ ID NO：3的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：4的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：5的LCDR 2和SEQ ID NO：6的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分与在b)下所述的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在另一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：7的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：8的HCDR 2和SEQ ID NO：9的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：10的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：11的LCDR 2和SEQ ID NO：12的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分与在b)下所述的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与在c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在根据本发明的双特异性抗原结合分子的所有不同构型中，本文所述的氨基酸取代(在存在时)可在第一抗原结合部分和(在存在时)第三抗原结合部分/Fab分子的CH1和CL结构域中或第二抗原结合部分/Fab分子的CH1和CL结构域中。优选地，它们在第一抗原结合部分和(在存在时)第三抗原结合部分/Fab分子的CH1和CL结构域中。根据本发明的概念，如果本文所述的氨基酸取代在第一抗原结合部分(和，在存在时，第三)抗原结合部分/Fab分子中进行，则第二抗原结合部分/Fab分子中不存在此类氨基酸取代。相反，如果本文所述的氨基酸取代在第二抗原结合部分/Fab分子中进行，则第一(和，在存在时，第三)抗原结合部分/Fab分子中不存在此类氨基酸取代。氨基酸取代特别是在包含以下Fab分子的双特异性抗原结合分子中进行，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH1彼此取代。
在根据本发明的双特异性抗原结合分子的特定实施例中，特别是其中如本文所述的氨基酸取代在第一(和，在存在时，第三)抗原结合部分/Fab分子中进行的情况下，第一Fab分子(和，在存在时，第三)Fab分子的恒定结构域CL为κ同种型。在根据本发明的双特异性抗原结合分子的其他实施例中，特别是其中如本文所述的氨基酸取代在第二抗原结合部分/Fab分子中进行的情况下，第二抗原结合部分/Fab分子的恒定结构域CL为κ同种型。在一些实施例中，第一(和，在存在时，第三)抗原结合部分/Fab分子的恒定结构域CL和第二抗原结合部分/Fab分子的恒定结构域CL为κ同种型。
在一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：84的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：85的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：96的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：92的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：1的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：2的HCDR 2和SEQ ID NO：3的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：4的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：5的LCDR 2和SEQ ID NO：6的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：7的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：8的HCDR 2和SEQ ID NO：9的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：10的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：11的LCDR 2和SEQ ID NO：12的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合；或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个特定实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQID NO：84的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)与第一抗原结合的第三抗原结合部分，并且该第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同；和d)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与在b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合，或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个特定实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQID NO：85的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)与第一抗原结合的第三抗原结合部分，并且该第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同；和d)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与在b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合，或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个特定实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQID NO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)与第一抗原结合的第三抗原结合部分，并且该第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同；和d)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与在b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合，或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个特定实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQID NO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：96的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)与第一抗原结合的第三抗原结合部分，并且该第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同；和d)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与在b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合，或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个特定实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQID NO：92的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)与第一抗原结合的第三抗原结合部分，并且该第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同；和d)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与在b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合，或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个特定实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：1的重链互补决定区(HCDR)1、SEQID NO：2的HCDR 2和SEQ ID NO：3的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：4的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：5的LCDR 2和SEQ ID NO：6的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)与第一抗原结合的第三抗原结合部分，并且该第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同；和d)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与在b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合，或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在一个特定实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：7的重链互补决定区(HCDR)1、SEQID NO：8的HCDR 2和SEQ ID NO：9的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：10的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：11的LCDR 2和SEQ ID NO：12的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)与第一抗原结合的第三抗原结合部分，并且该第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同；和d)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中(i)在a)下所述的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与在b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在b)下所述的第二抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合，或者(ii)在b)下所述的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与a)下所述的第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且在a)下所述的第一抗原结合部分和c)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与d)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在另一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：84的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和b)下所述的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在另一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：85的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和b)下所述的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在另一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和b)下所述的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在另一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：96的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和b)下所述的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在另一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：92的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和b)下所述的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在另一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：1的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：2的HCDR 2和SEQ ID NO：3的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：4的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：5的LCDR 2和SEQ ID NO：6的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和b)下所述的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在另一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，其中第一抗原为GPRC5D并且第一抗原结合部分为Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：7的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ IDNO：8的HCDR 2和SEQ ID NO：9的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：10的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：11的LCDR 2和SEQ ID NO：12的LCDR 3；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中第二抗原为CD3并且第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，并且其中Fab分子包含：重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和b)下所述的第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
根据上述任一实施例所述，双特异性抗原结合分子的成分(例如Fab分子，Fc结构域)可直接融合或通过各种接头融合，特别是通过本文所述或本领域中所公知的包含一个或多个氨基酸(通常约2-20个氨基酸)的肽接头进行融合。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头，其中n通常为1至10的整数，特别为2至4。
在某一特定方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)第一抗原结合部分和与第一抗原结合的第三抗原结合部分；其中第一抗原为GPRC5D并且其中第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自为(常规)Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分；其中第二抗原为CD3并且其中第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，该Fab分子包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分和第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分进一步在Fab重链的C末端与b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且与b)下所述的第二抗原结合部分和a)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在某一特定方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)第一抗原结合部分和与第一抗原结合的第三抗原结合部分；其中第一抗原为GPRC5D并且其中第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自为(常规)Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分；其中第二抗原为CD3并且其中第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，该Fab分子包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分和第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分进一步在Fab重链的C末端与b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且与b)下所述的第二抗原结合部分和a)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在某一特定方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)第一抗原结合部分和与第一抗原结合的第三抗原结合部分；其中第一抗原为GPRC5D并且其中第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自为(常规)Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分；其中第二抗原为CD3并且其中第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，该Fab分子包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：104的氨基酸序列；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分和第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分进一步在Fab重链的C末端与b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且与b)下所述的第二抗原结合部分和a)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在某一特定方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)第一抗原结合部分和与第一抗原结合的第三抗原结合部分；其中第一抗原为GPRC5D并且其中第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自为(常规)Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分；其中第二抗原为CD3并且其中第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，该Fab分子包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：104的氨基酸序列；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分和第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分进一步在Fab重链的C末端与b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且与b)下所述的第二抗原结合部分和a)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在某一特定方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)第一抗原结合部分和与第一抗原结合的第三抗原结合部分；其中第一抗原为GPRC5D并且其中第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自为(常规)Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分；其中第二抗原为CD3并且其中第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，该Fab分子包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：104的氨基酸序列；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分和第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分进一步在Fab重链的C末端与b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且与b)下所述的第二抗原结合部分和a)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在某一特定方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)第一抗原结合部分和与第一抗原结合的第三抗原结合部分；其中第一抗原为GPRC5D并且其中第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自为(常规)Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分；其中第二抗原为CD3并且其中第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，该Fab分子包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：104的氨基酸序列；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分和第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分进一步在Fab重链的C末端与b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且与b)下所述的第二抗原结合部分和a)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在某一特定方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含：a)第一抗原结合部分和与第一抗原结合的第三抗原结合部分；其中第一抗原为GPRC5D并且其中第一抗原结合部分和第二抗原结合部分各自为(常规)Fab分子，该Fab分子包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列；b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分；其中第二抗原为CD3并且其中第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链与Fab重链的可变结构域VL和VH彼此取代，该Fab分子包含：重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：104的氨基酸序列；和轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列；c)由第一亚基和第二亚基构成的Fc结构域；其中在a)下所述的第一抗原结合部分和第三抗原结合部分的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)(根据Kabat编号)取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)或精氨酸(R)(根据Kabat编号)取代(最特别是被精氨酸(R)取代)，并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分和第三抗原结合部分的恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)(根据Kabat EU索引编号)取代；并且其中在a)下所述的第一抗原结合部分进一步在Fab重链的C末端与b)下所述的第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且与b)下所述的第二抗原结合部分和a)下所述的第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与c)下所述的Fc结构域的亚基中的一个的N末端融合。
在根据本发明这一方面的一个实施例中，在Fc结构域的第一亚基中，位置366处的苏氨酸残基被色氨酸残基取代(T366W)，并且在Fc结构域的第二亚基中，位置407处的酪氨酸残基被缬氨酸残基取代(Y407V)，并且任选地，位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基取代(T366S)，并且位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基取代(L368A)(根据Kabat EU索引编号)。
在根据本发明这一方面的另一个实施例中，在Fc结构域的第一亚基中，位置354处的丝氨酸残基又被半胱氨酸残基取代(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基取代(E356C)(特别是位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基取代)，并且在Fc结构域的第二亚基中，位置349处的酪氨酸残基又被半胱氨酸残基取代(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。
在根据本发明这一方面的又一个实施例中，在Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中，位置234处的亮氨酸残基被丙氨酸残基取代(L234A)，位置235处的亮氨酸残基被丙氨酸残基取代(L235A)，并且位置329处的脯氨酸残基被甘氨酸残基取代(P329G)(根据Kabat EU索引编号)。
在根据本发明这一方面的另一个实施例中，Fc结构域为人IgG1 Fc结构域。
在特定的具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含：多肽，该多肽包含与SEQ IDNO：17的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：18的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：19的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；和多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：20的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在另一个特定的具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含：多肽，该多肽包含SEQID NO：17的氨基酸序列；多肽，该多肽包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列；多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：19的氨基酸序列；和多肽，该多肽包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。
在另一个具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含：多肽，该多肽包含与SEQ IDNO：21的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：22的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：23的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；和多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：24的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在另一个具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含：多肽，该多肽包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列；多肽，该多肽包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列；多肽，该多肽包含SEQ IDNO：23的氨基酸序列；和多肽，该多肽包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。
在另一个具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含：多肽，该多肽包含与SEQ IDNO：114的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：115的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：116的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；和多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：117的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在另一个具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含：多肽，该多肽包含SEQ IDNO：114的氨基酸序列；多肽，该多肽包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列；多肽，该多肽包含SEQ ID NO：116的氨基酸序列；和多肽，该多肽包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列。
在另一个具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含：多肽，该多肽包含与SEQ IDNO：118的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：119的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：120的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；和多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：121的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在另一个具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含：多肽，该多肽包含SEQ IDNO：118的氨基酸序列；多肽，该多肽包含SEQ ID NO：119的氨基酸序列；多肽，该多肽包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列；和多肽，该多肽包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列。
在另一个具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含：多肽，该多肽包含与SEQ IDNO：122的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：123的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：124的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；和多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：125的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在另一个具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含：多肽，该多肽包含SEQ IDNO：122的氨基酸序列；多肽，该多肽包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列；多肽，该多肽包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列；和多肽，该多肽包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列。
在另一个具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含：多肽，该多肽包含与SEQ IDNO：126的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：127的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：128的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；和多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：129的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在另一个具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含：多肽，该多肽包含SEQ IDNO：126的氨基酸序列；多肽，该多肽包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列；多肽，该多肽包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列；和多肽，该多肽包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列。
