KR20110117705A - 톨-유사 수용체 조정제 및 질병의 치료 - Google Patents

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KR20110117705A
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데니스 에이. 카르손
호워드 비. 코탐
토모코 하야시
마이클 찬
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더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본원에는 하나 이상의 톨 (toll)-유사 수용체의 효능제 또는 길항제인 소분자 접합체가 제공된다.

Description

톨-유사 수용체 조정제 및 질병의 치료 {Toll-like receptor modulators and treatment of diseases}
관련 출원에 관한 참조
본 출원은 2009년 2월 11일에 출원된 미국 가출원 제61/151,737호를 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
정부 권리에 관한 진술
본원에 기재된 본 발명은 국립 보건 연구소에 의해 지급 판정된 승인 번호 AI056453 및 AI077989-01의 정보 후원 하에 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대한 특정의 권리를 갖고 있다.
분야
본 기술 내용은 부분적으로, 톨 (Toll)-유사 수용체의 기능을 조정하는 분자, 및 이러한 분자를, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
톨 유사 수용체 (TLR)는 세균, 바이러스 또는 진균과 같은 미생물에 존재하는 특이적 분자 패턴을 인식하는 다양한 세포 유형 상에 존재하는 패턴 인식 수용체이다 (1). TLR은 지단백질 (TLR2), 이중 가닥 RNA (TLR3), 지질다당류 (LPS, TLR4), 플라겔린 (flagellin) (TLR5), 단일 가닥 RNA (TLR7/8), 및 세균성 또는 바이러스성 비-메틸화 CpG DNA (TLR9)를 인식한다. TLR3을 제외한 모든 TLR은 MyD88로서 지칭된 어댑터 (adapter) 단백질을 통하여 신호 전달하여, NF카파B 및 관련 사이토킨 유전자를 활성화시킨다 (2).
엔도솜 성분에 세포내적으로 위치한 TLR7 및 8은 단일 가닥 RNA 및 숙주 세포의 별개의 합성 구아노신 유사체를 인식한다 (3, 4). 구아닌 및 우리딘-풍부 단일 가닥 RNA가 TLR7에 대한 천연 리간드로서 확인되었다 (5). 또한, TLR7의 몇 가지 저분자량 활성화제가 확인되었는데, 이에는 이미다조퀴놀린 및 푸린-유사 분자가 포함된다 (3, 6, 7). 후자 중에서, 9-벤질-8-히드록시-2-(2-메톡시에톡시) 아데닌 ("SM")이 강력하고도 특이적인 TLR7 효능제로서 확인되었다 (8).
SM의 유도체는 벤질 부분 상의 알데히드 관능기를 혼입하고, 이러한 중간체를 히드라진 및 N-히드록시숙신이미드를 함유하는 이관능성 링커 분자를 통하여 상이한 보조 화학물과 커플링시킴으로써 합성하였다 (9). 마우스 혈청 알부민 (MSA) 단백질과 접합시키면 효력이 10배 내지 100배 정도 증가하였고, 자유 약물과 비교해서 생체내 약력학이 개선되었다. MSA 접합체는 비내 또는 기관내 투여에 의해 호흡기계로 전달될 수 있었다. 비내에 의한 약물 전달은 2가지 감염성 질환 마우스 모델, 즉 세균성 감염 및 바이러스성 감염 마우스 모델에서 유효한 것으로 입증되었다 (9). SM 중간체를 또한, 지질인 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 (DOPE)에 접합시켰는데, 이러한 접합체는 증강된 TLR7 효능제 활성을 보유하고 있는 것으로 결정되었다 (예를 들어, 2008년 2월 7일에 출원된 국제 특허출원 PCT/US2008/001631를 기준으로 한 WO 2008/115319 (2008년 9월 25일에 공개됨) 참조).
<개요>
본원에는 하나 이상의 톨-유사 수용체의 활성을 조정할 수 있는 소분자 접합체가 제공된다 (예를 들어, 이러한 접합체는 효능제 또는 길항제이거나 둘 다임). 용어 "톨-유사 수용체" (TLR)는 병원체 관련 분자 패턴 (PAMP)과 결합하고 포유동물에서 면역 반응을 촉진시키는 수용체 계열의 구성원을 지칭한다. 10개의 포유동물 TLR, 예를 들어 TLR1-10이 공지되어 있다. 용어 "톨-유사 수용체 효능제" (TLR 효능제)는 TLR과 상호 작용하고 상기 수용체의 활성을 자극하는 분자를 지칭한다. 합성 TLR 효능제는 TLR과 상호 작용하고 상기 수용체의 활성을 자극하는 것으로 설계되는 화학적 화합물이다. TLR 효능제의 예에는 TLR-7 효능제, TLR-3 효능제 또는 TLR-9 효능제가 포함된다. 용어 "톨-유사 수용체 길항제" (TLR 길항제)는 TLR과 상호 작용하고 상기 수용체의 신호 전달 활성을 억제 또는 중화시키는 분자를 지칭한다. 합성 TLR 길항제는 TLR과 상호 작용하고 상기 수용체의 활성을 방해하도록 설계된 화학적 화합물이다. TLR 길항제의 예에는 TLR-7 길항제, TLR-3 길항제 또는 TLR-9 길항제가 포함된다.
따라서, 한 실시양태에서는, 하기 화학식 I에 따른 구조를 갖는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 수화물이 본원에 제공된다:
<화학식 I>
Figure pct00001
상기 식에서,
X는 N 또는 CR2이고;
R은 -OR1, -SR1, 또는 -NRaRb이며;
X1은 결합이거나 또는 -O-, -S-, 또는 -NRc-이고;
Rc는 수소, C1-C10 알킬, 또는 치환된 C1-C10 알킬이거나, 또는 Rc와 R1은 질소 원자와 함께, 헤테로시클릭 고리 또는 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있으며;
R1은 수소, C1-C10 알킬, 치환된 C1-C10 알킬, C1-C10 알콕시, 치환된 C1-C10 알콕시, C1-C10 알킬 C1-C10 알콕시, 치환된 C1-C10 알킬 C1-C10 알콕시, C5-C10 아릴, 치환된 C5-C10 아릴, C5-C9 헤테로시클릭, 치환된 C5-C9 헤테로시클릭, C3-C9 카르보시클릭 또는 치환된 C3-C9 카르보시클릭이고;
R2는 각각 독립적으로, 수소, -OH, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, -C(O)-C1-C6 알킬 (알카노일), 치환된 -C(O)-C1-C6 알킬, -C(O)-C6-C10 아릴 (아로일), 치환된 -C(O)-C6-C10 아릴, -C(O)OH (카르복실), -C(O)O-C1-C6 알킬 (알콕시카르보닐), 치환된 -C(O)O-C1-C6 알킬, -NRaRb, -C(O)NRaRb (카르바모일), 치환된 C(O)NRaRb, 할로, 니트로, 또는 시아노이며;
이러한 알킬, 아릴 또는 헤테로시클릭 기 상의 치환기는 히드록시, C1-C6 알킬, 히드록시 C1-C6 알킬렌, C1-C6 알콕시, C3-C6 시클로알킬, C1-C6 알콕시 C1-C6 알킬렌, 아미노, 시아노, 할로겐 또는 아릴이며;
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로, 수소, C1-C6 알킬, C3-C8 시클로알킬, C1-C6 알콕시, 할로 C1-C6 알킬, C3-C8 시클로알킬 C1-C6 알킬, C1-C6 알카노일, 히드록시 C1-C6 알킬, 아릴, 아릴 C1-C6 알킬, Het, Het C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시카르보닐이고;
Rx는 각각 독립적으로, -X2-((R3)r-(R4)s)p, -C(O)NRaRb, 또는 -CH2NH-비오틴이며;
X2는 각각 독립적으로, 결합 또는 연결 기이고;
R3은 각각 독립적으로, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 부분이며;
R4는 각각 독립적으로, H, -C1-C6 알킬, -C1-C6 알콕시, -NRaRb, -N3, -OH, -CN, -COOH, -COOR1, -C1-C6 알킬-NRaRb, -C1-C6 알킬-OH, -C1-C6 알킬-CN, -C1-C6 알킬-COOH, -C1-C6 알킬-COOR1, 5 내지 6원 (5-6원) 고리, 치환된 5-6원 고리, -C1-C6 알킬-5-6원 고리, -C1-C6 알킬-치환된 5-6원 고리, C2-C9 헤테로시클릭, 또는 치환된 C2-C9 헤테로시클릭이고;
m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이며;
n은 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
p는 1 내지 100이며;
q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
r은 1 내지 1,000이며;
s는 1 내지 1,000이고;
n과 q의 합은 5이다.
특정 실시양태에서는, 또한 하기 화학식 II에 따른 구조를 갖는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 수화물이 제공된다:
<화학식 II>
Figure pct00002
상기 식에서,
X, X1, X2, R, R1, R2, R3, R4, m, n, p, q, r 및 s 실시양태는 상기 화학식 I에 대해 기재된 바와 같다.
일부 실시양태에서는, 하기 화학식 III에 따른 구조를 갖는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 수화물이 제공된다:
<화학식 III>
Figure pct00003
상기 식에서,
X, X1, R, R1 및 R2 실시양태는 상기 화학식 I에 대해 기재된 바와 같고;
Y는 -X2-((R3)r-(X3)t-(X4)s)p)q,
-X2-((R3)r-(X3)t-(X4)s-(R4)u)p)q,
-X2-(X4)s-(X3)t-((R3)r)p)q, 또는
-X2-(X4)s-(X3)t-((R3)r-(R4)u)p)q이며;
R3, R4, m, n, p, q, r 및 s 실시양태는 상기 화학식 I에 대해 기재된 바와 같고;
X3은 각각 독립적으로, 결합 또는 연결 기이며;
X4는 각각 독립적으로, 거대분자이고;
t는 1 내지 1,000이며;
u는 1 내지 1,000이다.
일부 실시양태에서, X는 N이다. 특정 실시양태에서, X1은 산소이고, 일부 실시양태에서, R1은 치환된 C1-C10 알킬, 예컨대 C1-C10 알킬 C1-C10 알콕시 부분 (예를 들어, -CH2CH2OCH3)이다. 일부 실시양태에서, R1은 6개 또는 그 보다 적은 수의 비-수소 원자로 이루어진다. 일부 실시양태에서, n은 4이고 R2는 각 경우에 수소이다.
특정 실시양태에서, X2 및/또는 X3은 독립적으로, 아미도 연결 기 (예를 들어, -C(O)NH- 또는 -NH(O)C-); 알킬 아미도 연결 기 [예를 들어, -C1-C6 알킬-C(O)NH-, -C1-C6 알킬-NH(O)C-, -C(O)NH-C1-C6 알킬-, -NH(O)C-C1-C6 알킬-, -C1-C6 알킬-NH(O)C-C1-C6 알킬-, -C1-C6 알킬-C(O)NH-C1-C6 알킬-, 또는 -C(O)NH-(CH2)t- (여기서, t는 1, 2, 3, 또는 4임)]; 치환된 5-6원 고리 [예를 들어, 아릴 환, 헤테로아릴 환 (예: 테트라졸, 피리딜, 2,5-피롤리딘디온 (예: 치환된 페닐 부분에 의해 치환된 2,5-피롤리딘온)), 카르보시클릭 고리 또는 헤테로시클릭 고리] 또는 산소 함유 부분 (예를 들어, -O-, -C1-C6 알콕시)이다.
