CN102439011A - Toll样受体调节剂和疾病的治疗 - Google Patents

Abstract

本发明提供作为一种或多种toll样受体的激动剂或拮抗剂的小分子缀合物。

Description

TOLL样受体调节剂和疾病的治疗

相关专利申请的交叉引用

本申请要求享有2009年2月11日提交的美国申请No.61/151,737，的提交日期的优先权，所述申请以引用的方式全文纳入本说明书。

政府权益声明

本文描述的发明是在由国家卫生研究院(National Institutes ofHealth)批准的基金号为AI056453和AI077989-01的政府支持下做出的。美国政府对本发明享有一定权益。

技术领域

本发明部分地涉及调节Toll样受体功能的分子，和通过将这样的分子给予需要它的受试者从而治疗疾病的方法。

背景技术

Toll样受体(TLR)是存在于各种细胞类型上的模式识别受体，其识别存在于微生物(例如细菌、病毒或真菌)中的特定分子模式(1)。TLR识别脂蛋白(TLR2)、双链RNA(TLR3)、脂多糖(LPS，TLR4)、鞭毛蛋白(TLR5)、单链RNA(TLR7/8)以及细菌或病毒未甲基化的CpGDNA(TLR9)。除了TLR3之外的所有TLR，通过被称作MyD88的衔接蛋白发送信号，引起NFkappaB和相关细胞因子基因活化(2)。

TLR7和8，位于细胞内的内体组件中，识别单链RNA和宿主细胞的不同的合成鸟苷类似物(3，4)。富含鸟嘌呤和尿苷的单链RNA被鉴定为是TLR7的天然配体(5)。此外，已经鉴定了TLR7的一些低分子量激活剂，包括咪唑并喹啉和嘌呤样分子(3，6，7)。在所述嘌呤样分子中，9-苄基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)腺嘌呤(″SM″)已经被鉴定为强效并且特异的TLR7激动剂(8)。已经通过以下方法合成了SM的衍生物：在所述苄基部分上引入醛官能团，并且通过包含肼和N-羟基琥珀酰亚胺的双官能连接分子将该中间体连接至不同的辅助化学实体(9)。与小鼠血清白蛋白(MSA)的缀合使其效能比游离药物提高了10至100倍，并且提高了体内药效动力学。所述MSA缀合物可通过鼻内或气管内给药而递送至呼吸***。鼻内药物递送在两种传染病的小鼠模型——细菌感染和病毒感染——中被证明是有效的(9)。所述SM中间体还被缀合至一种脂质，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，并且确定所述缀合物具有加强的TLR7激动剂活性(例如，基于2008年2月7日提交的国际专利申请PCT/US2008/001631的，2008年9月25日公布的WO 2008/115319)。

发明内容

本文提供可调节一个或多个toll样受体活性的小分子缀合物(例如，所述缀合物是激动剂和/或拮抗剂)。术语“toll样受体”(TLR)是指结合至病原体相关分子模式(PAMP)并且促进哺乳动物中的免疫应答的受体家族的成员。已知10种哺乳动物TLR，例如TLR1-10。术语“toll样受体激动剂”(TLR激动剂)是指与TLR相互作用并刺激所述受体活性的分子。合成的TLR激动剂是设计为与TLR相互作用并刺激所述受体活性的化合物。TLR激动剂的实例包括TLR-7激动剂、TLR-3激动剂或TLR-9激动剂。术语“toll样受体拮抗剂”(TLR拮抗剂)是指与TLR相互作用并抑制或中和所述受体的信号转导活性的分子。合成的TLR拮抗剂是设计为与TLR相互作用并妨碍所述受体活性的化合物。TLR拮抗剂的实例包括TLR-7拮抗剂、TLR-3拮抗剂或TLR-9拮抗剂。

因此，在一个实施方案中，本文提供具有式I结构的化合物：

或其可药用盐，包括其水合物，其中：

X是N或CR²；

R是-OR¹、-SR¹或-NR^aR^b，

X¹是键或者是-O-、-S-或-NR^c-；

R^c是氢、C1-C10烷基或取代的C1-C10烷基，或者R^c和R¹与氮原子一起可形成杂环或取代的杂环；

R¹是氢、C1-C10烷基、取代的C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、取代的C1-C10烷氧基、C1-C10烷基C1-C10烷氧基、取代的C1-C10烷基C1-C10烷氧基、C5-C10芳基、取代的C5-C10芳基、C5-C9杂环、取代的C5-C9杂环、C3-C9碳环或取代的C3-C9碳环；

每个R²独立地是氢、-OH、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基，取代的C1-C6烷氧基、-C(O)-C1-C6烷基(烷酰基)，取代的-C(O)-C1-C6烷基、-C(O)-C6-C10芳基(芳酰基)，取代的-C(O)-C6-C10芳基、-C(O)OH(羧基)、-C(O)O-C1-C6烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(O)O-C1-C6烷基、-NR^aR^b、-C(O)NR^aR^b(氨基甲酰基)、取代的C(O)NR^aR^b、卤素、硝基或氰基；

所述烷基、芳基或杂环基团上的所述取代基是羟基、C1-C6烷基、羟基C1-C6亚烷基、C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氧基C1-C6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；

R^a和R^b各自独立地是氢、C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷酰基、羟基C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、Het、Het C1-C6烷基或C1-C6烷氧基羰基；

每个R^x独立地是-X²-((R³)_r-(R⁴)_s)_p、-C(O)NR^aR^b或-CH₂NH-生物素；

每个X²独立地是键或连接基团；

每个R³独立地是聚乙二醇(PEG)部分；

每个R⁴独立地是H、-C1-C6烷基、-C1-C6烷氧基，-NR^aR^b、-N₃、-OH、-CN、-COOH、-COOR¹、-C1-C6烷基-NR^aR^b、-C1-C6烷基-OH、-C1-C6烷基-CN、-C1-C6烷基-COOH、-C1-C6烷基-COOR¹、5至6元(5-6元)环、取代的5-6元环、-C1-C6烷基-5-6元环、-C1-C6烷基-取代的5-6元环、C2-C9杂环或取代的C2-C9杂环；

m是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

n是0、1、2、3或4；

p是1至100；

q是1、2、3、4或5；

r是1至1000；

s是1至1000；并且

n和q的和等于5。

在一些实施方案中，还提供具有式II结构的化合物：

或其可药用盐，或其水合物，其中X、X¹、X²、R、R¹、R²、R³、R⁴、m、n、p、q、r和s的实施方案均是如上文对式I所描述的。

在一些实施方案中，提供具有式III结构的化合物：

或其可药用盐，或其水合物，其中：

X、X¹、R、R¹和R²的实施方案均是如上文对式I所描述的；

Y是-X²-((R³)_r-(X³)_t-(X⁴)_s)_p)_q、

-X²-((R³)_r-(X³)_t-(X⁴)_s-(R⁴)_u)_p)_q、

-X²-((X⁴)_s-(X³)_t-(R³)_r)_p)_q，或

-X²-((X⁴)_s-(X³)_t-(R³)_r-(R⁴)_u)_p)_q；

R³、R⁴、m、n、p、q、r和s的实施方案均是如上文对式I所描述的；

每个X³独立地是键或连接基团；

每个X⁴独立地是大分子；

t是1至1000；并且

u是1至1000。

在一些实施方案中，X是N。在一些实施方案中，X¹是氧，并且在一些实施方案中，R¹是取代的C1-C10烷基，例如C1-C10烷基C1-C10烷氧基部分(例如，-CH₂CH₂OCH₃)。R¹在一些实施例中是由6个或少于6个非氢原子组成。在一些实施方案中，n是4并且R²在每个实例中是氢。

一些实施方案中，X²和/或X³独立地是酰氨基连接基团(例如，-C(O)NH-或-NH(O)C-)；烷基酰氨基连接基团(例如，-C1-C6烷基-C(O)NH-、-C1-C6烷基-NH(O)C-、-C(O)NH-C1-C6烷基-、-NH(O)C-C1-C6烷基-、-C1-C6烷基--NH(O)C-C1-C6烷基-、-C1-C6烷基-C(O)NH-C1-C6烷基-或-C(O)NH-(CH₂)_t-，其中t是1、2、3或4)；取代的5-6元环(例如，芳环、杂芳环(例如，四唑、吡啶基、2，5-吡咯烷二酮(例如，由取代的苯基部分取代的2，5-吡咯烷二酮))、碳环或杂环)或含氧部分(例如，-O-、-C1-C6烷氧基)。

PEG部分可包括一个或多个PEG单元。PEG部分可包括约1至约1,000个PEG单元，在一些实施方案中包括但不限于，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800或900个单元。在一些实施方案中，PEG部分可包含约5至约25个PEG单元，约10至约50个PEG单元，约50至约150个PEG单元，约120至约350个PEG单元，约250至约550个PEG单元或者约650至约950个PEG单元。在一些实施方案中PEG单元是-O-CH₂-CH₂-或-CH₂-CH₂-O-。

在一些实施方案中，r是约5至约100，有时r是约5至约50或者约5至约25。在一些实施方案中，r是约5至约15，有时r是约10。在一些实施方案中，R³是PEG单元，r是约2至约10(例如，r是约2至约4)。在一些实施方案中，R3是-O-CH₂-CH₂-或-CH₂-CH₂-O-。

在一些实施方案中R₃是-O-CH₂-CH₂-或-CH₂-CH₂-O-，r是约1至约1000(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000)。在一些相关的实施方案中，r是约5至约25、约10至约50、约50至约150、约120至约350、约250至约550或约650至约950。

在一些实施方案中，s是约5至约100，有时s是约5至约50或约5至约25。在一些实施方案中，s是约5至约15，并且有时s是约10。在一些实施方案中，s是约5或更小(例如，s是1)。在一些实施方案中，所述(R³)_r取代基是直链，在一些实施方案中，所述(R³)_r取代基是支链。对于直链部分，s有时小于r(例如，当R₃是-O-CH₂-CH₂-或-CH₂-CH₂-O-时)，而有时s是1。在一些实施方案中R₃是直链PEG部分(例如，具有约1至约1000个PEG单元)，s是1而r是1。对于支链部分，s有时小于、大于或等于r(例如，当R₃是-O-CH₂-CH₂-或-CH₂-CH₂-O-时)，有时r是1，s是1，而p是约1至约1000(例如，p是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000)。

在一些实施方案中，t是约5至约100，有时t是约5至约50，或者约5至约25。在一些实施方案中，t是约5至约15，有时t是约10。在一些实施方案中，t是约5或更小(例如，t是1)。在一些实施方案中，u是约5至约100，有时u是约5至约50或者约5至约25。在一些实施方案中，u是约5至约15，有时u是约10。在一些实施方案中，u是约5或更小(例如，u是1)。

在一些实施方案中，R⁴取代基独立地是H、C1-C2烷基、-C1-C2烷氧基(例如，-OCH₃)、-NR^aR^b、-OH、-CN、-COOH、-COOR¹、-C1-C2烷基-NR^aR^b、C1-C2烷基-OH、C1-C2烷基-CN、C1-C2烷基-COOH或C1-C2烷基-COOR¹。在一些实施方案中，R⁴是任选取代的5-6元环(例如，芳环、杂芳环、碳环、杂环)。在一些实施方案中，R⁴不是氢，有时R⁴不是羟基。

在涉及具有式I的结构的化合物的一些实施方案中，m是约1，R²是氢，并且n是4，q是1，p是1，r是约10而s是1。

每个X⁴可以是相同的大分子或不同的大分子。在一些实施方案中，大分子选自以下：抗体、抗体片段、抗原、病原体抗原(例如，金黄色葡萄球菌(S.aureus)抗原)、蛋白质(例如，人血清白蛋白或其片段)、甘油、脂质、磷脂(例如，DOPE)和鞘脂等。在一些实施方案中，所述大分子是DOPE。

在一个实施方案中，本发明提供了一种预防、抑制或治疗受试者的炎性或自身免疫性病症(障碍或疾病)(例如，类风湿性关节炎)的方法，其包括将具有下面结构的化合物：

或其可药用盐或其水合物以可有效预防、抑制或治疗所述类风湿关节炎的量给予需要其的人受试者。

本文还提供一种药物组合物，其包含具有式I、II或III的结构的化合物的可药用盐。本文还提供一种预防、抑制或治疗受试者的炎性病症的方法，其包括将具有式I、II或III的结构的化合物以可有效预防、抑制或治疗所述病症(例如，自身免疫性障碍或其症状)的量给予需要其的受试者。本文还提供一种预防、抑制或治疗受试者的自身免疫性病症的方法，其包括将具有式I、II或III的结构的化合物以可有效预防、抑制或治疗所述病症(例如炎症)的量给予需要其的受试者。

因此，本发明提供用于医学疗法中的化合物，例如预防、抑制或治疗炎性障碍或疾病(例如，类风湿性关节炎，或者癌症)的试剂，所述化合物任选地与其他化合物结合使用。因此，本发明的化合物可用于预防、抑制或治疗自身免疫性障碍或疾病、炎性障碍或疾病或者癌症。

还提供所述化合物用于制造预防、抑制或治疗炎性和/或自身免疫性障碍或疾病或者癌症的药物的用途。在一个实施方案中，本发明提供用于预防、抑制或治疗受试者的癌症的方法，其包括将具有式I、II或III的结构的化合物以可有效预防、抑制或治疗所述癌症的量给予需要其的受试者。在一个实施方案中，本发明的化合物被给予患有癌症的受试者，其中指出了皮质类固醇，例如***、强的松龙(prednisilone)、甲基强的松龙或氢化可的松；癌症，例如何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤或脑瘤。在一个实施方案中，将本发明的化合物给予有患癌症风险的受试者，所述癌症的发生与炎症有关，例如结肠癌。因此，本发明提供用于医学疗法的化合物，例如预防、抑制或治疗癌症的试剂，所述化合物任选地与其他化合物结合使用。因此，本发明的化合物可用于预防、抑制或治疗多种自身免疫性障碍/疾病、炎性障碍/疾病和癌症。