在另一个具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含：多肽，该多肽包含与SEQ IDNO：130的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：131的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：132的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；和多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：133的序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在另一个具体实施例中，双特异性抗原结合分子包含：多肽，该多肽包含SEQ IDNO：130的氨基酸序列；多肽，该多肽包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列；多肽，该多肽包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列；和多肽，该多肽包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列。
Fc结构域
在特定实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含Fc结构域，该Fc结构域由第一亚基和第二亚基构成。应当理解，本文相对于双特异性抗原结合分子所述的Fc结构域的特征可等同应用于本发明的抗体中包含的Fc结构域。
双特异性抗原结合分子的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域为二聚体，其每个亚基包含CH2和CH3IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。在一个实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含不超过一个Fc结构域。
在一个实施例中，双特异性抗原结合分子的Fc结构域为IgG Fc结构域。在一个特定实施例中，Fc结构域为IgG1 Fc结构域。在另一个实施例中，Fc结构域为IgG4 Fc结构域。在一个更具体的实施例中，Fc结构域为IgG4 Fc结构域，其包含在位置S228(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代S228P。该氨基酸取代减少体内IgG4抗体的Fab臂交换(参见Stubenrauch等人，Drug Metabolism and Disposition 38，84-91(2010))。在另一个特定实施例中，Fc结构域为人Fc结构域。在一个甚至更特定的实施例中，Fc结构域为人IgG1 Fc结构域。人IgG1 Fc区的一个示例性序列在SEQ ID NO：42中给出。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
根据本发明的双特异性抗原结合分子包含不同的抗原结合部分，其可与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合，因此Fc结构域的两个亚基通常包含在两个不同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致两种多肽具有若干可能的组合。为改善重组生产中双特异性抗原结合分子的产率和纯度，在双特异性抗原结合分子的Fc结构域中引入促进所需的多肽缔合的修饰将为有利的。
因此，在特定实施例中，根据本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个实施例中，所述修饰在Fc结构域的CH3结构域中。
存在多种对Fc结构域的CH3结构域进行修饰以便增强异源二聚化的方法，这些方法很好地描述于例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291中。通常，在所有此类方法中，Fc结构域的第一亚基的CH3结构域和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域均以互补的方式进行工程化，以使每个CH3结构域(或包含CH3结构域的重链)不再能够与自身发生同源二聚化，而是被迫与互补工程化的其他CH3结构域进行异源二聚化(使得第一CH3结构域和第二CH3结构域异源二聚化，并且在两个第一CH3结构域或两个第二CH3结构域之间不形成同源二聚体)。这些用于改善重链异源二聚化的不同方法被视为与双特异性抗原结合分子中重链-轻链修饰结合的不同选择(例如，一个结合臂中的VH和VL交换/置换，以及在CH1/CL界面中引入带有相反电荷的氨基酸的取代基)，其减少了重链/轻链错配和Bence Jones型副产物。
在一个具体实施例中，所述促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰为所谓的″杵臼″修饰，其包括在Fc结构域的两个亚基中的一个的″杵″修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个的″臼″修饰。
″杵臼″技术描述于例如：US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9，617-621(1996)；和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)。通常，该方法包括在第一多肽的界面处引入一个突起(″杵″)，并且在第二多肽的界面中引入一个对应的空腔(″臼″)，以使该突起可定位于空腔中，从而促进异源二聚体形成并阻碍同源二聚体形成。通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽界面上的较小的氨基酸侧链来构建突起。通过将较大氨基酸侧链替换为较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)，在第二多肽的界面中形成与突起具有相同或相近大小的互补空腔。
因此，在一个特定实施例中，在双特异性抗原结合分子的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起，该突起可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第二亚基的CH3结构域内的突起为可定位在该空腔内。
优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。
优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。
可通过改变编码多肽的核酸(例如通过针对特定位点的诱变或通过肽合成)来制备突起和空腔。
在一个具体实施例中，在Fc结构域的第一亚基(″杵″亚基)(的CH3结构域)中，位置366处的苏氨酸残基被色氨酸残基取代(T366W)，并且在Fc结构域的第二亚基(″臼″亚基)(的CH3结构域)中，位置407处的酪氨酸残基被缬氨酸残基取代(Y407V)。在一个实施例中，在Fc结构域的第二亚基中，位置366处的苏氨酸残基又被丝氨酸残基取代(T366S)，并且位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基取代(L368A)(根据Kabat EU索引编号)。
在又一个实施例中，在Fc结构域的第一亚基中，位置354处的丝氨酸残基又被半胱氨酸残基取代(S354C)或位置356处的谷氨酸残基被半胱氨酸残基取代(E356C)(特别是位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基取代)，并且在Fc结构域的第二亚基中，位置349处的酪氨酸残基又被半胱氨酸残基取代(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫键，从而进一步稳定二聚体(Carter，JImmunol Methods 248，7-15(2001))。
在一个特定实施例中，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在一个特定实施例中，与第二抗原(例如活化T细胞抗原)结合的抗原结合部分与Fc结构域的第一亚基(包含″杵″修饰)融合(任选地，通过与GPRC5D结合的第一抗原结合部分融合，和/或通过肽接头融合)。不希望被理论束缚，与第二抗原(诸如活化T细胞抗原)结合的抗原结合部分与Fc结构域的含″杵″亚基的融合将(进一步)最大限度减少包含两个与活化T细胞抗原结合的抗原结合部分的产生(两个含″杵″多肽的空间碰撞)。
可以设想将用于强制异源二聚化的CH3修饰的其他技术作为本发明的替代方案，并且这些技术描述于例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中。
在一个实施例中，可替换使用EP 1870459中所述的异源二聚化方法。该方法基于在Fc结构域的两个亚基之间的CH3/CH3结构域界面的特定氨基酸位置引入带有相反电荷的氨基酸。本发明的双特异性抗原结合分子的一个优选实施例为(Fc结构域的)两个CH3结构域之一中的氨基酸突变R409D和K370E和Fc结构域的两个CH3结构域的另一个中的氨基酸突变D399K和E357K(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变T366S、L368A、Y407V，以及Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变R409D、K370E和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变D399K、E357K(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366S、L368A、Y407V，或者所述双特异性抗原结合分子包含Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变Y349C、T366W和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变S354C、T366S、L368A、Y407V，以及Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸突变R409D、K370E和Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸突变D399K、E357K(全部根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，可替换使用WO 2013/157953中所述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366K，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变L351D(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施例中，第一CH3结构域进一步包含氨基酸突变L351K。在另一个实施例中，第二CH3结构域进一步包含选自Y349E、Y349D和L368E(优选的是L368E)(根据Kabat EU索引编号)的氨基酸突变。
在一个实施例中，可替换使用WO 2012/058768中所述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一个实施例中，第二CH3结构域进一步包含位置T411、D399、S400、F405、N390或K392处的氨基酸突变，所述位置选自例如：a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W；b)D399R、D399W、D399Y或D399K；c)S400E、S400D、S400R或S400K；d)F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W；e)N390R、N390K或N390D；f)K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变L351Y、Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366V、K409F。在另一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变Y407A，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变T366A、K409F。在另一个实施例中，第二CH3结构域进一步包含氨基酸突变K392E、T411E、D399R和S400R(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，可替换使用WO 2011/143545中所述的异源二聚化方法，例如，在选自由368和409(根据Kabat EU索引编号)组成的组的位置处进行氨基酸修饰。
在一个实施例中，可替换使用WO 2011/090762中所述的异源二聚化方法，该方法同样使用上述的″杵臼″技术。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366W，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407A。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变T366Y，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变Y407T(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，双特异性抗原结合分子或其Fc结构域属于IgG2亚类，并且另选地使用WO 2010/129304中所述的异源二聚化方法。
在一个替代实施例中，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰包括介导静电转向作用的修饰，例如PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，此方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基界面上的一个或多个氨基酸残基，从而使同源二聚体形成在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。在一个此类实施例中，第一CH3结构域包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选的是K392D或N392D)对K392和N392的氨基酸取代，并且第二CH3结构域包含带正电荷的氨基酸(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R)，优选的是D399K、E356K、D356K或E357K并且更优选的是D399K和E356K)对D399、E356、D356或E357的氨基酸取代。在另一个实施例中，第一CH3结构域进一步包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，更优选的是K409D或R409D)对K409或R409的氨基酸取代。在另一个实施例中，第一CH3结构域进一步或可替代地包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))对K439和/或K370的氨基酸取代(全部根据Kabat EU索引编号)。
在又一个实施例中，可替代地使用WO 2007/147901中所述的异源二聚化方法。在一个实施例中，第一CH3结构域包含氨基酸突变K253E、D282K和K322D，并且第二CH3结构域包含氨基酸突变D239K、E240K和K292D(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个实施例中，可替代地使用WO 2007/110205中所述的异源二聚化方法。
在一个实施例中，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代K392D和K409D，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代D356K和D399K(根据Kabat EU索引编号)。
减少Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
Fc结构域赋予双特异性抗原结合分子(或抗体)有利的药代动力学特性，包括较长的血清半衰期，其有助于在靶组织中获得良好的蓄积和有利的组织-血液分配比。但是，与此同时，它可能导致不希望地将双特异性抗原结合分子(或抗体)导向表达Fc受体的细胞，而不是优选的携带抗原的细胞。此外，Fc受体信号传导途径的共活化可能导致细胞因子释放，其与T细胞活化特性(例如在双特异性抗原结合分子的实施例中，其中第二抗原结合部分与活化T细胞抗原结合)和双特异性抗原结合分子的长半衰期相结合，导致细胞因子受体的过度活化并在全身施用时产生严重副作用。由于T细胞例如被NK细胞可能破坏，活化T细胞以外的(携带Fc受体)的免疫细胞甚至可能降低双特异性抗原结合分子(特别是其中第二抗原结合部分与活化T细胞抗原结合至双特异性抗原结合分子)的效力。
因此，在特定实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比，根据本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域表现出降低的与Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个此类实施例中，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子)相比于天然IgG1 Fc结构域(或包含IgG1 Fc结构域的双特异性抗原结合分子)表现出小于50％、优选的是小于20％、更优选的是小于10％并且最优选的是小于5％的对Fc受体的结合亲和力，和/或相比于天然IgG1 Fc结构域(或包含IgG1 Fc结构域的双特异性抗原结合分子)表现出小于50％、优选小于20％、更优选小于10％并且最优选小于5％的效应子功能。在一个实施例中，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子)基本上不与Fc受体结合和/或诱导效应子功能。在一个特定实施例中，Fc受体为Fcγ受体。在一个实施例中，Fc受体为人Fc受体。在一个实施例中，Fc受体为活化Fc受体。在一个具体实施例中，Fc受体为活化人Fcγ受体，更具体地为人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地为FcγRIIIa。在一个实施例中，效应子功能为选自CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌的组中的一种或多种。在一个特定实施例中，效应子功能为ADCC。在一个实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比，Fc结构域对新生Fc受体(FcRn)表现出基本类似的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子)表现出天然IgG1 Fc结构域(或包含IgG1 Fc结构域的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70％、特别是大于约80％、更特别是大于约90％时，将获得与FcRn的基本上类似的结合。
在某些实施例中，与非工程化Fc结构域相比，工程化的Fc结构域对Fc受体具有降低的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在特定实施例中，双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含一种或多种氨基酸突变，其降低Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能。通常，在Fc结构域的两个亚基中的每一者中都存在相同的一个或多个氨基酸突变。在一个实施例中，氨基酸突变降低了Fc结构域与Fc受体的结合亲和力。在一个实施例中，氨基酸突变将Fc结构域与Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在存在多于一种降低氨基酸对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施例中，这些氨基酸突变的组合可使Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。在一个实施例中，与包含非工程化Fc结构域的双特异性抗原结合分子相比，包含工程化Fc结构域的双特异性抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力降低至20％以下、特别是10％以下、更特别是5％以下。在一个特定实施例中，Fc受体为Fcγ受体。在一些实施例中，Fc受体为人Fc受体。在一些实施例中，Fc受体为活化Fc受体。在一个具体实施例中，Fc受体为活化人Fcγ受体，更具体地为人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地为FcγRIIIa。优选地，减少与这些受体中的每一者的结合。在一些实施例中，也降低了与互补成分的结合亲和力，即与C1q的特异性结合亲和力。在一个实施例中，不降低与新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的双特异性抗原结合分子)表现出非工程化形式的Fc结构域(或包含所述非工程形式的Fc结构域的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现了与FcRn的基本上类似的结合，即Fc结构域对所述受体的结合亲和力得以保持。Fc结构域或包含所述Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子可表现出此类亲和力的大于约80％并且甚至大于约90％。在某些实施例中，与未经工程化Fc结构域相比，对双特异性抗原结合分子的Fc结构域进行工程化以获得降低的效应子功能。降低的效应子功能可包括但不限于以下一种或多种：降低补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、减少细胞因子分泌、减少抗原呈递细胞的免疫复合物介导的抗原摄取、减少与NK细胞的结合、减少与巨噬细胞的结合、减少与单核细胞的结合、减少与多形核细胞的结合、减少直接信号传导诱导的细胞凋亡、减少靶标结合抗体的交联、降低树突状细胞成熟度或减少T细胞引发。在一个实施例中，降低的效应子功能选自降低的CDC、降低的ADCC、降低的ADCP和减少的细胞因子分泌的组中的一种或多种。在一个特定实施例中，降低的效应子功能为降低的ADCC。在一个实施例中，降低的ADCC小于非工程化Fc结构域(或包含非工程化Fc结构域的双特异性抗原结合分子)诱导的ADCC的20％。
在一个实施例中，降低Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸突变为氨基酸取代。在一个实施例中，Fc结构域包含在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329(根据Kabat EU索引编号)的组的位置处的氨基酸取代。在一个更具体的实施例中，Fc结构域包含在选自L234、L235和P329(根据Kabat EU索引编号)的组的位置处的氨基酸取代。在一些实施例中，Fc结构域包含L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)的氨基酸取代。在一个此类实施例中，Fc结构域为IgG1 Fc结构域，特别为人IgG1 Fc结构域。在一个实施例中，Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代。在一个更具体的实施例中，氨基酸取代为P329A或P329G，特别为P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施例中，Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代，以及在选自E233、L234、L235、N297和P331(根据Kabat EU索引编号)的位置处的另一个氨基酸取代。在一个更具体的实施例中，该另一个氨基酸取代为E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定实施例中，Fc结构域包含在位置P329、L234和L235(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸取代。在更特定的实施例中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(″P329G LALA″、″PGLALA″或″LALAPG″)。具体地，在特定实施例中，Fc结构域的每个亚基包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)，即在Fc结构域的第一亚基和第二亚基中的每一者中，位置234处的亮氨酸残基被丙氨酸残基取代(L234A)，位置235处的亮氨酸残基被丙氨酸残基取代(L235A)，并且位置329处的脯氨酸残基被甘氨酸残基取代(P329G)(根据Kabat EU索引编号)。
在一个此类实施例中，Fc结构域为IgG1 Fc结构域，特别为人IgG1 Fc结构域。氨基酸取代的″P329G LALA″组合几乎完全消除了人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体(以及补体)结合，如PCT公开号WO 2012/130831所述，其全文以引用方式并入本文。WO 2012/130831还描述了用于制备此类突变Fc结构域的方法和确定其性质(例如Fc受体结合或效应子功能)的方法。
IgG4抗体与IgG1抗体相比，表现出与Fc受体的降低的结合亲和力和降低的效应子功能。因此，在一些实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域为IgG4 Fc结构域，特别为人IgG4 Fc结构域。在一个实施例中，IgG4 Fc结构域包含在位置S228处的氨基酸取代，具体地包含氨基酸取代S228P(根据Kabat EU索引编号)。为进一步降低其与Fc受体的结合亲和力和/或其效应子功能，在一个实施例中，IgG4 Fc结构域包含位置L235处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代L235E(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施例中，IgG4 Fc结构域包含在位置P329处的氨基酸取代，具体地包含氨基酸取代P329G(根据Kabat EU索引编号)。在一个特定实施例中，IgG4 Fc结构域包含位置S228、L235和P329处的氨基酸取代，具体地包含氨基酸取代S228P、L235E和P329G(根据Kabat EU索引编号)。此类IgG4 Fc结构域变体及其Fcγ受体结合性质描述于PCT公开号WO 2012/130831中，其全文以引用方式并入本文。
在一个特定实施例中，与天然IgG1 Fc结构域相比，表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的Fc结构域为包含氨基酸取代L234A、L235A和任选的P329G的人IgG1 Fc结构域或包含氨基酸取代S228P、L235E和任选的P329G(根据Kabat EU索引编号)的人IgG4 Fc结构域。
在某些实施例中，已消除Fc结构域的N-糖基化。在一个此类实施例中，Fc结构域包含位置N297处的氨基酸突变，特别是天冬酰胺被丙氨酸取代(N297A)或天冬氨酸取代(N297D)的氨基酸取代(根据Kabat EU索引编号)。
除上文和PCT公开号WO 2012/130831中所述的Fc结构域以外，具有降低的Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域也包括被Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个取代的那些(美国专利号6,737,056)(根据Kabat EU索引编号)。此类Fc变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个取代的Fc变体，包括所谓的″DANA″Fc变体，其中残基265和297被丙氨酸取代(美国专利号7,332,581)。
可使用此领域中所公知的遗传或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、***或修饰来制备变体Fc结构域。遗传方法可包括编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可通过例如测序来验证核苷酸变化是否正确。
与Fc受体的结合可易于通过ELISA确定，或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器例如BIAcore仪器(GE Healthcare)进行确定，并且Fc受体可通过例如重组表达来获得。可替代地，Fc结构域或包含Fc结构域的双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力可使用已知表达特定Fc受体的细胞系(例如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)进行评估。
Fc结构域或包含Fc结构域的双特异性抗原结合分子的效应子功能可通过此领域中所公知的方法进行测量。用于评估目标分子的ADCC活性的体外分析方法的实例描述于例如：美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83，7059-7063(1986)；和Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82，1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166，1351-1361(1987)。可替代地，可采用非放射性分析方法(参见例如：用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)；和CytoTox
Figure BDA0003492360380001211
非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。用于此类分析的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可在例如Clynes等人在Proc Natl Acad Sci USA 95，652-656(1998)中公开的动物模型中在体内评估目标分子的ADCC活性。
在一些实施例中，减少Fc结构域与补体成分的结合，具体地减少与C1q的结合。因此，在一些实施例中，其中Fc结构域被工程化为具有降低的效应子功能，所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可实施C1q结合分析以确定Fc结构域或包含Fc结构域的双特异性抗原结合分子能否结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评估补体活化，可实施CDC测定(参见例如：Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202，163(1996)；Cragg等人，Blood 101，1045-1052(2003)；和Cragg和Glennie，Blood 103，2738-2743(2004))。
FcRn结合和体内清除率/半衰期测定也可使用此领域中所公知的方法进行(参见例如Petkova，S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006)；WO 2013/120929)。
多核苷酸
本发明进一步提供了编码本文所述的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸。在一些实施例中，所述片段为抗原结合片段。
编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的多核苷酸可表现为编码整个抗体或双特异性抗原结合分子的单个多核苷酸或为共表达的多个(例如两个或多个)多核苷酸。共表达的由多核苷酸编码的多肽可通过例如二硫键或其他方式缔合以形成功能性抗体或双特异性抗原结合分子。例如，抗体或双特异性抗原结合分子的轻链部分可由与包含抗体或双特异性抗原结合分子的重链的抗体或双特异性抗原结合分子部分不同的多核苷酸进行编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成抗体或双特异性抗原结合分子。在另一个实例中，包含两个Fc结构域亚基之一和任选的一个或多个Fab分子(的一部分)的抗体或双特异性抗原结合分子的部分可由与包含两个Fc结构域亚基的另一个和任选的Fab分子(的一部分)的抗体或双特异性抗原结合分子的部分不同的多核苷酸进行编码。当共表达时，Fc结构域亚基将缔合以形成Fc结构域。
在一些实施例中，分离的多核苷酸编码根据本文所述的本发明的整个抗体或双特异性抗原结合分子。在其他实施例中，分离的多核苷酸编码根据本文所述的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子中包含的多肽。
在某些实施例中，多核苷酸或核酸为DNA。在其他实施例中，本发明的多核苷酸为RNA，例如，呈信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以为单链或双链RNA。
重组方法
可通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在重组生产时，将例如上文所述的编码抗体或双特异性抗原结合分子(片段)的一种或多种多核苷酸分离并***一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可易于使用常规方法进行分离和测序。在一个实施例中，提供了包含本发明的多核苷酸中的一种或多种的载体，优选的是包含表达载体。可使用本领域的技术人员所公知的方法来构建包含抗体或双特异性抗原结合分子(片段)的编码序列以及适当的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/基因重组。参见例如以下文献中所述的技术：Maniatis等人，MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1989)；和Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience，N.Y(1989)。表达载体可以为质粒、病毒的一部分，也可以为核酸片段。表达载体包括表达盒，其中将编码抗体或双特异性抗原结合分子(片段)(即编码区)的多核苷酸与启动子和/或其他转录或翻译控制组件可操纵地缔合以进行克隆。如本文所用的″编码区″，为由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸的一部分。尽管″终止密码子″(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但可以将其视为编码区的一部分(在存在时)，但是任何侧翼序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5’和3’非翻译区等)不属于编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中，例如存在于单个载体上，或存在于单独的多核苷酸构建体中，例如存在于单独的(不同的)载体上。此外，任何载体可包含单个编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如，本发明的载体可编码一种或多种多肽，该多肽经由蛋白水解后翻译或共翻译分离成最终蛋白。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，其与编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于专门的组件或基序(诸如分泌信号肽)或异源功能结构域。可操纵的缔合是指基因产物的编码区(例如多肽)与一个或多个调控序列缔合，从而使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制之下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA转录，并且两个DNA片段之间的接头性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力，也不干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(例如多肽编码区以及与之相缔合的启动子)″可操纵地缔合″。因此，如果启动子能够影响核酸的转录，则该启动子区将与编码多肽的核酸可操纵地缔合。启动子可以为细胞特异性启动子，其仅指导预定细胞中DNA的大量转录。除启动子外，其他转录控制组件，例如增强子、操纵子、阻遏子和转录终止信号，可与多核苷酸可操纵地缔合以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。各种转录控制区为本领域的技术人员所公知的。其中包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于巨细胞病毒(例如直接早期启动子，与内含子A结合)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(例如卢氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因的那些，例如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-珠蛋白以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如启动子诱导的四环素)。类似地，各种翻译控制组件为本领域的普通技术人员所公知的。其中包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及来源于病毒体系的组件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可包含其他特征，例如复制起点和/或染色体整合组件，例如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌或信号肽的其他编码区缔合，该分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果需要分泌抗体或双特异性抗原结合分子，可将编码信号序列的DNA置于编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段的核酸的上游。根据信号假说，哺乳动物细胞所分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，其在增长的蛋白质链通过粗内质网输出时从成熟蛋白质上裂解下来。本领域的普通技术人员将认识到，脊椎动物细胞所分泌的多肽通常具有与多肽的N末端融合的信号肽，其从翻译后的多肽上裂解下来以产生分泌或″成熟″形式的多肽。在某些实施例中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽或该序列的功能性衍生物，该功能性衍生物保留指导与之可操纵地缔合的分泌的能力。可替代地，可使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，野生型前导序列可被人组织胞浆素原活化物(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶的前导序列取代。