PEG 부분에는 하나 이상의 PEG 단위가 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서는, PEG 부분에 약 1 내지 약 1,000 PEG 단위가 포함될 수 있는데, 이에는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900 단위가 제한없이 포함된다. 특정 실시양태에서, PEG 부분은 약 5 내지 약 25 PEG 단위, 약 10 내지 약 50 PEG 단위, 약 50 내지 약 150 PEG 단위, 약 120 내지 약 350 PEG 단위, 약 250 내지 약 550 PEG 단위 또는 약 650 내지 약 950 PEG 단위를 함유할 수 있다. PEG 단위는 특정 실시양태에서, -O-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-O-이다.
일부 실시양태에서, r은 약 5 내지 약 100이고, 종종 r은 약 5 내지 약 50 또는 약 5 내지 약 25이다. 특정 실시양태에서, r은 약 5 내지 약 15이고, 종종 r은 약 10이다. 일부 실시양태에서, R3은 PEG 단위이고, r은 약 2 내지 약 10 (예를 들어, r은 약 2 내지 약 4임)이다. 특정 실시양태에서, R3은 -O-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-O-이다.
일부 실시양태에서, R3은 -O-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-O-이고, r은 약 1 내지 약 1,000 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1,000)이다. 특정의 관련 실시양태에서, r은 약 5 내지 약 25, 약 10 내지 약 50, 약 50 내지 약 150, 약 120 내지 약 350, 약 250 내지 약 550 또는 약 650 내지 약 950이다.
일부 실시양태에서, s는 약 5 내지 약 100이고, 종종 s는 약 5 내지 약 50 또는 약 5 내지 약 25이다. 특정 실시양태에서, s는 약 5 내지 약 15이고, 종종 s는 약 10이다. 일부 실시양태에서, s는 약 5 또는 그 미만이다 (예를 들어, s는 1임). 일부 실시양태에서, (R3)r 치환기는 선형이고, 특정 실시양태에서, (R3)r 치환기는 분지된다. 선형 부분의 경우, s는 종종 r 보다 적고 (예를 들어, R3은 -O-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-O-인 경우), 가끔은 s가 1이다. 일부 실시양태에서, R3은 선형 PEG 부분 (예를 들어, 약 1 내지 약 1,000 PEG 단위를 갖는다)이고, s는 1이며 r은 1이다. 분지된 부분의 경우, s는 종종 r 보다 적거나, r 보다 많거나 또는 r과 동등하고 (예를 들어, R3이 -O-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-O-인 경우), 가끔은 r이 1이고, s가 1이며, p가 약 1 내지 약 1,000이다 (예를 들어, p는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1,000임).
일부 실시양태에서, t는 약 5 내지 약 100이고, 종종 t는 약 5 내지 약 50 또는 약 5 내지 약 25이다. 특정 실시양태에서, t는 약 5 내지 약 15이고, 종종 t는 약 10이다. 일부 실시양태에서, t는 약 5 또는 그 미만이다 (예를 들어, t는 1임). 특정 실시양태에서, u는 약 5 내지 약 100이고, 종종 u는 약 5 내지 약 50 또는 약 5 내지 약 25이다. 일부 실시양태에서, u는 약 5 내지 약 15이고, 종종 u는 약 10이다. 특정 실시양태에서, u는 약 5 또는 그 미만이다 (예를 들어, u는 1임).
특정 실시양태에서, R4 치환기는 독립적으로, H, C1-C2 알킬, -C1-C2 알콕시 (예를 들어, -OCH3), -NRaRb, -OH, -CN, -COOH, -COOR1, -C1-C2 알킬-NRaRb, C1-C2 알킬-OH, C1-C2 알킬-CN, C1-C2 알킬-COOH 또는 C1-C2 알킬-COOR1이다. 일부 실시양태에서, R4는 임의로 치환된 5-6원 고리 (예를 들어, 아릴 환, 헤테로아릴 환, 카르보시클릭 고리, 헤테로시클릭 고리)이다. 특정 실시양태에서, R4는 수소가 아니고, 종종 R4는 히드록실이 아니다.
화학식 I에 따른 구조를 갖는 화합물에 속하는 일부 실시양태에서, m은 약 1이고, R2는 수소이며, n은 4이고, q는 1이며, p는 1이고, r은 약 10이며, s는 1이다.
X4는 각각, 동일한 거대분자 또는 상이한 거대분자일 수 있다. 특정 실시양태에서, 거대분자는 항체, 항체 단편, 항원, 병원체 항원 [예를 들어, 에스. 아우레우스 (S. aureus) 항원], 단백질 (예를 들어, 인간 혈청 알부민 단백질 또는 그의 단편), 글리세롤, 지질, 인지질 (예를 들어, DOPE), 스핑고지질 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 거대분자는 DOPE이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다음 구조를 갖는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 수화물을, 류마티스성 관절염을 예방, 억제 또는 치료하는 데에 유효한 양으로 이를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게서 염증성 또는 자가면역 질환 (장애 또는 질병) (예를 들어, 류마티스성 관절염)을 예방, 억제 또는 치료하는 방법을 제공한다:
Figure pct00004
또한 본원에는 화학식 I, II 또는 III에 따른 구조를 갖는 화합물의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 또한 본원에는 화학식 I, II 또는 III에 따른 구조를 갖는 화합물을, 염증 질환, 예를 들어 자가면역 장애 또는 그의 증상을 예방, 억제 또는 치료하는 데에 유효한 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게서 염증 질환을 예방, 억제 또는 치료하는 방법이 제공된다. 또한 본원에는 화학식 I, II 또는 III에 따른 구조를 갖는 화합물을, 자가면역 질환 또는 그의 증상, 예를 들어 염증을 예방, 억제 또는 치료하는 데에 유효한 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게서 자가면역 질환을 예방, 억제 또는 치료하는 방법이 제공된다.
따라서, 본 발명은 임의로 기타 화합물과 연계해서, 의학적 요법에 사용하기 위한 화합물, 예컨대 염증성 장애 또는 질병, 예를 들어 류마티스성 관절염, 또는 암을 예방, 억제 또는 치료하는 작용제를 제공한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 자가면역 장애 또는 질병, 염증성 장애 또는 질환, 또는 암을 예방, 억제 또는 치료하는 데에 유용하다.
또한, 염증성 및/또는 자가면역 장애 또는 질병, 또는 암을 예방, 억제 또는 치료하는 약물을 제조하기 위한, 상기 화합물의 용도가 제공된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 화학식 I, II 또는 III에 따른 구조를 갖는 화합물을, 암을 예방, 억제 또는 치료하는 데에 유효한 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에게서 암을 예방, 억제 또는 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 화합물을 암이 있는 대상체에게 투여하고, 코르티코스테로이드, 예를 들어 덱사메타손 (dexamethasone), 프레드니실론 (prednisilone), 메틸프레드니솔론 (methylprednisolone), 또는 히드로코르티손 (hydrocortisone)을 치료에 적응시킨 경우에는, 호지킨 림프종 (Hodgkin's lymphoma), 비호지킨 림프종 (Non-Hodgkin's lymphoma), 백혈병, 다발성 골수종 또는 뇌 종양과 같은 암 대상체에게 투여한다. 한 실시양태에서는, 암 (예를 들어, 결장암)에 걸릴 위험이 있는 대상체 (암 발생은 염증과 연관이 있다)에게 본 발명의 화합물을 투여한다. 따라서, 본 발명은 임의로 기타 화합물과 연계해서, 의학적 요법에 사용하기 위한 화합물, 예컨대 암을 예방, 억제 또는 치료하는 작용제를 제공한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 각종 자가면역 장애/질병, 염증성 장애/질환, 및 암을 예방, 억제 또는 치료하는 데에 유용하다.
도면은 본 발명의 실시양태를 예시하고 있으며, 이로써 제한되지 않는다. 예시 명료와 용이성을 위해, 이들 도면을 일정한 비율로 만들지 않았고, 일부 경우에는 본 발명의 각종 실시양태들이 특별한 실시양태의 이해를 촉진시키기 위해 과장되거나 확대되어 제시될 수 있다는 것을 인지해야 한다.
다음 약어들이 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된다: 톨-유사 수용체 (TLR), 지질다당류 (LPS), 골수세포 분화 일차 반응 유전자 (88) (MyD88), 골수 유래된 단핵 세포 (BMDM), 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에탄올 (EtOH), 테트라히드로푸란 (THF), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), N,N-디메틸메탄아미드 (DMF), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU), 디클로로메탄 (DCM), 트리에틸아민 (TEA), 형질세포성 수지상 세포 (pDC), 오브알부민 (OVA), 마우스 혈청 알부민 (MSA), 인간 혈청 알부민 (HSA), 및 면역글로불린 (Ig).
도 1은 지질- (6), PEG- (8), 또는 지질-PEG (9) TLR7 접합체의 합성에 사용된 도식을 예시한 것이다. (6), (8), 및 (9)는 화합물 명칭을 지칭한다.
도 2a-d는 뮤린 대식세포에서 TLR7 접합체의 시험관내 면역학적 성상 확인 결과를 도시한 것이다. 도 2e는 LPS 비반응성 돌연변이체 및 야생형 대식세포를 이용한 내독소 오염물 평가 결과를 도시한 것이다.
도 3a-b는 인간 PBMC에서 TLR7 접합체의 시험관내 면역학적 성상 확인 결과를 도시한 것이다.
도 4a-b는 생체 내에서 TLR7 접합체에 의한 프로-염증성 사이토킨 유도 역학을 예시한 것이다.
도 5a-c는 생체 내에서 TLR7 접합체의 아주반트성 (adjuvanticity) (예를 들어, 면역학적 반응을 개시시킬 수 있는 능력)을 예시한 것이다.
도 6a-c는 TLR7 접합체의 가능한 부작용을 평가한 결과를 도시한 것이다.
도 7a-b는 1V136 (자유 약리작용단) 및 1V282 (화합물 8)를 이용한 치료에 의한 복막 호중구 침윤 감소를 예시한 것이다.
도 8은 유도된 실험적 자가면역성 뇌척수염 (EAE)에 대한 1V282 (화합물 (8))를 이용한 치료 효과를 예시한 것이다.
도 9a-e는 NFkBbla RAW 264.7 세포 및 골수 유래된 대식세포 (BMDM) 상에서의 다양한 쇄 길이를 갖는 TLR7 효능제 접합체의 시험관내 활성을 도시한 것이다.
도 10a-c는 마우스에게 투여된 TLR7 효능제 PEG 접합체의 생체내 약력학을 도시한 것이다.