附图说明

附图举例说明本发明的实施方案并且不是限制性的。应注意为了清楚和容易地说明，这些附图不是按比例绘制，在一些情况下本发明的各种实施方案可被夸张地或放大地显示以便于对具体实施例的理解。

在本文件中全文使用以下缩写。Toll样受体(TLR)，脂多糖(LPS)、髓样分化因子初次应答基因(88)(MyD88)，骨髓来源单核细胞(BMDM)，外周血单核细胞(PBMC)，聚乙二醇(PEG)，乙醇(EtOH)，四氢呋喃(THF)，1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N，N，N’，N’-tetramethyluroniumhexafluorophosphate，HATU)，二氯甲烷(DCM)，三乙胺(TEA)，浆细胞样树突状细胞(Plasmacytoid dendritic cells，pDC)，卵清蛋白(OVA)，鼠血清白蛋白(MSA)，人血清白蛋白(HSA)和免疫球蛋白(Ig)。

图1描述用于合成脂质-(6)、PEG-(8)或脂质-PEG(9)TLR7缀合物的方案。(6)、(8)和(9)是指化合物名称。

图2A-D描述在鼠巨噬细胞中进行TLR7缀合物体外免疫学表征的结果。图2E描述使用LPS不应答突变体和野生型巨噬细胞进行内毒素污染评估的结果。

图3A-B描述在人PBMC中进行TLR7缀合物体外免疫学表征的结果。

图4A-B描述由TLR7缀合物在体内进行的促炎性细胞因子诱导的动力学。

图5A-C描述TLR7缀合物在体内的佐剂作用(adjuvanticity)(例如，起始免疫应答的能力)。

图6A-C描述TLR7缀合物的可能副作用的评估结果。

图7A-B描述通过用1V136(游离药效团)和1V282(化合物8)的治疗导致的腹膜嗜中性粒细胞浸润的减少。

图8描述用1V282(化合物(8))的治疗对诱导的试验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的作用。

图9A-E显示具有不同链长的TLR7激动剂缀合物对NFkBbla RAW264.7细胞和骨髓来源巨噬细胞(BMDM)的体外活性。

图10A-C描述给予小鼠的TLR7激动剂PEG缀合物的体内药效动力学。

图11A-B描述在血清转移关节炎模型中通过每日管饲法(A)或通过皮下注射(B)给予的1V282的抗炎效应。

图12A-B显示在巯基乙酸盐(thioglycolate)诱导的腹膜炎模型中TLR7激动剂PEG缀合物的抗炎效应。

具体实施方式

本文提供的是作为一种或多种Toll样受体的激动剂或拮抗剂的小分子缀合物。这样的缀合物可用于多种用途，包括但不限于，治疗病症，例如自身免疫性、炎症和细胞增殖性障碍或疾病。

化合物

小分子TLR调节剂是已知的。小分子TLR调节剂的实例在如下文献中有描述：基于2000年5月26日提交的专利申请no.09/555,292的，于2001年12月11日授权的美国专利No.6,329,381；和2006年8月21日提交的PCT/US2006/032371(于2007年3月1日公开为WO2007/024707)；2008年2月7日提交的PCT/US2008/001631(于2008年9月25日公开为WO2008/115319)；2007年4月23日提交的PCT/US07/009840(于2007年12月13日公开为WO/2007/142755)；和2008年2月7日提交的美国临时专利申请No.61/026,999。

已经确定一些小分子TLR激动剂(例如，本文中称作“小分子靶标”)可缀合至一个或多个PEG部分，并且得到的缀合物可表现出TLR拮抗剂活性。有数种用于将小分子靶标与一个或多个PEG部分缀合的已知方法。例如，一些PEG反应物是市售的并且适于缀合至所述小分子上的多个反应基团(例如，NOF Corporation，Japan(World Wide Web URLpeg-drug.com/peg_product/activated_peg.html))。本文使用的术语“PEG反应物”是指在产生PEG小分子靶标缀合物产物的条件下与小分子靶标结合的分子。例如，具有以下结构的一些PEG反应物可与小分子上的多种靶标基团反应：

CH₃O(CH₂CH₂O)_n-X，其中X是表1中的反应基团：

并且其中NHS^*是N-琥珀酰亚胺基。

在一些实施方案中，PEG反应物具有结构CH₃O(CH₂CH₂O)_n-X-NHS^*，其中X可以是-COCH₂CH₂COO-、-COCH₂CH₂CH₂COO-、-CH₂COO-和-(CH₂)₅COO-。在一些实施方案中，PEG反应物具有结构

在一些实施方案中，一些PEG反应物是双官能的。双官能PEG反应物的实例具有结构X-(OCH₂CH₂)n-X，其中X在一些实施方案中是(N-琥珀酰亚胺基氧羰基)甲基(-CH₂COO-NHS)、琥珀酰亚胺基戊二酸酯(-COCH₂CH₂CH₂COO-NHS)、(N-琥珀酰亚胺氧基羰基)戊基(-(CH₂)₅COO-NHS)、3-(N-马来酰亚胺基)丙酰氨基、(-NHCOCH₂CH₂-MAL)、氨基丙基(-CH₂CH₂CH₂NH₂)或2-硫基乙基(Sulfanylethyl)(-CH₂CH₂SH)。

在一些实施方案中，一些PEG反应物是杂官能的。杂官能的PEG反应物的实例具有结构

其中X在一些实施方案中可以是(N-琥珀酰亚胺氧基羰基)甲基(-CH₂COO-NHS)、琥珀酰亚胺基戊二酸酯(-COCH₂CH₂CH₂COO-NHS)、(N-琥珀酰亚胺氧基羰基)戊基(-(CH₂)₅COO-NHS)、3-(N-马来酰亚胺基)丙酰氨基(-NHCOCH₂CH₂-MAL)、3-氨基丙基(-CH₂CH₂CH₂NH₂)、2-硫基乙基(Sulfanylethyl)(-CH₂CH₂SH)、5-(N-琥珀酰亚胺氧基羰基)戊基(-(CH₂)₅COO-NHS]或对硝基苯基氧羰基(-CO₂-p-C₆H₄NO₂)。

还可以使用一些支链PEG反应物，例如具有以下结构的那些：

其中X是间隔基(spacer)而Y是官能团，包括但不限于(在一些实施方案中)马来酰亚胺、胺、戊二酰-NHS、碳酸酯-NHS或碳酸酯-对硝基苯酚。支链PEG反应物的一个优势是它们可产生具有持续释放性能的缀合产物。

在一些实施方案中，PEG反应物还可以是杂官能反应物，例如

HO(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂CH₂NH₂

HCl·H₂N-CH₂CH₂CH₂O(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)₅COOH    和

HO(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂CHO。

在一些实施方案中，可使用Boc^*-保护-氨基-PEG-羧基-NHS或马来酰亚胺-PEG-羧基-NHS反应物。

在一些实施方案中，梳形(comb-shaped)聚合物可被用作PEG反应物以将很多PEG单元纳入缀合物。梳形聚合物的一个实例显示如下

在一些实施方案中，对于在题为“化合物”的本部分中具体地显示的PEG反应物，所述PEG反应物中显示出的取代基“n”或“m”仅等同于“r”，所述“r”是如上为式I、II或III所定义的。PEG反应物和/或PEG缀合物产物的分子量可以是在约5克/摩尔至约100000克/摩尔变化。在一些实施方案中，PEG反应物和/或PEG缀合物产物的平均分子量或标称分子量为约10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，2000，3000，4000，5000，6000，7000，8000，9000，10000，20000，30000，40000，50000，60000，70000，80000或90000克/摩尔。在一些实施方案中，本文的化合物中的所述PEG部分是均相的，并且所述PEG部分的分子量对于具体一批化合物的每个分子是相同的(例如，R³是一个PEG单元并且r是2至10)。

在一些实施方案中，一种或多种R⁴取代基在所述PEG部分(例如，式I；直链或支链PEG部分)的末尾。在一些实施方案中，每个R⁴取代基可以相同或不同，并且可独立地选自-CH₂-CH₂-NH₂、-CH₂-CH₂-OH、-CH₂-CH₂-COOH、-CH₂-CH₂-COOR¹。所述连接物可以是任意合适的连接物，包括本文描述的连接物。

合适的连接物可被用于构建缀合物(例如，X²、X³)，并且已知多种连接物。可以使用的连接物的非限制性实例包括以下：

本文使用的术语“烷基”、“烯基”和“炔基”包括直链、支链和环状单价烃基以及它们的结合物，当其未被取代时仅包含C和H。实例包括甲基、乙基、异丁基、环己基、环戊基乙基、2-丙烯基、3-丁炔基等。每个这样的基团中的碳原子总数有时在本文中描述为：例如当所述基团可含有最高至10个碳原子时，它可以被表示为1-10C或C1-C10或C1-10。当杂原子(通常是N、O和S)可以在杂烷基中代替碳原子时，例如，描述所述基团的数字尽管仍被写为例如C1-C6，但代表所述基团中碳原子的数目加上这些杂原子的数目的总数，所包括的杂原子为所描述的环或链的骨架中碳原子的取代物。

通常，本发明的所述烷基、烯基和炔基取代基包含一个10C(烷基)或两个10C(烯基或炔基)。它们优选地包含一个8C(烷基)或两个8C(烯基或炔基)。有时它们包含一个4C(烷基)或两个4C(烯基或炔基)。单个基团可包含超过一种类型的重键，或者超过一个重键；当这样的基团包含至少一个碳-碳双键时，其被包括在术语“烯基”的定义中，而当这样的基团包含至少一个碳-碳三键时，则其被包括在术语“炔基”的定义中。

烷基、烯基和炔基基团经常可任选地被取代，其取代程度为这样的取代具有化学意义。常用的取代基包括但不限于，卤素、＝O、＝N-CN、＝N-OR、＝NR、OR、NR₂、SR、SO₂R、SO₂NR₂、NRSO₂R、NRCONR₂、NRCOOR、NRCOR、CN、COOR、CONR₂、OOCR、COR和NO₂，其中每个R独立地是H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基，并且每个R任选地被以下基团取代：卤素、＝O、＝N-CN、＝N-OR’、＝NR’、OR’、NR’₂、SR’、SO₂R’、SO₂NR’₂、NR’SO₂R’、NR’CONR’₂、NR’COOR’、NR’COR’、CN、COOR’、CONR’₂、OOCR’、COR’和NO₂，其中每个R’独立地是H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基。烷基、烯基和炔基也可被以下基团取代：C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基，其各自可被适于所述特定基团的取代基取代。

“乙炔(acetylene)”取代基是任选地被取代的2-10C炔基基团，并且具有式-C≡C-Ri，其中Ri是H或C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C7-C12芳烷基或C6-C12杂芳烷基，并且每个Ri基团可由选自以下的一个或多个取代基任选地取代：卤素、＝O、＝N-CN、＝N-OR’、＝NR’、OR’、NR’2、SR’、SO₂R’、SO₂NR’₂、NR’SO₂R’、NR’CONR’₂、NR’COOR’、NR’COR’、CN、COOR’、CONR’₂、OOCR’、COR’和NO₂，其中每个R’独立地是H、C1-C6烷基、C2-C6杂烷基、C1-C6酰基、C2-C6杂酰基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C7-12芳烷基或C6-12杂芳烷基，其各自可任选地由选自以下的一个或多个基团取代：卤素、C1-C4烷基、C1-C4杂烷基、C1-C6酰基、C1-C6杂酰基、羟基、氨基和＝O；并且其中两个R’可连接形成3-7元环，其可任选地包含最高达3个杂原子，所述杂原子选自N、O和S。在一些实施方案中，-C≡C-Ri的Ri是H或Me。

“杂烷基”、“杂烯基”和“杂炔基”等的定义类似于对应的烃基(烷基、烯基和炔基)，但是所述术语“杂”是指在主链残基中含有1至3个O、S或N杂原子或其组合的基团；因此相应烷基、烯基或炔基的至少一个碳原子由所指定的杂原子中的一个取代以形成杂烷基、杂烯基或杂炔基基团。对于烷基、烯基和炔基基团的杂基团形式(heteroform)来说，常见和优选大小一般与相应烃基基团相同，并且可存在于所述杂基团形式上的取代基与上文针对烃基基团描述的那些取代基相同。鉴于化学稳定性的原因，还应理解，除非另有说明，这样的基团不包含超过两个连续杂原子，除了当氧基如在硝基或磺酰基中那样出现在N或S上时。

尽管本文使用的“烷基”包括环烷基和环烷基烷基基团，术语“环烷基”在本文中可用于描述通过环碳原子连接的碳环非芳香族基团，而“环烷基烷基”可用于描述通过烷基连接物与所述分子连接的碳环非芳香族基团。类似地，“杂环基”可用于描述包含至少一个杂原子作为环成员并且通过环原子(可以是C或N)与所述分子连接的非芳香族环基团；“杂环烷基”可用于描述通过连接物与另一个分子连接的基团。适用于环烷基、环烷基烷基、杂环基和杂环烷基基团的大小和取代基与上文针对烷基基团所描述的那些相同。本文使用的这些术语还包括包含一个或两个双键的环，条件是所述环不是芳香族的。

本文使用的“酰基”包括这样的基团，即所述基团包含连接在羰基碳原子的两个可使用的原子价位中的一个价位上的烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基基团，而杂酰基是指这样的对应基团，即其中至少一个非羰基碳的碳被选自N、O和S的杂原子取代。因此，杂酰基包括，例如，-C(＝O)OR和-C(＝O)NR₂以及-C(＝O)-杂芳基。