编码可用于促进以后的纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记抗体或双特异性抗原结合分子的短蛋白质序列的DNA可包括在编码多核苷酸的抗体或双特异性抗原结合分子(片段)的内部或末端。
在另一个实施例中，提供了包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施例中，提供了包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可分别单独或组合结合本文中相对于多核苷酸和载体所述的任何特征。在一个此类实施例中，宿主细胞包含(例如已被转化或转染)一种或多种载体，该载体包含一种或多种编码本发明的抗体或双特异性抗原结合分子(的一部分)的多核苷酸。如本文所用的术语″宿主细胞″，是指可被工程化以产生本发明的抗体或双特异性抗原结合分子或其片段的任何类型的细胞体系。适于复制并支持抗体或双特异性抗原结合分子的表现的宿主细胞为此技术领域中所公知。可在适当情况下用特定的表达载体转染或转导此类细胞，并且可生长大量包含载体的细胞以接种大规模发酵罐，获得足够量的抗体或双特异性抗原结合分子以用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物(例如大肠杆菌)或各种真核细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等)。例如，多肽可能在细菌中产生，特别是在无需糖基化的情况下。在表达后，多肽可与细菌细胞糊体中的可溶性部分分离，并可经过进一步纯化。除原核生物以外，真核微生物(如丝状真菌或酵母菌)也为合适的多肽编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被″人源化″的真菌和酵母菌株，从而导致具有部分或完全人糖基化模式的多肽的产生。参见：Gerngross，Nat Biotech 22，1409-1414(2004)；和Li等人，Nat Biotech 24，210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适的宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定出许多杆状病毒株，它们可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，可使用适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系。可用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例包括：由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(如Graham等人，J Gen Virol 36，59(1977)中所述的293或293T细胞)；幼地鼠肾细胞(BHK)；小鼠睾丸支持细胞(如Mather，Biol Reprod 23，243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；Buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)；TRI细胞(如Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383，44-68(1982)所述)；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77，4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，例如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。有关某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如：Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，Vol.248(B.K.C.Lo主编，Humana Press，Totowa，NJ)，pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞等，还包括转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内的细胞。在一个实施例中，宿主细胞为真核细胞，优选的是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。
标准技术为此领域中所公知，可在这些***中表达外源基因。可对表达包含抗原结合结构域(例如抗体)的重链或轻链的多肽的细胞进行工程改造，使其也表达其他抗体链，从而使表达的产物为兼有重链和轻链的抗体。
在一个实施例中，提供了一种生产根据本发明所述的抗体或双特异性抗原结合分子的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体或双特异性抗原结合分子的条件下，培养包含编码如本文所提供的抗体或双特异性抗原结合分子的多核苷酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体或双特异性抗原结合分子。
本发明的双特异性抗原结合分子(或抗体)的成分可彼此基因融合。双特异性抗原结合分子可设计为使其成分直接彼此融合或通过接头序列间接融合。可根据此领域中所公知的方法确定接头的组成和长度，并可以对其效力进行测试。本文提供了介于双特异性抗原结合分子的不同成分之间的接头序列的实例。如果需要，还可以包括附加的序列以掺入切割位点，以分离融合体的各种组分，例如内肽酶识别序列。
本发明的抗体或双特异性抗原结合分子通常包含至少一个能够结合抗原决定簇的抗体可变区。可变区可形成并来源于天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分。用于生产多克隆抗体和单克隆抗体的方法为此技术领域中所公知(参见例如Harlow和Lane，″Antibodies，a laboratory manual″，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。非天然存在的抗体可使用固相肽合成来构建，可重组产生(例如，如美国专利号4,186,567中所述)，或者可例如通过筛选包含变异重链和变异轻链的组合文库来获得(参见例如授予McCafferty的美国专利号5,969,108)。
在本发明的抗体或双特异性抗原结合分子中，可使用任何动物种类的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区。可用于本发明的非限制性抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可来源于鼠、灵长类或人。如果抗体或双特异性抗原结合分子旨在供人使用，则可以使用抗体的嵌合形式，其中抗体的恒定区来源于人。抗体的人源化或完全人源化形式也可以根据本领域中熟知的方法进行制备(参见例如授予Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可以通过多种方法实现，这些方法包括但不限于：(a)将非人类(例如供体抗体)CDR移植到人(例如受体抗体)框架和恒定区上，其中保留或不保留关键框架残基(例如，对于保持良好的抗原结合亲和力或抗体功能很重要的那些)，(b)仅将非人类特异性决定区域(SDR或a-CDR；对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人框架和恒定区，或(c)移植整个非人类可变结构域，但通过替换表面残基将其″隐藏″(cloaking)在仿人区段中。人源化抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，并且进一步描述于例如：Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；US专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)接枝)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述了″表面重塑″)；Dall′Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述了″FR改组″)；Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)；和Klimka等人，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(描述了FR改组的″导向选择″法)。可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用″最佳匹配″方法选择的框架区(参见例如Sims等人J.Immunol.151：2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如：Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；和Presta等人J.Immunol.，151：2623(1993))；人成熟的(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见例如：Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)；和Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
可使用此领域中所公知的各种技术生产人抗体。人抗体一般性描述于：van Dijk和van de Winkel，Curr Opin Pharmacol 5，368-74(2001)；和Lonberg，Curr OpinImmunol 20，450-459(2008)。可通过对转基因动物给予免疫原来制备人抗体，该转基因动物已被修饰以应答于抗原攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代内源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。有关从转基因动物中获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。另见例如：美国专利号6,075,181和6,150,584(描述了XENOMOUSETM技术)；美国专利号5,770,429(描述了
Figure BDA0003492360380001281
技术)；美国专利号7,041,870(描述了K-M
Figure BDA0003492360380001282
技术)；和美国专利申请公开号US 2007/0061900(描述了
Figure BDA0003492360380001283
技术)。由此类动物产生的来源于完整抗体的人可变区可被进一步修饰，例如通过与不同的人恒定区结合来修饰。
人抗体也可通过基于杂交瘤的方法进行制备。用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有描述。(参见例如：Kozbor J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；和Boerner等人，J.Immunol.，147：86(1991)。)通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)。其他方法包括描述于例如以下文献中的那些：美国专利号7,189,826(描述了由杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)，和Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于以下文献中：Vollmers和Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)；和Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology，27(3)：185-91(2005)。
如本文所述的人抗体也可通过从人抗体文库分离而产生。
用于本发明的抗体可通过筛选组合文库中具有所需的一种或多种活性的抗体来分离。例如，用于筛选组合文库的方法综述于例如Lerner等人的Nature Reviews 16：498-508(2016)。例如，此领域中所公知的多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库中具有所需的结合特性的抗体。此类方法综述于以下文献中：Frenzel等人的mAbs 8：1177-1194(2016)；Bazan等人的Human Vaccines and Immunotherapeutics 8：1817-1828(2012)；和Zhao等人的Critical Reviews in Biotechnology 36：276-289(2016)；以及Hoogenboom等人的Methods in Molecular Biology 178：1-37(O′Brien等人主编，HumanPress，Totowa，NJ，2001)；和Marks和Bradbury的Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo主编，Human Press，Totowa，NJ，2003)。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因库，并在噬菌体文库中随机重组，然后可按照以下文献所述的方法筛选抗原结合噬菌体：Winter等人，Annual Review of Immunology 12：433-455(1994)。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或Fab片段展示抗体片段。来自免疫源的文库无需构建杂交瘤即可向免疫原提供高亲和力抗体。可替代地，可以在不进行任何免疫的情况下克隆天然谱系(例如，来自人)以向各种非自身以及自身抗原提供抗体的单一来源，如Griffiths等人在EMBO Journal 12：725-734(1993)中所述。最后，还可以通过克隆干细胞中未重排的V基因片段，并使用包含随机序列的PCR引物来编码高变异性CDR3区域并在体外完成重排，由此合成天然文库，如Hoogenboom和Winter在Journal of Molecular Biology 227：381-388(1992)中所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如：美国专利号5,750,373、7,985,840、7,785,903和8,679,490；以及美国专利公开号2005/0079574、2007/0117126、2007/0237764和2007/0292936。用于筛选组合文库中具有所需活性的抗体的此领域中所公知方法的其他实例包括核糖体和mRNA展示以及用于细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞上的抗体展示和选择的方法。酵母表面展示方法综述于例如Scholler等人的Methods in Molecular Biology 503：135-56(2012)、和Cherf等人的Methods in Molecular biology 1319：155-175(2015)以及Zhao等人的Methods in Molecular Biology 889：73-84(2012)中。用于核糖体展示的方法描述于例如He等人的Nucleic Acids Research 25：5132-5134(1997)和Hanes等人的PNAS 94：4937-4942(1997)中。
按照本文所述的方法制备的抗体或双特异性抗原结合分子可通过本领域中已知的技术进行纯化，例如高效液相层析法、离子交换层析法、凝胶电泳法、亲和力层析法、尺寸排阻层析法等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对本领域的技术人员而言为显而易见的。对于亲和力层析纯化，可使用抗体、配体、受体或抗原以结合抗体或双特异性抗原结合分子。例如，对于本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的亲和力层析纯化，可使用具有蛋白质A或蛋白质G的基质。可使用顺序蛋白质A或G亲和力层析法和尺寸排阻层析法分离基本上如实例中所述的抗体或双特异性抗原结合分子。抗体或双特异性抗原结合分子的纯度可通过多种熟知的分析方法(包括凝胶电泳法、高压液相层析法等)中的任一种进行测定。
分析
可采用此领域中所公知的各种分析法对本文所提供的抗体或双特异性抗原结合分子的物理/化学性质和/或生物活性进行鉴别、筛选或表征。
亲和力分析
抗体或双特异性抗原结合分子对Fc受体或靶抗原的亲和力可通过表面等离子体共振(SPR)进行测定，其中使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)和受体或靶蛋白(例如可通过重组表达获得的那些)。另选地，可使用表达特定受体或靶抗原的细胞系(例如通过流式细胞术(FACS))评估抗体或双特异性抗原结合分子对不同受体或靶抗原的结合。下面描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施例。
根据一个实施例，在25℃使用
Figure BDA0003492360380001301
T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离子体共振法测量KD。
为分析Fc部分与Fc受体之间的相互作用，利用固定在CM5芯片上的抗Penta His抗体(Qiagen)捕获His标记的重组Fc受体，并使用双特异性构建体作为分析物。简言之，根据供货商的说明，用N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)激活羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，GE Healthcare)。用10mM乙酸钠(pH5.0)将抗Penta-His抗体稀释至40μg/ml，然后以5μl/min的流速注入，以获得大约6500应答单位(RU)的偶联蛋白。注入配体后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。随后，捕获Fc受体60s，使其浓度达到4nM或10nM。为实施动力学测量，在25℃，将抗体或双特异性抗原结合分子的四倍系列稀释液(浓度范围介于500nM和4000nM之间)以30μl/min的流速在120s内注入HBS-EP(GE Healthcare，10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20，pH7.4)中。
为确定对靶抗原的亲和力，抗体或双特异性抗原结合分子由抗人Fab特异性抗体(GE Healthcare)捕获，该抗体固定在活化CM5传感器芯片表面上，如针对抗Penta-His抗体所述。偶联蛋白的最终量大约为12000RU。捕获抗体或双特异性抗原结合分子90s，使其浓度达到300nM。在180s内，靶抗原以250nM至1000nM的浓度范围通过流通池，其流速为30μL/min。监测解离180s。
扣除参考流通池获得的应答，以校正本体折射率差。稳态应答用于通过Langmuir结合等温线的非线性曲线拟合得出解离常数KD。通过同时拟合缔合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(
Figure BDA0003492360380001311
评估软件版本1.1.1)计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)通过koff/kon比率计算得出。参见例如：Chen等人，J Mol Biol 293，865-881(1999)。
活性分析
本发明的双特异性抗原结合分子(或抗体)的生物活性可通过如实例中所述的各种分析法来测量。生物活性可例如包括诱导T细胞的增殖、诱导T细胞中的信号传导、诱导T细胞中活化标志物的表达、诱导T细胞分泌细胞因子、诱导靶细胞(如肿瘤细胞)裂解以及诱导肿瘤消退和/或改善生存率。
组合物、配方和施用途径
本发明的另一方面提供了包含本文所提供的任何抗体或双特异性抗原结合分子的药物组合物，例如用于以下任何治疗方法。在一个实施例中，药物组合物包含本文所提供的任何抗体或双特异性抗原结合分子和药用载体。在另一个实施例中，药物组合物包含本文所提供的任何抗体或双特异性抗原结合分子和至少一种附加治疗剂(如下文所述)。
还提供了一种以适合于体内施用的形式产生本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的方法，该方法包括(a)获得根据本发明的抗体或双特异性抗原结合分子，和(b)与至少一种药用载体一起配制抗体或双特异性抗原结合分子，从而配制用于体内施用的抗体或双特异性抗原结合分子的制剂。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的溶于或分散于药用载体中的抗体或双特异性抗原结合分子。短语″药用或药理学上可接受″是指在采用的剂量和浓度下通常对受体无毒的分子实体和组合物，即当施用于动物(诸如例如人)时不产生不利的、过敏或其他不良反应(在适当情况下)。根据本公开，本技术领域熟知的技术人员将认识到包含抗体或双特异性抗原结合分子和任选的附加活性成分的药物组合物的制备方法，例如Remington′sPharmaceutical Sciences第18版(Mack Printing Company，1990)所述，该文献以引用方式并入本文。此外，对于动物(例如，人)施用，应当理解，制剂应符合FDA生物制品标准办公室或其他国家/地区的有关部门所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。优选的组合物为冻干制剂或水溶液。如本文所使用的″药用载体″，包括任何和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘结剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料，诸如本技术领域技术人员已知的材料及其组合(参见例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990，pp.1289-1329，该文献以引用方式并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不兼容，否则考虑其在治疗或药物组合物中的用途。
本发明的免疫缀合物(和任何附加治疗剂)可通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内施用，并且如果需要局部治疗，则可以采用病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可通过任何合适的途径进行，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，部分取决于短暂施用还是长期施用。
肠胃外组合物包括设计用于通过注射施用的那些，例如皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内肌内、鞘内或腹膜内注射。对于注射，可在水溶液中(优选地在生理相容性缓冲剂，如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲剂)中配制本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。该溶液可包含制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，抗体或双特异性抗原结合分子可以呈粉末形式，以便在使用前与合适的载剂例如无菌、无热原水一起配制。通过将所需量的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子与适当的溶剂以及所需的以下枚举的多种其他成分混合，制备无菌注射液。无菌性可易于例如通过无菌滤膜过滤来实现。通常，通过将各种灭菌后的活性成分掺入含有基本分散介质和/或其他成分的无菌载剂中来制备分散液。对于用于制备无菌注射液、混悬剂或乳剂的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，该技术可从先前过滤后的无菌液体介质中得到活性成分与任何其他所需成分的粉末。如有必要，应适当缓冲液体介质，并且在注射足够的盐水或葡萄糖之前先使液体稀释剂等渗。组合物必须在制造和储存条件下保持稳定，并且必须能够抵抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应最小限度地保持在安全浓度，例如，小于0.5ng/mg蛋白质。合适的药用载体包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索铵氯化物；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂(例如EDTA)；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属错合物(例如锌蛋白错合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可包含提高混悬剂粘度的化合物，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、右旋葡萄聚糖等。任选地，悬浮液还可包含合适的稳定剂或提高化合物溶解度的试剂，以制备高浓度溶液。另外，可将活性化合物的悬浮液制备为合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如ethyl cleats或甘油三酯)或脂质体。
活性成分可以包载在例如通过凝聚技术或通过接口聚合制备的微囊(例如，分别为羟甲基纤维素微囊或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、胶体药物递送***(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊(nanocapsule))中或粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company，1990)中。可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适的实例包括含有多肽的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成形物品的形式，例如膜或微囊。在特定实施例中，可以通过在组合物中使用延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝、明胶或其组合)来产生可注射组合物的延长吸收。
除之前描述的组合物外，该双特异性抗原结合分子还可以配制为储存制剂。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射施用。因此，例如抗体或双特异性抗原结合分子可以用合适的聚合物质或疏水物质(例如作为可用油中的乳状液)或离子交换树脂配制，或作为微溶的衍生物，例如作为微溶的盐配制。
包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的药物组合物可以利用常规的混合、溶解、乳化、包封、包载或冻干方法来制备。可使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制药物组合物，这些载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可用于药用的制剂。合适的制剂视所选的施用途径而定。
抗体或双特异性抗原结合分子可以以游离酸或碱、中性或盐形式配制成组合物。药用盐为基本上保持游离酸或碱的生物学活性的盐。这些包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的那些，或与无机酸(例如，盐酸、磷酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的那些。与游离羧基形成的盐还可以衍生自：无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。药用盐趋向于比对应的游离碱形式更易溶于水性溶剂和其他质子性溶剂。
治疗方法和组合物
本文中提供的抗体或双特异性抗原结合分子中的任一种都可以用于治疗方法。本发明的抗体或双特异性抗原结合分子可以用作免疫治疗剂，例如用于癌症的治疗中。
为了在治疗方法中使用，本发明的抗体或双特异性抗原结合分子将以符合良好医疗实践的方式予以配制、给药和施用。此背景中考虑的因素包括待治疗的具体疾患、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、递送药剂的部位、施用方法、施用日程和医疗从业者已知的其他因素。
在一个方面，提供了本发明的抗体或双特异性抗原结合分子用作药物。在另一方面，提供了本发明的抗体或双特异性抗原结合分子用于治疗疾病。在某些实施例中，提供了本发明的抗体或双特异性抗原结合分子以用于治疗的方法中。在一个实施例中，本发明提供了本文中所述的抗体或双特异性抗原结合分子用于在有需要的个体中治疗疾病。在某些实施例中，本发明提供了抗体或双特异性抗原结合分子用于治疗患有疾病的个体的方法，该方法包括对该个体施用治疗有效量的抗体或双特异性抗原结合分子。在某些实施例中，待治疗的疾病为增生性疾病。在一个特定实施例中，疾病为癌症。在某些实施例中，该方法进一步包括向该个体施用治疗有效量的至少一种附加治疗剂，例如抗癌剂(如果该待治疗的疾病为癌症)。在另外的实施例中，本发明提供了如本文所述的抗体或双特异性抗原结合分子用于诱导靶细胞、特别是肿瘤细胞裂解。在某些实施例中，本发明提供了抗体或双特异性抗原结合分子用于在个体中诱导靶细胞、特别是肿瘤细胞裂解的方法中，该方法包括对个体施用有效量的抗体或双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞裂解。根据上述任一实施例中的″个体″为哺乳动物，优选地为人。在某些实施例中，待治疗的疾病为自身免疫性疾病，特别地为全身性红斑狼疮和/或类风湿关节炎。自身反应性浆细胞产生致病性自身抗体为自身免疫性疾病的标志。因此，GPRC5D可用于靶向自身免疫性疾病中的自反应浆细胞。
本发明的另一方面提供了本发明的抗体或双特异性抗原结合分子在药物的制造或制备中的用途。在一个实施例中，药物用于治疗有需要的个体的疾病。在另一个实施例中，药物用于治疗疾病的方法中，该方法包括向患有疾病的个体施用治疗有效量的药物。在某些实施例中，待治疗的疾病为增生性疾病。在一个特定实施例中，疾病为癌症。在一个实施例中，该方法进一步包括向该个体施用治疗有效量的至少一种附加治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病为癌症)。在另一个实施例中，药物用于诱导靶细胞、特别是肿瘤细胞裂解。在又一个实施例中，药物用于在个体中诱导靶细胞、特别是肿瘤细胞裂解的方法中，该方法包括对个体施用有效量的药物以诱导靶细胞裂解。根据上述任一实施例中″个体″可为哺乳动物，优选地为人。
本发明的另一方面提供了一种治疗疾病的方法。在一个实施例中，该方法包括向患有此类疾病的个体施用治疗有效量的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在一个实施例中，向所述个体施用包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的组合物，该组合物呈药用形式。在某些实施例中，待治疗的疾病为增生性疾病。在一个特定实施例中，疾病为癌症。在某些实施例中，该方法进一步包括向该个体施用治疗有效量的至少一种附加治疗剂，例如抗癌剂(如果该待治疗的疾病为癌症)。根据上述任一实施例中″个体″可为哺乳动物，优选地为人。
本发明的另一方面提供了一种诱导靶细胞、特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个实施例中，该方法包括在T细胞、特别是细胞毒性T细胞的存在下，使靶细胞与本发明的抗体或双特异性抗原结合分子接触。在另一方面，提供了一种诱导个体中靶细胞、特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个此类实施例中，该方法包括对个体施用有效量的抗体或双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞裂解。在一个实施例中，″个体″为人。
在某些实施例中，待治疗的疾病为增生性疾病，特别地为癌症。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、***、子宫内膜癌、食管癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、***癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌和肾癌。可使用本发明的抗体或双特异性抗原结合分子治疗的其他细胞增殖性疾病包括但不限于定位在以下部位中的肿瘤：腹部、骨骼、乳腺、消化***、肝、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经***(中枢和外周)、淋巴***、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸部和泌尿生殖***。还包括癌前状况或病变和癌症转移。在某些实施例中，癌症选自肾癌、皮肤癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、脑癌和头颈癌。在一个实施例中，癌症为***癌。熟练的技术人员容易地认识到，在许多情况下，该抗体或双特异性抗原结合分子可能无法提供治愈，而只能提供部分益处。在一些实施例中，还认为具有某种益处的生理变化在治疗上有益。因此，在一些实施例中，认为提供生理变化的抗体或双特异性抗原结合分子的量被认为是″有效量″或″治疗有效量″。需要治疗的受试者、患者或个体通常为哺乳动物，更具体地为人。
在一些实施例中，对细胞施用有效量的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。在其他实施例中，对个体施用治疗有效量的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子以治疗疾病。
对于疾病的预防或治疗，本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的适当剂量(单独使用或与一种或多种附加治疗剂组合使用)将取决于待治疗的疾病的类型、施用途径、患者的体重、抗体或双特异性抗原结合分子的类型、疾病的严重度和病程、为了预防或是治疗的目的施用该抗体或双特异性抗原结合分子、之前或并行的治疗干预、患者的临床病史和对该抗体或双特异性抗原结合分子的反应和主治医师的判断。在任何情况下，负责施用的从业者将确定组合物中一种或多种活性成分的浓度以及单个受试者的合适剂量。本文中考虑各种施用方案，其包括但不限于在多种时间点单次或多次施用、快速注射施用和脉冲输注。