도 11a-b는 혈청 전이된 관절염 모델에서 매일 섭식 (a)에 의해 투여되거나 피하 주사 (b)에 의해 투여된 1V282의 항염증 효과를 예시한 것이다.
도 12a-b는 티오글리콜레이트 유도된 복막염 모델에서 TLR7 효능제 PEG 접합체의 항염증 효과를 도시한 것이다.
<발명의 상세한 설명>
본원에는 하나 이상의 톨 유사 수용체의 효능제 또는 길항제인 소분자 접합체가 제공된다. 이러한 접합체는, 예를 들어 자가면역, 염증 및 세포 증식성 장애 또는 질병과 같은 질환을 치료하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 각종 방식으로 활용될 수 있다.
화합물
소분자 TLR 조정제는 공지되어 있다. 소분자의 예는 미국 특허 제6,329,381호 (2001년 12월 11일에 허여됨; 2000년 5월 26일에 출원된 미국 특허원 제09/555,292호로부터 유래됨) 및 2006년 8월 21일에 출원된 PCT/US2006/032371 (2007년 3월 1일에 WO2007/024707로서 공개됨); 2008년 2월 7일에 출원된 PCT/US2008/001631 (2008년 9월 25일에 WO 2008/115319로서 공개됨); 2007년 4월 23일에 출원된 PCT/US07/009840 (2007년 12월 13일에 WO/2007/142755로서 공개됨); 및 2008년 2월 7일에 출원된 미국 가출원 제61/026,999호에 기재되어 있다.
특정 소분자 TLR 효능제 (예를 들어, 본원에서 "소분자 표적"으로서 지칭된다)를 하나 이상의 PEG 부분과 접합시킬 수 있고, 이로써 생성되는 접합체가 TLR 길항제 활성을 나타낼 수 있는 것으로 결정되었다. 소분자 표적을 하나 이상의 PEG 부분과 접합시키는 것으로 공지된 몇 가지 방법이 있다. 예를 들어, 몇 가지 PEG 반응물이 시판되고 있고, 이는 소분자 상의 각종 반응성 기와 접합시키는 데에 적합하다 [예를 들어, NOF Corporation, Japan (World Wide Web URL peg-drug.com/peg_product/activated_peg.html)]. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "PEG 반응물"은 PEG-소분자 표적 접합체 생성물을 생성시키는 조건 하에 소분자 표적화 조합되는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 다음 구조를 갖는 특정의 PEG 반응물이 소분자 상의 각종 표적 기와 반응할 수 있다:
CH3O(CH2CH2O)n - X (여기서, X는 표 1에 따른 반응성 기임):
Figure pct00005
일부 실시양태에서, PEG 반응물은 구조 CH3O(CH2CH2O)n - X - NHS* (여기서, X는 -COCH2CH2COO-, -COCH2CH2CH2COO-, -CH2COO- 및 -(CH2)5COO-일 수 있다)를 갖는다. 특정 실시양태에서, PEG 반응물은 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00006
특정의 PEG 반응물은 일부 실시양태에서 이관능성이다. 이관능성 PEG 반응물의 예는 일부 실시양태에서, 구조 X - (OCH2CH2)n - X [여기서, X는 (N-숙신이미딜옥시카르보닐)메틸 (-CH2COO-NHS), 숙신이미딜글루타레이트 (-COCH2CH2CH2COO-NHS), (N-숙신이미딜옥시카르보닐)펜틸 (-(CH2)5COO-NHS), 3-(N-말레이미딜)프로판아미도, (-NHCOCH2CH2-MAL), 아미노프로필 (-CH2CH2CH2NH2) 또는 2-술파닐에틸 (-CH2CH2SH)이다]를 갖는다.
특정 실시양태에서, 일부 PEG 반응물은 헤테로-관능성이다. 헤테로-관능성 PEG 반응물의 예는 다음 구조를 갖는다:
Figure pct00007
상기 구조에서,
X는 일부 실시양태에서, (N-숙신이미딜옥시카르보닐)메틸 (-CH2COO-NHS), 숙신이미딜글루타레이트 (-COCH2CH2CH2COO-NHS), (N-숙신이미딜옥시카르보닐)펜틸 (-(CH2)5COO-NHS), 3-(N-말레이미딜)프로판아미도, (-NHCOCH2CH2-MAL), 3-아미노프로필 (-CH2CH2CH2NH2), 2-술파닐에틸 (-CH2CH2SH), 5-(N-숙신이미딜옥시카르보닐)펜틸 (-(CH2)5COO-NHS), 또는 p-니트로페닐옥시카르보닐 (-CO2-p-C6H4NO2)일 수 있다.
특정의 분지된 PEG 반응물, 예를 들어 다음 구조를 갖는 반응물을 활용할 수도 있다:
Figure pct00008
상기 구조에서,
일부 실시양태에서, X는 스페이서이고, Y는 관능기, 비제한적으로 예를 들어 말레이미드, 아민, 글루타릴-NHS, 카르보네이트-NHS 또는 카르보네이트-p-니트로페놀이다. 측쇄 PEG 반응물의 이점은 이들이 지속 방출 특성을 지닌 접합 생성물을 산출시킬 수 있다는 것이다.
PEG 반응물은 특정 실시양태에서, 헤테로-관능성 반응물, 예컨대
Figure pct00009
일 수 있다. 일부 실시양태에서, Boc*-보호된-아미노-PEG-카르복실-NHS 또는 말레이미드-PEG-카르복실-NHS 반응물을 활용할 수 있다.
특정 실시양태에서, 빗 (comb) 모양의 중합체를 PEG 반응물로서 활용하여 수많은 PEG 단위를 접합체 내로 혼입시킬 수 있다. 빗-모양의 중합체의 한 예가 다음에 제시된다:
Figure pct00010
"화합물" 표제의 섹션에 구체적으로 제시된 PEG 반응물의 목적상, PEG 반응물에 제시된 치환기 "n" 또는 "m"은 일부 실시양태에서, 단지 상기 화학식 I, II 또는 III에 대해 정의된 "r"과 같다. PEG 반응물 및/또는 PEG 접합체 생성물은 분자량 범위가 약 5 그램/몰 내지 약 100,000 그램/몰일 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG 반응물 및/또는 PEG 접합체 생성물은 평균 또는 공칭 분자량이 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000 또는 90,000 그램/몰이다. 일부 실시양태에서, 본원의 화합물 중의 PEG 부분은 균질하고, PEG 부분의 분자량은 특별한 화합물 배치의 각 분자 (예를 들어, R3은 하나의 PEG 단위이고, r은 2 내지 10임)에 대해 동일하다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 R4 치환기는 PEG 부분에서 종결된다 (예를 들어, 화학식 I; 선형 또는 분지된 PEG 부분). 각 R4 치환기는 동일하거나 상이할 수 있고, 일부 실시양태에서 -CH2-CH2-NH2, -CH2-CH2-OH, -CH2-CH2-COOH, -CH2-CH2-COOR1로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 링커는 본원에 기재된 링커를 포함한 적합한 어떠한 링커일 수도 있다.
적합한 링커를 활용하여 접합체 (예를 들어, X2, X3)를 구축할 수 있고, 다중 링커가 공지되어 있다. 활용될 수 있는 링커의 비-제한적 예에는 다음이 포함된다:
Figure pct00011
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알킬", "알케닐" 및 "알키닐"에는 이들이 치환되지 않은 경우에 C 및 H 만을 함유하는, 직쇄, 측쇄 및 시클릭 1가 히드로카르빌 라디칼, 및 이들의 조합물이 포함된다. 그의 예에는 메틸, 에틸, 이소부틸, 시클로헥실, 시클로펜틸에틸, 2 프로페닐, 3 부티닐 등이 포함된다. 이러한 각 기 중의 탄소 원자 총 수는 종종 본원에 기재되는데, 예를 들어 이들 기가 10개 이하의 탄소 원자를 함유할 수 있는 경우, 이는 1-10C로서 또는 C1-C10 또는 C1-10으로서 나타낼 수 있다. 헤테로 원자 (전형적으로, N, O 및 S)가 헤테로알킬 기에서와 같이 탄소 원자를 대체할 수 있는 경우에는, 예를 들어 이러한 기에 기개된 수가, 예를 들어 여전히 C1-C6으로서 씌여 있긴 하지만, 기재되는 환 또는 쇄의 주쇄 중의 탄소 원자에 대한 대체물로서 포함되는 헤테로 원자 수 + 해당 기 내의 탄소 원자 수의 합을 나타낸다.
전형적으로, 본 발명의 알킬, 알케닐 및 알키닐 치환기는 1개의 10C (알킬) 또는 2개의 10C (알케닐 또는 알키닐)를 함유한다. 바람직하게, 이들 치환체는 1개의 8C (알킬) 또는 2개의 8C (알케닐 또는 알키닐)를 함유한다. 종종, 이들은 1개의 4C (알킬) 또는 2개의 4C (알케닐 또는 알키닐)를 함유한다. 단일 기에는 한 가지 초과 유형의 다중 결합, 또는 1개 초과의 다중 결합이 포함될 수 있고; 이러한 기가 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 경우에는 용어 "알케닐"의 정의 내에 포함되고, 이러한 기가 1개 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 경우에는 용어 "알키닐"의 정의 내에 포함된다.
알킬, 알케닐 및 알키닐 기는 종종, 치환이 화학적으로 의미가 있는 정도로 임의로 치환된다. 전형적인 치환기에는 할로, =O, =N-CN, =N-OR, =NR, OR, NR2, SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRCOOR, NRCOR, CN, COOR, CONR2, OOCR, COR, 및 NO2 (여기서, R은 각각 독립적으로, H, C1-C8 알킬, C2-C8 헤테로알킬, C1-C8 아실, C2-C8 헤테로아실, C2-C8 알케닐, C2-C8 헤테로알케닐, C2-C8 알키닐, C2-C8 헤테로알키닐, C6-C10 아릴, 또는 C5-C10 헤테로아릴이고, R은 각각, 할로, =O, =N-CN, =N-OR', =NR', OR', NR'2, SR', SO2R', SO2NR'2, NR'SO2R', NR'CONR'2, NR'COOR', NR'COR', CN, COOR', CONR'2, OOCR', COR', 및 NO2에 의해 임의로 치환되며, R'는 각각 독립적으로, H, C1-C8 알킬, C2-C8 헤테로알킬, C1-C8 아실, C2-C8 헤테로아실, C6-C10 아릴 또는 C5-C10 헤테로아릴임)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 알킬, 알케닐 및 알키닐 기는 또한, C1-C8 아실, C2-C8 헤테로아실, C6-C10 아릴 또는 C5-C10 헤테로아릴에 의해 치환될 수 있는데, 이들 각각은 특별한 기에 대해 적당한 치환기에 의해 치환될 수 있다.