酰基和杂酰基基团是键合在任意通过羰基碳原子的开放原子价连接的基团或分子上。通常，它们是C1-C8酰基基团，其包含甲酰基、乙酰基、特戊酰和苯甲酰，以及C2-C8杂酰基基团，其包括甲氧基乙酰基、乙氧基羰基和4-吡啶甲酰基(pyridinoyl)。包含酰基或杂酰基基团的所述烃基基团、芳基基团和这些基团的杂基团形式可由取代基取代，所述取代基是本文描述的通常适合用于所述酰基或杂酰基基团的各个对应组分基本的取代基。

“芳香族”部分或“芳基”部分是指具有公知的芳香性特性的单环或稠合双环部分；实例包括苯基和萘基。类似地，“杂芳香族”和“杂芳基”是指这样的单环或稠合双环***，即其包含一个或多个选自O、S和N的杂原子作为环成员。杂原子的加入允许5元和6元环中的芳香性。常见的杂芳香族***包括单环C5-C6芳香族基团，例如吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、噁唑基和咪唑基，以及由这些单环基团之一与苯环或与任意所述杂芳香族单环基团稠合形成的稠合双环部分，可形成C8-C10双环基团，例如吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并***基、异喹啉基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、吡唑并吡啶基、喹唑啉基、喹喔啉基和肉啉基等。该定义包括在整个环***中电子分布方面具有芳香性特性的任意单环或稠合双环***。它还包括其中至少环(所述环与所述分子的其他部分直接连接)具有芳香性特性的双环。通常，所述环***包含5-12个环成员原子。所述单环杂芳基优选地包含5-6个环成员，而所述双环杂芳基包含8-10个环成员。

芳基和杂芳基部分可被多种取代基取代，所述取代基包括C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-C12芳基、C1-C8酰基和这些基团的杂基团形式，其各自本身可被进一步取代；芳基和杂芳基的其他取代基包括卤素、OR、NR₂、SR、SO₂R、SO₂NR₂、NRSO₂R、NRCONR₂、NRCOOR、NRCOR、CN、COOR、CONR₂、OOCR、COR和NO₂，其中每个R独立地是H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C7-C12芳烷基或C6-C12杂芳烷基，并且每个R可任选地如上文针对烷基基团所述的那样被取代。当然，芳基或杂芳基基团上的所述取代基团可由这样基团进一步取代，即所述基团为上文描述的适合于每种类型的此类取代基或适合于所述取代基的每个组分的基团。因此，例如，芳烷基取代基可在芳基部分由上文描述的通常用于芳基基团的取代基取代，并且它还可在所述烷基部分进一步由上文描述的通常用于或适合用于烷基基团的取代基取代。

类似地，“芳烷基”和“杂芳烷基”是指通过连接基团键合至其连接点的芳香族和杂芳香族环***，所述连接基团例如亚烷基，包括取代的或未取代的、饱和的或不饱和的、环状的或非环状的连接物。通常，所述连接物是C1-C8烷基或其杂基团形式。这些连接物还可包括羰基基团，因此使得它们能够提供作为酰基或杂酰基部分的取代基。芳烷基或杂芳烷基基团中的芳基或杂芳基环可用与上文描述的用于芳基基团的取代基相同的取代基取代。芳烷基基团优选地包括苯环，所述苯环任选地由上文定义的用于芳基基团的基团和C1-C4亚烷基取代，所述C1-C4亚烷基是未取代的或是由一个或两个C1-C4烷基基团或杂烷基基团取代，其中所述烷基或杂烷基基团可任选地环化以形成环，例如环丙烷、二氧戊环或氧杂环戊烷。类似地，杂芳烷基基团优选地包括C5-C6单环杂芳基基团，其任选地由上文描述的通常作为芳基基团上取代基的基团和C1-C4亚烷基取代，所述C1-C4亚烷基是未取代的或是由1个或2个C1-C4烷基基团或杂烷基基团取代，或者杂芳烷基基团包括任选地取代的苯环或C5-C6单环杂芳基和C1-C4杂亚烷基，所述C1-C4杂亚烷基是未取代的或由1个或2个C1-C4烷基或杂烷基基团取代，其中所述烷基或杂烷基基团可任选地环化以形成环，例如环丙烷、二氧戊环或氧杂环戊烷。

当芳烷基或杂芳烷基基团被描述为被任选地取代时，所述取代基可以是在所述基团的所述烷基或所述杂烷基部分上，或者是在所述基团的所述芳基或杂芳基部分上。任选地存在于所述烷基或杂烷基部分上的所述取代基与上文描述的通常用于烷基基团的那些相同；任选地存在于所述芳基或杂芳基部分上的取代基与上文描述的通常用于芳基基团的那些相同。

本文使用的“芳烷基”基团如果未被取代则是烃基基团，并且通过所述环和亚烷基或类似连接物中的碳原子总数而被描述。因此，苄基基团是C7-芳烷基基团，而苯乙基是C8-芳烷基。

上文描述的“杂芳烷基”是指包含芳基基团的部分，所述芳基基团通过连接基团连接，并且其与“烷芳基”的不同之处在于所述芳基部分的至少一个环原子或所述连接基团中的一个原子是选自N、O和S的杂原子。所述杂芳烷基基团在本文中是根据所述环和结合的连接物中原子总数来描述，并且它们包括通过杂芳基连接物连接的芳基基团；通过烃基连接物(例如亚烷基)连接的杂芳基基团；和通过杂烷基连接物连接的杂芳基基团。因此，例如，C7-杂芳烷基可包括吡啶基甲基、苯氧基和N-吡咯基甲氧基。

本文使用的“亚烷基”是指二价烃基基团；因为它是二价的，所以它可将两个其他基团连接在一起。它一般指-(CH₂)_n-，其中n是1-8，并且优选地n是1-4，虽然其中进行了详细说明，但亚烷基还可由其他基团所取代，并且可以是其他长度，并且所述开放原子价不必在链的另一末端。因此，-CH(Me)-和-C(Me)₂-还可称作亚烷基，称作环基团，例如环丙-1，1-二基。当亚烷基被取代时，所述取代基包括本文描述的一般存在于烷基基团上的那些取代基。

一般而言，包含在取代基中的任何烷基、烯基、炔基、酰基、芳基或芳烷基基团或者这些基团之一的任意杂基团形式本身可任选地由其他取代基取代。如果没有另作描述，这些取代基的性质类似于针对初级取代基本身所列举的那些取代基。因此，例如在R2是烷基的实施方案中，该烷基可任选地由针对R2的实施方案中所列出的剩余取代基取代，该取代应具有化学意义并且不会破坏针对所述烷基本身所提出的大小限制；例如，由烷基或由烯基取代的烷基就完全超出这些实施方案中的碳原子的上限，并且不被包括在内。但是，由芳基、氨基、烷氧基和＝O等取代的烷基包括在本发明的范围内，并且这些取代基基团的原子不被计入用于描述所描述的烷基、烯基等基团的数目。当没有具体说明取代基的数目时，每个这样的烷基、烯基、炔基、酰基或芳基基团可根据其可用的化合价由多个取代基来取代；例如，特别地，任意这些基团可在其任意或全部可用化合价处由氟原子取代。

本文使用的“杂基团形式”是指基团(例如烷基、芳基或酰基)的衍生物，其中所指定的碳环基团的至少一个碳原子已被选自N、O和S的杂原子取代。因此，烷基、烯基、炔基、酰基、芳基和芳烷基的所述杂基团形式分别是杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂酰基、杂芳基和杂芳烷基。应理解通常不超过两个N、O或S原子会连续相连，除了其中氧基连接至N或S以形成硝基或磺酰基基团。杂基团形式在本文中有时被称作“Het”。

本文使用的“Halo”或“卤素”包括氟、氯、溴和碘。常常优选氟和氯。本文描述的“氨基”是指NH₂，但当氨基被描述为“取代的”或“任选地取代的”时，所述术语包括NR’R”，其中每个R’和R”独立地是H，或者是烷基、烯基、炔基、酰基、芳基或芳烷基基团，或者是这些基团之一的杂基团形式，并且每个所述烷基、烯基、炔基、酰基、芳基或芳烷基基团或这些基团之一的杂基团形式可任选地由本文描述的适于对应基团的取代基取代。所述术语还包括这样的形式，即其中R’和R”连接在一起形成3-8元环，其可以是饱和的、不饱和的或者是芳香族的，并且其包含1-3个独立地选自N、O和S的杂原子作为环成员，并且其可任选地由描述为适于烷基基团的取代基取代，或者如果NR’R”是芳香族基团，则它可任选地由所描述的通常用于杂芳基基团的取代基取代。

本文使用的术语“碳环”是指在所述环上仅包含碳原子的环状化合物，而“杂环”是指包含杂原子的环状化合物。所述碳环和杂环结构包括具有单环、双环或多环***的化合物。本文使用的术语“杂原子”是指不是碳或氢的任意原子，例如氮、氧或硫。杂环的举例性实例包括但不限于四氢呋喃、1，3-二氧戊环、2，3-二氢呋喃、吡喃、四氢吡喃、苯并呋喃、异苯并呋喃、1，3-二氢异苯并呋喃、异噁唑、4，5-二氢异噁唑、哌啶、吡咯烷、吡咯烷-2-酮、吡咯、吡啶、嘧啶、八氢吡咯并[3，4b]吡啶、哌嗪、吡嗪、吗啉、硫代吗啉、咪唑、咪唑烷-2，4-二酮、1，3-二氢苯并咪唑-2-酮、吲哚、噻唑、苯并噻唑、噻二唑(thiadiazole)、噻吩、四氢噻吩-1，1-二氧化物、二氮杂卓、***、胍、二氮杂双环[2.2.1]庚烷、2，5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷、2，3，4，4a，9，9a-六氢-1H-β-咔啉、环氧乙烷、氧杂环丁烷(oxetane)、四氢吡喃、二噁烷、内酯、氮丙啶、氮杂环丁烷、哌啶、内酰胺，并且还可包括杂芳基。杂芳基的其他示例性实例包括但不限于呋喃、吡咯、吡啶、嘧啶、咪唑，苯并咪唑和***。

在一些情况下，本文描述的化合物包含一个或多个手性中心。本发明包括各个分离的立体异构形式以及具有不同程度手性纯度的立体异构体的混合物，包括外消旋混合物。它还包括多种非对映异构体和可形成的互变异构体。本发明的化合物还可以一种或多种互变异构形式存在。例如，当R是-OH时，本文描述的化合物可以一种或多种互变异构形式存在。

本文描述的术语“任选地取代”表示被描述的具体一种或多种基团可以没有非氢的取代基，或者所述一种或多种基团可以有一个或多个非氢的取代基。如果没有另作说明，可存在的这样取代基的总数等于存在于被描述的所述基团的未取代形式之上的氢原子的数目。当任选的取代基是通过双键(例如羰基氧(＝O))连接时，所述基团占用两个可用化合价，这样依照可用化合价的数目可以减少所包括的取代基的总数。

药物组合物和制剂

本文描述的化合物可被制备为可药用盐。本文使用的术语“可药用盐”是指所公开化合物的衍生物，其中母体化合物是通过制备其酸性或碱性盐而被修饰。可药用盐的实例包括但不限于，碱性残基(例如胺)的无机或有机酸盐；酸性残基(例如羧酸)的碱或有机盐；等等。可药用盐包括例如由无毒的无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，常规无毒盐包括源自无机酸的那些，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸等；以及从有机酸制备的盐，所述有机酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸(pamoic)、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、延胡索酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸和羟乙磺酸等。在其他实例中，常规无毒盐包括源自碱的那些，所述碱例如氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铵、咖啡碱和各种胺等。可药用盐可从所述母体化合物(其含有碱性或酸性部分)通过常规化学方法合成。这样的盐一般可通过以下方式制备：使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的合适碱或酸在水中或有机溶剂中或者两者的混合物中反应；一般优选非水介质，例如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适盐的列表可见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack PublishingCompany，Easton，PA，p.1418(1985)，其内容以引用的方式纳入本文。

本文使用的术语“可药用”是指处于正确医学判断范围内的化合物、材料、组合物和/或剂型适用于与人和动物的组织接触而不会带来过度的毒性、刺激性、***反应或与合理益处/风险比相称的其他问题或并发症。

术语“稳定化合物”和“稳定结构”意欲表示强度足以禁受从反应混合物至有用程度的纯度的分离并且成为有效治疗剂的配制的化合物。本文考虑将稳定的化合物用于所描述的治疗方法。

本文描述的化合物可与一种或多种其他试剂结合配制。所述一种或多种其他试剂可以包括但不限于本文描述的另外化合物、抗细胞增殖试剂(例如，化学疗法的)、抗炎试剂和抗原。

本文描述的化合物可被配制为药物组合物并给予哺乳动物主体，例如人患者或非人动物，其可以是适于所选给药路径的多种形式，所述给药路径例如口服或肠胃外给药，经静脉内、肌肉内、局部或皮下路径。在一些实施方案中，组合物可被局部给药，例如膀胱内给药(intravesicularly)。化合物常常包括稀释剂以及在一些情况下包括佐剂、缓冲剂和防腐剂等。在一些实施方案中，化合物还可在脂质体组合物中或者作为微乳剂形式被给药。还考虑用于药物的各种持续释放***，其可用于本文描述的化合物。参见，例如美国专利No.5,624,677，其方法以引用的方式纳入本文。

因此，化合物可被全身性地给予(例如口服)，例如与可药用载体结合，所述可药用载体例如惰性稀释剂或可吸收可食用载体。

本文描述的化合物可被装入硬壳或软壳明胶胶囊中，可被压制为片剂，或者可被直接纳入所述患者饮食的食物中。对于口服治疗给药，所述活性化合物可与一种或多种赋形剂结合并且以以下形式使用：可摄取的片剂、颊含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆和薄片(wafer)等。这样的组合物和制剂应包含至少0.1％的活性化合物。当然，所述组合物和制剂的百分比可以变化并且可方便地是给定单位剂型重量的约2至约60％。这类治疗有用的组合物中活性化合物的量应使得可获得有效剂量水平。

