CN117805397A - 检测游离vegf的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种检测施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品中的游离的VEGF的方法，所述血液样品包括与贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普结合的VEGF以及游离的VEGF。本申请还提供了贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普用于检测施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品中的游离VEGF的用途。
Description
技术领域
本申请涉及生物样品检测领域。具体地，本申请涉及检测生物样品中的游离VEGF。
背景技术
湿性年龄相关性黄斑变性（AMD）又称新生血管性AMD，其与新血管的生成有很大的相关性，以脉络膜新生血管（CNV）的形成为特征，占AMD发病率的20%，虽然比例不大，但却是90%以上患者视力损害的主要原因。湿性AMD可合并眼底出血和渗出，进而发生瘢痕化，破坏黄斑结构，影响视功能。湿性AMD进展迅速，如不治疗，40%以上的患者5年内会双眼发生病变。该类患者中有~90%左右的患者视力障碍多由渗出物引起。
新血管的生成与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）相关。VEGF又称血管通透因子（vascular permeability factor，VPF），其为高度特异性的一种促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用，包括VEGF-a、VEGF- b、VEGF- c、VEGF- d、VEGF- e(病毒编码)和胎盘生长因子(PIGF)。VEGF-c和VEGF-d主要参与***生成的调节。鉴于VEGF- a在调节血管生成和疾病中的主导作用，且是生理上最相关的VEGF亚型。新血管的生成可将营养物质运输到组织和器官并清除代谢产物，故其对维持机体稳态作用起着关键的作用。然而，不受控制的血管生长能赋予肿瘤细胞生长优势，也可促进糖尿病视网膜病变。
临床研究表明，在雷尼单抗（Lucentis，Genentech）给药组中观察到微小的可能与全身VEGF抑制相关的严重不良事件发生率的趋势，反映出严重动脉血栓栓塞事件的趋势，并且在较小程度上反映了严重非眼出血的趋势。而且，观察到每月0.5mg雷尼单抗治疗的受试者与其他受试者相比，严重动脉血栓栓塞事件的总体趋势略有增加。故检测在给药后对VEGF的抑制水平对安全性有一定的指示作用。
目前，商品化的试剂盒灵敏度为15.6pg/mL，且无法确定是否为游离的VEGF。因此，需要建立一种可以检测游离VEGF的方法，用于指示VEGF单抗药物以及VEGF trap类药物的药效和不良事件发生率的关系。
发明内容
第一方面，本申请提供了一种检测施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品中的游离的VEGF的方法，所述血液样品包括与贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普结合的VEGF以及游离的VEGF，所述方法包括：
(1) 将贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普固定在固相上；
(2) 向步骤(1)的固相上加入施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品；
(3) 向步骤(2)的血液样品中加入带有可检测标记的抗VEGF抗体，所述带有可检测标记的抗VEGF抗体与VEGF的结合表位与贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普与VEGF的结合表位不重叠；
(4) 检测所述可检测标记的强度以确定所述血液样品中的游离的VEGF的含量。
在一些实施方案中，所述可检测标记是生物素。
在一些实施方案中，检测所述可检测标记的强度还包括加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。
在一些实施方案中，步骤(3)中的抗VEGF抗体是人VEGF165抗体。
在一些实施方案中，步骤(3)中的带有可检测标记的抗VEGF抗体是人VEGF165生物素化抗体，即生物素化抗VEGF抗体BAF293。
在一些实施方案中，贝伐珠单抗是安维汀。
在一些实施方案中，所述受试者被施用贝伐珠单抗，且步骤(1)中贝伐珠单抗被固定在固相上。
在一些实施方案中，所述受试者被施用贝伐珠单抗，且步骤(1)中阿柏西普被固定在固相上。
在一些实施方案中，所述受试者被施用贝伐珠单抗，且步骤(1)中雷尼单抗被固定在固相上。
在一些实施方案中，所述受试者被施用阿柏西普，且步骤(1)中贝伐珠单抗被固定在固相上。
在一些实施方案中，所述受试者被施用阿柏西普，且步骤(1)中阿柏西普被固定在固相上。
在一些实施方案中，所述受试者被施用贝伐珠单抗，且步骤(1)中雷尼单抗被固定在固相上。
在一些实施方案中，步骤(1)中的贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普在固相上的固定不影响步骤(2)中的血液样品中的游离的VEGF与固定在固相上的贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普的结合。
在一些实施方案中，所述带有可检测标记的抗VEGF抗体结合VEGF的结合位点与贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普结合VEGF的结合位点不同，且带有可检测标记的抗VEGF抗体与VEGF的结合不影响固相上贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普与VEGF的结合。