"아세틸렌" 치환기는 임의로 치환되는 2-10C 알키닐 기이고, 식 -C≡C-Ri을 갖는다 (여기서, Ri는 H 또는 C1-C8 알킬, C2-C8 헤테로알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 헤테로알케닐, C2-C8 알키닐, C2-C8 헤테로알키닐, C1-C8 아실, C2-C8 헤테로아실, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C7-C12 아릴알킬, 또는 C6-C12 헤테로아릴알킬이고, 각 Ri 기는 할로, =O, =N-CN, =N-OR', =NR', OR', NR'2, SR', SO2R', SO2NR'2, NR'SO2R', NR'CONR'2, NR'COOR', NR'COR', CN, COOR', CONR'2, OOCR', COR', 및 NO2로 부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 임의로 치환되며, R'는 각각 독립적으로, H, C1-C6 알킬, C2-C6 헤테로알킬, C1-C6 아실, C2-C6 헤테로아실, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C7-12 아릴알킬, 또는 C6-12 헤테로아릴알킬이고, 이들 각각은 할로, C1-C4 알킬, C1-C4 헤테로알킬, C1-C6 아실, C1-C6 헤테로아실, 히드록시, 아미노 및 =O로부터 선택된 하나 이상의 기에 의해 임의로 치환되고; 2개의 R'는 연결되어, N, O 및 S로부터 선택된 3개 이하의 헤테로 원자를 임의로 함유하는 3-7원 고리를 형성할 수 있다). 일부 실시양태에서, -C≡C-Ri의 Ri는 H 또는 Me이다.
"헤테로알킬", "헤테로알케닐", 및 "헤테로알키닐" 등은 상응하는 히드로카르빌 (알킬, 알케닐 및 알키닐) 기와 유사하게 정의되지만, '헤테로' 용어는 주쇄 잔기 내에 1개 내지 3개의 O, S 또는 N 헤테로 원자 또는 그의 조합을 함유하는 기를 지칭하므로; 상응하는 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기의 1개 이상의 탄소 원자가 명시된 헤테로 원자 중의 하나에 의해 대체되어 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 또는 헤테로알키닐 기를 형성한다. 알킬, 알케닐 및 알키닐 기의 헤테로 형태에 대한 전형적이면서도 바람직한 크기는 일반적으로, 상응하는 히드로카르빌 기에 대해서와 동일하고, 이러한 헤테로 형태 상에 존재할 수 있는 치환기는 상기 히드로카르빌 기에 대해 정의된 바와 동일하다. 화학적 안정성 이유로 인해, 달리 명시되지 않는 한, 옥소 기가 니트로 또는 술포닐 기에서와 같이 N 또는 S 상에 존재하는 경우를 제외하고는 상기 기에 2개 초과의 연속되는 헤테로 원자가 포함되지 않는다는 것을 또한 인지해야 한다.
본원에 사용된 바와 같은 "알킬"에 시클로알킬 및 시클로알킬알킬 기가 포함되긴 하지만, 용어 "시클로알킬"은 환 탄소 원자를 통하여 연결되는 카르보시클릭 비-방향족 기를 기재하기 위해 본원에 사용될 수 있고, "시클로알킬알킬"은 알킬 링커를 통하여 분자에 연결되는 카르보시클릭 비-방향족 기를 기재하기 위해 사용될 수 있다. 유사하게, "헤테로사이클릴"은 환 구성원으로서 1개 이상의 헤테로 원자를 함유하고, C 또는 N일 수 있는 환 원자를 통하여 분자에 연결되는 비-방향족 시클릭 기를 기재하기 위해 사용될 수 있고; "헤테로사이클릴알킬"은 링커를 통하여 또 다른 분자에 연결되는 상기 기를 기재하기 위해 사용될 수 있다. 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 헤테로사이클릴 및 헤테로사이클릴알킬 기에 적합한 치환기 및 크기는 상기 알킬 기에 대해 정의된 바와 동일하다. 본원에 사용된 바와 같은 이들 용어에는 또한, 1개의 이중 결합 또는 2개를 함유하는 환이 포함되는데, 단 이러한 환은 방향족이 아니다.
본원에 사용된 바와 같은 "아실"은 카르보닐 탄소 원자의 2개의 이용 가능한 원자가 위치 중의 하나에 부착된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 아릴알킬 라디칼을 포함하는 기를 포괄하고, 헤테로아실은 카르보닐 탄소 이외의 1개 이상의 탄소를 N, O 및 S로부터 선택된 헤테로 원자에 의해 대체시킨 상응하는 기를 지칭한다. 따라서, 헤테로아실에는, 예를 들어 -C(=O)OR 및 -C(=O)NR2 뿐만 아니라 -C(=O)-헤테로아릴이 포함된다.
아실 및 헤테로아실 기는 카르보닐 탄소 원자의 개방 원자가를 통하여 이에 부착되는 모든 기 또는 분자와 결합된다. 전형적으로, 이는 C1-C8 아실 기 (이에는 포르밀, 아세틸, 피발로일, 및 벤조일이 포함된다), 및 C2-C8 헤테로아실 기 (이에는 메톡시아세틸, 에톡시카르보닐 및 4-피리디노일이 포함된다)이다. 아실 또는 헤테로아실 기를 포함하는 상기 기의 히드로카르빌 기, 아릴 기 및 헤테로 형태는 아실 또는 헤테로아실 기의 상응하는 성분 각각에 대해 일반적으로 적합한 치환기로서 본원에 기재된 치환기에 의해 치환될 수 있다.
"방향족" 부분 또는 "아릴" 부분은 널리 공지된 방향족성의 특징을 지닌 모노시클릭 또는 융합된 바이시클릭 부분을 지칭하고; 그의 예에는 페닐 및 나프틸이 포함된다. 유사하게, "헤테로방향족" 및 "헤테로아릴"은 환 구성원으로서 O, S 및 N으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로 원자를 함유하는 상기 모노시클릭 또는 융합된 바이시클릭 고리 시스템을 지칭한다. 헤테로 원자를 봉입하면 5원 고리에서 뿐만 아니라 6원 고리에서도 방향족성이 허용된다. 전형적인 헤테로 방향족 시스템에는 모노시클릭 C5-C6 방향족 기, 예컨대 피리딜, 피리미딜, 피라지닐, 티에닐, 푸라닐, 피롤릴, 피라졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴 및 이미다졸릴; 및 이들 모노시클릭 기 중의 하나를 페닐 환과 융합시키거나 또는 헤테로 방향족 모노시클릭 기 중의 어느 하나와 융합시켜 C8-C10 바이시클릭 기, 예컨대 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 인다졸릴, 벤조트리아졸릴, 이소퀴놀릴, 퀴놀릴, 벤조티아졸릴, 벤조푸라닐, 피라졸로피리딜, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 신놀리닐 등을 형성함으로써 형성된 융합된 바이시클릭 부분이 포함된다. 환 시스템 전반에 걸친 전자 분포도 관점에서 방향족성 특징을 지닌 모든 모노시클릭 또는 융합된 환 바이시클릭 시스템이 상기 정의에 포함된다. 이에는 또한, 적어도 분자의 나머지 부분에 직접 부착되는 환이 방향족성의 특징을 갖는 바이시클릭 기가 포함된다. 전형적으로, 환 시스템은 5-12 환 구성원 원자를 함유한다. 바람직하게, 모노시클릭 헤테로아릴은 5-6 환 구성원을 함유하고, 바이시클릭 헤테로아릴은 8-10 환 구성원을 함유한다.
아릴 및 헤테로아릴 부분은 C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C5-C12 아릴, C1-C8 아실, 및 이들의 헤테로형태 (이들 각각은 그 자체가 추가로 치환될 수 있다)를 포함한 각종 치환체에 의해 치환될 수 있고; 아릴 및 헤테로아릴 부분에 대한 기타 치환기에는 할로, OR, NR2, SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRCOOR, NRCOR, CN, COOR, CONR2, OOCR, COR, 및 NO2 (여기서, R은 각각 독립적으로, H, C1-C8 알킬, C2-C8 헤테로알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 헤테로알케닐, C2-C8 알키닐, C2-C8 헤테로알키닐, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C7-C12 아릴알킬, 또는 C6-C12 헤테로아릴알킬이고, R은 각각, 상기 알킬 기에 대해 기재된 바와 같이 임의로 치환된다)가 포함된다. 아릴 또는 헤테로아릴 기 상의 치환기는 물론, 이러한 치환기의 각 유형 또는 치환기의 각 성분에 대해 적합한 것으로 본원에 기재된 기에 의해 추가로 치환될 수 있다. 따라서, 예를 들어 아릴알킬 치환기는 아릴 부분 상에서 아릴 기에 대해 전형적인 것으로 본원에 기재된 치환기에 의해 치환될 수 있고, 알킬 부분 상에서 알킬 기에 대해 전형적이거나 적합한 것으로서 본원에 기재된 치환기에 의해 추가로 치환될 수 있다.
유사하게, "아릴알킬" 및 "헤테로아릴알킬"은 알킬렌과 같은 연결 기 (이에는 치환되거나 치환되지 않고, 포화 또는 불포화의 시클릭 또는 아시클릭 링커가 포함된다)를 통하여 그의 부착 점에 결합되는 방향족 및 헤테로방향족 환 시스템을 지칭한다. 전형적으로, 링커는 C1-C8 알킬 또는 그의 헤테로 형태이다. 이들 링커에는 또한, 카르보닐 기가 포함될 수 있으므로, 이들이 아실 또는 헤테로아실 부분으로서 치환기를 제공할 수 있게 해준다. 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬 기 중의 아릴 또는 헤테로아릴 환은 상기 아릴 기에 대해 기재된 바와 동일한 치환기에 의해 치환될 수 있다. 바람직하게, 아릴알킬 기에는 상기 아릴 기에 대해 정의된 기에 의해 임의로 치환된 페닐 환; 및 치환되지 않거나 또는 1개 또는 2개의 C1-C4 알킬 기 또는 헤테로알킬 기에 의해 치환되는 C1-C4 알킬렌이 포함되는데, 이러한 알킬 또는 헤테로알킬 기는 임의로 폐환시켜 시클로프로판, 디옥솔란 또는 옥사시클로펜탄과 같은 환을 형성할 수 있다. 유사하게, 헤테로아릴알킬 기에는 바람직하게, 아릴 기 상의 전형적인 치환기로서 상기 언급된 기에 의해 임의로 치환되는 C5-C6 모노시클릭 헤테로아릴 기; 및 치환되지 않거나 또는 1개 또는 2개의 C1-C4 알킬 기 또는 헤테로알킬 기에 의해 치환되는 C1-C4 알킬렌이 포함되거나, 또는 이에는 임의로 치환된 페닐 환 또는 C5-C6 모노시클릭 헤테로아릴; 및 치환되지 않거나 또는 1개 또는 2개의 C1-C4 알킬 기 또는 헤테로알킬 기에 의해 치환되는 C1-C4 헤테로알킬렌이 포함되는데, 이러한 알킬 또는 헤테로알킬 기는 임의로 폐환시켜 시클로프로판, 디옥솔란 또는 옥사시클로펜탄과 같은 환을 형성할 수 있다.