片剂、锭剂、丸剂和胶囊等还可包含以下物质：粘合剂，例如黄耆胶、***树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉和藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；和甜味剂，例如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜(aspartame)；或者调味剂，例如薄荷、冬青油；或者可以加入樱桃调味剂。当所述单位剂型是胶囊时，除上述类型的材料之外，它还可以包含液体载体，例如植物油或聚乙二醇。各种其他材料可作为包衣存在，或者另外修饰所述固体单位剂型的外观形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可用明胶、蜡、紫胶或糖等包被。糖浆或酏剂可包含所述活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染色剂和调味剂，例如樱桃或柑橘调味剂。当然，用于配制任何单位剂型的任何材料应该是可药用的并且使用量基本上是无毒的。此外，所述活性化合物可纳入持续释放制剂和装置中。

可通过输注或注射给予活性化合物。活性化合物或其可药用盐的溶液可在水中制备，任选地与无毒表面活性剂混合。还可在甘油、液体聚乙二醇、三乙酸甘油酯和它们的混合物中和在油中制备分散剂。在普通的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。

可药用剂量形式可包括包含活性成分的无菌水溶液或分散剂或无菌粉末，其适于临时制备无菌溶液或分散剂，并且任选地被封装在脂质体内。最终的剂型有时是无菌液体并且在制备和储存条件下是稳定的。液体载体或运载体可以是溶剂或液体分散剂介质，其包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯和它们的合适混合物。可通过例如形成脂质体，通过在分散剂的情况下维持所需颗粒大小，或者通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过各种抗细菌和抗真菌试剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和乙基汞硫代水杨酸钠(thimerosal)等)可产生对微生物作用的预防作用。在一些实施方案中，包含等渗试剂，例如，糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂来实现，所述试剂例如单硬脂酸铝和明胶。无菌溶液常常可通过以下方式制备：将需要量的活性化合物，有时连同一种或多种上文列举的其他成分，纳入合适的溶剂中，之后过滤灭菌。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，有时使用的制备方法是真空干燥和冻干技术，其产生含有活性成分加上存在于先前无菌过滤溶液中的任意其他所需成分的粉末。

对于局部给药，本文的化合物可以纯的形式被施用，例如，以液体形式。但是，一般需要给予与可接受载体结合的组合物或制剂形式的化合物，所述载体可以是固体或液体的。可用的固体载体包括极细固体，例如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅和氧化铝等。可用的液体载体包括水、醇类或二醇类或者水-醇/二醇混合物，本发明的化合物可在其中(任选地在无毒表面活性剂的帮助下)溶解或分散为有效水平。可加入佐剂例如香料和其他抗菌剂以优化用于给定用途的性质。所得液体组合物可从吸收垫(用于浸渍绷带或其他敷料)施用，或者使用泵型或烟雾喷射器喷洒在感染区域。

还可与液体载体一起使用增稠剂来形成可涂抹糊剂、凝胶、膏剂、皂剂等，以用于直接施用于使用者的皮肤，所述增稠剂例如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料。所述化合物的可用剂量可通过在动物模型中比较它们的体外活性和体内活性来确定。用于从小鼠和其他动物的有效剂量外推至人的方法是本领域已知的；例如，参见美国专利No.4,938,949。本文的化合物作为TLR激动剂或TLR拮抗剂发挥作用的能力可使用药理学模型来确定，所述药理学模型是已知的，包括Lee et al.，PNAS，100：6646(2003)公开的方法。液体组合物中所述化合物的浓度一般是约0.1-25wt％，优选地为约0.5-10wt％。在例如凝胶或粉末的半固体或固体组合物中的浓度为约0.1-5wt％，优选地为约0.5-2.5wt％。

用于治疗所需的化合物或其活性盐或衍生物的量不仅因所选的具体盐而不同，还因给药路径、待治疗病症的特性和所述患者的年龄和状态而不同，并且最终由主治医生或临床医生来决定。总的来说，合适的剂量有时为约0.5至约100mg/kg，例如，每天约10至约75mg/kg体重，例如每天3至约50mg/千克受试者体重，并且常常是6至90mg/kg/天，或约15至60mg/kg/天。化合物可被方便地以单位剂型给予，并且每单位剂型例如包含5至1000mg，或10至750mg，或50至500mg活性成分。可给予活性成分以达到约0.01至约100pM、约0.5至约75pM、约1至50pM或约2至约30pM活性化合物的峰值血浆浓度。可通过以下方式来实现这样的浓度，例如静脉注射任选地溶于盐水的活性成分的0.05至5％溶液，或者口服给予含有约1-100mg活性成分的大丸剂。可通过连续输注以提供约0.01-5.0mg/kg/hr或者通过包含约0.4-15mg/kg活性成分的间断输注来维持需要的血液水平。需要的剂量可方便地以单一剂量形式存在或者作为以适当间隔(例如，每天2、3、4或更多个亚剂量)给予的多次剂量存在。亚剂量本身可被进一步分开，例如，分为若干离散的疏松间隔的给药；例如从吹入器中多次吸入，或者通过多次滴入眼睛施用。

治疗

本文使用的术语“治疗(treat，treating)”是指(i)防止病理病症发生(例如，预防)；(ii)抑制所述病理病症或者阻止其发展；(iii)减轻所述病理病症；和/或(iv)改善、缓解、减轻并且消除病症的症状。本文描述的候选分子或化合物的量可以是在制剂或药物中的治疗有效量，其是能够引起生物学效应(例如抑制炎症)，或者引起改善、缓解、减少、减轻、减弱或消除病症(例如疾病)的症状的量。所述术语还指降低或终止细胞增殖速度(例如，使肿瘤生长减缓或停止)或者减少增殖癌细胞的数量(例如，除去肿瘤的一部分或全部)。这些术语还适合指减少微生物在受微生物感染的***中(例如，细胞、组织或受试者)的滴度(titre)，降低微生物繁殖的速度，减少症状的数目或者减轻与所述微生物感染相关的症状的效应，并且/或者从所述***中消除可检测量的所述微生物。微生物的实例包括但不限于病毒、细菌和真菌。

本文使用的术语“治疗有效量”是指用来在受试者中治疗或防止疾病或障碍，或者治疗疾病或障碍的症状的本文所提供化合物的量，或者是本文所提供化合物的结合的量。本文使用的术语“受试者”和“患者”一般是指将接受或者已经接受本发明所述方法的治疗(例如，给予本文所述的化合物)的个体。

本文描述的化合物可被给予需要其的受试者以可能防止、抑制或治疗一种或多种炎性障碍。下文中使用的术语“处理(treating)”“治疗(treatment)”和“治疗效应”可以指减少、抑制或终止(防止)炎症反应(例如，减少或停止抗体产生或针对特定抗原的抗体的量)，减少发炎组织的量并且完全或部分地减轻炎性病症。炎性病症包括但不限于，***反应、哮喘、自身免疫性障碍、慢性炎症、慢性***炎、肾小球肾炎、超敏感性、炎性肠病、肌病(例如，与全身性硬皮病、皮肌炎、多肌炎和/或包涵体肌炎结合)、***、再灌注损伤、类风湿性关节炎、移植物排斥、脉管炎和白细胞病症(例如，切-东综合征，慢性肉芽肿病)。一些自身免疫疾病也是炎性障碍(例如，类风湿性关节炎)。在一些实施方案中，所述炎性障碍选自：慢性炎症、慢性***炎、肾小球肾炎、超敏感性、肌病、***、再灌注损伤、移植物排斥、脉管炎和白细胞病症。在一些实施方案中，炎性病症包括但不限于支气管扩张、细支气管炎、囊性纤维化、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、动脉粥样硬化和感染性休克(例如，伴随多器官衰竭的败血症)。在一些实施方案中，炎性病症不是选自以下的病症：***反应、哮喘、ARDS和自身免疫病症。在一些实施方案中，炎性病症不是选自以下的病症：胃肠道炎症、脑炎症、皮肤炎症和关节炎症。在一些实施方案中，所述炎性病症是嗜中性粒细胞介导的障碍。

本文描述的化合物可给予需要其的受试者以便可能治疗一种或多种自身免疫障碍。在这样的治疗中，术语“处理”、“治疗”和“治疗效应”可以指减轻、抑制或终止自身免疫反应(例如，减缓或终止抗体产生或针对特定抗原的抗体的量)，减少炎症组织的量并且完全或者部分低减轻自身免疫障碍。自身免疫障碍包括但不限于自身免疫性脑脊髓炎、大肠炎、自身免疫性胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、华格纳肉芽肿和大动脉炎。测试用于这些疾病的化合物的模型包括但不限于(a)(i)由髓鞘少突胶质糖蛋白(MOG)肽诱导的C5BL/6，(ii)SJL小鼠PLP139-151，或178-191EAE，和(iii)用于自身免疫性脑脊髓炎的由MOG或PLP肽诱导的EAE过继转移模型；(b)自身免疫性IDDM的非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠；(c)对于大肠炎的硫酸葡聚糖钠(DSS)-诱导的大肠炎模型和三硝基苯磺酸(TNBS)-诱导的大肠炎模型；和(d)作为韦氏肉芽肿和大动脉炎的模型的***性小血管炎障碍(systemic small vasculitis disorder)。本文描述的化合物可给予受试者以便可能治疗一种或多种以下障碍：急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、阿狄森氏病；斑秃(alopecia areata)；强直性脊柱炎；抗磷脂抗体综合征(APS)；自身免疫性溶血性贫血；自身免疫性肝炎；自身免疫性内耳病；大疱性类天疱疮；乳糜泻；南美洲锥虫病(Chagasdisease)；慢性阻塞性肺病；克罗恩病(两类特发性炎性肠病“IBD”之一)；皮肌炎；1型糖尿病；子宫内膜异位；古德帕斯彻综合征；格雷夫斯病；格-巴综合征(GBS)；桥本病；化脓性汗腺病；特发性血小板减少性紫癜；间质性膀胱炎；红斑狼疮；混合型***病；硬斑病；多发性硬化(MS)；重症肌无力；发作性睡病；神经性肌强直；寻常天疱疮；恶性贫血；多肌炎；原发性胆汁性肝硬变；类风湿性关节炎；精神***症；硬皮病；斯耶格伦综合征；颞动脉炎(也被称作“巨细胞性动脉炎”)；溃疡性结肠炎(两种类型的特发性炎性肠病“IBD”之一)；脉管炎；白癜风；和韦格纳肉芽肿。在一些实施方案中，所述自身免疫障碍或疾病不是选自以下的障碍或疾病：克罗恩病、类风湿性关节炎、狼疮和多发性硬化。

本文描述的化合物可给予需要其的受试者以在所述受试者中诱导免疫应答。在一些实施方案中，所述免疫应答可由所述受试者针对外源抗原(例如，病原体感染)自发产生。在一些实施方案中，可将抗原与本文描述的化合物一起给予，其中所述受试者中产生针对所述抗原的免疫应答。在一些实施方案中，抗原可以是对具体细胞增殖条件(例如，特定癌症抗原)或具体病原体(例如，***壁抗原；金黄色葡萄球菌抗原)特异性的。

本文描述的化合物可给予需要其的受试者以便可能治疗一种或多种细胞增殖失调。在这样的治疗中，术语“处理”、“治疗”和“治疗效应”可以指降低或停止细胞增殖速度(例如，减缓或终止肿瘤生长)，减少增殖肿瘤细胞的数目(例如，除去肿瘤的一部分或全部)并且完全或部分地减轻细胞增殖病症。细胞增殖病症包括但不限于结肠直肠癌、乳癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、***癌、结肠癌、***癌、脑癌、头和颈癌、皮肤癌、肝癌、肾脏癌和心脏癌。癌症的实例包括造血肿瘤性疾病(hematopoietic neoplastic disorder)，其是涉及造血起源的增生/瘤细胞(例如，来自髓样细胞、淋巴样细胞或红系(erythroid lineage)细胞或者其前体细胞)的疾病。所述疾病可起源于低分化的急性白血病，例如成红细胞白血病和急性成巨核细胞白血病。其他髓性疾病包括但不限于急性早幼粒细胞白血病(acute promyeloid leukemia)(APML)、急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)(在Vaickus，Crit.Rev.inOncol./Hemotol.11：267-297(1991)中综述)；淋巴癌，包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，其包括B-谱系ALL和T-谱系ALL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、幼淋巴细胞白血病(PLL)、毛细胞性白血病(HLL)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。其他形式的恶性淋巴瘤包括但不限于非何杰金淋巴瘤及其各种变体、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)、何杰金病和里-施病(Reed-sternberg disease)。在一个具体实施方案中，所述细胞增殖疾病是非内分泌肿瘤或内分泌肿瘤。非内分泌肿瘤的示例性实例包括但不限于腺癌、腺泡细胞癌、腺鳞癌、巨细胞瘤、管内***粘液性肿瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm)、粘液性囊腺瘤(mucinous cystadenocarcinomas)、胰胚细胞瘤(pancreatoblastomas)、浆液性囊腺瘤(serous cystadenomas)、实体和假***状瘤(pseudopapillary tumor)。内分泌腺瘤可以是胰岛细胞瘤。

细胞增殖病症还包括炎性病症，例如皮肤的炎性病症，包括例如，湿疹、盘状红斑狼疮、扁平苔藓、硬化性苔藓(lichen sclerosus)、蕈样肉芽肿病、光照性皮肤病、玫瑰糠疹、银屑病。还包括与肥胖有关的细胞增殖病症，例如脂肪细胞的增生。