在一些实施方案中，贝伐珠单抗、雷尼单抗和阿柏西普中的任一种与VEGF的结合阻止了固相上贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普与所结合的VEGF的结合。
第二方面，本申请提供了贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普用于检测施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品中的游离的VEGF的用途。
具体实施方式
固定在固相上的捕获药物可确定所检测的VEGF为未和药物结合的VEGF，即游离VEGF。捕获药物容易获取，成本低，可以加速检测的进程。本申请的方法操作简单、重复性好、适用大规模检测生物样品中的游离的VEGF。
目前抗VEGF药物包括雷尼单抗、阿柏西普和超适应症的贝伐珠单抗。
阿柏西普是VEGFR受体结构域-Fc融合蛋白。阿柏西普含2个结构域。贝伐珠单抗可以是安维汀(Avastin)。
第一方面，本申请提供了一种检测施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品中的游离的VEGF的方法，所述血液样品包括与贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普结合的VEGF以及游离的VEGF，所述方法包括：
(1) 将贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普固定在固相上；
(2) 向步骤(1)的固相上加入施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品；
(3) 向步骤(2)的血液样品中加入带有可检测标记的抗VEGF抗体，所述带有可检测标记的抗VEGF抗体与VEGF的结合表位与贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普与VEGF的结合表位不重叠；
(4) 检测所述可检测标记的强度以确定所述血液样品中的游离的VEGF的含量。
在一些实施方案中，向步骤(1)的固相上加入施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品，使得所述血液样品中的游离的VEGF与固定在固相上的贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普结合，且血液样品中与贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普结合的VEGF不与固定在固相上的贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普结合。
在一些实施方案中，向步骤(2)的血液样品中加入带有可检测标记的抗VEGF抗体，并用PBST洗液洗涤；所述带有可检测标记的抗VEGF抗体与步骤(2)中与固定在固相上的贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普结合的游离的VEGF结合。
PBST洗液是含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液，简称为PBST。
在一些实施方案中，所述可检测标记是生物素。
在一些实施方案中，检测所述可检测标记的强度还包括加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。
在一些实施方案中，步骤(3)中的抗VEGF抗体是人VEGF165抗体。
在一些实施方案中，步骤(3)中的带有可检测标记的抗VEGF抗体是人VEGF165生物素化抗体。
人VEGF165生物素化抗体优选是购自R&D的Human/Primate VEGF165BiotinylatedAntibody，其是抗原亲和纯化的多克隆羊IgG （商品编号: BAF293）。
在一些实施方案中，贝伐珠单抗是安维汀。
在一些实施方案中，所述受试者被施用贝伐珠单抗，且步骤(1)中贝伐珠单抗被固定在固相上。
在一些实施方案中，所述受试者被施用贝伐珠单抗，且步骤(1)中阿柏西普被固定在固相上。
在一些实施方案中，所述受试者被施用贝伐珠单抗，且步骤(1)中雷尼单抗被固定在固相上。
在一些实施方案中，所述受试者被施用阿柏西普，且步骤(1)中贝伐珠单抗被固定在固相上。
在一些实施方案中，所述受试者被施用阿柏西普，且步骤(1)中阿柏西普被固定在固相上。
在一些实施方案中，所述受试者被施用贝伐珠单抗，且步骤(1)中雷尼单抗被固定在固相上。
在一些实施方案中，步骤(1)中的贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普在固相上的固定不影响步骤(2)中的血液样品中的游离的VEGF与固定在固相上的贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普的结合。
在一些实施方案中，步骤(1)中的贝伐珠单抗在固相上的固定不影响步骤(2)中的血液样品中的游离的VEGF与固定在固相上的阿柏西普的结合。
在一些实施方案中，步骤(1)中的阿柏西普在固相上的固定不影响步骤(2)中的血液样品中的游离的VEGF与固定在固相上的贝伐珠单抗的结合。
在一些实施方案中，所述带有可检测标记的抗VEGF抗体结合VEGF的结合位点与贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普结合VEGF的结合位点不同，且带有可检测标记的抗VEGF抗体与VEGF的结合不影响固相上贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普与VEGF的结合。