아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬 기가 임의로 치환된 것으로서 기재되는 경우, 치환기는 해당 기의 알킬 또는 헤테로알킬 부분 상에 존재할 수 있거나 또는 아릴 또는 헤테로아릴 부분 상에 존재할 수 있다. 알킬 또는 헤테로알킬 부분 상에 임의로 존재하는 치환기는 일반적으로 상기 알킬 기에 대해 기재된 바와 동일하고; 아릴 또는 헤테로아릴 부분 상에 임의로 존재하는 치환기는 일반적으로 상기 아릴 기에 대해 기재된 바와 동일하다.
본원에 사용된 바와 같은 "아릴알킬" 기는 이들이 치환되지 않은 경우에는 히드로카르빌 기이고, 환 및 알킬렌 또는 유사한 링커 내의 탄소 원자 총 수로써 기재된다. 따라서, 벤질 기는 C7-아릴알킬 기이고, 페닐에틸은 C8-아릴알킬이다.
상기 언급된 바와 같은 "헤테로아릴알킬"은 연결 기를 통하여 부착되는 아릴 기를 포함하는 부분을 지칭하고, 아릴 부분의 1개 이상의 환 원자 또는 연결 기 내의 1개 원자가 N, O 및 S로부터 선택된 헤테로 원자라는 점에서 "아릴알킬"과 상이하다. 헤테로아릴알킬 기는 본원에서, 조합된 환과 링커 내의 원자 총 수에 따라서 기재되고, 이에는 헤테로알킬 링커를 통하여 연결된 아릴 기; 알킬렌과 같이 히드로카르빌 링커를 통하여 연결된 헤테로아릴 기; 및 헤테로알킬 링커를 통하여 연결된 헤테로아릴 기가 포함된다. 따라서, 예를 들어 C7-헤테로아릴알킬에는 피리딜메틸, 페녹시 및 N-피롤릴메톡시가 포함될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "알킬렌"은 2가 히드로카르빌 기를 지칭하는데; 이는 2가이기 때문에, 2개의 다른 기를 함께 연결할 수 있다. 전형적으로, 이는 -(CH2)n- (여기서, n은 1 내지 8이고, 바람직하게 n은 1 내지 4임)을 지칭하고, 명시된 경우일지라도, 알킬렌은 다른 기에 의해 치환될 수도 있으며, 다른 길이일 수 있고, 개방 원자가가 반드시 쇄의 반대 말단에 있을 필요는 없다. 따라서, -CH(Me)- 및 - C(Me)2-는 시클로프로판-1,1-디일과 같은 시클릭 기와 마찬가지로, 알킬렌으로서 지칭될 수도 있다. 알킬렌 기가 치환되는 경우, 이러한 치환기에는 본원에 기재된 바와 같은 알킬 기 상에 전형적으로 존재하는 것들이 포함된다.
일반적으로, 모든 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실, 또는 아릴 또는 아릴알킬 기, 또는 치환기에 함유되어 있는 이들 기 중의 하나의 모든 헤테로형태는 그 자체가 부가의 치환기에 의해 임의로 치환될 수 있다. 이들 치환기의 종류는 달리 기재되지 않는 한 일차 치환기 자체와 관련하여 언급된 것과 유사하다. 따라서, 예를 들어 R2가 알킬인 실시양태의 경우, 이러한 알킬은 R2에 대한 실시양태로서 열거된 나머지 치환기 (이는 화학적 의미를 만들고, 이것이 알킬 자체에 대해 제공된 크기 제한을 손상시키지 않는다)에 의해 임의로 치환될 수 있고; 예를 들어, 알킬이나 알케닐에 의해 치환된 알킬은 이들 실시양태에 대한 탄소 원자의 상한치를 단순히 연장시킬 것이지만, 포함되지 않는다. 그러나, 아릴, 아미노, 알콕시, =O 등에 의해 치환된 알킬은 본 발명의 범위 내에 포함될 것이고, 이들 치환기의 원자는 기재되는 알킬, 알케닐 등의 기를 설명하기 위해 사용된 수에 계수되지 않는다. 치환기의 수가 명시되지 않은 경우, 이러한 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실 또는 아릴 기 각각은 그의 이용 가능한 원자가에 따라서 수많은 치환기에 의해 치환될 수 있는데; 특히, 이들 기 모두는, 예를 들어 그의 이용 가능한 원자가 중의 어느 것 또는 모두에서 불소 원자에 의해 치환될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "헤테로형태"는 지정된 카르보시클릭 기의 1개 이상의 탄소 원자를 N, O 및 S로부터 선택된 헤테로 원자에 의해 대체시킨, 알킬, 아릴 또는 아실과 같은 기의 유도체를 지칭한다. 따라서, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실, 아릴, 및 아릴알킬의 헤테로형태는 각각 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 헤테로아실, 헤테로아릴, 및 헤테로아릴알킬이다. 2개 이하의 N, O 또는 S 원자가 통상적으로 일련으로 연결되는데, 단 옥소 기는 N 또는 S에 부착되어 니트로 또는 술포닐 기를 형성한다는 것을 인지해야 한다. 헤테로형태 부분은 종종, 본원에서 "Het"로서 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같은 "할로" 또는 "할로겐"에는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도가 포함된다. 플루오로 및 클로로가 종종 바람직하다. 본원에 사용된 바와 같은 "아미노"는 NH2를 지칭하지만, 아미노가 "치환된" 또는 "임의로 치환된"으로서 기재되는 경우, 상기 용어에는 NR'R" (여기서, R' 및 R"는 각각 독립적으로, H이거나 또는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실, 아릴 또는 아릴알킬 기, 또는 이들 기 중의 하나의 헤테로형태이고, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실, 아릴 또는 아릴알킬 기, 또는 이들 기 중의 하나의 헤테로형태 각각은 상응하는 기에 적합한 것으로서 본원에 기재된 치환기에 의해 임의로 치환된다)가 포함된다. 상기 용어에는 또한, R'와 R"가 함께 연결되어, 포화, 불포화 또는 방향족일 수 있고 환 구성원으로서 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 헤테로 원자를 함유하며, 알킬 기에 적합한 것으로서 기재된 치환기에 의해 임의로 치환되는 3-8원 고리를 형성하거나, 또는 NR'R"가 방향족 기인 경우에는 헤테로아릴 기에 대해 전형적인 것으로서 기재된 치환기에 의해 임의로 치환되는 형태가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "카르보사이클"은 환에 탄소 원자 만을 함유하는 시클릭 화합물을 지칭하는 반면, "헤테로사이클"은 헤테로 원자를 포함하는 시클릭 화합물을 지칭한다. 카르보시클릭 및 헤테로시클릭 구조에는 모노시클릭, 바이시클릭 또는 다중 환 시스템을 갖는 화합물이 포괄된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "헤테로 원자"는 탄소 또는 수소가 아닌 모든 원자, 예컨대 질소, 산소 또는 황을 지칭한다. 헤테로사이클의 예시적 예에는 테트라히드로푸란, 1,3 디옥솔란, 2,3 디히드로푸란, 피란, 테트라히드로피란, 벤조푸란, 이소벤조푸란, 1,3 디히드로 이소벤조푸란, 이속사졸, 4,5 디히드로이속사졸, 피페리딘, 피롤리딘, 피롤리딘 2 온, 피롤, 피리딘, 피리미딘, 옥타히드로 피롤로[3,4 b]피리딘, 피페라진, 피라진, 모르폴린, 티오모르폴린, 이미다졸, 이미다졸리딘 2,4 디온, 1,3 디히드로벤즈이미다졸 2 온, 인돌, 티아졸, 벤조티아졸, 티아디아졸, 티오펜, 테트라히드로 티오펜 1,1 디옥시드, 디아제핀, 트리아졸, 구아니딘, 디아자비시클로[2.2.1]헵탄, 2,5 디아자비시클로[2.2.1]헵탄, 2,3,4,4a,9,9a 헥사히드로 1H 베타 카르볼린, 옥시란, 옥세탄, 테트라히드로피란, 디옥산, 락톤, 아지리딘, 아제티딘, 피페리딘, 락탐이 포함되지만, 이에 제한되지 않고, 헤테로아릴을 포괄할 수도 있다. 헤테로아릴의 기타 예시적 예에는 푸란, 피롤, 피리딘, 피리미딘, 이미다졸, 벤즈이미다졸 및 트리아졸이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 경우에 있어, 본원에 기재된 화합물은 하나 이상의 키랄 원자를 함유한다. 본 발명에는 각각의 단리된 입체이성체성 형태 뿐만 아니라 다양한 키랄 순도의 입체이성체의 혼합물 (라세미 혼합물 포함)이 포함된다. 또한, 형성될 수 있는 각종 부분입체이성체 및 호변체가 포괄된다. 본 발명의 화합물은 또한, 하나 이상의 호변체 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, R이 -OH인 경우, 본원에 기재된 화합물은 하나 이상의 호변체 형태로 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "임의로 치환된"이란 기재되는 특별한 기(들)가 비-수소 치환기를 갖지 않을 수 있거나, 또는 이러한 기(들)가 하나 이상의 비-수소 치환기를 가질 수도 있다는 것을 나타낸다. 달리 명시되지 않는다면, 존재할 수 있는 이러한 치환기의 총 수는 기재되는 기의 치환되지 않은 형태 상에 존재하는 H 원자 수와 동등하다. 임의의 치환기가 이중 결합, 예컨대 카르보닐 산소 (=O)를 통하여 부착되는 경우, 해당 기는 2개의 이용 가능한 원자가를 차지하므로, 포함될 수 있는 치환기의 총 수는 이용 가능한 원자가의 수에 따라서 감소된다.
제약 조성물 및 제형
본원에 기재된 화합물은 제약상 허용되는 염으로서 제조할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는 염"은 모 화합물을 그의 산 또는 염기 염로 만듦으로써 변형시킨, 기재된 화합물의 유도체를 지칭한다. 제약상 허용되는 염의 예에는 염기성 잔기 (예: 아민)의 무기 또는 유기 산 염; 산성 잔기 (예; 카르복실산)의 알칼리 또는 유기 염 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 제약상 허용되는 염에는, 예를 들어 비-독성 무기 또는 유기 산으로부터 형성된 모 화합물의 통상적인 비-독성 염 또는 4급 암모늄 염이 포함된다. 예를 들어, 통상적인 비-독성 염에는 무기 산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 술팜산, 인산, 질산 등으로부터 유래된 염; 및 유기 산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 파모산, 말레산, 히드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 술파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 에탄 디술폰산, 옥살산, 이세티온산 등으로부터 제조된 염이 포함된다. 기타 예에서, 통상적인 비-독성 염에는 염기로부터 유래된 염, 예컨대 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화암모늄, 카페인, 각종 아민 등이 포함된다. 제약상 허용되는 염은 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 부분을 함유하는 모 화합물로부터 합성할 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이들 화합물의 자유 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매, 또는 이들 둘의 혼합물 중에서 적당한 염기 또는 산의 화학량적 양과 반응시킴으로써 제조할 수 있는데; 일반적으로, 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올, 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 바람직하다. 적합한 염의 목록이 다음 문헌에 보고되었다 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985)] 참조; 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는"은 철저한 의학적 판단 범주 내에서 합리적인 유익/유해 비율이 알맞게 균형이 잡힌, 과도한 독성, 자극, 알레르기성 반응, 또는 기타 문제점 또는 합병증 없이 인간 및 동물 조직과의 접촉에 사용하기 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
용어 "안정한 화합물" 및 "안정한 구조"는 반응 혼합물로부터 유용한 순도로의 단리를 견뎌내고 효능있는 치료제로의 제형을 견뎌내기에 충분히 강건한 화합물을 표시한다. 안정한 화합물이 본원에 기재된 치료 방법에 사용되는 것으로 본 발명에 고려된다.