细胞增殖病症还包括病毒疾病，包括例如获得性免疫缺陷综合症、腺病毒科感染、α病毒感染、虫媒病毒感染、波尔那病、本扬病毒科感染、杯状病毒科感染、水痘、冠状病毒科感染、柯萨奇病毒感染、巨细胞病毒感染、登革热、DNA病毒感染、臁疮、接触传染、脑炎、虫媒病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、传染性红斑(erythema infectiosum)、汉坦病毒感染(hantavirus infection)、出血热、病毒性肝炎(viral，hepatitis)、病毒性人单纯胞疹(viral，human，herpes simplex)、带状疱疹(herpes zoster)、耳部带状疱疹(herpes zosteroticus)、疱疹病毒科感染、传染性单核细胞增多症、流感(例如，在鸟和人中)、拉沙热(Lassa fever)、麻疹、***、流行性腮腺炎、副粘病毒科(oaramyxoviridae)感染、白蛉热、多瘤病毒感染、狂犬病、呼吸道合胞病毒感染、裂谷热(Riff Valley fever)、RNA病毒感染、风疹、慢病毒疾病、天花、亚急性硬化性全脑炎、肿瘤病毒感染、疣突(wart)、西尼罗热、病毒疾病和黄热病。例如，SV40转化病毒的大T抗原作用于UBF，将其激活并将其他病毒蛋白募集至Pol I复合体，从而刺激细胞增殖以确保病毒繁殖。细胞增殖病症还包括与血管发生(例如，癌症)有关的病症，以及与由脂肪细胞和其他脂肪细胞增殖引起的肥胖有关的病症。

细胞增殖病症还包括由心区不适(cardiac stress)(例如高血压、气囊血管形成术、瓣膜病和心肌梗死)引起的心脏病症。例如，心肌细胞是心脏中构成心室壁主要部分的分化的肌细胞，而血管平滑肌细胞形成血管。尽管两者都是肌肉细胞类型，但是心肌细胞和血管平滑肌细胞的收缩机制、生长和分化都不同。心肌细胞在心脏形成后很快成为终极分化的，因此失去了***的能力，而平滑肌细胞持续进行从收缩型转变为增殖表型的改变。例如，在各种病理生理应激(例如高血压、气囊血管形成术、瓣膜病和心肌梗死)下，心脏和血管经受形态学生长相关变化，其能够降低心脏功能并且最终表现为心力衰竭。因此，本文提供的是通过给予本文描述的化合物以治疗心脏细胞增殖病症的方法，其中所述化合物的量为可有效治疗所述心脏病症的量。可在心区不适已发生或已被检测出之前或之后给予所述化合物，例如，可在高血压、气囊血管形成术、瓣膜病或心肌梗死发生或检测出之后给予所述化合物或核酸。给予这样的化合物可减少血管肌细胞和/或平滑肌细胞的增殖。

一些实施例还涉及通过给予本文描述的候选分子或核酸来治疗老化症状并且/或者治疗与细胞衰老有关的病症。例如，由于沃纳基因(Wernergene)的改变引起的沃纳综合征的提早老化疾病，所述沃纳基因编码WRN DNA螺旋酶。不囿于任何理论，已知该蛋白质位于核仁并且与G四链体特异性结合，WRN DNA螺旋酶的变异导致衰老。

实施例

下文描述的实施例是举例说明而非限制本发明。

TLR分子可影响受体定位、细胞活化和细胞因子产生。在TLR4和9的情况下，TLR的定位是响应于细胞因子诱导的显著特性(10-12)。将脂质与药物缀合可促进药物通过极性脂质载体进入细胞，从而比常规递送***更有效地并且更特异性地达到有效的药物细胞内浓度。药物与脂质缀合(用药用软膏或油膏配制)可提供对皮肤的渗透以用于治疗皮肤病症。PEG化可通过增加在体内的稳定性而延长药物的血液循环，继而使毒性下降(13)。这里，将脂质和聚乙二醇与TLR7激动剂(SM)缀合，并且测试了所述缀合物的免疫活性。单个TLR7激动剂缀合物在体内和体外表现出不同的免疫刺激特性。与未缀合的TLR7激动剂(SM)相比，将所述TLR7激动剂与脂质的缀合增加了刺激先天免疫的能力。脂质-TLR7激动剂缀合物在体内显示出迅速发生并且长效的佐剂效应。这些数据表明脂质-TLR7缀合物具有作为用于治疗性疫苗的佐剂的潜在用途。但是，将所述TLR7激动剂与PEG缀合，改变了SM药效团的特性，所述缀合物相反地表现出TLR7拮抗剂活性。

实施例1：缀合物的合成和表征

材料

从Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)购买1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。所有其他试剂都是从Sigma-Aldrich(St.Louis MO)购买的，均至少是试剂级而无需进一步纯化的。溶剂从Fischer Scientific(Pittsburgh，PA)购买，可以买来即用或者用合适的干燥试剂再蒸馏。卵清蛋白(OVA，V级)从Sigma-Aldrich购买。

使用从BioWhittaker(Walkerville，马里兰，美国)购买的QCL1000

端点显色LAL测定法(Endopoint chromogenic LAL assay)检测用于免疫学活性试验的试剂和缀合物中内毒素水平。整个实验中使用每微克(μg)蛋白质或药物含有少于1皮克(pg)内毒素的试剂。由于DOPE在所述LAL分析中给出假阳性结果，使用来自脂多糖不应答突变体小鼠(C3H/HeJ)的骨髓来源单核(BMDM)细胞来检测内毒素造成的污染(参见图1B)。由来自C3H/HeJ小鼠的BMDM进行的细胞因子生产水平与来自野生型C3H/HeOuJ品种的细胞中的水平相似，表明内毒素污染是可以忽略的(参见图2B)。所有的缀合物都以干粉的形式储存在-80℃下。将所述缀合物以100mM溶于DMSO，并且在免疫学分析之前进一步稀释。

使用从EMD(Gibbstown，NJ)购买的预先包被的TLC硅胶60 F254铝片进行分析性TLC，并使用UV光显影。使用指定的溶剂***在EMD硅胶60(40-63μm)上进行快速色谱。将无脂质化合物的色谱和质谱(ESI)记录在具有Supelco Discovery HS C18柱(Sigma-Aldrich)的1100LC/MSD(Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara CA)上，纯度大于98％的百分比面积。含有脂质的化合物的质谱(ESI)被记录在FinniganLCQDECA(Thermo Fisher Scientific Inc.Waltham，MA)上。从VarianMercury Plus 400(Varian，Inc.，Palo Alto CA)上获得1H NMR谱。使用合适的重氢化NMR溶剂将化学位移表达为百万分之......份(ppm)，参考0ppm时的TMS。

从Charles River Laboratories(Wilmington，MA)购买C57BL/6(B6)小鼠。从The Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)购买C3H/HeJ和C3H/HeOuJ小鼠。TLR7缺陷小鼠(C57BL/6背景)获赠自Dr.S.Akira，(Osaka University，Osaka，Japan)并且回交10代至C57BL/6背景。动物在UCSD育种和饲养，条件为22±0.5℃，从7am至7pm的12:12-h明暗周期的房间中。所有的程序和方法都得到了动物保护和利用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的批准。

化学合成

本文描述的化学合成方案使用圆括号中的数字指代图1中的化合物，使用圆括号中的字母指代反应步骤(例如，加入的化学物质和/或反应条件)。例如，(a)指包括加入反应物的反应步骤，所述反应物与化合物(1)结合并反应时可导致化合物(2)的形成。对于每个反应步骤，所述反应条件和加入的化合物是；(a)N，N’-甲基亚乙基二氨基氢化铝锂(Cha，J.et al.，(2002)Selective conversion of aromatic nitriles to aldehydes bylithium N，N′-dimethylethylenediaminoaluminum hydride，Bull.KoreanChem.Soc.23，1697-1698)，THF，0℃；(b)NaI，氯代三甲基硅烷，CH₃CN，室温；(c)PBS，室温；(d)NaOH∶EtOH 1∶1，回流；(e)DOPE，HATU，三乙胺，DMF/DCM 1∶1，室温；(f)O-(2-氨基乙基)-O’-(2-叠氮基乙基)九甘醇，HATU，三乙胺，DMF，室温；(g)4-戊炔酸(4-pentynoic acid)，抗坏血酸钠，Cu(OAc)2，t-BuOH/H₂O/THF 2∶2∶1，室温；和(h)DOPE，HATU，三乙胺，DMF/DCM 1∶1，室温。

4-((6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)-8-氧-7H-嘌呤-9(8H)-基)甲基)苯甲酸的合成(参见图1，化合物5)。将20mL的1∶1乙醇∶水混合物加至0.10g(0.28mmol)的4-((6-氨基-8-甲氧基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基)苄腈(参见图1，化合物1)，将所得结合物回流8小时。将所得反应混合物冷却并用浓盐酸酸化至pH 2。用DCM(3×20mL)进一步萃取所述水性溶液，用MgSO4干燥并真空蒸发以产生8-氧-9-苯甲酸(化合物5)、8-甲氧基-9-苯甲酸和8-氧-9-苯甲酸乙酯的混合物。干燥之后即将所述产物溶于CH₃CN(25mL)并且加入NaI(0.14g，0.96mmol)(图1，反应步骤(b))。向该溶液中加入12μL(0.96mmol)三甲基氯硅烷，逐滴搅拌加入。将所述反应混合物在40℃下加热4小时，然后冷却、过滤并用水(20mL)洗涤然后用二***(20mL)洗涤以得到白色固体，产率为85％。对所得产物进行核磁共振(NMR)分析，结果如下，1H NMR(400MHz，DMSO-d₆)(ppm)：10.33(s，1H)，7.89(d，J＝8Hz，2H)，7.37(d，J＝8Hz，2H)，6.65(s，2H)，4.92(s，2H)，4.24(t，J＝4Hz，2H)，3.56(t，J＝4Hz，2H)，3.25(s，3H)。在HPLC上的保留时间(Rt)＝14.3分钟。ESI-MS(阳离子模式)：对于C₁₆H₁₇N₅O₅计算的m/z[M+1]360.34；实测360.24。

2-(4-((6-氨基-2-(2-甲氧基乙氧基)-8-氧-7H-嘌呤-9(8H)-基)甲基)苯甲酰氨基)乙基2，3-二(油酰氧基)丙基磷酸酯的合成(参见图1，化合物6)。向溶于1mL无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的0.022g(0.06mmol)化合物5的溶液加入O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(0.026g，0.067mmol)和无水三乙胺(TEA)(17.0μL，0.12mmol)。制备溶于无水1∶1 二氯甲烷(DCM)∶DMF(1mL)的1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(0.05g，0.067mmol)溶液并将其缓慢加至所述反应混合物中(图1反应步骤(e))。在室温下搅拌所述反应混合物直到反应完成，然后真空蒸发。使用溶于DCM的15％甲醇(MeOH)通过快速色谱纯化所得产物以得到0.038g白色固体，产率为58％。对所得产物进行NMR分析，结果如下，1H NMR(400MHz，DMSO-d₆)(ppm)：9.7(s，1H)，7.87(d，J＝8.3Hz，2H)，7.32(d，J＝8.3Hz，2H)，6.61(s，2H)，5.30(m，4H)，5.05(m，1H)，4.88(s，2H)，4.26(m，4H)，4.06(m，1H)，3.77(m，4H)，3.57(m，2H)，3.35(m，2H)，3.26(s，3H)，2.23(m，4H)，1.95(m，8H)，1.46(m，4H)，1.22(m，40H)，0.83(m，6H)。ESI-MS(阴离子模式)：对于C₅₇H₉₂N₆O₁₂P计算的m/z[M-1]1083.35；实测1083.75。

4-((6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基)-N-(32-叠氮基-3，6，9，12，15，18，21，24，27，30-十氧杂三十二烷基)苯甲酰胺(参见图1，化合物7)的合成。向溶于无水DMF(5mL)的化合物5(0.100g，0.278mmol)的溶液加入HATU(0.117g，0.306mmol)和无水TEA(77.014μL，0.556mmol)(参见图1，反应步骤(f))。制备溶于无水DMF(1mL)的O-(2-氨基乙基)-O’-(2-叠氮基乙基)九甘醇(0.150g，0.306mmol)并将其缓慢加至所述反应混合物中。在室温下搅拌所述反应混合物直到反应完成，然后真空蒸发。使用溶于DCM的5％甲醇(MeOH)通过快速色谱纯化所得产物以得到0.224g不透明的油，产率为93％。在HPLC上的保留时间＝12分钟。对所得产物进行NMR分析，结果如下，1H NMR(400MHz，DMSO-d₆)(ppm)：10.01(s，1H)，8.45(t，J＝5.6Hz，1H)，7.78(d，J＝8.3Hz，2H)，7.35(d，J＝8.3Hz，2H)，6.49(s，2H)，4.90(s，2H)，4.25(t，J＝4Hz，2H)，3.57(m，4H)，3.5(m，36H)，3.4(M，6H)，3.26(s，3H).ESI-MS(阳离子模式)：对于C₃₈H₆₁N₉O₁₄计算的m/z[M+1]868.94；实测868.59。

3-(1-(1-(4-((6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基)苯基)-1-氧-5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十氧杂-2-氮杂三十四烷-34-基)-1H-1，2，3-***-4-基)丙酸(参见图1，化合物8)的合成。将化合物7(0.218g，0.251mmol)和4-戊炔酸(0.074g，0.753mmol)溶于1∶1 叔丁醇∶H2O(3mL)(参见图1，反应步骤(g))。向所述反应混合物中缓慢加入溶于1∶1 叔丁醇∶H2O(1mL)的抗坏血酸钠(0.02g，100mmol)和Cu(OAc)2(0.009g，50mmol)并且在室温下搅拌直到经TLC监测化合物7完全反应。用DCM(10mL)和H2O(10mL)萃取所述产物，用MgSO₄干燥有机层以得到0.230g的不透明油，产率为95％。在HPLC上的保留时间＝11.5分钟。对所得产物进行NMR分析，结果如下，1H NMR(400MHz，DMSO-d₆)(ppm)：13.48(s，1H)，7.76(d，J＝8.29Hz，2H)，7.75(s，1H)，7.23(d，J＝8.29，2H)，4.88(s，2H)，4.41(t，J＝5.12Hz，2H)，4.23(t，J＝4Hz，2H)，3.74(t，J＝5.12Hz，2H)，3.57(t，J＝4Hz，2H)，3.51(m，8H)，3.42(m，36H)，3.26(s，3H)，2.79(t，J＝7.56Hz，2H)，2.24(t，J＝7.56Hz，2H)。ESI-MS(阳离子模式)：对于C₄₃H₆₇N₉O₁₆计算的m/z[M+1]966.04；实测966.67。