在一些实施方案中，所述带有可检测标记的抗VEGF抗体结合VEGF的结合位点与阿柏西普结合VEGF的结合位点不同，且带有可检测标记的抗VEGF抗体与VEGF的结合不影响固相上阿柏西普与VEGF的结合。
在一些实施方案中，所述带有可检测标记的抗VEGF抗体结合VEGF的结合位点与贝伐珠单抗结合VEGF的结合位点不同，且带有可检测标记的抗VEGF抗体与VEGF的结合不影响固相上贝伐珠单抗与VEGF的结合。
在一些实施方案中，贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普与VEGF的结合阻止了固相上贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普与所结合的VEGF的结合。
在一些实施方案中，贝伐珠单抗与VEGF的结合阻止了固相上阿柏西普与所结合的VEGF的结合。
在一些实施方案中，雷尼单抗与VEGF的结合阻止了固相上贝伐珠单抗与所结合的VEGF的结合。
在一些实施方案中，雷尼单抗与VEGF的结合阻止了固相上阿柏西普与所结合的VEGF的结合。
在一些实施方案中，阿柏西普与VEGF的结合阻止了固相上贝伐珠单抗与所结合的VEGF的结合。
第二方面，本申请提供了贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普用于检测施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品中的游离的VEGF的用途。
实施例
将通过具体实例的方式更详细地描述本申请。提供以下实施例仅用于说明目的，且并不旨在以任何方式限制本申请。本领域技术人员将容易认识到各种非关键参数，这些参数可以被改变或修改以产生基本上相同的结果。实施例中没有标注试剂具体来源的，均可以常规购买获得。
实施例1：标准曲线制备
试剂信息
样品：VEGF，( 0.2 mg/mL)；
固相上的包被试剂1：安维汀(Avastin) 25mg/mL；
固相上的包被试剂2：阿柏西普(Zaltrap) 25mg/mL；
检测试剂 （带有可检测标记的抗VEGF抗体）：人VEGF165生物素化抗体(R&D，货号BAF293) 0.2mg/mL；
酶标试剂：SA-HRP；
封闭液/稀释液：I-Block；
底物：TMB溶液(Thermo)；
终止液：1M 硫酸溶液(UP-pharma)；
碳酸盐缓冲液：CBS (UP-pharma)；
洗板液（PBST洗液）：PBST pH 7.2~7.4(UP-Pharma)；
表1. 试剂准备
实验步骤
1 配制包被试剂工作液：根据实验用量按照表1中的配制方法配制包被试剂工作液。
2 包被：将配制好的包被试剂工作液1或包被试剂工作液2以100 μL/孔加入酶标板，并用封板膜封板，2~8℃包被16-18h。
3 洗板：取出酶标板，用洗板液以350μL/孔洗板3次，并于纸巾上拍干板孔。
4 封闭：用封闭液以300 μL/孔加入酶标板，封板膜封板，25±3℃生化培养箱温育2h ± 10min。
5 配制样品：参见表2。
6 洗板：取出酶标板，用洗板液以350μL/孔洗板3次，并于纸巾上拍干板孔。
7 加样：100μL/孔加入配制的样品，封板膜封板，25±3℃生化培养箱温育2h ±5min。
8 配制检测试剂工作液：根据实验用量按照表1中的配制方法配制检测试剂工作液。
9 洗板：取出酶标板，用洗板液以350μL/孔洗板3次，每次浸泡30s，并于纸巾上拍干板孔。
10 加检测试剂工作液：以100μL/孔加入检测试剂工作液，封板膜封板，25±3℃生化培养箱温育1h ± 5min。
11 配制酶标试剂工作液：根据实验用量按照表1中的配制方法配制酶标试剂工作液。
12 洗板：取出酶标板，用洗板液以350μL/孔洗板3次，每次浸泡30s，并于纸巾上拍干板孔。
13 加酶标试剂工作液：以100μL/孔加入酶标试剂工作液，封板膜封板，25±3℃生化培养箱温育1h ± 5min。
14 洗板：取出酶标板，用洗板液以350μL/孔洗板3次，每次浸泡30s，并于纸巾上拍干板孔。
15 加底物：100μL/孔加入配制好的底物工作液，室温避光反应15~20min (依据颜色深浅调整显色时间）。
16 加终止液：每孔50μL加入终止液；轻微振荡，确保各孔边缘无蓝-绿色现象。
17 检测：10min内用酶标仪读取吸光度，检测波长450nm，参比波长630nm；打印并保存原始数据。
表2-1. 标曲样品配制
备注：用I-Block将0.2mg/mL的VEGF储备液按照上述表格配制成浓度为3.91、7.81、15.6、31.3、62.5、125、250、500和1000pg/mL的标曲样品。
表2-2. 验证样品配制
备注：用I-Block将0.2mg/mL的VEGF储备液按照上述表格配制成浓度为7.81、20.0、65.0、375和500 pg/mL的验证样品。
表3：板图
备注：STD：标准曲线样品；VS：验证样品。
表4：板图的原始数据
表5：标曲拟合结果
备注：STD：标准曲线样品；VS：验证样品。
实施例2：游离VEGF模式测试
在含有VEGF的样品中加入不同浓度的贝伐珠单抗（即安维汀(Avastin)），使用实施例1中的实验步骤检测游离VEGF，其中包被试剂为0.25μg/mL浓度的安维汀。
表6-1：Avastin药物浓度配制表
注：配制的Avastin样品与按照表2-1配制的VEGF样品按照等体积混合，并按照下面板图加入微孔板中进行测试。
表6-2 加样板图
注：尾缀为-A1的样品为VEGF样品与1000μg/mL的Avastin等体积混合终浓度为500μg/mL的Avastin；-A2为100μg/mL的Avastin，-A3为10μg/mL的Avastin，-A4为1μg/mL的Avastin，-A5为0.1μg/mL的Avastin。
表7：游离VEGF模式测试结果分析
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备注：STD：标准曲线样品；VS：验证样品，BQL表示未检测到数值。