在一次或一系列的治疗中合适地对患者施用抗体或双特异性抗原结合分子。根据疾病的类型和严重程度不同，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体或双特异性抗原结合分子可为例如通过一次或多次分开的施用或通过连续输注来对患者施用的初始候选剂量。根据上述因素，一种典型的日剂量可在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于在几天或更长时间内重复施用，视病症而定，治疗通常将持续直至出现所需的疾病症状抑制。抗体或双特异性抗原结合分子的一种示例性剂量将在从约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其他非限制性实例中，剂量还可以包含每次施用从约1微克/kg体重、约5微克/kg体重、约10微克/kg体重、约50微克/kg体重、约100微克/kg体重、约200微克/kg体重、约350微克/kg体重、约500微克/kg体重、约1毫克/kg体重、约5毫克/kg体重、约10毫克/kg体重、约50毫克/kg体重、约100毫克/kg体重、约200毫克/kg体重、约350毫克/kg体重、约500毫克/kg体重至约1000毫克/kg体重或更多和可从其衍生的任意范围。在从本文中所列的数字衍生的范围的非限制性实例中，可基于上述数字施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5微克/kg体重至约500毫克/kg体重等范围内的剂量。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg中的一种或多种剂量(或其任意组合)。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约2种至约20种或例如约6种剂量的抗体或双特异性抗原结合分子)。可以施用初始较高的负荷剂量，然后施用一种或多种较低的剂量。但是，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定很容易监测此治疗的进展。
本发明的抗体或双特异性抗原结合分子通常将以对达到预期目的有效的量使用。为用于治疗或预防疾病病症，以治疗有效量施用或应用本发明的抗体或双特异性抗原结合分子或其药物组合物。尤其是鉴于本文中提供的详细公开，确定治疗有效量完全在本技术领域技术人员的能力范围之内。
对于全身施用，最初可以从诸如细胞培养物测定的体外测定估计治疗有效剂量。然后可以在动物模型中制定剂量，以达到包括细胞培养物中确定的IC50在内的循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人体有用的剂量。
也可以使用本技术领域中熟知的技术，根据体内数据(例如动物模型)估计初始剂量。本技术领域普通技术人员可以根据动物数据容易地优化对人的施用。
可以单独调节剂量和间隔来提供足以维持治疗效果的抗体或双特异性抗原结合分子的血浆浓度。通过注射施用的常见患者剂量在约0.1-50mg/kg/天的范围内，典型范围为0.5-1mg/kg/天。可以通过每天施用多种剂量来达到治疗有效的血浆浓度。血浆中的浓度可以例如通过HPLC来测量。
在局部施用或选择性摄取的情况下，抗体或双特异性抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域的技术人员将能够在无需过度实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文中所述的抗体或双特异性抗原结合分子的治疗有效剂量通常将提供治疗益处而不引起实质性毒性。可通过标准药学方法在细胞培养物或实验动物中测定抗体或双特异性抗原结合分子的毒性和治疗有效性。可以用细胞培养物测定和动物研究来测定LD50(致死群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，其可以表示为比值LD50/ED50。优选为具有大治疗指数的抗体或双特异性抗原结合分子。在一个实施例中，根据本发明的抗体或双特异性抗原结合分子具有高治疗指数。从细胞培养测定法和动物研究中得到的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选地在包括很小毒性或无毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可根据多种因素(例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的状况等)在此范围内变化。精确的制剂、施用途径和剂量可以由个别医师基于患者的病症来选择(参见例如Fingl等人，1975，在ThePharmacological Basis of Therapeutics，第1章第1页，该文献全文以引用方式并入本文)。
用本发明的抗体或双特异性抗原结合分子治疗的患者的主治医师将指导如何和何时由于毒性、器官功能障碍等而终止、中断或调整施用。相反，主治医师还将知道在临床反应不充分(排除毒性)时如何将治疗调整至更高的水平。在目标疾病的治疗中，施用剂量的大小将随待治疗疾病的严重程度、施用途径等而变化。病症的严重程度可部分地通过例如标准预后评价法来评价。此外，剂量以及可能的施用频率也将根据个体患者的年龄、体重和反应而变化。
其他药物和治疗
本发明的抗体和双特异性抗原结合分子可以在治疗中与一种或多种其他药物联合施用。例如，本发明的抗体或双特异性抗原结合分子可以与至少一种附加治疗剂联合施用。术语″治疗剂″涵盖为治疗需要此类治疗的个体中的症状或疾病而施用的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的特定适应症的任何活性成分，优选地，为那些相互无不利影响的具有互补活性成分。在某些实施例中，该附加治疗剂为免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒剂、细胞凋亡启动剂或增加细胞对凋亡诱导剂敏感性的药物。在一个特定实施例中，该附加治疗剂为抗癌剂，例如微管破坏剂、抗代谢药、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素疗法、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡启动剂或抗血管发生剂。
此类其他药物合适地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药物的有效量视所使用的抗体或双特异性抗原结合分子的量、疾病或治疗的类型以及上文讨论的其他因素而定。抗体或双抗体抗原结合分子通常以与本文中所述相同的剂量和施用途径，或本文中所述剂量的约1％至99％，或以经验上/临床上确定为适当的任意剂量和通过任意途径使用。
上面提到的此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或多种治疗剂包含在同一或单独的组合物中)，以及单独施用，在这种情况下，本发明的抗体或双特异性抗原结合分子的施用可在施用附加治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后发生。本发明的抗体或双特异性抗原结合分子还可以与放射疗法联合使用。
制品
本发明的另一方面提供包含用于治疗、预防和/或诊断上述疾病的制品。制品包括容器和容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料例如玻璃或塑料形成。该容器可容纳组合物，该组合物本身或与有效治疗、预防和/或诊断疾病的另一组合物结合使用，并可能具有无菌入口(例如，容器可为具有可通过皮下注射针头穿孔的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性剂为本发明的抗体或双特异性抗原结合分子。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的疾病。此外，该制品可以包括(a)其中包含有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的抗体或双特异性抗原结合分子；和(b)其中包含有组合物的第二容器，其中组合物包含其他细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的此实施例中的制品可以进一步包含指示组合物可以用于治疗具体疾病的包装插页。可替代地或另外地，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，该容器包含药用缓冲剂，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。从商业和使用者的角度来看，它可以进一步包含其他材料，其中包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施例中，本文提供的任何抗GPRC5D抗体可用于检测生物样品是否存在GPRC5D。如本文所用的术语″检测″，涵盖定量或定性检测。在某些实施例中，生物样品包括细胞或组织(诸如***组织)。
在一个实施例中，提供了一种用于诊断或检测方法中的抗GPRC5D抗体。在另一方面，提供了一种检测生物样品中是否存在GPRC5D的方法。在某些实施例中，该方法包括在允许抗GPRC5D抗体与GPRC5D结合的条件下使生物样品与本文所述的抗GPRC5D抗体接触，并检测抗GPRC5D抗体与GPRC5D之间是否形成复合物。此类方法可为体外或体内方法。在一个实施例中，使用抗GPRC5D抗体来选择适合使用抗GPRC5D抗体进行治疗的受试者，例如GPRC5D为用于选择患者的生物标志物。
可使用本发明的抗体诊断的示例性疾病包括癌症，特别是多发性骨髓瘤。
在某些实施例中，提供了标记的抗GPRC5D抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(例如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及间接检测(例如，通过酶促反应或分子相互作用)的部分，例如酶或配体。示例性标记包括但不限于：放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I；荧光团，例如稀土螯合物或荧光素及其衍生物；玫瑰红及其衍生物；丹磺酰基；伞形酮；荧光素酶，例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)；荧光素；2，3-二氢邻苯二甲二酮；辣根过氧化物酶(HRP)；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡萄糖淀粉酶；溶菌酶；糖类氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶；杂环氧化酶，例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与采用过氧化氢氧化染料前体(例如HRP、乳过氧化酶或微过氧化酶)的酶结合使用；生物素/抗生物素蛋白；旋转标记物；噬菌体标记物；稳定自由基等。
本发明的另一方面涉及与GPRC5D结合的抗体(10B10)，该抗体包含重链可变区(VL)，其中VL可包含与SEQ ID NO：81的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。该抗体可包含轻链可变区(VL)，其中VL包含与SEQ ID NO：82的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。该抗体可包含VH和VL，其中VL可包含与SEQ ID NO：81的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中VL包含与SEQ ID NO：82的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。优选地，该抗体包含：VH，该VH包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列；和VL，该VL包含SEQID NO：82的氨基酸序列。
本发明的另一方面涉及一种抗体(10B10-TCB)。该抗体可包含第一轻链，其中第一轻链包含与SEQ ID NO：67的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。该抗体可包含第二轻链，其中第二轻链包含与SEQ ID NO：68的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。该抗体可包含第一重链，其中第一重链包含与SEQ ID NO：69的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。该抗体可包含第二重链，其中第二重链包含与SEQ ID NO：70的序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一个特定实施例中，该抗体包含：第一轻链，该第一轻链包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列；第二轻链，该第二轻链包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列；第一重链，该第一重链包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列；和第二重链，该第二重链包含SEQID NO：70的氨基酸序列。
氨基酸序列
Figure BDA0003492360380001421
Figure BDA0003492360380001431
Figure BDA0003492360380001441
Figure BDA0003492360380001451
Figure BDA0003492360380001461
Figure BDA0003492360380001471
Figure BDA0003492360380001481
Figure BDA0003492360380001491
Figure BDA0003492360380001501
Figure BDA0003492360380001511
Figure BDA0003492360380001521
Figure BDA0003492360380001531
Figure BDA0003492360380001541
Figure BDA0003492360380001551
Figure BDA0003492360380001561
Figure BDA0003492360380001571
Figure BDA0003492360380001581
Figure BDA0003492360380001591
Figure BDA0003492360380001601
Figure BDA0003492360380001611
Figure BDA0003492360380001621
Figure BDA0003492360380001631
实例
以下为本发明的方法和组合物的实例。应当理解，鉴于上文给出的一般描述，可以实施各种其他实施例。
实例1：肿瘤靶标的表达
为鉴定多发性骨髓瘤在正常浆细胞上表达的差异基因，对来自多发性骨髓瘤(MM)患者的10个样品和来自健康供体骨髓的10个浆细胞(PC)进行RNAseq。根据制造商的说明，使用RNeasy Micro试剂盒(Qiagen)萃取RNA。在RNA萃取过程中，使用无RNA酶的DNA酶套装(Qiagen)去除基因组DNA。萃取的RNA的质量由Agilent Eukaryote Total RNA pico芯片(Agilent Technologies)进行控制。根据制造商的说明，利用Illumina测序所用的SMARTer超低RNA试剂盒(Clontech)由1.6ng总RNA制备和扩增eDNA。然后，按照制造商的说明对1ng扩增的eDNA进行Nextera XT文库制备(Illumina)。测序文库使用Kapa LibraryQuantification试剂盒(Kapa Biosystems)进行定量，并使用高灵敏度芯片(AgilentTechnologies)在Bioanalyzer上通过毛细管电泳进行质量控制。使用第4版簇生成试剂盒和第4版测序试剂(Illumina)，在HiSeq2500测序仪(Illumina)上对文库进行2x50个循环的测序。
B细胞成熟抗原(BCMA)为一种细胞表面蛋白，在恶性浆细胞上表达，因此被视为多发性骨髓瘤的靶标(Tai YT&Anderson Kc，Targeting B-cell maturation antigen inmultiple myeloma，Immunotherapy.2015 NOv；7(11)：1187-1199)。使用RNAseq技术的深入分析表明，GPRC5D在多发性骨髓瘤患者的浆细胞中的表达与BCMA一样高(图2)。更重要地，多发性骨髓瘤患者的浆细胞与健康浆细胞之间GPRC5D的表达差异约为20倍。相反，来自多发性骨髓瘤患者的浆细胞与健康浆细胞之间的BCMA表达差异仅为2倍。GPRC5D的总体表达远高于其他已知的多发性骨髓瘤靶分子，例如SLAM7、CD138和CD38。另外，健康的初始或记忆性B细胞几乎不表达GPRC5D。
实例2：GPRC5D结合物的产生和T细胞双特异性(TCB)抗体的制备
GPRC5D结合物通过大鼠的DNA免疫产生，然后产生杂交瘤，并对杂交瘤进行筛选和测序。利用ELISA，通过其与表达GPRC5D的转染子的结合来测量特异性结合的筛选。在下文中，鉴定出两种GPRC5D结合物，分别称为5E11(SEQ ID NO 13和14)和5F11(SEQ ID NO 15和16)。一旦鉴定出特异性结合物，IgG将转化为T细胞双特异性抗体。将结合物转化为T细胞双特异性抗体的原理在本技术领域的例如PCT公开号WO 2014/131712 A1中举例说明并描述，该专利全文以引用方式并入本文。如图3所示，T细胞双特异性抗体包含两个GPRC5D结合部分和一个CD3结合部分(抗GPRC5D/抗CD3 T细胞双特异性抗体)。制备了以下抗GPRC5D/CD3T细胞双特异性抗体：i)5E11-TCB(SEQ ID NO：17、18、19和20)；ii)5F11-TCB(SEQ ID NO：21、22、23和24)；iii)ET150-5-TCB(SEQ ID NO：25、26、27和28)；iv)B72-TCB(SEQ ID NO：73、74、75和76)；和v)BCMA-TCB(SEQ ID NO：77、78、79和80)。ET150-5 GPRC5D结合部分描述于PCT公开号WO 2016/090329A2中。术语″ET-150-5″在本文中同义地用于术语″Et150-5″，反之亦然。作为阴性对照，制备了非靶向DP47-TCB。DP47-TCB为一种非靶向T细胞双特异性抗体，其仅与CD3结合而不与GPRC5D结合。DP47-TCB描述于PCT公开号WO 2014/131712 A1中，该专利全文以引用方式并入本文。B72-TCB衍生自WO 2018/0117786 A2的表23中公开的GCDB72抗体，并且包含GCDB72的GPRC5D结合部分。B72-TCB以crossmab 1+1形式生成(SEQID NO：73、74、75和76)。BCMA-TCB衍生自WO 2016/166629 A1，并且包含如本文所公开的A02_Rd4_6nM_C01的GPRC5D结合部分。BCMA-TCB以crossmab 2+1形式生成(SEQ ID NO：77、78、79和80)。
实例3：T细胞双特异性抗体与多发性骨髓瘤细胞系的结合
为测量与GPRC5D的结合，对报告的多发性骨髓瘤细胞系(Lombardi等人Molecularcharacterization of human multiple myeloma cell lines by integrativegenomics：insights into the biology of the disease；Genes ChromosomesCancer.2007Mar；46(3)：226-38)进行基于FACS的结合测定。在RPMI 1640+Glutamax培养基(Gibco)中培养细胞系AMo-1、L363和oPM-2，该培养基中添加有20％热灭活的胎牛血清(FBS，Gibco)和1％青霉素-链霉素100X(Gibco)。采用仅添加10％FBS的相同培养基对细胞系WSU-DLCL2(阴性对照)进行培养。细胞系NCI-H929和RPMI-8226也用添加50μM巯基乙醇(Gibco)和1mM丙酮酸钠(Gibco)的相同培养基进行培养。在75cm2烧瓶(TPP)中培养细胞系，每周传代两次。
使用间接染色评估不同抗人GPRC5D-TCB抗体(5E11-TCB、5F11-TCB和ET150-5TCB)的结合。用浓度为10μg/ml至0.00064μg/ml的抗人GPRC5D-TCB构建体5E11-TCB、5F11-TCB或ET150-5 TCB对细胞进行孵育，使用0.2倍连续稀释，或用无构建体的100μL磷酸盐缓冲盐溶液(PBS；Gibco)在4℃孵育1小时。在4℃，用在PBS中以1∶800稀释的Live blue染料(Life Technologies)对细胞染色20min，然后用PE复合的山羊抗人IgG进行染色；在流式细胞仪染色缓冲剂(eBioscience)中，用稀释1/300的Fcγ片段特异性抗体(JacksonLaboratories)在4℃孵育30分钟。在自定义设计的BD Biosciences Fortessa上进行流式细胞仪采集，并使用FlowJo软件(Tree Star，Ashland，OR)和GraphPad Prism软件进行分析。
图4A至图4C显示5E11-TCB和5F11-TCB均以剂量依赖性方式结合所有测试的多发性骨髓瘤细胞系。相比之下，ET150-5-TCB与被测细胞系的结合弱得多。未观察到抗GPRC5D-TCB与WSU-DLCL2细胞(非霍奇金淋巴瘤的GPRC5D-细胞系)的结合。
实例4：抗GPRC5D-TCB介导的T细胞毒性
为测量抗GPRC5D-TCB抗体的功能，实施了体外T细胞毒性测定。简言之，在RPMI1640+Glutamax培养基(Gibco)中培养细胞系AMo-1、L363和oPM-2，该培养基中添加有20％热灭活的胎牛血清(FBS；Gibco)和1％青霉素-链霉素100X(PS；Gibco)。采用仅添加10％FBS的相同培养基对细胞系WSU-DLCL2进行培养。细胞系NCI-H929和RPMI-8226用添加50μM巯基乙醇(Gibco)和1mM丙酮酸钠(Gibco)的相同培养基进行培养。在75cm2烧瓶(TPP)中培养细胞系，每周传代两次。
使用人泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)，在添加有10％FBS(Gibco)+I％PS(Gibco)的IMDM培养基(Gibco)中，以比例为1∶10的靶标∶效应子，用3.105从外周血单核细胞(PBMC)(Buffspende Schlieren的血沉棕黄层)分离的异源性T细胞对细胞系进行共培养。将抗人GPRC5D-TCB抗体(5E11-TCB、5F11-TCB、ET150-5 TCB或DP47-TCB)以1μg/ml至0.000001μg/ml范围内的不同浓度添加至共培养物中，其连续稀释因子为0.1或0μg/ml。在37℃和5％CO2中孵育20小时后，将每孔75μl的上清液转移到96孔白板(Greiner bio-one)中，每孔包含25μl CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay(Promega)。在室温下孵育15min后，在PerkinElmer EnVision上进行发光收集，并使用GraphPad Prism和XLfit软件进行分析。绘制LDH释放的发光信号数据。
图5A至图5E显示5E11-TCB和5F11-TCB均在多发性骨髓瘤细胞系上、特别是在NCI-H929(图5B)、RPMI-8226(图5C)、L363(图5D)和AMO-1(图5A)上介导强T细胞毒性，而在阴性对照细胞系WSU-DLCL2(图5E)上未观察到杀灭作用。相比之下，ET150-5-TCB对所测试的多发性骨髓瘤细胞系的杀灭作用几乎没有下降或明显下降。表1汇总了从图5A至图5E中显示的数据得出的EC50值。EC50值使用Excel中的XLfit附加功能通过将信号的原始数据相对于滴定的TCB进行绘图而计算得出。
表1.抗GPRC5D-TCB介导的杀灭的EC50
NCI-H929 RPMI-8226 L363 AMO-1 WSI-DLCL2
5E11-TCB 0.007nM 0.024nM 0.012nM 0.014nM /
5F11-TCB 0.001nM 0.002nM 0.001nM 0.003nM /
ET150-5-TCB 0.833nM 0.797nM 0.768nM 0.0835nM /
实例5：抗GPRC5D-TCB介导的T细胞活化
为了从机理上解释抗GPRC5D-TCB的作用方式，在存在抗GPRC5D-TCB的情况下，与靶标多发性骨髓瘤细胞系共培养后，测量T细胞的活化。与实例4和图5A至图5E中所述的实验类似，使用人泛T细胞分离试剂盒，在添加有10％FBS(Gibco)+1％PS(Gibco)的IMDM培养基(Gibco)中，以比例为1∶10的靶标∶效应子的细胞系与3.105从PBMC(BuffspendeSchlieren的血沉棕黄层)分离的异源性T细胞进行共培养。将抗人GPRC5D-TCB抗体(5E11-TCB、5F11-TCB、ET150-5 TCB或DP47-TCB)以1μg/ml至0.000001μg/ml范围内的不同浓度添加至共培养物中，其连续稀释因子为0.1或0μg/ml。在37℃和5％CO2中孵育20小时后，将细胞染色以评估T细胞活化。首先在4℃用在PBS(Gibco)中以1：800稀释的Live blue染料(Life Technologies)染色细胞20min。然后，流式细胞仪染色缓冲剂(eBioscience)中，在4℃用AF700抗人CD4(克隆OKT4)、BV711抗人CD8(克隆SK1)、BV605抗人CD25(克隆BC96)、APC-Cy7抗人CD69(克隆FN50)(全部来自BioLegend)以及PE-Cy5.5抗人CD3(克隆SK7；eBioscience)对细胞染色30min。在自定义设计的BD Biosciences Fortessa上进行流式细胞仪采集，并使用FlowJo软件(Tree Star，Ashland，OR)和GraphPad Prism软件进行分析。
图6显示5F11-TCB通过上调活化标志物CD25和CD69而在与NCI-H929细胞的共培养物中诱导T细胞活化，而对照(例如非靶向DP47-TCB并且不含任何TCB)则不诱导T细胞活化。作为另一种阴性对照，将经过5F11-TCB处理的T细胞与WSU-DLCL2细胞共培养，其中T细胞也未活化。这些活化特性在所研究的多种细胞系中保持一致，例如AMo-1、NCI-H929、RPMI-8226、L363(图7A-J)。与较弱的杀灭力一致，除最高测试浓度1mg/kg外，ET150-5-TCB不诱导T细胞活化。
实例6：抗GPRC5D-TCB的定位和内化
用CMFDA(Invitrogen)对NCI-H929细胞染色，并将其接种到24孔板中涂有聚-L-赖氨酸(Sigma)的圆形盖玻片上。用Alexa Fluor 647琥珀酰亚胺酯(InVitrogen，目录号A201106)以2.5的摩尔比标记抗体(5E11-IgG、5E11-TCB、5F11-IgG、5F11-TCB)。将细胞在37℃粘附过夜，然后在不同持续时间和温度下将荧光标记的抗体(Alexa Fluor 647标记的5E11-IgG、-5E11-TCB、-5F11-IgG、-5F11-TCB)直接添加至生长培养基中(在冰上，30分钟；在37℃，1小时；在37℃，3小时)。在每个时间点后，使用冷PBS(Lonza)淬灭反应并洗去未结合的抗体。然后在4℃用Cytofix(BD)固定细胞20分钟，并用PBS洗涤两次。然后转移盖玻片，用Fluoromount G(eBioscience)将其固定在载玻片上，并在成像前于4℃的黑暗环境中放置过夜。用来自Zeiss的倒置LSM 700和60x油镜进行荧光共聚焦显微镜检查。使用与显微镜相连的Zen软件(Zeiss)收集影像，并在IMARIS软件(Bitplane)上查看。图8A显示所有抗体在4℃或37℃都将多发性骨髓瘤细胞系的表面(质膜)染色。如果抗体被细胞内化，则在37℃培养时，荧光染色将出现在细胞质中。未观察到GPRC5D+细胞系对GPRC5D-结合IgG或GPRC5D-结合TCB的内化。通过应用来自细胞膜和细胞质定义区域的目标区域的强度总和(3小时)，进一步证实了这一结果。利用IMARIS软件分析并定量膜与细胞质的信号比。图8B表明，用不同抗体孵育3小时后，膜与细胞质强度的比率不变(约4)，意味着荧光信号集中在表面而不是细胞质中。
实例7：表征GPRC5D结合物：通过ELISA进行重组细胞结合
利用表达人GPRC5D或食蟹猴GPRC5D或鼠GPRC5D或人GPRC5A的稳定转染的CHO克隆分析潜在的前导候选抗体作为IgG的结合。具体而言，使用新鲜培养基将104个细胞(活力≥98％)接种到384孔微量滴定板中(BD Poly D-Lysin，#356662，体积：25μl/孔)。在37℃孵育过夜后，在4℃在2小时内向细胞中添加25μl/孔的抗体稀释液(在1xPBS中15x1∶3稀释，测定浓度从30μg/ml开始)。使用90μl/孔PBST(10xPBS，Roche，#11666789001+0.1％Tween 20)进行一步洗涤后，随后在室温(RT)下添加50μl/孔0.05％戊二醛(Sigma目录号：G5882，溶于1xPBS中)对细胞固定10min。在使用90μl/孔PBST的三个附加洗涤步骤后，添加第二抗体进行检测：对于人类抗体，使用在封闭缓冲剂(1x PBS(Roche#11666789001)+2％BSA(牛血清白蛋白组分V，无脂肪酸，Roche#10735086001)+0,05％Tween 20)中按1∶2000稀释的山羊抗人Igκ链抗体HRP缀合物(Millipore#AP502P)(25μl/孔)。对于大鼠抗体，使用山羊抗大鼠IgG1抗体HRP缀合物(Bethyl#A110-106P)、山羊抗大鼠IgG2a抗体HRP缀合物(Bethyl#A110-109P)和山羊抗大鼠IgG2b抗体HRP缀合物(Bethyl#A110-111P)的混合物，各种抗体在封闭缓冲剂中按1∶10000稀释(25μl/孔)。在室温下孵育1h并使用90μl/孔PBST完成三个额外的洗涤步骤后，在10min内添加25μl/孔TMB底物(Roche订单号11835033001)，并通过在370nm/492nm下测量以确定最终OD的显色。
所有测试的抗体均以pM范围内的EC50值(反映亲和力)显示出与人GPRC5D的阳性结合。仅大鼠IgG 10B10和07A04在表达食蟹猴GPRC5D的CHO细胞上表现出交叉反应，其EC50值与人受体相当(图9)。还检测到所有其他抗体的食蟹猴交叉反应性，但水平低于10B10和07A04(图9)。未检测到与表现小鼠GPRC5D的CHO细胞的显著结合，也未检测到与表现GPRC5A的人CHO细胞的结合(图9)。结合EC50值汇总于表2中。
表2.物种间基于ELISA的GPRC5D结合特性
Figure BDA0003492360380001691
实例8：GPRC5D结合物：重组GPRC5D-TCB介导MM细胞系上的T细胞毒性
为比较GPRC5D-TCB或其他靶向TCB的功能，对多种MM细胞系进行体外T细胞毒性测定：MoLP-2(图10B)、AMo-1(图10C)、EJM(图10D)和NCI-H929(图10G)。简言之，在RPMI 1640+Glutamax培养基(Gibco)中培养细胞系，该培养基中添加有20％热灭活的胎牛血清(FBS；Gibco)和1％青霉素-链霉素100X(PS；Gibco)。用添加有GlutaMax 1X(Gibco)的培养基对MoLP-2进行培养。用仅添加有10％FBS的培养基对OPM-2(图10A)、RPMI-8226(图10E)和L-363(图10F)细胞系进行培养。在添加有50μM巯基乙醇(Gibco)、1mM丙酮酸钠(Gibco)和GlutaMax 1X(Gibco)的培养基中对NCI-H929进行培养。在IMDM(Gibco)+10％FBS(Gibco)和1％PS(Gibco)中对EJM进行培养。在75cm2烧瓶(TPP)中培养所有细胞系，每周传代两次。
使用人泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)，在添加有10％FBS(Gibco)+1％PS(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)中，以比例为10∶1的靶标∶效应子，用从PBMC分离的30万异源性T细胞(Buffspende Schlieren的血沉棕黄层)对细胞系进行共培养。将抗人GPRC5D TCB构建体(5E11-TCB、5F11-TCB、10B10-TCB、B72-TCB、BCMA-TCB和DP47-TCB)以12.5nM至0.0000125nM范围内的不同浓度加入共培养物中，按1/10连续稀释，并与未经处理的样品进行比较。在37℃和5％CO2中孵育20小时后，将每孔75μl的上清液转移到96孔白板(Greinerbio-one)中，每孔包含25μl CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay(Promega)。在室温下孵育15min后，在PerkinElmer EnVision上进行发光收集，并使用GraphPad Prism和XLfit软件进行分析。绘制LDH释放的发光信号数据(图10)。图10A-G总结了表明在MM细胞系5E11-TCB和5F11-TCB相比于BCMA-TCB、10B10-TCB和B72-TCB具有更强的T细胞毒性介导作用的数据。TCB介导的杀灭的EC50示于表3中，并根据不同供体T细胞的不同实验的平均值计算得出(n＝2或n＝3)。
表3.体外杀灭试验的EC50值
Figure BDA0003492360380001711
实例9：健康人体骨髓细胞中的体外T细胞活化
在采样后1天或2天，对四个不同的健康供体(Lonza#1M-105，批号0000739254；0000739255；0000739256和0000734008)的新鲜未经处理的骨髓进行处理。在室温使用BDPharm Lysis缓冲剂(BD#555899；1X，溶于无菌水中)进行快速红细胞裂解5分钟后，通过离心和分别在126g和443g进行缓冲剂交换，将细胞洗涤2次。对细胞进行计数，并以300000cells/mL的浓度悬浮在RPMI 1640 Glutamax+20％HI胎牛血清+2％人血清+1％青霉素/链霉素(均来自Gibco)中，并将100μL细胞悬液接种接种到96孔板圆底(TPP)的各个孔中。向每个孔中加入培养基或添加有50μL浓度为200nM(4X)至20pM的B72-TCB、5F11-TCB、5E11-TCB、BCMA-TCB、10B10-TCB或DP47-TCB的培养基，按1/10进行连续稀释。最后，以6Mio/mL(效应物T与健康骨髓靶细胞的比例为10∶1)加入来自健康供体PBMC的泛T细胞(MiltenyiBiotec，#130-096-535)的50μL异源性分离的T细胞。在加湿培养箱中于37℃孵育过夜后，将细胞用PBS洗涤一次，并在4℃用50μL在PBS中按1/800稀释的Live blue(Invitrogen，#L23105)染色20分钟。洗涤后，将细胞与以下在FAC缓冲剂(PBS 1X，2％胎牛血清；1％0.5MEDTA PH 8；0.25％NaN3叠氮化钠(20％))中稀释的抗体混合物于4℃孵育30分钟：CD25BV605、CD69 APC-Cy7、BCMA BV421、CD38 BV510、CD138 FITC、按1/100稀释的FcRH5 PE和CD8 BV711、CD3 PE-Cy5以及按1/300稀释的CD4 AlexaFluor 700(均来自BioLegend)和GPRC5D AlexaFluor 647(内部制备，克隆5E11 IgG)。洗涤后，将细胞重悬于100μL FAC缓冲剂中，并用Fortessa(BD Biosciences)收集数据。
图11A-F中显示的数据表明，B72-TCB诱导健康骨髓中T细胞的非特异性活化(通过CD69的上调测得)，但测试的其他任何TCB均不存在此诱导作用。如图所示，B72-TCB诱导的非特异性活化为一种浓度依赖性效应，在50nM下比5nM下更明显(图12A和12B)。
实例10：TCB的体内效力
在效力研究中，比较了携带完全人源化NSG小鼠的多发性骨髓瘤中不同TCB构建体(GPRC5D 5F110-TCB、5E11-TCB、BCMA-TCB和B72-TCB)的肿瘤消退率。NCI-H929细胞最初从ATCC取得，而OPM-2细胞则从DSMZ取得。两种细胞系均得到扩增。在包含10％FCS和2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、1mM丙酮酸钠的RPMI中，对培养基进行培养。将细胞置于水饱和气氛和5％CO2中进行培养。以2.5x106NCI-H929和5x106 OPM-2细胞/动物的浓度，将RPMI细胞培养基(Gibco)和GFR matrigel(1∶1，总体积为100μl)中的细胞皮下注射到动物右胁，活力＞95.0％。
实验开始时4-5周龄的雌性NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠(在法国里昂的Charles River繁殖)保持无病原体条件，根据规定的指南每天光照12h/黑暗12h(GV-Solas；Felasa；TierschG)。实验研究方案已经由地方政府审查和批准(RoB-55.2-2532.Vet_03-16-10)。收到动物后，将动物饲养一周以适应新环境并进行观察。定期进行持续的健康状况监测。
根据方案，经腹膜内注射，对雌性NSG小鼠给予15mg/kg Busulfan，一天后静脉注射从脐带血中分离出的1x105人造血干细胞。在干细胞注射后第16-20周，对小鼠放血，并利用流式细胞仪分析血液是否成功实现人源化。将有效移植的小鼠根据其人T细胞频率随机分入不同的治疗组中(n＝10/组)。那时，将肿瘤细胞注射到小鼠中。如上所述，在肿瘤大小达到约200mm3时，每周用化合物或PBS(载剂)治疗一次。向所有小鼠静脉注射不同剂量的TCB分子(见图13A至图13D以及图14A至图14D)。
为了得到适当量的化合物，用组氨酸缓冲剂(20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0)稀释储备液。使用卡尺每周测量两次肿瘤生长，并依据以下方法计算肿瘤体积：
Tv：(W2/2)x L (W：宽；L：长)
终止研究并在四次注射化合物后处死所有小鼠，分离出肿瘤并称重。