본원에 기재된 화합물은 한 가지 이상의 기타 작용제와 병용해서 제형화할 수 있다. 이러한 한 가지 이상의 기타 작용제에는 본원에 기재된 또 다른 화합물, 항-세포 증식제 (예: 화학요법제), 항염증제, 및 항원이 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 화합물은 제약 조성물로서 제형화하고, 선택된 투여 경로, 예를 들어 경구 또는 비경구, 정맥내, 근육내, 국소 또는 피하 경로에 적합하도록 적응시킨 각종 형태로 포유동물 숙주, 예컨대 인간 환자 또는 비-인간 동물에게 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 국소 투여하는데, 예를 들어 소포내 투여한다. 조성물에는 종종, 희석제 뿐만 아니라 일부 경우에는, 아주반트, 완충제, 방부제 등이 포함된다. 화합물은 특정 실시양태에서, 리포솜성 조성물 중에 또는 마이크로에멀션으로서 투여할 수도 있다. 약물에 대한 각종 지속 방출 시스템이 또한 고안되었는데, 이를 본원에 기재된 화합물에 적용할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,624,677호 참조; 그의 방법이 본원에 참고로 포함된다).
따라서, 화합물을 제약상 허용되는 비히클, 예컨대 불활성 희석제 또는 동화될 수 있는 식용 담체와 조합하여 전신 투여할 수 있는데, 예를 들어 경구 투여할 수 있다.
본원에 기재된 화합물은 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 봉입시킬 수 있거나, 정제로 압착시킬 수 있거나, 또는 환자의 음식물에 직접 혼입시킬 수 있다. 경구 치료적 투여의 경우에는, 활성 화합물을 하나 이상의 부형제와 조합할 수 있고, 섭취 가능한 정제, 볼 정제, 트로키제, 캅셀제, 엘릭서제, 현탁제, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용할 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 0.1% 이상의 활성 화합물을 함유해야 한다. 조성물 및 제제의 비율은 물론, 다양할 수 있고, 소정의 단위 투여 형태의 약 2 내지 약 60 중량%인 것이 편리할 수 있다. 이러한 치료상 유용한 조성물 중의 활성 화합물의 양은 유효한 투여량 수준이 수득되는 양이다.
정제, 트로키제, 환제, 캅셀제 등은 다음을 함유할 수도 있다: 결합제, 예컨대 트라가칸드 검, 아카시아 검, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 인산이칼슘; 붕해제, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 알진산 등; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트; 및 감미제, 예컨대 슈크로스, 프럭토스, 락토스 또는 아스파르탐 또는 향미제, 예컨대 박하, 살리실산 메틸 (oil of wintergreen), 또는 체리 향미제를 가할 수도 있다. 단위 투여 형태가 캅셀제인 경우, 이는 상기 유형의 물질 이외에도, 액상 담체, 예컨대 식물성 오일 또는 폴리에틸렌 글리콜을 함유할 수 있다. 각종 기타 물질이 피막으로서 존재할 수 있거나, 또는 고형 단위 투여 형태의 물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캅셀제를 젤라틴, 왁스, 쉘락 또는 당 등으로 피복시킬 수 있다. 시럽 또는 엘릭서제는 활성 화합물; 감미제로서의 슈크로스 또는 프럭토스; 방부제로서의 메틸 및 프로필파라벤; 염료 및 향미제, 예컨대 체리 또는 오렌지 향미제를 함유할 수 있다. 물론, 모든 단위 투여 형태를 제조하는 데에 사용된 모든 물질은 이용된 양에서 제약상 허용되고 실질적으로 비-독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물을 지속 방출 제제 및 장치 내로 혼입시킬 수 있다.
활성 화합물을 주입 또는 주사에 의해 투여할 수 있다. 활성 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용제는 비독성 계면활성제와 임의로 혼합하여, 수중에서 제조할 수 있다. 분산제는 또한, 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜, 트리아세틴 및 그의 혼합물, 및 오일 중에서 제조할 수 있다. 통상적인 저장 및 사용 조건 하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제를 함유한다.
제약 투여 형태에는 활성 성분을 포함하는 멸균성 수성 용제 또는 분산제 또는 멸균성 산제가 포함될 수 있는데, 이는 멸균성 용제 또는 분산제의 일시적인 제조에 적합하고, 임의로 리포솜에 피막화시킨다. 궁극적인 투여 형태는 종종, 멸균성 유체이고 제조 및 저장 조건 하에 안정적이다. 액상 담체 또는 비히클은, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일, 비-독성 글리세릴 에스테르, 및 그의 적합한 혼합물을 포함하는 액상 분산 매질 또는 용매일 수 있다. 적당한 유동성은, 예를 들어 리포솜을 형성하거나, 분산제의 경우 요구되는 입자 크기를 유지시키거나, 또는 계면활성제를 사용함으로써 유지시킬 수 있다. 미생물의 작용 방지는 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 유발될 수 있다. 등장제, 예를 들어 당, 완충제 또는 염화나트륨이 일부 실시양태에서 포함된다. 주사용 조성물의 흡수 연장은 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 이루어질 수 있다. 멸균성 용제는 종종, 활성 화합물의 요구 량을 종종 상기 열거된 한 가지 이상의 기타 성분과 함께 적당한 용매에 혼입시킨 다음, 필터 멸균시킴으로써 제조한다. 멸균성 주사용 용제를 제조하기 위한 멸균성 산제의 경우에, 종종 활용되는 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술인데, 이로써 앞서 멸균-여과시킨 용액에 존재하는 모든 부가의 목적 성분 이외에도 활성 성분의 분말이 산출된다.
국소 투여의 경우에는, 본원의 화합물을, 예를 들어 액체 형태인 경우에 순수한 형태로 적용할 수 있다. 그러나, 화합물을 고형 또는 액상일 수 있는 허용되는 담체와 조합하여 조성물 또는 제형으로서 투여하는 것이 일반적으로 바람직하다. 유용한 고형 담체에는 미분된 고형물, 예컨대 탈크, 점토, 미세결정성 셀룰로스, 실리카, 알루미나 등이 포함된다. 유용한 액상 담체에는 물, 알콜 또는 글리콜 또는 물-알콜/글리콜 블렌드 (여기서는, 본 발명의 화합물이 임의로 비-독성 계면활성제의 도움 하에 유효한 수준으로 용해되거나 분산될 수 있다)가 포함된다. 아주반트, 예컨대 방향제 및 부가의 항미생물제를 가하여 소정의 용도를 위해 해당 특성을 최적화시킬 수 있다. 이로써 생성되는 액상 조성물은 흡수성 패드로부터 적용할 수 있거나, 밴드 및 기타 드레싱을 함침시키기 위해 사용될 수 있거나, 또는 펌트형 또는 에어로솔 분무기를 이용하여 환부 상에 분무할 수 있다.
증점제, 예컨대 합성 중합체, 지방산, 지방산 염 및 에스테르, 지방 알콜, 변형된 셀룰로스 또는 변형된 무기질 물질을 액상 담체와 함께 이용하여, 사용자의 피부에 직접 적용하기 위한 확산 가능한 페이스트, 젤, 연고, 비누 등을 형성시킬 수도 있다. 화합물의 유용한 투여량은 그들의 시험관내 활성, 및 동물 모델에서의 생체내 활성을 비교함으로써 결정할 수 있다. 마우스 및 기타 동물에서의 유효한 투여량을 인간에게 외삽하여 추정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,938,949호 참조). TLR 효능제 또는 TLR 길항제로서 작용할 수 있는 본원의 화합물의 능력은 다음 문헌에 기재된 과정을 포함한, 공지되어 있는 약리학적 모델을 이용하여 결정할 수 있다 (문헌 [Lee et al., PNAS, 100:6646 (2003)] 참조). 일반적으로, 액상 조성물 중의 화합물(들)의 농도는 약 0.1 내지 25 wt-%, 바람직하게 약 0.5 내지 10 wt-%일 것이다. 반-고형 또는 고형 조성물, 예컨대 젤 또는 분말 중의 농도는 약 0.1 내지 5 wt-%, 바람직하게 약 0.5 내지 2.5 wt-%일 것이다.
치료에 사용하는 데에 요구되는 화합물, 또는 그의 활성 염 또는 유도체의 양은 선택된 특별한 염 뿐만 아니라 투여 경로, 치료하고자 하는 질환의 종류 및 환자의 연령 및 상태에 따라서 다양할 것이고, 궁극적으로는 담당 의사 또는 임상의의 재량에 따를 것이다. 일반적으로, 적합한 용량은 종종, 약 0.5 내지 약 100 mg/kg의 범위, 예를 들어 1일 약 10 내지 약 75 mg/체중 kg, 예컨대 1일 3 내지 약 50 mg/수용자의 체중 kg이고, 종종 1일 6 내지 90 mg/kg, 또는 1일 약 15 내지 60 mg/kg의 범위이다. 화합물은 단위 투여 형태로 투여하는 것이 편리할 수 있고, 예를 들어 단위 투여 형태당 5 내지 1,000 mg, 또는 10 내지 750 mg, 또는 50 내지 500 mg의 활성 성분을 함유한다. 활성 성분은 약 0.01 내지 약 100 pM, 약 0.5 내지 약 75 pM, 약 1 내지 50 pM, 또는 약 2 내지 약 30 pM의 활성 화합물의 피크 혈장 농도를 달성하도록 투여할 수 있다. 이러한 농도는, 예를 들어 임의로 염수 중에서 활성 성분의 0.05 내지 5% 용액을 정맥내 주사하거나, 또는 약 1 내지 100 mg의 활성 성분을 함유하는 거환으로서 경구 투여함으로써 달성될 수 있다. 목적하는 혈액 수준은 약 0.01 내지 5.0 mg/kg/hr을 제공하도록 지속적으로 주입하거나 또는 약 0.4 내지 15 mg/kg의 활성 성분(들)을 함유하도록 간헐적으로 주입함으로써 유지시킬 수 있다. 목적하는 용량은 편리하게, 단일 용량으로 제시하거나 또는 적당한 간격, 예를 들어 1일 2회, 3회, 4회 또는 그 초과의 서브-용량으로 나누어 투여되는 용량으로서 제시될 수 있다. 서브-용량 그 자체는, 예를 들어 별개의 느슨한 간격의 투여 횟수로 추가로 나뉘어지는데, 예를 들어 흡입기로부터의 다수의 흡입 또는 안구 내로의 복수개 비말 적용에 의해서 이루어진다.