2-(3-(1-(1-(4-((6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基)苯基)-1-氧-5，8，11，14，17，20，23，26，29，32-十氧杂-2-氮杂三十四烷-34-基)-1H-1，2，3***-4-基)丙酰氨基)乙基2，3-二(油酰氧基)丙基磷酸酯(参见图1，化合物9)的合成。向溶于无水DMF(1mL)的化合物8(96mg，0.1mmol)、HATU(42mg，0.11mmol)溶液中加入无水TEA(2.7μL，0.2mmol)。向所得反应混合物中逐滴加入溶于1∶1 DCM∶DMF(1mL)的DOPE(81.4mg，0.11mmol)溶液，在室温下搅拌直到反应完成(参见图1，反应步骤(h))。完成之后即通过真空蒸发，之后通过使用溶于DCM的15％MeOH的快速色谱分离所述产物，得到155mg的不透明油，产率为92％。对所得产物进行NMR分析，结果如下，1H NMR(400MHz，DMSO-d₆)(ppm)：8.5(s，2H)，8.39(s，1H)，7.79(m，3H)，7.33(d，J＝6.23Hz，2H)，6.91(s，2H)，5.31(m，4H)，5.05(m，1H)，4.89(s，2H)，4.46(m，2H)，4.23(m，4H)，4.08(t，J＝8Hz，2H)，3.76(m，4H)，3.63(t，J＝8Hz，2H)，3.56(t，J＝8Hz，2H)，3.48(m，36H)，3.26(m，5H)，3.17(m，2H)，2.82(t，J＝8Hz，2H)，2.39(t，J＝8Hz，2H)，2.24(m，4H)，1.96(m，8H)，1.48(m，4H)，1.23(m，40H)，0.84(m，6H)。ESI-MS(阳离子模式)：对于C84H142N10O23P计算的m/z[M+1]1691.05；实测1692.82。

使用类似的技术合成其他化合物(例如，表2中所示化合物)。例如，以如上文针对图1中化合物6的制备所描述的方法制备并纯化4-((6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基-N-十六烷基苄胺(化合物1Z7)和4-((6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)甲基-N，N-双十六烷基苄胺(化合物1Z9)，除了使用各自的单-和双-取代的十六烷基胺替代1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。使用ESI-MS观察到化合物1Z7的质量为583.7(阳离子模式；对于C₃₂H₅₀N₆O₄计算的m/z[M+1]是582.78)。使用ESI-MS观察到1Z9的质量为808.2(阳离子模式；对于C₄₈H₈₂N₆O₄计算的m/z[M+1]是807.20)。

从所述氨基甲基衍生物(1V184)制备生物素化衍生物N-(4-((6-氨基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-9H-嘌呤-9-基)苯甲基)-5-((3aS，4S，6aR)-2-氧六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(化合物1Z18)并使用如上文所述的相同方法将其缀合至生物素。使用ESI-MS观察到571.5的质量(阳离子模式；对于C₂₆H₃₄N₈O₅S计算的m/z[M+1]是570.66)。

实验方法

体外方法

使用小鼠白血病单核细胞巨噬细胞系RAW264.7来进行细胞因子诱导的体外测量。Raw264.7小鼠获得自美国模式培养物保藏所(ATCC，Rockville，MD)并在DMEM完全培养基[添加了10％热灭活的胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和100U/mL青霉素/100μg/mL链霉素的Dulbecco改进的Eagle培养基(Irvine Scientific，Irvine，CA)]中培养。如Wu，C.C etal.，(2007)“Immunotherapeutic activity of a conjugate of a Toll-likereceptor 7 ligand”，Proc Natl Acad Sci U S A 104，3990-5中所述从C57BL/6和TLR7缺陷小鼠制备BMDM。

总的来说，在37℃下，5％CO2下用各种浓度的缀合物培养RAW264.7细胞或BMDM持续18小时，收集培养上清液。所述上清液中细胞因子(IL-6，IL-12或TNF-α)的水平通过ELISA(BD BiosciencesPharmingen，La Jolla，CA)测定(Cho，H.J et al.，“ImmunostimulatoryDNA-based vaccines induce cytotoxic lymphocyte activity by a T-helpercell-independent mechanism”[参见注释]，Nat Biotechnol 18，509-14(2000))，结果显示在图2A-D中。数据是三次重复的平均值±SEM并且代表3个独立实验。这些细胞因子的最小检测水平是15pg/mL。

如上文所述通过将约1×10⁶/mL RAW 264.7细胞与各种缀合物或对照孵育来测量TNFα的水平(参见图2A)。如上文所述通过将0.5×10⁶/mLBMDM与各种缀合物或对照孵育来测量IL-6和IL12水平(参见图2B-D)。缀合物被制备为储液(SM、化合物(6)、(8)和(9)为10μm，化合物(4a)为0.1μm)，并从其中制备系列稀释液(1∶5)。

BMDM也被用于评估使用本文描述的合成方案合成的TLR7缀合物的内毒素污染水平。将来自C3H/HeJ(LPS不应答突变体)或C3H/HeOuJ(野生型)的0.5×10⁶/mL BMDM与TLR7缀合物(10μM SM，0.1μM化合物4a，10μM化合物6，10μM化合物8或10μM化合物9)孵育18小时。通过ELISA来测量培养上清液中的IL-6或IL-12水平，结果显示在图2B中。每个所述TLR7缀合物在TLR4突变体和野生型小鼠中诱导相似水平的IL-6，表明这些结合物的LPS污染极少。

如Hayashi，T et al.，“Enhancement of innate immunity againstMycobacterium avium infection by immunostimulatory DNA is mediatedby indoleamine 2，3-dioxygenase”，Infect Immun 69：6156-64，(2001)中所述，从购自The San Diego Blood Bank(San Diego，CA)的人血沉棕黄层(buffy coat)分离人血液外周单核细胞(PBMC)。将PBMC(1×10⁶/mL)与各种浓度的TLR7缀合物在37℃，5％CO2下孵育18小时，并收集培养上清液。通过Luminex bead assay(Invitrogen，Carlsbad，CA)测定所述上清液中的细胞因子(IL-6、TNF-α或IFNα1)水平，结果显示在图3A-B中。数据是三次重复的平均值±SEM，并且代表3个独立的实验。IL-6、TNF-α和IFNα1的最低检测水平分别为6pg/mL、10pg/mL和15pg/mL。

体内方法

使用6至8周龄C57BL/6小鼠来研究TLR7缀合物诱导促炎性细胞因子的药效动力学。将所述小鼠静脉注射TLR激动剂和它们的缀合物(每只鼠40nmol化合物(4a)或200nmol SM和化合物(6)、(8)或(9))。注射后2、4、6、24或48小时收集血液样本。分离血清，在使用前保持在-20℃。血清中细胞因子(例如，IL-6和TNF-α)的水平是通过Luminex beadmicroassay来测量，结果显示在图4A-B中。数据是五只小鼠的平均值±SEM，并且代表两个独立的实验。IL-6和TNF-α的最低检测水平分别为5pg/mL和10pg/mL。

还测量了TLR7缀合物导致的免疫反应起始(例如，佐剂性)。在第0和7天，给C57BL/6小鼠的组(n＝5)皮下接种20μg与约10nmol的各种TLR7缀合物混合的卵清蛋白(OVA)，其中10nmol是对于所述缀合物的TLR7部分的剂量目标，实际量取决于每个缀合物的实际化学式。TLR9-活化的免疫刺激寡核苷酸序列(ISS-ODN；1018)被用作对于Th1诱导佐剂的阳性对照(Roman，M et al.，Immunostimulatory DNA sequencesfunction as T helper-1-promoting adjuvants(1997)，Nat Med 3：849-54)。在第0、7、14、21、28、42和56天收集血清。用盐水或用与载体混合的OVA免疫的小鼠作为对照。在第56天处死小鼠，取脾脏用于制备脾细胞和组织切片。将约200微升的2.5×10⁶/mL脾细胞储液一式三份等分加入圆底组织培养微量滴定板，其中有总体积为200μl RPMI 1640完全培养基[RPMI1640(Irvine Scientific，Irvine，CA)](添加了10％热灭活的FCS、2mM L-谷氨酰胺和100U/mL青霉素/100μg/mL链霉素)，并用100μg/mL OVA或仅用培养基来再刺激。在一些实验中，免疫后24小时检查注射位点是否有炎症或局部反应迹象。观察小鼠活动以作为对免疫的可能“患病”反应的量度，然后每周称重。除了采集脾脏，第56天还采集肺、肝脏、心脏和肾脏，用10％缓冲的***(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)固定并用石蜡包埋。用苏木精和伊红(H&E)染色5μm厚的切片，在显微镜下观察。

如Cho，H.J et al.，“Immunostimulatory DNA-based vaccines inducecytotoxic lymphocyte activity by a T-helper cell-independent mechanism”[参见注释]，Nat Biotechnol 18，509-14(2000)中所述，通过ELISA测量IgG亚类(在一些实施方案中，具体地是IgG1和IgG2)的抗-OVA抗体，结果显示在图5A和5B中。每个ELISA板包含之前定量的血清滴定来产生标准曲线。该标准品的滴度被计算为所给出吸光率读数是背景两倍的最大血清稀释倍数。各种血清样本均在1∶100稀释度下测试。结果表达为mL/单位，以所述标准血清的单位/mL为基础计算，并且表示为每组5只动物的平均值+SEM。^*和T表示分别与用与载体混合的OVA免疫的小鼠相比P＜0.05和P＜0.01，是由单因素ANOVA得到的。

从采集的脾脏制备脾细胞。然后将脾细胞培养物(用100μg/mL OVA或仅培养基再刺激)在37℃和5％CO₂下培养，并且72小时后收集上清液。通过ELISA(BD Bioscience PharMingen)根据制造商的说明(Kobayashi，H et al.，Prepriming：a novel approach to DNA-basedvaccination and immunomodulation”，Springer Semin Immunopathol22：85-96(2000))测量所述培养物上清液中IFNγ水平，结果显示在图5C中。计算每组中平均总脾细胞数目并与所述PBS-免疫组比较以监测脾细胞增殖。数据是5只小鼠的平均值±SEM，并且代表3个独立的实验。

通过三重分析(总脾细胞数计数、组织学检查和目测观察注射区域和总体健康状态以及经处理的小鼠的行为)来评估TLR7缀合物的可能不良反应。用与TLR7缀合物、载体或对照激动剂(寡核苷酸序列ISS-ODN)混合的OVA来免疫C57BL/6小鼠。在第56天，处死小鼠并对总脾细胞数计数，结果显示在图6A中。采集脾脏并进行组织学观察，如图6B(放大倍数＝100×)所示。注射后24小时观察皮肤注射位点，如图6C所示。用OVA加TLR7缀合物免疫的小鼠和仅用OVA免疫的小鼠相比，所计数的脾细胞数目没有显著差异(参见图6A)。对来自用与TLR7缀合物和OVA混合物免疫的小鼠脾脏的组织学观察没有显示出白髓破坏或红髓细胞构成增加(参见图6B)。皮肤注射位点的皮肤没有可见的红色或青光眼反应(参见图6C)。

通过测量侵入经处理小鼠腹膜内的嗜中性粒细胞数目的减少，还通过对所诱导的实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的作用来评估用化合物(8)进行的治疗的效力。通过对C57BL/6小鼠静脉注射(i.v.)50纳摩尔游离药效团(1V136)或化合物(8)并持续3天来测量腹膜嗜中性粒细胞浸润的减少。最后一次化合物注射18小时后腹膜内注射(i.p.)2ml 3％巯基乙醇酸酯(thioglycolate，TG)以诱导嗜中性粒细胞募集。TG注射4小时后收集腹膜细胞。通过血细胞计数器对总细胞计数，并且通过形态学鉴定嗜中性粒细胞。结果显示在图7A和7B中。

使用用髓鞘少突胶质糖蛋白(MOG)处理的C57BL/6小鼠测定化合物(8)对实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的效应。MOG是少突胶质细胞细胞表面和髓鞘最外表面上表达的膜蛋白。MOG是自身抗原蛋白质，当其被破坏时可引起特征为神经元脱髓鞘的疾病，类似于例如与多发性硬化有关的症状。在啮齿目动物中，MOG已被证明具有高度致脑炎性，并且可引起强烈的T和B细胞应答。EAE是中枢神经***(CNS)的炎性脱髓鞘疾病，并被作为人CNS脱髓鞘疾病(包括多发性硬化和急性播散性脑脊髓炎(ADEM))的动物模型而得到广泛研究，也作为有用的脑炎症研究。

用MOG(或MOG肽)进行的处理可用于诱导EAE。用MOG蛋白质处理小鼠6天。在第6天和之后(参见图8)，每天静脉注射(i.v.)50纳摩尔化合物(8)或PBS。EAE临床评分被用作脱髓鞘作用的临床度量，并且通过视觉观察测定。化合物(8)治疗的第11-17天时观察到了统计学上显著的临床评分，显示在图8(参见其上有^*的数据点)中。