图13A至图13D显示了在治疗后接受NCI-H929注射的所有动物的肿瘤生长动力学。5F11-TCB在1mg/kg或0.1mg/kg下诱导所有动物完全肿瘤缓解(图13A)，而B72-TCB在1mg/kg的剂量下仅诱导部分肿瘤缓解，而0.1mg/kg的剂量下则无效果(图13C)。BCMA-TCB还以1mg/kg的剂量诱导部分肿瘤缓解(图13B)。
图14A至图14D显示了在治疗后接受OPM-2注射的所有动物的肿瘤生长动力学。5F11-TCB(图14A，上图)和5E11-TCB(图14B，上图)以0.1mg/kg的剂量导致大多数动物完全缓解，而B72-TCB(图14C，上图)在0.1mg/kg的剂量下在控制肿瘤生长方面效力较弱。与B72-TCB(图14C，下图)相比，在0.01mg/kg的剂量下，5F11-TCB(图14A，下图)和5E11-TCB(图14B，下图)更有效地抑制了肿瘤的生长。
实例11：抗GPRC5D抗体的人源化
通过查询人V区和J区序列的BLASTp数据库中的鼠输入序列(裁剪为可变部分)，确定合适的人受体框架。选择人受体框架的选择标准为序列同源性、相同或相似的CDR长度、人种系的估计频率以及VH-VL结构域接口的某些氨基酸的保守性。在种系鉴定步骤之后，将鼠输入序列的CDR移植到人受体框架区。评估这些初始CDR移植物与亲本抗体之间每个氨基酸的差异，以评估可能对相应可变区的结构完整性的影响，并在认为适当时引入针对亲本序列的″反向突变″。结构评估基于亲本抗体和人源化变体的Fv区同源性模型，这些模型使用内部抗体结构同源性建模方案建立，该方案使用BIoVIA Discovery StudioEnvironment 17R2版实现。在某些人源化变体中，包括″正向突变″，即，氨基酸交换将在亲本结合剂的给定CDR位置上发生的原始氨基酸改变为在人受体种系的等效位置上发现的氨基酸。目的在于增加人源化变体的总体人类特征(超出框架区)，以进一步降低免疫原性风险。
使用内部开发的计算机仿真工具预测配对的VH和VL人源化变体的VH-VL结构域方向(如WO 2016/062734A1所述，该专利全文以引用方式并入本文)。将结果与亲本结合剂的预测的VH-VL结构域取向进行比较，以选择几何形状与原始抗体接近的构架组合。合理的做法为检测VH-VL接口区域中可能的氨基酸交换，这些交换可能导致两个结构域的配对发生破坏性变化，进而对结合特性产生不利影响。
GPRC5D结合物5E11的受体框架选择及其适应性
根据下表4选择受体框架。
表4.GPRC5D结合物5E11的受体框架
Figure BDA0003492360380001741
CDR3后框架区来自人IGHJ种系IGHJ3*02(DAFDIWGQGTMVTVSS)和人IGHJ种系IGKJ5*01(ITFGQGTRLEIK)。与受体框架相关的部分以粗体显示。
基于结构上的考虑，在5E11人源化变体的某些位置引入从人受体框架到亲本结合物中氨基酸的反向突变(表5和6)。此外，某些位置被确定为正向突变的有前景的候选位置，其中亲本结合剂的CDR中的氨基酸被人受体种系中发现的氨基酸取代。下表中详细列出了这些变化。
注：反向突变以b为前缀，正向突变以f为前缀，例如bS49A指位置49发生从丝氨酸到丙氨酸的反向突变(人种系氨基酸到亲代抗体氨基酸)。所有残基索引在Kabat编号中给出。
表5.VH/VL 5E11人源化变体列表
Figure BDA0003492360380001742
Figure BDA0003492360380001751
表6.VH/VL 5E11人源化变体的序列
Figure BDA0003492360380001752
Figure BDA0003492360380001761
GPRC5D结合物5F11的受体框架选择及其适应性
根据下表7选择受体框架。
表7.GPRC5D结合物5F11的受体框架
Figure BDA0003492360380001762
CDR3后框架区来自人IGHJ种系IGHJ3*02(DAFDIWGQGTMVTVSS)和人IGHJ种系IGKJ2*01(YTFGQGTKLEIK)。与受体框架相关的部分以粗体显示。
基于结构上的考虑，在5F11人源化变体的某些位置引入从人受体框架到亲本结合物中氨基酸的反向突变(表8和9)。此外，某些位置被确定为正向突变的有前景的候选位置，其中亲本结合剂的CDR中的氨基酸被人受体种系中发现的氨基酸取代。下表中详细列出了这些变化。
注：反向突变以b为前缀，正向突变以f为前缀，例如bA93T指位置93发生从丙氨酸到苏氨酸的反向突变(人种系氨基酸到亲代抗体氨基酸)。所有残基索引在Kabat编号中给出。
表8.VH/VL 5F11人源化变体列表
Figure BDA0003492360380001763
Figure BDA0003492360380001771
表9.VH/VL 5F11人源化变体的序列
Figure BDA0003492360380001772
Figure BDA0003492360380001781
利用ELISA表征人源化变体
为表征GPRC5D结合物的VH和VL结构域的人源化变体，使用如上文所述的ELISA方案(参见实例7)。表10中汇总了5E11的人源化变体数据，表11中汇总了5F11的人源化变体数据。表12显示了亲本5E11和亲本5E11以及所选的人源化变体的CDR序列。
表10.5E11的人源化变体的表征
Figure BDA0003492360380001782
Figure BDA0003492360380001791
表10.续
Figure BDA0003492360380001792
Figure BDA0003492360380001801
表11.5F11的人源化变体的表征
Figure BDA0003492360380001802
Figure BDA0003492360380001811
表11.续
Figure BDA0003492360380001812
Figure BDA0003492360380001821
表12.一系列人源化变体的CDR序列
Figure BDA0003492360380001822
实例12：在存在所选的抗GPRC5D IgG的不同人源化变体的情况下，CAR-J细胞的体外活化
依据以下方法对不同人源化抗GPRC5D IgG活化PGLALA-CAR-J效应细胞的能力。将表达GPRC5D的多发性骨髓瘤靶细胞L363(Diehl等人，Blut 36：331-338(1978))与抗PGLALA-CAR-J效应细胞(表达针对IgG分子的Fc部分中的PGLALA(P329G L234A L235A)突变的TCR并且包含NFAT启动子的Jurkat-NFAT人急性淋巴白血病报告细胞系，如PCT申请号PCT/EP2018/086038和PCT申请号PCT/EP2018/086067中所公开)共培养。在IgG分子与L363细胞和PGLALA-CAR-J细胞上的GPRC5D同时结合后，NFAT启动子被活化并导致活性萤火虫荧光素酶的表现。
在分析中，将人源化IgG变体在RPMI 1640培养基(包含Glutamax、15％HI胎牛血清、1％青霉素-链霉素；均来自GIBCO)中稀释，并转移至圆底96孔板中(最终浓度为0.2pg/ml至10μg/ml)。每孔添加20000个L363细胞，并加入抗PGLALA-CAR-J效应细胞，使最终效应物(抗PGLALA-CAR-J)与靶标(L363)细胞的比例为5∶1，并且每个孔的最终体积为200μl。在加湿培养箱中，将细胞置于37℃孵育大约16h。在孵育时间结束时，将100μl/孔的上清液转移到白色平底96孔板(Costar)中，并与另外100μl/孔的ONE-Glo荧光素酶底物(Promega)孵育5min，然后使用PerkinElmer Envision读取发光。使用GraphPad Prism将行数据相对于IgG浓度的相对发光信号(RLU)作图，并使用XL-fit软件计算EC50。
如图15A至图15B和表13所示，所有评估的GPRC5D IgG在与表达GPRC5D的靶细胞和抗-PGLALA-CAR-J细胞同时结合时诱导CAR-J活化。对于抗GPRC5D结合物5F11和5E11，与亲本抗体预人源化相比，可以鉴定出具有类似或甚至改善的EC50值的人源化变体。对于结合物5F11，分子P1AE5741可诱导最强的活化作用(图15A)。对于结合物5E11，分子P1AE5730和P1AE5723可诱导最强的活化作用(图15B)。
表13.CAR-J活化的EC50值
Figure BDA0003492360380001841
实例13：进一步T细胞双特异性抗体的制备
将结合物转化为T细胞双特异性抗体的原理在本技术领域的例如PCT公开号WO2014/131712 A1中举例说明并描述，该专利全文以引用方式并入本文。如图3所示，T细胞双特异性抗体包含两个GPRC5D结合部分和一个CD3结合部分(抗GPRC5D/抗CD3 T细胞双特异性抗体)。制备以下抗GPRC5D/抗CD3 T细胞的双特异性抗体：i)6623(SEQ ID NO 114、115、116和117)；ii)6624(SEQ ID NO 118、119、120和121)；iii)6625(SEQ ID NO 122、123、124和125)；iv)6626(SEQ ID NO 126、127、128和129)。DP47-TCB(″非靶向TCB″)描述于PCT公开号WO 2014/131712 A1中，该专利全文以引用方式并入本文。B72-TCB衍生自WO 2018/0117786 A2的表23中公开的GCDB72抗体，并且包含GCDB72的GPRC5D结合部分(实例7)。术语″B72 TCB″在本文中也指术语″B72″。BCMA-TCB衍生自WO 2016/166629 A1，并且包含如本文所公开的A02_Rd4_6nM_C01的GPRC5D结合部分。如实例2所述，BCMA-TCB以crossmab 2+1形式生成(SEQ ID NO 77、78、79、80)。术语″5F11-TCB″和″5F11p-CH2527″在本文中可互换使用。术语″5E11-TCB″和″5E11p-CH2527″在本文中可互换使用。
实例14.1：T细胞双特异性抗体与多发性骨髓瘤细胞系和Jurkat-NFAT细胞的结合
为测量与GPRC5D的结合，对报告的多发性骨髓瘤细胞系(Lombardi等人Molecularcharacterization of human multiple myeloma cell lines by integrativegenomics：insights into the biology of the disease；Genes ChromosomesCancer.2007Mar；46(3)：226-38)进行基于流式细胞仪的结合测定。将细胞系NCI-H929(
Figure BDA0003492360380001842
CRL-9068)置于添加有10％FBS、1x青霉素/链霉素(Gibco)、1x丙酮酸钠(Gibco)和50μM β-巯基乙醇(Gibco)的RPMI 1640和Glutamax培养基(Gibco)中进行培养。将Jurkat-NFAT报告细胞(带有NFAT启动子的表达CD3的人急性淋巴白血病报告细胞，GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P，Promega#CS176501)在RPMI 1640中培养，该溶液中包含2g/l葡萄糖、2g/l NaHCO3、10％FCS、25mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、1x NEAA、1x丙酮酸钠和200μg/ml潮霉素B。
将96圆底孔板中每个孔中的0.1Mio细胞与100nM至1.3pM(连续稀释倍数1∶5)的指定GPRC5D-TCB构建体5E11p-CH2527、6625、6626、5F11p-CH2527、6623或6624或无构建体在4℃孵育30min。用FACS缓冲剂(PBS，2％胎牛血清；1％0.5M EDTA pH 8；0.25％NaN3叠氮化钠(20％))将细胞洗涤两次，并用FACS缓冲剂中按1/100稀释PE-缀合的山羊抗人IgG、Fcγ片段特异性(Jackson Laboratories，109-606-008)在4℃再染色30min。
使用自定义设计的BD Biosciences Fortessa进行流式细胞术采集，并使用BDDiva进行分析。使用GraphPad Prism软件计算EC50值。
图16表明所有TCB分子均能够以浓度依赖性方式与人GPRC5D以及人CD3两者结合。简言之，5E11p-CH2527的两个人源化版本(即6625和6626)与亲本TCB的结合均表现出与人GPRC5D的增强结合，这也导致结合EC50值降低(图16A和表14.1)。此外，与5F11p-CH2527和6623相比，6624与人GPRC5D的结合略有增强(图16B)。通常，所有基于5F11的分子都比基于5E11的分子表现出更出色的与人GPRC5D的结合。所有基于5E11的TCB分子表现出相当的与人CD3的浓度依赖性结合(图16C)，而与表达人CD3的Jurkat-NFAT细胞一起孵育时，5F11p-CH2527的两种人源化变体(即6623和6624)在最高抗体浓度下表现出比亲本更强的整体结合信号(图16D)。
表14.1：所显示的GPRC5D-TCB分子与NCI-H929上表达的人GPRC5D或Jurkat细胞上表达的人CD3结合的EC50值(nM)。
EC50(nM) 5E11p-CH2527 6625 6626 5F11p-CH2527 6623 6624
NCI-H929 3.36 1.15 0.85 0.18 0.36 0.1
Jurkat 3.67 11.47 7.8 2.31 n.c. n.c.
实例14.2：T细胞双特异性抗体与多发性骨髓瘤细胞系的结合
由于实例14.1中显示的数据被错误地计算为10倍，因此EC50值过低。因此，为重新评估与GPRC5D的结合，对报告的多发性骨髓瘤细胞系(Lombardi等人Molecularcharacterization of human multiple myeloma cell lines by integrativegenomics：insights into the biology of the disease；Genes ChromosomesCancer.2007 Mar；46(3)：226-38)进行一系列基于FACS的结合测定。在添加有20％热灭活的胎牛血清(FBS，Gibco)的RPMI 1640+1％Glutamax培养基(Gibco)中对细胞系OPM-2进行培养。在添加有10％热灭活的胎牛血清(FBS，Gibco)、50μM巯基乙醇(Gibco)和1mM丙酮酸钠(Gibco)的RPMI 1640+1％Glutamax培养基(Gibco)中对细胞系NCI-H929进行培养，并在添加有10％热灭活的胎牛血清(FBS，Gibco)的RPMI 1640+1％Glutamax培养基(Gibco)中对RPMI-8226进行培养。在75cm2烧瓶(TPP)中培养细胞系，每周传代两次。
简言之，收获悬浮细胞，对其计数并评估生存力。所有后续步骤均在4℃进行。
将细胞以每毫升0.5Mio个细胞重悬于PBS中。接下来，将0.05Mio细胞接种到圆底96孔板的每个孔中，离心并弃去上清液。用包含Fc阻断剂(BioLegend#422302，按1∶400的比例预稀释)的zombie aqua生存力染色剂(BioLegend#423102，按1∶400的比例预稀释)对细胞染色20分钟，每个孔的总体积为50μl。用FACS缓冲剂洗涤细胞，并与浓度递增的5E11(6625)-TCB(在本文中也称为6625)(0.7nM-500nM，每个孔的总体积为25μl)一起在4℃孵育30分钟。对测定板进行离心，并弃去上清液。
此后，通过平稳的涡旋将细胞重悬，并在4℃以每个孔总体积25μl的温度再孵育30min，在FACS缓冲剂中包含500nM二级抗体(aPGLALA mulG2b Alexa 647，内部制备)。将细胞洗涤一次，并在配备FACS Diva的BD流式细胞仪上进行分析。使用GraphPadPrism6取得结合曲线和EC50值。重复分析1的EC50值对应于图25A、图25B和图25C中所示的图。重复分析2的EC50值对应于图25D、图25E和图25F中所示的图。重复分析3的EC50值对应于图25G、图25H和图25I中所示的图。
图25显示了5E11(6625)-TCB与表达各种水平的人GPRC5D的MM细胞系的浓度依赖性结合。结合的EC50为20nM至158nM，并且由于细胞上靶标表达量的变化而显示出一些测定变化。
表14.2. 5E11(6625)-TCB与在不同确定的MM细胞系上表达的人GPRC5D的结合的EC50值
EC50(nM) OPM-2 NCI-H929 RPMI-8226
重复分析1 34.5 75.8 26.8
重复分析2 75.5 ～123.2 20.4
重复分析3 54.2 ～158.2 55
实例15
使用RPMI-8226(
Figure BDA0003492360380001871
CCL-155)细胞与Jurkat-NFAT报告细胞(Promega#CS176501)的共培养物，评估GPRC5D-TCB在同时结合人CD3和人GPRC5D时诱导CD3介导的Jurkat-NFAT效应细胞活化的能力。在TCB分子与RPMI-8226细胞上的人GPRC5D和Jurkat-NFAT报告细胞上的人CD3抗原同时结合后，NFAT启动子被活化并导致活性萤火虫荧光素酶的表现。发光信号的强度(通过添加荧光素酶底物取得)与CD3活化和信号传导的强度成正比。
在测定时，在96孔板的每个孔中接种20000个RPMI8226细胞，并在包含20％FBS和1％Pen/Strep的RPMI中以1∶10连续稀释倍数添加指示的TCB分子以取得50nM至5fM的最终浓度范围。向每个孔中添加50000Jurkat-NFAT细胞，取得2.5∶1的最终E∶T比率。在37℃和5％CO2中孵育过夜后，将100μl ONE-Glo试剂(Promega)加入等体积的测定上清液中，并在室温下避光保存5分钟。使用Perkin Elmer读板仪分析发光。
如图17A所示，所有评估的GPRC5D TCB分子均以剂量依赖性方式诱导Jurkat-NFAT活化，而在两种非靶向DP47 TCB对照分子中任一个的存在下均未得到明显的信号。非靶向DP47 TCB 1包含CD3结合物，该结合物包含SEQ ID NO：104的VH和SEQ ID NO：105的VL。非靶向DP47 TCB 2包含CD3结合物，该结合物包含SEQ ID NO：35的VH和SEQ ID NO：36的VL。使用GraphPadPrism6计算Jurkat活化的相应EC50值，并列于表15中。考虑到EC50以及AUC(见表15)，分子的排序如下：6624＞6623＞5F11p-CH2527＞6626～6625＞5E11p-CH2527。
在存在其他(多发性骨髓瘤)细胞系的情况下进行了类似的测定，该细胞系表达各种浓度的人GPRC5D(通过流量(Quantum Simply Cellular，Bangslabs)测定)，并以细胞系名称旁边括号中的GPRC5D结合位点编号指示。
使用GraphPadPrism计算EC50和AUC，并将其绘制在x轴与y轴上(图17B至图17G)。
如图17B至图17G所示，在存在具有各种相对GPRC5D表达的细胞系的情况下，所有分子均表现出浓度依赖性Jurkat活化；分子排序类似，并且与存在的靶细胞系无关。
表15：EC50值(pM)或曲线下面积(AUC)由存在RPMI-8226细胞的情况下GPRC5D-TCB介导的Jurkat-NFAT报告细胞的活化计算得出，其通过过夜孵育(～20h)后的发光进行测量。
Figure BDA0003492360380001881
实例16：GPRC5D-TCB介导的T细胞毒性
为进一步测量抗GPRC5D-TCB抗体的功能，实施了体外肿瘤细胞裂解测定。简言之，将AMo-1(DSMZ ACC 538)、NCI-H929
Figure BDA0003492360380001891
CRL-9068、LP-1(DSMZ ACC 41)和IM-9(
Figure BDA0003492360380001892
CCL-159)细胞系与作为效应细胞的人泛T细胞共培养，最终效应子与靶标的比率为10∶1。使用人泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)，从健康供体的外周血单核细胞(PBMC)中分离出人泛T细胞。加入浓度递减(在50nM至5pM的范围内，稀释倍数为1∶10)的指示GPRC5D-(6625和B72)或靶向BCMA的T细胞结合双分子。纳入非靶向TCB作为阴性对照。
在37℃和5％CO2孵育20小时后，按照制造商的手册通过定量发光信号(CytoTox-Glo细胞毒性测定法，Promega)确定细胞死亡。将相对发光信号(RLU)显示为确定细胞死亡的直接指标。使用GraphPadPrism计算EC50和AUC，并汇总于表16中。
图18A至图18D表明，所有TCB分子均能够分别诱导人GPRC5D和BCMA的相对表达量变化的各种肿瘤细胞系的浓度依赖性裂解。6625和B72的直接比较结果显示，6625分子具有更高的效力和效价。6625与BCMA-TCB的比较结果显示，在存在AMo-1(图18A)、NCI-H929(图18B)和LP-1(图18C)的情况下，6625的体外效力和效价更高。而BCMA-TCB诱导IM-9的更强肿瘤细胞裂解(图18D)，其表现的GPRC5D浓度较低。在测试的细胞系上，6625和BCMA-TCB的不同排序可能通过GPRC5D与BCMA在这些细胞系上的不同相对表达浓度来解释。
表16：在存在指定的细胞系的情况下由GPRC5D-或BCMA-TCB介导的肿瘤细胞裂解计算EC50值(pM)，并在孵育过夜(～20h)后通过发光确定。
EC50(pM) 肿瘤适应症 6625 B72 BCMA-TCB
AMO-1 浆细胞瘤 8.3 79.9 137.1
NCI-H929 MM 0.597 26.95 171
LP-1 MM 7.99 48.95 76.36
IM-9 来自MM患者的B类淋巴母细胞 266.9 197.5 55.69
表17：在存在指定的细胞系的情况下由GPRC5D-或BCMA-TCB介导的肿瘤细胞裂解计算曲线下面积，并在孵育过夜(～20h)后通过发光确定。
AUC 肿瘤适应症 6625 B72 BCMA-TCB
AMO-1 浆细胞瘤 80117761 54494020 47326610
NCI-H929 MM 17872547 10854134 10684467
LP-1 MM 15438497 11504124 11100680
IM-9 来自MM患者的B类淋巴母细胞 9268093 8600921 10994563
实例17：在存在初代MM样品的情况下，抗GPRC5D-TCB介导的T细胞活化
为评估GPRC5D TCB分子在初代多发性骨髓瘤样品上的活性，使用BD Pharm Lysis缓冲剂(#555899)解冻冷冻的未经处理的骨髓样品(Proteogenex)，并进行快速的红细胞裂解。然后，洗涤细胞，将其重悬于RPMI 1640 Glutamax中，其中包含20％热灭活的胎牛血清、2％人血清和1％青霉素/链霉素(均来自Gibco)，并以每孔100μL细胞悬液(30000个细胞)的量将其接种到96孔板圆底(TPP)中。加入自体T细胞，使得混合BM样品中的每个细胞对应10个T细胞。加入指示的分子，使最终浓度范围为50nM至0.05nM(按1∶10稀释)，96孔板中每个孔中的总体积为200μl。
在加湿培养箱中于37℃孵育过夜后，将细胞用PBS洗涤一次，并在4℃用50μL Liveblue(Invitrogen，#L23105)染色20分钟，以区分活细胞与死细胞。根据制造商的建议，使用以下抗体的混合物进行表面染色：CD25 BV605、CD69 APC-Cy7、CD38 BV510、CD138 FITC、CD8 BV711、CD3 PE-Cy5和CD4 AlexaFluor700(均来自BioLegend)。在最终分析中，将细胞重悬于100μL FAC缓冲剂中，并用Fortessa(BD Biosciences)收集数据。图19显示了由存活的CD8 T细胞的百分比确定的T细胞活化百分比，其中早期活化标志物CD69呈阳性。T细胞活化的EC50由Graph Pad Prism计算得出，并汇总于表18中。靶向GPRC5D的两种代表性双分子，即6624和6625，均能够诱导浓度依赖性T细胞活化，其EC50分别为1.06pM和14.8pM，而在存在非靶向TCB对照的情况下，则未诱导T细胞活化。在所示的情况下，BCMA-TCB活化的T细胞的程度小于所评估的两种GPRC5D TCB分子。潜在的原因可能为GPRC5D和BCMA的相对表现量差异(未评估)。仅在比使用6624和6625观察到的浓度高得多的浓度下，B72分子才诱导显著的T细胞活化，但是在测得的两种最高浓度下，B72导致更高的总体活化。正如我们在健康供体的骨髓样品中观察到的在类似的B72浓度的T细胞活化一样，目前尚不清楚在存在初代MM样品的情况下观察到的B72效应是否纯粹具有靶标依赖性(见图21)。
表18：EC50值(pM)，由GPRC5D-或BCMA-TCB介导的自体T细胞活化计算得出，与初代MM样品一起孵育，并在大约24h后通过流式细胞术分析CD8 T细胞上的CD69进行定量。
Figure BDA0003492360380001911
实例18：健康供体的PBMC孵育后的B细胞耗竭
利用经典的密度梯度离心，从健康供体的血液中分离出人PBMC。在包含10％FBS和1％Pen/Strep的RPMI 1640培养基中，以每孔200000个PBMC的量将其接种到96孔板中。加入指示的双特异性分子，使其最终浓度达到50nM、5nM、0.5nM或0.05nM，每个孔的总体积为200μl。在加湿培养箱中于37℃培养48h后，用FACS缓冲剂洗涤细胞，并根据制造商的操作规程将细胞与Human TruStain FcXTM(Fc block，BioLegend)一起孵育以封闭Fc受体。使用Liveblue(Invitrogen，#L23105)区分活细胞与死细胞(参见实例17)。在4℃对以下标志物进行30min的表面表达：CD19、CD45、CD4、CD38、CD8、CD138(均来自BioLegend)。为了对每个孔中的B细胞进行绝对定量，在使用BD FACS Fortessa进行流式细胞分析之前，向每个孔中加入10μl CountBright绝对计数珠(Invitrogen#C36950)。图20A至图20D显示了5种不同健康供体的总结，这些供体已经用指定的双特异性分子在不同抗体浓度下进行了评估，所述浓度分别为50nM(图20A)、5nM(图20B)、0.05nM(图20C)和0.05nM(图20D)。根据重复测定结果的SD(每个供体)，按照未经处理的对照对B细胞计数进行归一化。在BCMA-TCB以及GPRC5D-TCB6626中均观察到健康B细胞的大量消耗，而其他靶向GPRC5D的TCB(包括B72)在大多数供体中均未显著消耗B细胞。利用6626观察到的B细胞耗竭作用仅限于高于约5nM的浓度，而BCMA-TCB耗竭在0.05nM的浓度下已导致健康B细胞耗竭。总之，结果表明，靶向GPRC5D的分子耗竭健康B细胞的风险似乎要低得多，这可能体现了它的安全性优势。
实例19：健康供体骨髓样品孵育后对T细胞活化的影响
在采样后1天，对健康供体(Lonza)的未经处理的骨髓进行评估。使用(BD Pharm裂解缓冲剂#555899)快速裂解红细胞后，洗涤细胞，将其重悬于RPMI 1640 Glutamax中，其中包含20％热灭活的胎牛血清、2％人血清和1％青霉素/链霉素(均来自Gibco)，并以每孔100μL细胞悬液(30000个细胞)的量将其接种到96孔板圆底(TPP)中。加入指示的分子，使最终浓度范围为5nM至0.05nM(按1∶10稀释)，96孔板中每个孔中的总体积为200μl。
在加湿培养箱中于37℃孵育过夜后，将细胞用PBS洗涤一次，并在4℃用50μL Liveblue(Invitrogen，#L23105)染色20分钟，以区分活细胞与死细胞。根据制造商的建议，使用以下抗体的混合物进行表面染色：CD25 BV605、CD69 APC-Cy7、CD38 BV510、CD138 FITC、CD8 BV711、CD3 PE-Cy5和CD4 AlexaFluor700(均来自BioLegend)。在最终分析中，将细胞重悬于100μL FAC缓冲剂中，并用Fortessa(BD Biosciences)收集数据。图21显示了T细胞活化，其通过指定治疗后的CD69阳性CD8+(A)或CD4+ T细胞(B)的百分比确定。
利用BCMA-TCB或B72检测到骨髓样品中存在明显的浓度依赖性T细胞活化，而利用6624或6625则检测不到。这说明以更高的剂量使用时，6624和6625等分子比BCMA-TCB或B72具有潜在的安全性优势。
实例20：健康供体人全血中的细胞因子释放
在BD Vacutainer锂肝素管中收集来自6位健康供体的全血，并在3小时内进行分析。在PBS(Gibco#14190)中稀释GPRC5D-TCB 6624和6625以及非靶向TCB对照分子，并在圆底96孔板(Corning#Costar 3799)中将5μL加入195μL全血中，使最终浓度达到50、0.5和0.005nM。单克隆抗体Gazyva(奥比妥珠单抗)和Lemtrada(阿仑单抗)的相似检测浓度分别为50、0.5和0.005nM，而Erbitux(西妥昔单抗)的检测浓度为50nM。PBS仅用作载剂对照。在37℃孵育24h后，将板以1800g(3000rpm)离心5min。根据制造商的建议，在使用Millipore试剂盒(HCYToMAG-60K)和Luminex阅读器LX 200进行多重细胞因子检测之前，收集血浆上清液(～70μl)并保存在-80℃。如图22A(人TNFa)和图22B(人IL-6)所汇总，6624诱导的低水平TNFa和IL-6的分泌水平与Gazyva类似，而6625诱导的水平甚至更低，表明6624可能在细胞因子释放方面表现出良好的安全性。
实例21：NCI-H929(hNSG小鼠)中不同GPRC5DxCD3双特异性TCB分子的体内效力
为进一步评估GPRC5D TCB分子6623、6624、6625和6626的效力，评估了它们在具有多发性骨髓瘤的完全人源化NSG小鼠中诱导肿瘤消退的潜力。将生存力＞95.0％的2.5x106NCI-H929细胞重悬于RPMI细胞培养基(Gibco)和GFR matrigel(1∶1，总体积为100μl)中，并皮下注射到人源化雌性NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠右胁。
小鼠的人源化方法如下：实验开始时4-5周龄的小鼠(在法国里昂的CharlesRiver繁殖)保持无病原体条件，根据规定的指南每天光照12h/黑暗12h(GV-Solas；Felasa；TierschG)。实验研究方案已经由地方政府审查和批准(RoB-55.2-2532.Vet_03-16-10)。收到动物后，将动物饲养一周以适应新环境并进行观察。定期进行持续的健康状况监测。根据方案，经腹膜内注射，对雌性NSG小鼠给予15mg/kg Busulfan，一天后静脉注射从脐带血中分离出的1x105人造血干细胞。在干细胞注射后第16-20周，对小鼠放血，并利用流式细胞仪分析血液是否成功实现人源化。将有效移植的小鼠根据其人T细胞频率随机分入不同的治疗组中(n＝10/组)。
那时，将肿瘤细胞注射到小鼠中。如上所述，在肿瘤大小达到平均尺寸308mm3(范围92-841mm3)时，每周用化合物或PBS(载剂)治疗一次。向所有小鼠静脉注射0.05mg/kg和0.005mg/kg的所示TCB分子(参见图23A和23B)。
为了得到适当量的化合物，用组氨酸缓冲剂(20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0)稀释储备液。使用卡尺每周测量两次肿瘤生长，并依据以下方法计算肿瘤体积：
Tv：(W2/2)x L (W：宽；L：长)
在肿瘤细胞接种后第41天终止研究，并在三次注射化合物后处死所有小鼠，分离出肿瘤并称重。根据双向两性方差分析(Tukey试验)进行统计。
如图23A和23B所示，在0.005mg/kg的低剂量下，评估的GPRC5D-TCB分子未表现出有效的肿瘤生长抑制。相比之下，在0.05mg/kg的剂量下，与载剂组相比，评估结果表明所有四种GPRC5D TCB分子均具有显著的抗肿瘤生长反应。图23C至图23G进一步示出每个治疗组的单只小鼠的肿瘤生长抑制。但是，在评估的四种分子之间无显著差异，证实了所有四种GPRC5D TCB分子的高临床前效力。
实例22：hFcRn Tg和Ko小鼠体内的SDPK
为评估GPRC5D TCB分子6623、6624、6625和6626的PK特性，分别以1mg/kg的剂量经由尾静脉将各自的分子通过静脉内(推注)到-/-huFcRn Tg系32(B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr>Tg(FCGRT)32Dcr)小鼠或-/-muFcRn(B6.129X1-Fcgrttm1Dcr/DcrJ)(JAX实验室，Bar harbor，USA)中。所有研究均在当地兽医当局的批准下严格遵守瑞士联邦关于动物保护的法规和国际实验动物管理评鉴和认证协会(AAALAC)的规定。在施用后的指定时间点通过静脉穿刺(尾静脉)采集血液以得到血清用于分析：对于-/-huFcRn Tg系，施用后0.083、7、24、48、72、168、336、504和672h；对于-/-muFcRn系，施用后32、0.083、2、7、24、31、48、72和96h。将血液在室温保存20分钟以进行coting，并通过在4℃以15000rpm离心5min得到血清，然后立即将其冷冻。所有血清样品均保存在-20℃，直至通过电化学发光免疫分析法(ECLIA)进行分析，该方法为一种针对所施用的抗体及其变体的人Fab部分的特异性方法。
简言之，将预先用测定缓冲剂稀释的样品与捕获和检测分子在37℃孵育9分钟。使用生物素化mAb<H-Fab(κ)>M-IgG-Bi作为捕获分子，并使用钌(II)三(联吡啶基)32+标记的mAb<H-Fab(CH1)>M-1.19.31-IgG-S-Ru小鼠单克隆抗体进行检测。加入链霉亲和素包被的磁性微粒，并在37℃额外孵育9min，以使由于生物素与链霉亲和素的相互作用而形成复合物。将复合物磁性捕获在电极上，并通过光电倍增检测器测量使用共反应物三丙胺(TPA)产生的化学发光信号。以四重复的方式，分析所有血清样品和阳性或阴性对照样品，并利用施用的相应抗体进行校准。
如图24和表19所示，所有四种GPRC5D TCB分子在hFcRn tg32小鼠中均表现出可接受的PK分布，其范围在经典IgG的一个范围内。在FcRn ko小鼠中产生的数据被视为与评估非特异性细胞摄取有关，这可能与免疫原性相关。如图10B所汇总，6625和6626的清除率相当，而6623和6624的清除率则升高，表明非特异性细胞摄取的可能性略高。
表19：根据SDPK研究计算出的hFcRn Tg32或FcRn Ko小鼠中的清除率和相应的半衰期
Figure BDA0003492360380001951
***
尽管为了清楚理解起见，通过说明和实例的方式对上述发明进行了详细描述，但是这些描述和实例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均以引用的方式明确纳入其全部内容。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司
<120> 与 GPRC5D 结合的抗体
<130> P35639
<160> 133
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Ala Met Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Ala
1 5 10 15
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly Ile Asn Leu Met Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
His Ala Ser Ile Leu Ala Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Gln Gln Thr Arg Glu Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ala
1 5 10
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr
1 5
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr
1 5 10 15
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Gly Gln Leu Leu Glu Asn Pro Tyr Thr
1 5
<210> 13
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Glu Leu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly
20 25 30
Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Thr Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro
65 70 75 80
Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg Glu
85 90 95
Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ala Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Leu Ser Val Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Phe Gln Lys Pro Gly Lys Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr His Cys Gly Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly
20 25 30
Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Thr Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro
65 70 75 80
Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg Glu
85 90 95
Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 18
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 19
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Glu Leu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 20
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Glu Leu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser
225 230 235 240
Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser
245 250 255
Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys
260 265 270
Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala
275 280 285
Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala
290 295 300
Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr
305 310 315 320
Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
325 330 335
Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
340 345 350
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
355 360 365
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
370 375 380
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
385 390 395 400
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
405 410 415
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
420 425 430
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
435 440 445
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
450 455 460
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
465 470 475 480
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
485 490 495
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
500 505 510
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
515 520 525
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
530 535 540
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
545 550 555 560
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
565 570 575
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
580 585 590
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
595 600 605
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
610 615 620
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
625 630 635 640
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
645 650 655
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 21
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Leu Ser Val Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Phe Gln Lys Pro Gly Lys Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr His Cys Gly Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg
115 120 125
Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 22
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 23
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ala Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 24
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ala Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu
225 230 235 240
Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr
245 250 255
Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro
260 265 270
Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
275 280 285
Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala
290 295 300
Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys
305 310 315 320
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
325 330 335
Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
340 345 350
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
355 360 365
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
370 375 380
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
385 390 395 400
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
405 410 415
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
420 425 430
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
435 440 445
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
450 455 460
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
465 470 475 480
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
485 490 495
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
500 505 510
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
515 520 525
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
530 535 540
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
545 550 555 560
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
565 570 575
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
580 585 590
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
595 600 605
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
610 615 620
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
625 630 635 640
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
645 650 655
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 25
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Val Gly Gly Asn
20 25 30
Tyr Val Phe Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ala Thr Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Ser Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Phe Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Lys Lys
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 26
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 27
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Lys Ala Tyr Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 28
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Lys Ala Tyr Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser
225 230 235 240
Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser
245 250 255
Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys
260 265 270
Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala
275 280 285
Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala
290 295 300
Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr
305 310 315 320
Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
325 330 335
Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
340 345 350
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
355 360 365
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
370 375 380
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
385 390 395 400
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
405 410 415
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
420 425 430
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
435 440 445
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
450 455 460
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
465 470 475 480
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
485 490 495
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
500 505 510
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
515 520 525
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
530 535 540
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
545 550 555 560
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
565 570 575
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
580 585 590
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
595 600 605
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
610 615 620
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
625 630 635 640
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
645 650 655
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 35
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 36
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 38
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 39
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 40
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 41
<211> 198
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 41
Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys
50 55 60
Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu
65 70 75 80
Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro
85 90 95
Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn
100 105 110
Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp
115 120 125
Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys
130 135 140
Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn
165 170 175
Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly
180 185 190
Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195
<210> 42
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 45
<211> 345
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Met Tyr Lys Asp Cys Ile Glu Ser Thr Gly Asp Tyr Phe Leu Leu Cys
1 5 10 15
Asp Ala Glu Gly Pro Trp Gly Ile Ile Leu Glu Ser Leu Ala Ile Leu
20 25 30
Gly Ile Val Val Thr Ile Leu Leu Leu Leu Ala Phe Leu Phe Leu Met
35 40 45
Arg Lys Ile Gln Asp Cys Ser Gln Trp Asn Val Leu Pro Thr Gln Leu
50 55 60
Leu Phe Leu Leu Ser Val Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Phe Ala Phe
65 70 75 80
Ile Ile Glu Leu Asn Gln Gln Thr Ala Pro Val Arg Tyr Phe Leu Phe
85 90 95
Gly Val Leu Phe Ala Leu Cys Phe Ser Cys Leu Leu Ala His Ala Ser
100 105 110
Asn Leu Val Lys Leu Val Arg Gly Cys Val Ser Phe Ser Trp Thr Thr
115 120 125
Ile Leu Cys Ile Ala Ile Gly Cys Ser Leu Leu Gln Ile Ile Ile Ala
130 135 140
Thr Glu Tyr Val Thr Leu Ile Met Thr Arg Gly Met Met Phe Val Asn
145 150 155 160
Met Thr Pro Cys Gln Leu Asn Val Asp Phe Val Val Leu Leu Val Tyr
165 170 175
Val Leu Phe Leu Met Ala Leu Thr Phe Phe Val Ser Lys Ala Thr Phe
180 185 190
Cys Gly Pro Cys Glu Asn Trp Lys Gln His Gly Arg Leu Ile Phe Ile
195 200 205
Thr Val Leu Phe Ser Ile Ile Ile Trp Val Val Trp Ile Ser Met Leu
210 215 220
Leu Arg Gly Asn Pro Gln Phe Gln Arg Gln Pro Gln Trp Asp Asp Pro
225 230 235 240
Val Val Cys Ile Ala Leu Val Thr Asn Ala Trp Val Phe Leu Leu Leu
245 250 255
Tyr Ile Val Pro Glu Leu Cys Ile Leu Tyr Arg Ser Cys Arg Gln Glu
260 265 270
Cys Pro Leu Gln Gly Asn Ala Cys Pro Val Thr Ala Tyr Gln His Ser
275 280 285
Phe Gln Val Glu Asn Gln Glu Leu Ser Arg Ala Arg Asp Ser Asp Gly
290 295 300
Ala Glu Glu Asp Val Ala Leu Thr Ser Tyr Gly Thr Pro Ile Gln Pro
305 310 315 320
Gln Thr Val Asp Pro Thr Gln Glu Cys Phe Ile Pro Gln Ala Lys Leu
325 330 335
Ser Pro Gln Gln Asp Ala Gly Gly Val
340 345
<210> 46
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Glu Leu Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 48
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 49
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Glu Leu Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg
85 90 95
Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 51
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg
85 90 95
Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 52
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg
85 90 95
Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 53
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg
85 90 95
Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 54
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gln Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg
85 90 95
Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 55
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg
85 90 95
Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 56
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 57
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 58
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 59
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 60
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 61
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Gly Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 63
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Gly Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 64
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Gly Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 65
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr His Cys Gly Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 66
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr His Cys Gly Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 67
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro His Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Asn Met Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 68
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 69
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Arg Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Glu Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Leu Thr Tyr Tyr Gly Arg Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 70
<211> 677
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Arg Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Glu Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Leu Thr Tyr Tyr Gly Arg Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val
225 230 235 240
Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu
245 250 255
Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
260 265 270
Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly
275 280 285
Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu
290 295 300
Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp
305 310 315 320
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe
325 330 335
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
340 345 350
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
355 360 365
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
370 375 380
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
385 390 395 400
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
405 410 415
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
420 425 430
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
435 440 445
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
450 455 460
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
465 470 475 480
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
485 490 495
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
500 505 510
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
515 520 525
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
530 535 540
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala
545 550 555 560
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
565 570 575
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
580 585 590
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
595 600 605
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
610 615 620
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
625 630 635 640
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
645 650 655
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
660 665 670
Leu Ser Pro Gly Lys
675
<210> 71
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 71
Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Tyr Asn Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 72
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser His
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Asn Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Ala
65 70 75 80
Phe Leu Lys Val Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val His Thr Arg Gly Ile Ile Arg Gly Arg Gly Leu Phe Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 73
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
100 105 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 74
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 75
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Ser Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ala Leu Arg Val Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 76
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Ala Thr His
20 25 30
Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 77
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 78
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Arg Trp Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 79
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr
225 230 235 240
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly
245 250 255
Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly
260 265 270
Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly
275 280 285
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
290 295 300
Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala
305 310 315 320
Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
325 330 335
Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
340 345 350
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
355 360 365
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
370 375 380
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
385 390 395 400
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
405 410 415
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
420 425 430
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
435 440 445
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
450 455 460
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
465 470 475 480
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
485 490 495