从表7的结果中可以看出，随着加入药物浓度的增加，游离的VEGF减少。因此，可以表明检测的浓度为游离的VEGF浓度。
本方法灵敏度为3.9pg/mL，较商品化试剂盒15.6pg/mL更高。固定于固相的包被试剂为上市药物，易获取，且能解决抗体制备周期长成本高的短板。本申请的方法成本低，每块板的成本在100元以内，而商品化试剂盒成本在5000元左右。在节省成本且灵敏度高的同时，本申请的方法适合大批量样品的筛选，可以加速新药上市进程。
实施例3：基于加入的药物和包被试剂的不同组合，测试血液样品中的游离VEGF
按照实施例1的实验步骤检测游离VEGF的浓度，区别仅在于将实施例1中的标曲样品和验证样品换成本实施例的具体样品。本实施例所用的具体样品是取自受试者的血液样品，并在血液样品中加入10μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL的贝伐珠单抗(Avastin)、雷尼单抗(ranibizumab，Lucentis)或阿柏西普(Zaltrap)。
包被试剂和加入的药物的组合如下：
(1) 加入的药物是10μg/mL、1μg/mL或0.1μg/mL的贝伐珠单抗且包被试剂是0.25μg/mL的贝伐珠单抗；
(2) 加入的药物是10μg/mL、1μg/mL或0.1μg/mL的贝伐珠单抗且包被试剂是0.25μg/mL的阿柏西普；
(3) 加入的药物是10μg/mL、1μg/mL或0.1μg/mL的贝伐珠单抗且包被试剂是0.25μg/mL的雷尼单抗；
(4) 加入的药物是10μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL的阿柏西普且包被试剂是0.25μg/mL的贝伐珠单抗；
(5) 加入的药物是10μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL的阿柏西普且包被试剂是0.25μg/mL的阿柏西普；以及
(6) 加入的药物是10μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL的贝伐珠单抗且包被试剂是0.25μg/mL的雷尼单抗。
检测到血液样品中的游离的VEGF的含量如表8所示，结果表明上述六种组合均能够有效地检测到血液样品中的游离VEGF。
表8：游离VEGF检测结果
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Claims (10)
1.检测施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品中的游离的VEGF的方法，所述血液样品包括与贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普结合的VEGF以及游离的VEGF，所述方法包括：
(1) 将贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普固定在固相上；
(2) 向步骤(1)的固相上加入施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品；
(3) 向步骤(2)的血液样品中加入带有可检测标记的抗VEGF抗体，所述带有可检测标记的抗VEGF抗体与VEGF的结合表位与贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普与VEGF的结合表位不重叠；
(4) 检测所述可检测标记的强度以确定所述血液样品中的游离的VEGF的含量。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述可检测标记是生物素。
3.如权利要求2所述的方法，其中检测所述可检测标记的强度还包括加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。
4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(3)中的抗VEGF抗体是人VEGF165抗体。
5.如权利要求1所述的方法，其中步骤(3)中的带有可检测标记的抗VEGF抗体是生物素化抗VEGF抗体BAF293。
6.如权利要求1所述的方法，其中，
所述受试者被施用贝伐珠单抗，且步骤(1)中贝伐珠单抗被固定在固相上；
所述受试者被施用贝伐珠单抗，且步骤(1)中阿柏西普被固定在固相上；
所述受试者被施用贝伐珠单抗，且步骤(1)中雷尼单抗被固定在固相上；
所述受试者被施用阿柏西普，且步骤(1)中贝伐珠单抗被固定在固相上；
所述受试者被施用阿柏西普，且步骤(1)中阿柏西普被固定在固相上；或
所述受试者被施用贝伐珠单抗，且步骤(1)中雷尼单抗被固定在固相上。
7.如权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普在固相上的固定不影响步骤(2)中的血液样品中的游离的VEGF与固定在固相上的贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普的结合。
8.如权利要求1所述的方法，其中带有可检测标记的抗VEGF抗体与VEGF的结合不影响固相上贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普与VEGF的结合。
9.如权利要求1所述的方法，其中贝伐珠单抗、雷尼单抗和阿柏西普中的任一种与VEGF的结合阻止了固相上贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普与所结合的VEGF的结合。
10.贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普用于检测施用贝伐珠单抗、雷尼单抗或阿柏西普后的受试者血液样品中的游离VEGF的用途。
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