在一些实验中进行统计学评估以确定所观察结果的统计学显著性。将一种统计学软件包(Prism 4.0，GraphPad，San Diego CA)用于统计学分析，其包括回归分析。讲数据作图并通过非线性回归拟合，假定为各组之间有相同标准偏差的高斯分布。在所述佐剂性实验中，各组之间的统计学差异是通过带有Bonferroni事后试验的双因子ANOVA来分析以比较对照小鼠和用OVA免疫的小鼠。P＜0.05的值被认为是统计学显著的。

结果和讨论

化学合成

从化合物(1)合成化合物(4)产生5∶1的UC1V150与MSA蛋白质的恒定缀合比率(Wu，C.C et al.，“Immunotherapeutic activity of aconjugate of a Toll-like receptor 7 ligand”，Proc Natl Acad Sci U S A 104，3990-5(2007))。化合物(1)的9-苯乙腈的碱水解(图1，反应步骤(d))提供多功能苯甲酸官能团(化合物(5))并允许缀合物(6)、(8)和(9)的组合。所述苯甲酸是在存在溶于无水DMF中的TEA的情况下通过用HATU活化而与DOPE偶联(图1，反应步骤(e))以得到化合物6，产率为58％。

由于将化合物(6)溶于合适的溶剂用于测试有困难，将其偶联PEG间隔团来提高溶解性。在存在溶于无水DMF中的TEA的情况下通过用HATU活化将容易得到的胺/叠氮化物双官能PEG偶联至所述苯甲酸(参见图1，反应步骤(f)，得到化合物(7))。通过铜(I)-催化的叠氮化物-炔与4-戊炔酸环加成形成1，2，3-***(图1，反应步骤(g))而得到化合物(8)，产率为95％。最后，通过用DOPE和化合物(8)形成HATU活化的酰胺来制备化合物(9)(图1，反应步骤(h))。

体外测量由脂质缀合的TLR7激动剂导致的细胞因子诱导

与非缀合药物(SM)相比，当TLR7激动剂化合物(4a)与小鼠血清白蛋白共价偶联时，其在体外和体内表现出10倍或更高的细胞因子诱导效能(Wu，C.C et al.，“Immunotherapeutic activity of a conjugate of aToll-like receptor 7 ligand”，Proc Natl Acad Sci U S A 104，3990-5(2007))。使用相似的试验，用鼠巨噬细胞系RAW264和原代骨髓来源巨噬细胞(BMDM)来比较所述脂质-TLR激动剂缀合物(图1，化合物6)、PEG-TLR7激动剂缀合物(图1，化合物8)和PEG-脂质(图1，化合物9)缀合物的体外效能。用系列稀释的TLR7缀合物刺激各个细胞18小时，所述培养基中释放的细胞因子的水平由ELISA来测定并且与非结合TLR7激动剂(SM)比较(参见图2A，图A-D).

与非缀合激动剂相比，化合物(4a)(例如，TLR7-MSA缀合物)先前显示出其作为细胞因子诱导剂的效力强100倍，而当所述脂质-TLR7缀合物被标准化至所述非缀合激动剂的摩尔水平时，其效力强10倍。尽管所述PEG-TLR7缀合物(化合物8)与非缀合TLR7(SM)相比显示出较低的效力，脂质与PEG-TLR7缀合物的缀合(脂质PEG-TLR7)(化合物9)将它们的效力恢复至与非缀合TLR7(SM)相似的水平。处于所述缀合形式的最高水平下，基本相似浓度的不具有TLR7缀合的MSA、脂质或PEG被用作阴性对照，在RAW264.7细胞和BMDM中分别诱导极低的细胞因子水平或不诱导细胞因子水平(数据未显示)。

为了评估TLR7激动剂的所述缀合形式是否单独地诱导巨噬细胞刺激，与非-TLR7巨噬细胞刺激相反，用化合物(4a)、(6)、(8)、(9)和SM处理来自野生型和TLR7缺陷小鼠(TLR7-KO或敲除小鼠)的BMDM。化合物(4a)、(6)、(8)、(9)和SM诱导了极少的IL-12和IL-6或不诱导IL-12和IL-6，而这些缀合物在野生型BMDM中是有活性的，表明所述激动剂活性可归因于这些缀合物的TLR7活性(参见图2C-D)。内毒素评估(图2B，和上文所描述)进一步支持以下结论，即激动剂活性可归因于这些缀合物的TLR7活性(例如，所产生的IL-6水平没有显著的统计学差异)。

为了进一步调查在人细胞中的免疫学活性，用TLR7缀合物处理来自三个供体的人PBMC，并且通过Luminex assay来测定IL-6和IFNa1的水平(图3A-B)。在该试验中使用缀合至TLR7(4b)的人血清白蛋白(HSA)而不是MSA-缀合物(4a)。TLR7缀合物效力的顺序与在鼠巨噬细胞中观察到的顺序相似((4b)＞(6)＞(9)＞/＝SM＞(8))(图3A)。在来自全部供体的PBMC中观察到了一致的化合物效力趋势。与化合物(4a)不同，化合物(4b)(例如，TLR7-HSA缀合物)在人PBMC中诱导了最低水平的IFNa1(在三个供体中观察到)(图3B)。

由TLR缀合物引起的促炎细胞因子诱导的体内动力学

为了比较TLR7缀合物的体内免疫学特性，对C57BL/5小鼠静脉给予TLR7激动剂缀合物，并且研究血清中促炎细胞因子的动力学(图4A和4B)。基于之前的研究(Wu，C.C et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 104，3990-5(2007))，在比化合物SM、(6)、(8)和(9)浓度(每只动物200nmol)低的浓度下使用化合物(4a)(每只动物40nmol)。对于所有TLR7缀合物在注射后2小时观察到对TNFα和IL-6的最大诱导(分别为图4A-B)。由非缀合TLR7(SM)诱导的细胞因子水平在2小时后迅速下降。由化合物(4a)、(6)和(9)诱导的细胞因子持续最长至6小时。化合物(8)在注射后任意时间点仅诱导低水平的IL-6(参见图4B)，没有显著诱导TNFα(参见图4B)。接受盐水、MSA或DOPE的对照小鼠的血清显示极少或没有显示可检测的细胞因子水平(数据未显示)。

脂质-TLR7缀合物促进迅速而长期的体液应答

通过测量疫苗诱导的抗原特异性IgG(特别是IgG1和IgG2)的水平和同种型来评估佐剂性的效能(Mosmann，T.R.，and Coffman，R.L.，‘TH1and TH2 cells：different patterns of lymphokine secretion lead to differentfunctional properties’，Annual Review Immunology 7：145-73(1989))。对C57BL/6小鼠各组(n＝5只动物/组)用与TLR7缀合物混合的OVA(卵清蛋白)进行皮下免疫。将ISS-ODN用作强效Th1佐剂阳性对照。将用盐水或OVA加载体(0.1％DMSO)免疫的小鼠用作阴性对照。在第0、7、14、21、28、42和56天通过ELISA监测OVA-特异性IgG1和IgG2a血清诱导动力学(图5A-B)。在早至第14天时即在用与化合物(4a)或化合物(6)混合的OVA免疫的小鼠中观察IG亚类抗体的诱导(参见图5A)。抗-OVA IgG2a水平在用OVA/化合物(6)混合物免疫的小鼠中持续上升，而所述水平在用OVA/化合物(4a)混合物免疫的小鼠中随后下降，如图5A所示。这些数据与用化合物(4a)或(6)和OVA结合物免疫的小鼠脾细胞的OVA-特异性IFNγ分泌增强一致(参见图5C)。

不良效应的体内评估

TLR7激动剂(SM)可在小鼠中诱导厌食效应和低体温(Hayashi，T etal.，“Mast cell dependent anorexia and hypothermia induced by mucosalactivation of Toll like Receptor 7”，Am J Physiol Regul Integr CompPhysiol 295，R123-32(2008))，引起小鼠体重减轻。因此，作为实验方法的一部分，对用脂质-TLR7激动剂缀合物免疫的小鼠的体重和皮肤反应(注射位点处)进行监测。在小鼠中诱导所述厌食反应的非缀合TLR7激动剂(SM)的最小剂量在粘膜给药中为每只鼠50纳摩尔(Hayashi，T etal.，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 295，R123-32(2008))。选择佐剂实验的剂量(每只鼠10纳摩尔)以避免由TLR7激动剂引起的呕吐反应。在用与化合物(6)混合的OVA免疫的小鼠和注射了盐水的小鼠之间在平均体重上没有观察到显著差异(数据未显示)。

长时间给予TLR7还能诱导髓样细胞增殖(Baenziger，S et al.，“Triggering TLR7 in mice induces immune activation and lymphoidsystem disruption，resembling HIV-mediated pathology”，Blood 113：377-388(2009)。计算脾细胞总数以作为脾髓样细胞增殖的指标(参见图6A)。在用OVA、TLR7激动剂缀合物和盐水对照免疫的小鼠之间脾细胞总数没有显著差异(参见图6B)。对来自用与OVA和TLR7激动剂混合物免疫的小鼠脾脏进行的组织学检查显示没有白髓(生发中心)结构破坏，红髓细胞构成增多(参见图6B)。此外，在对从每组收集的肝脏、肺、心脏和肾脏样本的组织学检查中没有观察到显著差异(数据未显示)。在脂质-TLR7缀合物注射位点或其附近也没有肉眼可见的发红或青光眼反应(参见图6C)。

可将巯基乙醇酸酯(TG)用作诱发试剂以将白细胞和巨噬细胞募集至炎症位点。为响应于感染或炎症，嗜中性粒细胞一般是到达感染或炎症位点的第一种粒细胞类型。因此，用巯基乙醇酸酯处理可引起很多免疫应答细胞类型的募集，所述免疫应答细胞类型可用于确定与TLR7缀合物给药相关的可能不良效应。这些研究使用的方法可用各种TLR7缀合物化合物预处理小鼠3天，之后在最后的TLR7缀合物处理18小时后注射2mL的3％巯基乙醇酸酯溶液。TG注射之后4小时采集全部腹膜细胞并且对其计数。从形态学上鉴定嗜中性粒细胞并计数。结果显示在图7A-B中。

仅用盐水处理的小鼠被用作阴性对照，并且确立未处理小鼠募集的总腹膜细胞的基础水平和嗜中性粒细胞的总数。用TG(溶于盐水)处理但未用TLR7缀合物预处理的小鼠被用作募集的阳性对照，并且显示出大约5×10⁶个总细胞募集至腹膜，其中约90％是嗜中性粒细胞(在5×10⁶总细胞中超过4×10⁶个嗜中性粒细胞)。用TLR7游离药效团(1V136)或TLR7缀合物(1V282，化合物(8))预处理的小鼠显示出募集的总细胞和募集的嗜中性粒细胞的减少，表明用游离药效团或化合物(8)处理可降低白细胞、粒细胞和巨噬细胞所应答的炎症/感染反应的水平，但是对所募集的细胞类型的分布(例如，每种细胞类型的相对量)有极少的效应或没有效应。因此，当与TG相比时，游离药效团和化合物(8)没有显示出其他不良反应(例如，没有如上描述的呕吐反应)，并且可诱导白细胞、粒细胞和巨噬细胞募集。

如上所述，MOG蛋白质也被用于评估各种TLR7缀合物的可能不良效应。对结果的评估是通过观察与MOG诱导的EAE(例如，脑炎症、神经元的脱髓鞘作用等)相关的各种症状来进行的。症状的严重程度被记录为“临床评分”，并且在MOG处理的最初6天之后比较未处理小鼠(PBS)和用化合物(8)处理的小鼠(参见图8)。通过在第1-17天的上方标示*表示临床评分上的统计学显著差异。用化合物(8)处理显著降低第11天至17天EAE症状的严重程度，并且降低症状严重程度最初的上升状态，这体现为从第8天开始至第11天的两条线的斜率差异。因此，化合物8可被认为不会引起额外的不良反应(例如，没有如上所述的呕吐反应)并且还降低与MOG诱导的EAE相关症状的严重程度。

结论

非缀合TLR7(SM)不溶于水性溶液。水溶性可以通过增加药物扩散或促进细胞吸收而在控制药物可利用性方面具有重要作用。PEG化可促进药物溶解性并且降低免疫原性(Veronese，F.M.，and Mero，A，“Theimpact of PEGylation on biological therapies”，BioDrugs 22，315-29(2008))。PEG化还能够提高药物稳定性、所述缀合物在血液中的停留时间并且能够减少蛋白质水解和肾***(Veronese，F.M.，and Mero，A，BioDrugs 22，315-29(2008))。当TLR7缀合至PEG时(例如，化合物(8))，溶解性显著增大(数据未显示)。但是，与未修饰的TLR7激动剂相比，在体外(图2A，板块A和B)和在体内(图4A和4B)细胞因子诱导的效力减弱。在体外和体内的活性都能够通过进一步缀合至DOPE(化合物9)而恢复。化合物(9)能够诱导Th2免疫应答(由IgG1水平表示)，同时表现出极小的Th1应答(由IgG2a水平表示)。

TLR7激动剂缀合物化合物(4a)(MSA缀合物)和(6)(脂质缀合物)促进IgG2a滴度的迅速升高(图5A)。用MSA-TLR7缀合物(化合物(4a))免疫的小鼠中IgG2a水平在最后一次免疫3周之后下降，而用与脂质TLR7缀合物(化合物(6))混合的OVA免疫的小鼠显示出持久且进一步增加的抗原特异性IgG2a水平(图5A)。尽管化合物(4a)不能够维持IgG2a的水平，但是用与化合物(4a)混合的OVA免疫的小鼠脾细胞的OVA-特异性IFNγ分泌保持相对高的水平(图5C)。缀合至不同部分(其给出不同的免疫特性)的相同TLR7激动剂可用于设计用于处理不同疾病类别(例如感染和自身免疫疾病)的佐剂。