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
500 505 510
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
515 520 525
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
530 535 540
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
545 550 555 560
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
565 570 575
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
580 585 590
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
595 600 605
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
610 615 620
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
625 630 635 640
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
645 650 655
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 80
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 81
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro His Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Asn Met Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 82
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Arg Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Glu Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Leu Thr Tyr Tyr Gly Arg Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Ala Met Ala
1 5 10
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 84
Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Ala
<210> 85
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 85
Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 86
His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 87
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 87
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly Ile Asn Leu Met Asn
1 5 10 15
<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 88
His Ala Ser Ile Leu Ala Ser
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 89
Gln Gln Thr Arg Glu Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 90
Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ala
1 5 10
<210> 91
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 91
Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 92
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 92
Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 93
His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr
1 5
<210> 94
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 94
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr
1 5 10 15
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 95
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 96
Arg Met Ser Asn Arg Ala Ser
1 5
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 97
Gly Gln Leu Leu Glu Asn Pro Tyr Thr
1 5
<210> 98
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 98
Ser Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 99
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 99
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 100
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 100
His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr Gly Tyr
1 5 10
<210> 101
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 101
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 102
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 103
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
<210> 104
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 104
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 105
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 105
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 106
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn
1 5 10
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 107
Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 108
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 108
Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 109
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 109
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 110
Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser
1 5
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 111
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 112
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 112
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 113
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 113
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105
<210> 114
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 114
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Gly Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg
115 120 125
Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 115
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 115
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 116
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 116
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 117
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 117
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu
225 230 235 240
Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr
245 250 255
Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro
260 265 270
Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
275 280 285
Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala
290 295 300
Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys
305 310 315 320
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
325 330 335
Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
340 345 350
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
355 360 365
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
370 375 380
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
385 390 395 400
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
405 410 415
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
420 425 430
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
435 440 445
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
450 455 460
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
465 470 475 480
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
485 490 495
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
500 505 510
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
515 520 525
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
530 535 540
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
545 550 555 560
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
565 570 575
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
580 585 590
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
595 600 605
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
610 615 620
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
625 630 635 640
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
645 650 655
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 118
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 118
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Gly Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg
115 120 125
Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 119
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 119
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 120
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 120
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 121
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 121
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu
225 230 235 240
Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr
245 250 255
Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro
260 265 270
Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
275 280 285
Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala
290 295 300
Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys
305 310 315 320
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
325 330 335
Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
340 345 350
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
355 360 365
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
370 375 380
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
385 390 395 400
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
405 410 415
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
420 425 430
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
435 440 445
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
450 455 460
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
465 470 475 480
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
485 490 495
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
500 505 510
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
515 520 525
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
530 535 540
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
545 550 555 560
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
565 570 575
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
580 585 590
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
595 600 605
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
610 615 620
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
625 630 635 640
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
645 650 655
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 122
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 122
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg
85 90 95
Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 123
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 123
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 124
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 124
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 125
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 125
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser
225 230 235 240
Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser
245 250 255
Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys
260 265 270
Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala
275 280 285
Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala
290 295 300
Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr
305 310 315 320
Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
325 330 335
Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
340 345 350
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
355 360 365
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
370 375 380
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
385 390 395 400
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
405 410 415
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
420 425 430
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
435 440 445
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
450 455 460
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
465 470 475 480
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
485 490 495
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
500 505 510
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
515 520 525
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
530 535 540
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
545 550 555 560
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
565 570 575
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
580 585 590
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
595 600 605
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
610 615 620
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
625 630 635 640
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
645 650 655
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 126
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 126
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg
85 90 95
Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 127
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 127
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr
100 105 110
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 128
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 128
Glu Leu Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 129
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 129
Glu Leu Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser
225 230 235 240
Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser
245 250 255
Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys
260 265 270
Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala
275 280 285
Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala
290 295 300
Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr
305 310 315 320
Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
325 330 335
Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
340 345 350
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
355 360 365
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
370 375 380
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
385 390 395 400
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
405 410 415
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
420 425 430
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
435 440 445
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
450 455 460
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
465 470 475 480
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
485 490 495
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
500 505 510
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
515 520 525
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
530 535 540
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
545 550 555 560
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
565 570 575
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
580 585 590
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
595 600 605
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
610 615 620
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
625 630 635 640
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
645 650 655
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
<210> 130
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 130
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Gly Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg
115 120 125
Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 131
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 131
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro
115 120 125
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
130 135 140
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
145 150 155 160
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
165 170 175
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
195 200 205
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
210 215 220
Asn Arg Gly Glu Cys
225
<210> 132
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 132
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 133
<211> 669
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 133
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
225 230 235 240
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
245 250 255
Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
260 265 270
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val
275 280 285
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr
290 295 300
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
305 310 315 320
Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
325 330 335
Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
340 345 350
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
355 360 365
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
370 375 380
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
405 410 415
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
420 425 430
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
435 440 445
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
450 455 460
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
465 470 475 480
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
485 490 495
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
500 505 510
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
515 520 525
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
530 535 540
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
545 550 555 560
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys
565 570 575
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
580 585 590
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
595 600 605
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
610 615 620
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
625 630 635 640
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
645 650 655
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665

Claims (32)

1.一种双特异性抗原结合分子，其包含：
(a)与第一抗原结合的第一抗原结合部分，
其中所述第一抗原为GPRC5D，并且所述第一抗原结合部分包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：84的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；