치료
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료" 및 "치료하는"은 (i) 병적 상태가 발생하지 못하게 하고/하거나 (예를 들어, 예방); (ii) 병적 상태를 억제하거나 그의 발생을 저지시키고/시키거나; (iii) 병적 상태를 구제하고/하거나; (iv) 질병 증상을 개선, 완화, 경감 및 제거하는 것을 지칭한다. 본원에 기재된 후보 분자 또는 화합물은 제형 또는 약물 중에 치료상 유효한 양으로 존재할 수 있는데, 이는 생물학적 효과를 유발시킬 수 있거나 (예를 들어, 염증을 억제시킨다) 또는 질환, 예를 들어 질병의 증상을 개선, 완화, 경감, 구제, 감소 또는 제거할 수 있는 양이다. 상기 용어는 또한, 세포 증식 속도를 감소 또는 중지시키거나 (예를 들어, 종양 성장을 느리게 하거나 중지시킨다) 또는 증식성 암 세포의 수를 감소시키는 것을 (예를 들어, 종양의 일부 또는 전부를 제거한다) 지칭할 수 있다. 이들 용어는 또한, 미생물에 감염된 시스템 (예를 들어, 세포, 조직 또는 대상체) 중의 미생물의 역가를 감소시키고/시키거나, 미생물 증식 속도를 감소시키고/시키거나, 미생물 감염과 연관된 증상 수 또는 증상 효과를 감소시키고/시키거나 시스템으로부터 탐지 가능한 양의 미생물을 제거하기 위해 적용 가능하다. 미생물의 예에는 바이러스, 세균 및 진균이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료상 유효량"은 대상체에게서 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하거나 또는 이러한 질병 또는 장애의 증상을 치료하기 위한, 본원에 제공된 화합물의 양 또는 본원에 제공된 화합물의 조합물의 양을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체" 및 "환자"는 일반적으로, 본원에 기재된 방법에 따른 치료 (예를 들어, 본원에 기재된 화합물을 투여함)를 받을 예정이거나 이러한 치료를 받은 적이 있는 개체를 지칭한다.
본원에 기재된 화합물은 한 가지 이상의 염증 장애를 잠재적으로 예방, 억제 또는 치료하기 위해, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여할 수 있다. 다음에 사용되는 바와 같은 용어 "치료하는", "치료" 및 "치료적 효과"는 염증 반응을 저하, 억제 또는 중지 (예방)시키고 (예를 들어, 특이적 항원에 대한 항체의 양 또는 항체 생성을 느리게하거나 중지시킨다), 염증 발생된 조직의 양을 감소시키며, 염증 질환을 완전히 또는 부분적으로 완화시키는 것을 지칭할 수 있다. 염증 질환에는 알레르기, 천식, 자가면역 장애, 만성 염증, 만성 전립선염, 사구체신염, 과민증, 염증성 장 질환, 근육병증 (예를 들어, 전신성 경화증, 피부근염, 다발성 근염 및/또는 봉입체 근염과 함께 옴), 골반 염증성 질환, 재관류 손상, 류마티스성 관절염, 이식 거부, 혈관염, 및 백혈구 장애 [예를 들어, 체디악-히가시 (Chediak-Higashi) 증후군, 만성 육아종성 질병]가 비제한적으로 포함된다. 특정의 자가면역 장애가 또한, 염증 장애 (예를 들어, 류마티스성 관절염)이다. 일부 실시양태에서, 염증 장애는 만성 염증, 만성 전립선염, 사구체신염, 과민증, 근육병증, 골반 염증성 질환, 재관류 손상, 이식 거부, 혈관염 및 백혈구 장애로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 염증 질환에는 기관지 확장증, 세기관지염, 낭포성 섬유증, 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 아테롬성 경화증 및 패혈성 쇽 (예를 들어, 다발성 기관 부전증을 수반한 패혈증)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 염증 질환은 알레르기, 천식, ARDS 및 자가면역 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 질환이 아니다. 특정 실시양태에서, 염증 질환은 위장관 염증, 뇌 염증, 피부 염증 및 관절 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환이 아니다. 특정 실시양태에서, 염증 질환은 호중구-매개된 장애이다.
본원에 기재된 화합물은 한 가지 이상의 자가면역 장애를 잠재적으로 치료하기 위해, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여할 수 있다. 이러한 치료에서, 용어 "치료하는", "치료" 및 "치료적 효과"는 자가면역 반응을 저하, 억제 또는 중지시키고 (예를 들어, 특이적 항원에 대한 항체의 양 또는 항체 생성을 느리게하거나 중지시킨다), 염증 발생된 조직의 양을 감소시키며, 자가면역 장애를 완전히 또는 부분적으로 완화시키는 것을 지칭할 수 있다. 자가면역 장애에는 자가면역성 뇌척수염, 결장염, 자가면역성 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM), 및 베게너 (Wegener) 육아종증 및 다카야수 (Takayasu) 동맥염이 비제한적으로 포함된다. 이러한 질병에 대해 화합물을 시험하는 방법에는 (a)(i) 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG) 펩티드에 의해 유도된 C5BL/6, (ii) SJL 마우스 PLP139-151, 또는 178-191 EAE, 및 (iii) 자가면역성 뇌척수염을 알아보기 위해 MOG 또는 PLP 펩티드에 의해 유도된 EAE의 양자 면역전달 모델; (b) 자가면역성 IDDM을 알아보기 위한 비-비만 당뇨병 (NOD) 마우스; (c) 결장염을 알아보기 위한 덱스트란 술페이트 나트륨 (DSS)-유도된 결장염 모델 및 트리니트로벤젠 술폰산 (TNBS)-유도된 결장염 모델; 및 (d) 베게너 육아종증 및 다카야수 동맥염에 대한 모델로서 전신성 소 혈관염 장애가 비제한적으로 포함된다. 본원에 기재된 화합물은 다음 장애 중의 한 가지 이상을 잠재적으로 치료하기 위해 대상체에게 투여할 수 있다: 급성 파종성 뇌척수염 (ADEM); 애디송병 (Addison's disease); 원형 탈모증; 강직성 척추염; 항인지질 항체 증후군 (APS); 자가면역성 용혈성 빈혈; 자가면역성 간염; 자가면역성 내이 질환; 수포성 유사천포창; 복막 질환; 샤가스병 (Chagas disease); 만성 폐쇄성 폐 질환; 크론병 (Crohns disease) (2가지 유형의 특발성 염증성 장 질환 "IBD" 중의 한 가지); 피부근염; 당뇨병 유형 1; 자궁내막증; 구드패스츄어 증후군 (Goodpasture's syndrome); 그레이브병 (Graves' disease); 길랑-바레 (Guillain-Barre) 증후군 (GBS); 하시모토병 (Hashimoto's disease); 화농성 한선염; 특발성 혈소판감소성 자반증; 간질성 방광염; 홍반성 루푸스; 혼합 결체 조직 질환; 국소 피부경화증; 다발성 경화증 (MS); 중증 근무력증; 발작성 수면; 신경근육 긴장증; 심상성 천포창; 악성 빈혈; 다발성 근염; 원발성 담즙성 간경변; 류마티스성 관절염; 정신분열증; 피부 경화증; 쇼그렌 (Sjogren's) 증후군; 측두 동맥염 ("거대 세포 동맥염"으로서 공지되기도 함); 궤양성 결장염 (2가지 유형의 특발성 염증성 장 질환 "IBD" 중의 한 가지); 혈관염; 백반증; 및 베게너 육아종증. 일부 실시양태에서, 자가면역 장애 또는 질환은 크론병, 류마티스성 관절염, 루푸스 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 장애 또는 질환이 아니다.
본원에 기재된 화합물은 대상체에게서 면역 반응을 유도시키기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여할 수 있다. 면역 반응은 특정 실시양태에서, 외래 항원 (예를 들어, 병원체 감염)에 대항하여 대상체에 의해 자동적으로 발생될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 항원을 본원에 기재된 화합물과 함께 공동-투여하는데, 이러한 항원에 대항하여 대상체에게서 면역 반응이 서서히 증가한다. 항원은 특정 실시양태에서, 특별한 세포 증식성 질환 (예를 들어, 특이적 암 항원) 또는 특별한 병원체 (예를 들어, 그램 양성 세균 벽 항원; 에스. 아우레우스 (S. aureus) 항원)에 대해 특이적일 수 있다.
본원에 기재된 화합물은 한 가지 이상의 세포 증식성 장애를 잠재적으로 치료하기 위해, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여할 수 있다. 이러한 치료에서, 용어 "치료하는", "치료" 및 "치료적 효과"는 세포 증식 속도를 저하 또는 중지시키고 (예를 들어, 종양 성장을 느리게하거나 중지시킨다), 증식성 암 세포의 수를 감소시키며 (예를 들어, 종양의 일부 또는 전부를 제거한다), 세포 증식성 질환을 완전히 또는 부분적으로 완화시키는 것을 지칭할 수 있다. 세포 증식성 질환에는 결장직장암, 유방암, 폐암, 간암, 췌장암, 림프절암, 결장암, 전립선암, 뇌암, 두경부암, 피부암, 간암, 신장암 및 심장암이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 암의 예에는 조혈 기원 (예를 들어, 골수세포 계열, 림프계 또는 적혈구계, 또는 그의 전구 세포로부터 발생됨)의 과형성/종양성 세포와 관련이 있는 질병인 조혈 종양성 장애가 포함된다. 이러한 질병은 불량하게 분화된 급성 백혈병, 예를 들어 적혈모구성 백혈병 및 급성 거대모구성 백혈병으로부터 유발될 수 있다. 부가의 골수성 장애에는 급성 전골수성 백혈병 (APML), 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 만성 골수성 백혈병 (CML) (문헌 [Vaickus, Crit. Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-297 (1991)] 참조)이 포함되지만, 이에 제한되지 않고; 림프성 악성 종양에는 급성 림프아구성 백혈병 (ALL) (이에는 B-계열 ALL 및 T-계열 ALL이 포함된다), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 전림프구성 백혈병 (PLL), 모발 세포 백혈병 (HLL) 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (Waldenstrom macroglobulinemia) (WM)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 부가 형태의 악성 림프종에는 비호지킨 림프종 및 그의 변이체, 말초 T 세포 림프종, 성인 T 세포 백혈병/림프종 (ATL), 피부 T-세포 림프종 (CTCL), 대형 과립상 림프구성 백혈병 (LGF), 호지킨병 및 리드-스테른베르크병 (Reed-Sternberg disease)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 특별한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 비-내분비 종양 또는 내분비 종양이다. 비-내분비 종양의 예시적 예에는 선암종, 선방 세포 암종, 선편평 상피암, 거대 세포 종양, 관내 유두상 점액 종양, 점액 낭선암종, 췌장모세포종, 장액성 낭선종, 고형 및 가유두상 종양이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 내분비 종양은 섬 세포 종양일 수 있다.