合成了TLR7激动剂的各种缀合物并且发现其在体内和体外均具有不同的免疫学特性。所报道的TLR7激动剂缀合物物理特性方面的多样性可在治疗不同疾病方面有广泛的应用。水溶性缀合物可提供全身给药途径。含有脂质的缀合物可适于需要持续刺激邻近免疫细胞的局部给药(例如，施用用于感染性疾病的佐剂)。脂质部分能够促进药物穿透皮肤屏障并且对于皮肤障碍的治疗有益。TLR7激动剂与脂质或PEG部分的缀合可作为一种用于扩展对感染、癌症或自身免疫疾病的临床治疗的具有前景的策略。

从本文显示的数据可以得出结论，即化合物(8)在一些条件下具有拮抗活性。图4A-B显示化合物(8)具有极少的或没有IL-6或TNFα刺激活性，并且能够降低一般与IL-6或TNFα活性提高相关的炎症或感染应答的一些方面(参见图7A-B和图8)。这些观察结果与拮抗活性一致(例如，一种化合物可与受体结合但不会刺激受体活化)。

天然免疫***细胞上的Toll样受体(TLR)的活化会激发、扩大并引导抗原特异性的获得性免疫应答。因此，刺激TLR的配体代表潜在的免疫佐剂。在该研究中，通过多功能苯甲酸官能团将强效TLR7激动剂与聚乙二醇(PEG)、脂质或脂质-PEG缀合。与未修饰的TLR7激动剂相比，每个缀合物在体外和体内表现出不同的免疫特性。在小鼠巨噬细胞和人外周血单核细胞中，所述脂质-TLR7缀合物比游离TLR7配体的效力强至少100倍，而PEG和PEG-脂质缀合物的效力与所述游离形式的效力相似。当所述缀合物被全身体内给予时，与所述未修饰TLR7活化剂相比，所述脂质和脂质-PEG TLR7缀合物在血清中提供持续水平的免疫刺激细胞因子。当在接种过程中所述缀合物被用作佐剂时，仅所述脂质-TLR7缀合物诱导持续的Th1以及Th2抗原特异性应答。这些数据显示TLR7配体的免疫刺激活性能够通过缀合而被增强和集中，从而可能扩大了这些试剂的潜在治疗应用。

其他化合物及其特性

生物活性

由GeneBlazerCellSensor细胞系NFkB-bla RAW 264.7(Invitrogen)和原代小鼠BMDM测定缀合至不同链长PEG的TLR7激动剂的体外活性。将细胞用各种浓度的所述TLR7激动剂PEG缀合物进行孵育。根据制造商的说明测定Cellsensor细胞系的NFkB活化。将BMDM用所述缀合物孵育过夜，并通过ELISA来评估上清液中的IL-6水平。使用Prism来计算估计的EC50。

带有6、10和18PEG链的缀合物在NFkB-bla RAW细胞和BMDM中显示出相似的效力(图9A-D)。在使用NFkB-bla RAW细胞的测定法中，含有较长PEG链的缀合物对于NFkB活化的活性较小(图9D-E)。相反地，较长链缀合物对于BMDM的IL-6分泌显示出较高的活性(图9D-E)。在带有6PEG链的缀合物中，具有NH₂末端基团的缀合物与带有COOH或N₃末端基团的缀合物相比显示出稍高的活性(图9A)。

给C57BL/6小鼠注射溶于100μL盐水的200纳摩尔各种TLR7激动剂-PEG缀合物。在指定的时间点收集血清并通过luminex beads assay测定细胞因子(TNFα、IL-6、IL-12)的水平(图10A-B)。该研究中使用的所有化合物都明显可溶于0.1-0.2％DMSO-盐水溶液中。当游离TLR7激动剂缀合至6PEG链(1Z2)时，活性降低(图10A-B)。含有较长链的缀合物(例如，1V303(18PEG链)和1Z3(约s47PEG链))诱导未缀合激动剂(1V136)水平的细胞因子。与未缀合TLR7激动剂相比，1Z5(含有约271-PEG链)诱导更高的细胞因子水平。

为了比较NH₂和COOH末端基团在体内的生物活性，使用缀合至TLR7激动剂的6PEG链和10PEG链(图10C)。含有NH₂末端基团的1Z2和1V298与含有COOH末端基团的对应缀合物相比显示出相对高的细胞因子诱导(图10C-D)。

在人炎性疾病的小鼠模型中(血清转移关节炎，实验性变应性脑脊髓炎(EAE)(参见上文)和巯基乙醇酸酯诱导的腹膜炎)中测试TLR7激动剂-PEG缀合物的抗炎效能。对于血清转移关节炎(图11)，在第0天对C57BL/6小鼠注射K/BxN血清并通过每天管饲1V282(图11A)或通过皮下注射1V282(图11B)而进行治疗。在皮下注射和管饲法治疗中每天给予1V282减少了爪肿胀。

对于巯基乙醇酸酯腹膜炎(图12)，对C57BL/6小鼠静脉或口服给予1V282三天。最后一次处理后一天，对小鼠腹膜内注射2ml巯基乙醇酸酯介质。静脉和皮下给予1V136被用作阳性对照。在所述巯基乙醇酸盐注射3小时后，评估嗜中性粒细胞对腹膜的浸润。通过全身或口服途径给予1V282减少了细胞(特别是嗜中性粒细胞)对腹膜腔的浸润。

人的1型糖尿病的特征是胰腺β细胞的特定破坏，一般与免疫介导的损伤有关。使用化学方法诱导的糖尿病模型来测试长时间给予TLR7激动剂-PEG缀合物是否能够降低所述疾病的严重程度或发作。使用多次小剂量的链脲霉素(烷化剂)(例如，连续5天的40mg/kg)。在易感啮齿目动物中，这会诱导其中免疫破坏起作用(如在人1型糖尿病中)的胰岛素缺乏型糖尿病。基于在其他相关疾病中观察到的作用方式，TLR7-PEG缀合物将改善该疾病的进程。

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本文提及的每件专利、专利申请、出版物和文件都以引用的方式纳入本文。对上述专利、专利申请、公开文本和文件的引用并非承认任意前述内容是都是相关的现有技术，它也并不构成对这些出版物或文件的内容和日期的任何认可。

可在不背离本发明基础方面的情况下对以上内容作出修改。尽管已经参考一个或多个具体实施方案对本发明进行了非常详细的描述。本领域普通技术人员能够理解可对本申请中所具体公开的实施方案进行改变，然而这些修改和改进是在本发明的范围和精神之内。

本文举例说明性地描述的本发明可在不存在本文没有具体公开的任意元素的情况下合适地实施。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包括”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任意一个都可由其他两个之一代替。所使用的术语和表达作为描述性的术语而非限制性的术语，使用这样的术语和表达不排除所显示或描述的特征的任何等同物或其部分，并且在所要求保护的本发明范围内各种修改都是可能的。术语“一”或“一个”可指其修饰的元素中的一个或多个(例如，“一种试剂”可指一种或多种试剂)，除非上下文中清楚地描述了是一种所述元素还是超过一种所述元素。本文使用的术语“约”是指处于基础参数的10％之内的值(即，增加或减去10％)，用在一串数值之前的术语“约”修饰所述每个值(即，“约1、2和3”是约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量可包括90克和110克。因此，应理解尽管本发明已经通过代表性实施方案和任选特征而被具体地公开了，本领域技术人员可采取对本文所公开的概念的修饰和变化方案，并且这样的修饰和变化方案被认为是在本发明的范围之内的。

Claims (34)

1.一种具有式I结构的化合物：

或其可药用盐，包括其水合物，其中：

X是N或CR²；

R是-OR¹、-SR¹或-NR^aR^b，

X¹是-O-、-S-或-NR^c-；

R^c是氢、C1-C10烷基或取代的C1-C10烷基，或者R^c和R¹与氮原子一起能够形成杂环或取代的杂环；

每个R¹独立地是氢、C1-C10烷基、取代的C1-C10烷基、C1-C10烷氧基、取代的C1-C10烷氧基、C1-C10烷基C1-C10烷氧基、取代的C1-C10烷基C1-C10烷氧基、C5-C10芳基、取代的C5-C10芳基、C5-C9杂环、取代的C5-C9杂环、C3-C9碳环或取代的C3-C9碳环；

每个R²独立地是氢、-OH、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、-C(O)-C1-C6烷基(烷酰基)、取代的-C(O)-C1-C6烷基、-C(O)-C6-C10芳基(芳酰基)、取代的-C(O)-C6-C10芳基、-C(O)OH(羧基)、-C(O)O-C1-C6烷基(烷氧基羰基)、取代的-C(O)O-C1-C6烷基、-NR^aR^b、-C(O)NR^aR^b(氨基甲酰基)、取代的C(O)NR^aR^b、卤素、硝基或氰基；

所述烷基、烷氧基、芳基或杂环基团上的取代基是羟基、C1-C6烷基、羟基C1-C6亚烷基、羧基C1-C6亚烷基、C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基、C1-C6烷氧基C1-C6亚烷基、氨基、氰基、卤素或芳基；

每个R^a和R^b独立地是氢、C1-C20烷基、C3-C8环烷基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷酰基、羟基C1-C6烷基、芳基、芳基C1-C6烷基、Het、Het C1-C6烷基或C1-C6烷氧基羰基；

每个R^x独立地是-X²-((R³)_r-(R⁴)_s)_p、-C(O)NR^aR^b或-CH₂NH-生物素；

每个X²独立地是键或连接基团；

每个R³独立地是聚乙二醇(PEG)部分；

每个R⁴独立地是H、-C1-C6烷基、-C1-C6烷氧基、-NR^aR^b、-N₃、-OH，-CN、-COOH、-COOR¹、-C1-C6烷基-NR^aR^b、C1-C6烷基-OH、C1-C6烷基-CN、C1-C6烷基-COOH、C1-C6烷基-COOR¹、5-6元环、取代的5-6元环、-C1-C6烷基-5-6元环、-C1-C6烷基-取代的5-6元环、C2-C9杂环或取代的C2-C9杂环；

m是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

n是0、1、2、3或4；

p是1至100；

q是1、2、3、4或5；

r是1至1,000；

s是1至1,000；并且

n和q的和等于5。

2.权利要求1的化合物，其中X¹是氧。

3.权利要求1或2的化合物，R¹是取代的C1-C6烷基。

4.权利要求3的化合物，其中R¹是C1-C10烷基C1-C10烷氧基部分。

5.权利要求4的化合物，其中R¹是-CH₂CH₂OCH₃。

6.权利要求1至5任一项的化合物，其中X²是酰氨基连接基团。

7.权利要求6的化合物，其中X²是-C(O)NH-、-NH(O)C-、-C1-C6烷基-C(O)NH-、-C1-C6烷基-NH(O)C-、-C(O)NH-C1-C6烷基-、-NH(O)C-C1-C6烷基-、-C1-C6烷基--NH(O)C-C1-C6烷基-、-C1-C6烷基-C(O)NH-C1-C6烷基-或-C(O)NH-(CH₂)_t-，其中t是1、2、3或4。

8.权利要求1至7任一项的化合物，其中在每种情况下n是4而R²是氢。

9.权利要求1至8任一项的化合物，其中所述PEG部分包括约1至约1,000个PGE单元。

10.权利要求9的化合物，其中每个PEG单元是-O-CH₂-CH₂-或-CH₂-CH₂-O-。

11.权利要求1至10任一项的化合物，其中r是约5至约100。

12.权利要求11的化合物，其中r是约5至约50。

13.权利要求12的化合物，其中r是约5至约25。

14.权利要求13的化合物，其中r是约5至约15。

15.权利要求14的化合物，其中r是约10。

16.权利要求1至15任一项的化合物，其中s是约5至约100。

17.权利要求16的化合物，其中s是约5至约50。

18.权利要求17的化合物，其中s是约5至约25。

19.权利要求18的化合物，其中s是约5至约15。

20.权利要求19的化合物，其中s是约10。

21.权利要求1至20任一项的化合物，其中一个或多个所述PEG部分是直链的。

22.权利要求1至21任一项的化合物，其中一个或多个所述PEG部分是支链的。

23.权利要求1至22任一项的化合物，其中每个R⁴取代基独立地是H、C1-C2烷基、-C1-C2烷氧基(例如，-OCH₃)、-NR^aR^b、-OH、-CN、-COOH、-COOR¹、-C1-C2烷基-NR^aR^b、C1-C2烷基-OH、C1-C2烷基-CN、C1-C2烷基-COOH或C1-C2烷基-COOR¹。

24.权利要求1至23任一项的化合物，其中m是1。

25.权利要求24的化合物，其中R²是氢、n是4、q是1、p是1、r是约10而s是1。

26.一种药物组合物，包含权利要求1至25任一项的化合物的可药用盐。

27.权利要求26的药物组合物，其中所述可药用盐是使用选自以下的酸制备的：盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸。

28.权利要求26的药物组合物，其中所述可药用盐是使用选自以下的酸制备的：乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、延胡索酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸和羟乙磺酸。

29.权利要求26的药物组合物，其中所述可药用盐是使用选自以下的碱制备的：氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铵、咖啡碱和胺。

30.一种预防、抑制或治疗哺乳动物的自身免疫性病症的方法，其包括将权利要求1至25任一项的化合物或权利要求26至29任一项的药物组合物以可有效预防、抑制或治疗所述自身免疫病症的量给予需要其的哺乳动物。

31.一种预防、抑制或治疗哺乳动物的炎性病症的方法，其包括将权利要求1至25任一项的化合物或权利要求26至29任一项的药物组合物以可有效预防、抑制或治疗所述炎性病症的量给予需要其的哺乳动物。

32.权利要求30或31的方法，其中所述哺乳动物是人。

33.一种化合物用于自身免疫障碍或疾病或者炎性障碍或疾病的医学疗法的用途，所述化合物包含通过聚乙二醇部分缀合至磷脂的TLR7激动剂。

34.权利要求33的用途，其中所述化合物是权利要求1至25任一项的化合物，或者在权利要求26至29任一项的药物组合物中。

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