(ii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：83的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：85的HCDR 2和SEQ ID NO：86的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：87的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：88的LCDR 2和SEQ ID NO：89的LCDR 3；
(iii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；
(iv)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：91的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：96的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；或
(v)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：90的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：92的HCDR 2和SEQ ID NO：93的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：94的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：95的LCDR 2和SEQ ID NO：97的LCDR 3；以及
(b)与第二抗原结合的第二抗原结合部分，其中所述第二抗原为CD3，并且所述第二抗原结合部分包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：29的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：30的HCDR 2和SEQ ID NO：31的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：32的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：33的LCDR 2和SEQ ID NO：34的LCDR 3；
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：98的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：99的HCDR 2和SEQ ID NO：100的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：101的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：102的LCDR 2和SEQ ID NO：103的LCDR 3；或
(ii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：106的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO：107的HCDR 2和SEQ ID NO：108的HCDR 3；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：109的轻链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO：110的LCDR 2和SEQ ID NO：111的LCDR 3。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，
(i)其中所述第一抗原结合部分的所述VH包含与SEQ ID NO：13的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中所述第一抗原结合部分的所述VL包含与SEQ ID NO：14的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或
(ii)其中所述第一抗原结合部分的所述VH包含与SEQ ID NO：15的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中所述第一抗原结合部分的所述VL包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或
(iii)其中所述第一抗原结合部分的所述VH包含与SEQ ID NO：48的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中所述第一抗原结合部分的所述VL包含与SEQ ID NO：53的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或
(iv)其中所述第一抗原结合部分的所述VH包含与SEQ ID NO：49的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中所述第一抗原结合部分的所述VL包含与SEQ ID NO：52的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或
(v)其中所述第一抗原结合部分的所述VH包含与SEQ ID NO：57的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中所述第一抗原结合部分的所述VL包含与SEQ ID NO：64的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或
(vi)其中所述第一抗原结合部分的所述VH包含与SEQ ID NO：58的序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中所述第一抗原结合部分的所述VL包含与SEQ ID NO：63的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第二抗原结合部分的所述VH包含
(i)与SEQ ID NO：35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合部分的所述VL包含与SEQ ID NO：36的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
(ii)与SEQ ID NO：104的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合部分的所述VL包含与SEQ ID NO：105的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或
(iii)与SEQ ID NO：112的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合部分的所述VL包含与SEQ ID NO：113的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合部分和/或所述第二抗原结合部分为Fab分子。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第二抗原结合部分为Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变结构域VL和VH或恒定结构域CL和CH1、特别是所述可变结构域VL和VH经彼此替换。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合部分为Fab分子，其中在所述恒定结构域中，位置124处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代，并且位置123处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)(根据Kabat编号)独立地取代，并且在所述恒定结构域CH1中，位置147处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代，并且位置213处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根据Kabat EU索引编号)独立地取代。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分彼此融合，任选地经由肽接头彼此融合。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分各自为Fab分子，并且其中(i)所述第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与所述第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，或(ii)所述第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与所述第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其包含第三抗原结合部分。
10.根据权利要求9所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第三抗原部分与所述第一抗原结合部分相同。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其包含含有第一亚基和第二亚基的Fc结构域。
12.根据权利要求11所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合部分、所述第二抗原结合部分和在存在时的所述第三抗原结合部分各自为Fab分子；
并且其中(i)所述第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与所述第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且所述第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与所述Fc结构域的所述第一亚基的N末端融合，或(ii)所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C末端与所述第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且所述第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与所述Fc结构域的所述第一亚基的N末端融合；
并且其中所述第三抗原结合部分，在存在时，在所述Fab重链的C末端与所述Fc结构域的所述第二亚基的N末端融合。
13.根据权利要求11或12所述的双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域为IgG Fc结构域。
14.根据权利要求13所述的双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域为IgG1 Fc结构域。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域为人Fc结构域。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域的所述第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第一亚基的CH3结构域内产生突起，所述突起可定位在所述第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且所述Fc结构域的所述第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第二亚基的CH3结构域内产生空腔，所述第一亚基的CH3结构域内的所述突起可定位在所述空腔内。
17.根据权利要求11至16中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域包含降低与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。
18.一种或多种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至17中任一项所述的双特异性抗原结合分子。
19.一种或多种载体，特别是表达载体，其包含根据权利要求18所述的一种或多种多核苷酸。
20.一种宿主细胞，其包含根据权利要求18所述的一种或多种多核苷酸或根据权利要求19所述的一种或多种载体。
21.一种生产与GPRC5D结合的双特异性抗原结合分子的方法，所述方法包括下列步骤：a)在适合表达所述双特异性抗原结合分子的条件下培养根据权利要求20所述的宿主细胞，以及b)任选地回收所述双特异性抗原结合分子。
22.一种与GPRC5D结合的双特异性抗原结合分子，其通过根据权利要求21所述的方法生产。
23.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至17或权利要求22中任一项所述的双特异性抗原结合分子以及药用载体。
24.根据权利要求1至17或权利要求22中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据权利要求23所述的药物组合物，其用作药物。
25.根据权利要求1至17或权利要求22中任一项所述的双特异性抗原结合分子或根据权利要求23所述的药物组合物，其用于治疗疾病。
26.根据权利要求25所述的双特异性抗原结合分子或药物组合物，其中所述疾病为癌症或自身免疫性疾病。
27.根据权利要求25所述的双特异性抗原结合分子或药物组合物，其中所述疾病为多发性骨髓瘤。
28.根据权利要求1至17或权利要求22中任一项所述的双特异性抗原结合分子在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
29.一种治疗个体中疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含根据权利要求1至17或权利要求22中任一项所述的呈药用形式的双特异性抗原结合分子。
30.根据权利要求28所述的用途或根据权利要求29所述的方法，其中所述疾病为癌症或自身免疫性疾病。
31.根据权利要求28所述的用途或根据权利要求29所述的方法，其中所述疾病为多发性骨髓瘤。
32.如本文所述的本发明。
CN202080054556.2A 2019-07-31 2020-07-28 与gprc5d结合的抗体 Pending CN114174342A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19189255 2019-07-31
EP19189255.3 2019-07-31
PCT/EP2020/071182 WO2021018859A2 (en) 2019-07-31 2020-07-28 Antibodies binding to gprc5d

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114174342A true CN114174342A (zh) 2022-03-11

Family

ID=67513452

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080054556.2A Pending CN114174342A (zh) 2019-07-31 2020-07-28 与gprc5d结合的抗体

Country Status (18)

Country Link
US (1) US20220259318A1 (zh)
EP (1) EP4003526A2 (zh)
JP (2) JP2022543553A (zh)
KR (1) KR20220028035A (zh)
CN (1) CN114174342A (zh)
AR (1) AR119553A1 (zh)
AU (1) AU2020323686B2 (zh)
BR (1) BR112022001460A2 (zh)
CA (1) CA3144524A1 (zh)
CL (1) CL2022000127A1 (zh)
CO (1) CO2022000803A2 (zh)
CR (1) CR20220019A (zh)
IL (1) IL287613A (zh)
MX (1) MX2022001156A (zh)
PE (1) PE20220394A1 (zh)
SG (1) SG11202112491WA (zh)
TW (1) TW202112823A (zh)
WO (1) WO2021018859A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024002308A1 (zh) * 2022-06-30 2024-01-04 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种新型多特异肿瘤抑制剂的开发和应用

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI829831B (zh) 2018-12-21 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合cd3之抗體
AU2021291011A1 (en) 2020-06-19 2023-01-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to CD3 and CD19
EP4213945A1 (en) * 2020-09-16 2023-07-26 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating multiple myeloma
WO2022179970A1 (en) 2021-02-24 2022-09-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Regeneration and multiple use of depth filters
WO2022247804A1 (zh) * 2021-05-23 2022-12-01 上海祥耀生物科技有限责任公司 抗gprc5d抗体、其制备方法与用途
TW202334222A (zh) * 2021-11-05 2023-09-01 大陸商正大天晴藥業集團股份有限公司 結合gprc5d的抗體及其用途
CN116375868A (zh) * 2021-12-31 2023-07-04 康源博创生物科技(北京)有限公司 一种抗cd3的人源化抗体及其在制备双特异性抗体中的应用
WO2024017326A1 (zh) * 2022-07-21 2024-01-25 山东先声生物制药有限公司 抗gprc5d纳米抗体及其应用
WO2024031091A2 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for gprc5d and bcma
WO2024079015A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and imids
WO2024079009A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and proteasome inhibitors
WO2024079010A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of a gprc5d tcb and cd38 antibodies

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014131694A1 (en) * 2013-02-26 2014-09-04 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2016055593A1 (en) * 2014-10-09 2016-04-14 Engmab Ag Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1 for use in the treatment of ovarian cancer
WO2018017786A2 (en) * 2016-07-20 2018-01-25 Janssen Pharmaceutica Nv Anti- gprc5d antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind gprc5d and cd3, and uses thereof
WO2018147245A1 (ja) * 2017-02-07 2018-08-16 第一三共株式会社 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗体及び該抗体を含む分子

Family Cites Families (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2388385B1 (fr) 1977-04-18 1982-01-08 Hitachi Metals Ltd Piece d'ornement fixee par des aimants permanents
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
DE69830901T2 (de) 1997-05-02 2006-05-24 Genentech Inc., San Francisco ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ATE419009T1 (de) 1997-10-31 2009-01-15 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
AU782626B2 (en) 1999-10-04 2005-08-18 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
AU784983B2 (en) 1999-12-15 2006-08-17 Genentech Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
ES2528794T3 (es) 2000-04-11 2015-02-12 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
NZ592087A (en) 2001-08-03 2012-11-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
US20040110704A1 (en) 2002-04-09 2004-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
DE60332957D1 (de) 2002-12-16 2010-07-22 Genentech Inc Immunoglobulinvarianten und deren verwendungen
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
ES2574993T3 (es) 2003-01-22 2016-06-23 Roche Glycart Ag Construcciones de fusión y uso de las mismas para producir anticuerpos con mayor afinidad de unión al receptor de Fc y función efectora
US7635472B2 (en) 2003-05-31 2009-12-22 Micromet Ag Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd3, anti-cd19 antibody constructs for the treatment of b-cell related disorders
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
EP1791565B1 (en) 2004-09-23 2016-04-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
NZ556286A (en) 2005-02-07 2010-11-26 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules that bind EGFR, vectors encoding same, and uses thereof
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
AU2006301492B2 (en) 2005-10-11 2011-06-09 Amgen Research (Munich) Gmbh Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
AU2007229698B9 (en) 2006-03-24 2012-11-08 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
US20080044455A1 (en) 2006-08-21 2008-02-21 Chaim Welczer Tonsillitus Treatment
EP2471816A1 (en) 2006-08-30 2012-07-04 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
LT2520590T (lt) 2007-04-03 2018-09-10 Amgen Research (Munich) Gmbh Susijusioms rūšims specifinis rišantis domenas
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
CA2756244A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
EP2417156B1 (en) 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
WO2010136172A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
RU2015153109A (ru) 2009-09-16 2019-01-15 Дженентек, Инк. Содержащие суперспираль и/или привязку белковые комплексы и их применения
SI2519543T1 (sl) 2009-12-29 2016-08-31 Emergent Product Development Seattle, Llc Beljakovine, ki se vežejo s heterodimeri in njihova uporaba
US9527926B2 (en) 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
CA3220104A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
PT2691417T (pt) 2011-03-29 2018-10-31 Roche Glycart Ag Variantes de fc de anticorpos
SI2748202T1 (sl) 2011-08-23 2018-10-30 Roche Glycart Ag Bispecifične molekule, ki se vežejo na antigen
KR101870555B1 (ko) 2011-08-23 2018-06-22 로슈 글리카트 아게 T 세포 활성화 항원 및 종양 항원에 대해 특이적인 이중특이적 항체 및 이의 사용 방법
CN103748114B (zh) 2011-08-23 2017-07-21 罗切格利卡特公司 T细胞活化性双特异性抗原结合分子
CA2859667C (en) 2011-12-20 2022-05-24 Medimmune, Llc Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
JP6152120B2 (ja) 2012-02-15 2017-06-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｆｃ受容体に基づくアフィニティークロマトグラフィー
MX360109B (es) 2012-04-20 2018-10-23 Merus Nv Metodos y medios para la produccion de moleculas de tipo ig.
MY192312A (en) 2013-02-26 2022-08-17 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
CN105849124B (zh) 2013-12-20 2022-04-12 豪夫迈·罗氏有限公司 双重特异性抗体
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
CN106573986A (zh) 2014-07-29 2017-04-19 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性抗体
PE20170263A1 (es) 2014-08-04 2017-03-30 Hoffmann La Roche Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
CA2957354A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
CN107074933B (zh) 2014-10-24 2021-03-19 豪夫迈·罗氏有限公司 基于vh-vl域间角的抗体人源化
IL307767A (en) 2014-12-05 2023-12-01 Memorial Sloan Kettering Cancer Center G protein-coupled receptor-directed antibodies and methods of use
CN114773476A (zh) 2015-04-13 2022-07-22 辉瑞公司 治疗性抗体和它们的用途
CN107787332B (zh) 2015-04-24 2022-09-09 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性抗原结合蛋白
WO2018117786A1 (es) 2016-12-19 2018-06-28 Campo Y Ramos Juan Carlos Método de moldeo científico autoajustado por aprendizaje recurrente en tiempo real
TWI829667B (zh) * 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
KR20210011002A (ko) * 2018-05-16 2021-01-29 얀센 바이오테크 인코포레이티드 암을 치료하는 방법 및 t-세포 재유도 치료제의 효능을 향상시키는 방법
TWI829831B (zh) * 2018-12-21 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合cd3之抗體
MY198034A (en) * 2018-12-21 2023-07-27 Hoffmann La Roche Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014131694A1 (en) * 2013-02-26 2014-09-04 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
CN105143270A (zh) * 2013-02-26 2015-12-09 罗切格利卡特公司 双特异性t细胞活化抗原结合分子
WO2016055593A1 (en) * 2014-10-09 2016-04-14 Engmab Ag Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1 for use in the treatment of ovarian cancer
US20170306044A1 (en) * 2014-10-09 2017-10-26 Engmab Ag Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1 for use in the treatment of ovarian cancer
WO2018017786A2 (en) * 2016-07-20 2018-01-25 Janssen Pharmaceutica Nv Anti- gprc5d antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind gprc5d and cd3, and uses thereof
WO2018147245A1 (ja) * 2017-02-07 2018-08-16 第一三共株式会社 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗体及び該抗体を含む分子

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TATSUSHI KODAMA: "Anti-GPRC5D/CD3 Bispecific T-Cell--Redirecting Antibody for the Treatment of Multiple Myeloma", LARGE MOLECULE THERAPEUTICS, vol. 18, no. 9, pages 1555 - 1564, XP055743011, DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-18-1216 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024002308A1 (zh) * 2022-06-30 2024-01-04 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种新型多特异肿瘤抑制剂的开发和应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022543553A (ja) 2022-10-13
CO2022000803A2 (es) 2022-02-07
CA3144524A1 (en) 2021-02-04
KR20220028035A (ko) 2022-03-08
AR119553A1 (es) 2021-12-29
AU2020323686A1 (en) 2021-11-11
PE20220394A1 (es) 2022-03-18
EP4003526A2 (en) 2022-06-01
JP2023175704A (ja) 2023-12-12
WO2021018859A2 (en) 2021-02-04
CR20220019A (es) 2022-02-11
SG11202112491WA (en) 2021-12-30
WO2021018859A3 (en) 2021-05-14
US20220259318A1 (en) 2022-08-18
CL2022000127A1 (es) 2022-10-28
MX2022001156A (es) 2022-02-22
TW202112823A (zh) 2021-04-01
AU2020323686B2 (en) 2024-03-21
IL287613A (en) 2021-12-01
BR112022001460A2 (pt) 2022-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI829667B (zh) 結合gprc5d之抗體
AU2020323686B2 (en) Antibodies binding to GPRC5D
US20220411491A1 (en) Antibodies binding to gprc5d
CN114364700A (zh) 与nkg2d结合的抗体
US11685790B2 (en) Antibodies binding to STEAP-1
CN114828965A (zh) 与hla-a2/mage-a4结合的抗体
TWI805665B (zh) 結合hla-a2/wt1之抗體
RU2797268C2 (ru) Антитела, связывающиеся с gprc5d
CN117545770A (zh) 抗hla-g抗体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40061356

Country of ref document: HK