세포 증식성 질환에는 또한, 염증성 질환, 예컨대 피부 염증 질환이 포함되는데, 이에는 예를 들어 습진, 원판상 홍반성 루푸스, 편평 태선, 경화 태선, 균상 식육종, 광선피부병, 장미색 잔비늘증 (pityriasis rosea), 건선이 포함된다. 또한, 비만과 관계된 세포 증식성 질환, 예를 들어 비만 세포의 증식이 포함된다.
세포 증식성 질환에는 또한, 바이러스성 질병, 예를 들어 후천성 면역결핍증, 아데노비리대 (adenoviridae) 감염, 알파바이러스 (alphavirus) 감염, 아르보바이러스 (arbovirus), 보르나병 (Borna disease), 부니아비리대 (bunyaviridae) 감염, 칼리시비리대 (caliciviridae) 감염, 수두, 코로나비리대 (Ccoronaviridae) 감염, 콕사키에바이러스 (coxsackievirus) 감염, 시토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) 감염, 뎅기, DNA 바이러스 감염, 전염성 농창, 뇌염, 아르보바이러스, 엡슈타인-바르 (Epstein-Barr) 바이러스 감염, 감염성 홍반, 한타바이러스 (hantavirus) 감염, 출혈성 열, 바이러스성 간염, 바이러스성, 인간, 단순포진, 대상포진, 귀대상포진, 헤르페스비리대 (herpesviridae) 감염, 감염성 단핵구증, 인플루엔자, 예를 들어 조류 또는 인간에게서의 인플루엔자, 라사열 (Lassa fever), 홍역, 전염성 물사마귀, 유행성 이하선염, 오아라믹소비리대 (oaramyxoviridae) 감염, 플레보토무스열 (phlebotomus fever), 폴리오마바이러스 (polyomavirus) 감염, 광견병, 호흡기 합포체 바이러스 감염, 리프트 계곡열 (Rift Valley fever), RNA 바이러스 감염, 풍진, 슬로우바이러스 (slow virus)병, 두창, 아급성 경화성 범뇌염, 종양 바이러스 감염, 사마귀, 서부 나일강 열 바이러스 질병 및 황열이 포함된다. 예를 들어, SV40 형질전환성 바이러스의 대형 T 항원은 UBF 상에서 작용하고, 이를 활성화시키며 기타 바이러스성 단백질을 Pol I 복합체로 동원시킴으로써, 세포 증식을 자극하여 바이러스 증식을 보장한다. 세포 증식성 질환에는 또한, 혈관형성과 관계된 질환 (예를 들어, 암) 및 비만 세포 및 기타 지방 세포의 증식에 의해 유발된 비만과 관계된 질환이 포함된다.
세포 증식성 질환에는 또한, 심장 스트레스로부터 비롯되는 심장 질환, 예컨대 고혈압, 풍선 혈관확장술, 판막 질병 및 심근 경색이 포함된다. 예를 들어, 심근세포는 심실벽의 벌크를 구성하는 심장 중의 분화된 근육 세포이고, 혈관 평활근 세포가 혈관 안에 있다. 심근 세포와 혈관 평활근 세포 둘 다가 근육 세포 유형이긴 하지만, 이들은 그들의 수축, 성장 및 분화 기전에 있어서 다양하다. 심근 세포는 심장 형성 직후에 말단적으로 분화되므로, 분할될 수 있는 능력을 상실하게 되는 반면, 혈관 평활근 세포는 수축성에서부터 증식성 표현형으로 지속적으로 조정이 진행되고 있다. 각종 병리생리학적 스트레스, 예컨대 고혈압, 풍선 혈관확장술, 판막병 및 심근 경색 하에서는, 예를 들어 심장과 혈관이 심장 기능을 저하시켜 궁극적으로 심부전증을 발현시킬 수 있는 형태학적 성장 관련 변경을 진행한다. 따라서, 본원에는 심장 질환을 치료하는 데에 유효한 양의 본원에 기재된 화합물을 투여함으로서 심장 세포 증식성 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 본원의 화합물은 심장 스트레스가 발생하거나 탐지되기 전 또는 후에 투여할 수 있고, 화합물 또는 핵산은, 예를 들어 고혈압, 풍선 혈관확장술, 판막병 또는 심근 경색의 발생 또는 탐지 후에 투여할 수 있다. 이러한 화합물을 투여하는 것이 혈관 근육 세포 및/또는 평활근 세포의 증식을 저하시킬 수 있다.
특정 실시양태는 또한, 본원에 기재된 후보 분자 또는 핵산을 투여함으로써, 세포 노화와 관련된 질환을 치료하고/하거나 노화 증상을 치료하는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 베르너 (Werner) 증후군의 미숙한 노화 질병은 WRN DNA 헬리카세를 암호화하는 베르너 유전자 상의 변경으로부터 비롯된다. 특정 이론에 제한되는 것은 아니지만, 상기 단백질은 핵소체에 국재되고 G-사량체와 특이적으로 결합하는 것으로 공지되어 있고, WRN DNA 헬리카세 상의 돌연변이로 인해 노화가 발생한다.
<실시예>
다음에 제시되는 실시예는 본 발명을 예시하며, 제한하지 않는다.
TLR 분자는 수용체 국재화, 세포 활성화 및 사이토킨 생성에 영향을 미칠 수 있다. TLR4 및 9의 경우, TLR의 위치는 사이토킨 유도의 유의적 프로파일에 반응적이다 (10-12). 지질이 약물과 접합하는 것은 약물이 극성 지질 담체를 통하여 세포 내로 유입되는 것을 촉진시킴으로써, 통상적인 전달 시스템 보다 약물의 유효 세포내 농도를 보다 효율적이면서도 보다 특이적으로 달성할 수 있게 해준다. 의약용 연고 또는 연고제와 제형화된, 지질에 대한 약물의 접합은 피부 장애를 치료하기 위하여 피부 내로의 침투를 제공할 수 있다. PEG화는 생체 내에서의 안정성을 증가시킴으로써, 결국에는 독성을 저하시켜 약물의 혈액 순환을 연장시킬 수 있다 (13). 이때, 지질 및 폴리에틸렌 글리콜을 TLR7 효능제 (SM)와 접합시켰고, 이러한 접합체의 면역 활성을 시험하였다. 개개의 TLR7 효능제 접합체가 별개의 생체내 및 시험관내 면역자극 프로파일을 제시하였다. 지질에 대한 TLR7 효능제의 접합으로 인해, 접합되지 않은 TLR7 효능제 (SM)와 비교해서 선천 면역을 자극할 수 있는 능력이 개선되었다. 지질-TLR7 효능제 접합체는 생체 내에서 신속한 개시와 오래 지속되는 아주반트 효과를 나타내었다. 이들 데이터는 지질-TLR7 효능제가 치료용 백신 접종을 위한 아주반트로서 잠재적으로 적용된다는 사실을 제안하고 있다. 그러나, TLR7 효능제를 PEG와 접합시키면, SM 약리작용단 및 접합체의 특성이 변형되어, 대신 TLR7 길항제 활성이 나타났다.
실시예 1: 접합체의 합성 및 성상 확인
재료
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)은 아반티 폴라 리피즈 (Avanti Polar Lipids; Alabaster, AL)로부터 구입하였다. 기타 모든 시약은 추가의 정제없이 시그마-알드리히 (Sigma-Aldrich; St. Louis MO)로부터 적어도 시약 등급으로서 구입하였다. 용매는 피셔 사이언티픽 (Fischer Scientific; Pittsburgh, PA)으로부터 구입하였고, 구입된 제품으로서 사용하였거나 또는 적당한 건조제를 이용하여 재증류시켜 사용하였다. 오브알부민 (OVA, 등급 V)은 시그마-알드리히로부터 구입하였다.
면역학적 활성을 실험하기 위한 시약 및 접합체 중의 내독소 수준은 바이오휘태커 (BioWhittaker; Walkerville, Maryland, USA)로부터 구입한 QCL1000® 종말점 발색 LAL 검정을 이용하여 측정하였다. 단백질 또는 약물 1 마이크로그램 (㎍)당 1 피코그램 (pg) 미만의 내독소를 함유하는 시약이 실험 내내 사용되었다. DOPE는 LAL 검정에서 가 양성 결과를 제공하기 때문에, 지질당류 비반응성 돌연변이체 마우스 (C3H/HeJ)로부터 유래된 골수 유래 단핵 (BMDM) 세포를 사용하여 내독소에 의한 오염을 시험하였다 (도 1B 참조). C3H/HeJ 마우스로부터 유래된 BMDM에 의한 사이토킨 생성 수준은 야생형 C3H/HeOuJ 균주로부터 유래된 세포에서의 수준과 유사하였는데, 이는 내독소 오염이 무시할만한 수준이었다는 것을 나타낸다 (도 2b 참조). 모든 접합체를 건조 분말에서 -80℃ 하에 저장하였다. 접합체를 DMSO에 100 mM으로 용해시켰고, 면역학적 검정 이전에 추가로 희석시켰다.
EMD (Gibbstown, NJ)로부터 구입한 예비코팅된 TLC 실리카 겔 60 F254 알루미늄 시트를 이용하여 분석적 TLC를 수행하고, UV 광을 이용하여 가시화하였다. 명시된 용매 시스템을 이용하여 EMD 실리카 겔 60 (40-63 ㎛) 상에서 섬광 크로마토그래피를 수행하였다. 지질을 수반하지 않은 화합물에 대한 크로마토그래피 및 질량 스펙트럼 (ESI)을 약 98 면적% 순도로 수펠코 디스커버리 (Supelco Discovery) HS C18 칼럼 (공급처: 시그마-알드리히)을 수반한 1100 LC/MSD (공급처; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara CA) 상에서 기록하였다. 지질 함유 화합물의 질량 스펙트럼 (ESI)은 핀니간 (Finnigan) LCQDECA (공급처: Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA) 상에서 기록하였다. 1H NMR 스펙트럼을 바리안 머큐리 플러스 (Varian Mercury Plus) 400 (공급처: Varian, Inc., Palo Alto CA) 상에서 수득하였다. 화학적 이동은 0 ppm 하에서의 TMS를 기준으로 하여 적합한 이중수소화 NMR 용매를 이용하여 백만개당 부 (ppm)로 표현하였다.
C57BL/6 (B6) 마우스는 챨스 리버 라보라토리즈 (Charles River Laboratories; Wilmington, MA)로부터 구입하였다. C3H/HeJ 및 C3H/HeOuJ 마우스는 더 잭슨 라보라토리즈 (The Jackson Laboratories; Bar Harbor, ME)로부터 구입하였다. TLR7 결핍성 마우스 (C57BL/6 배경)은 닥터 에스. 아키라 (Dr. S. Akira; Osaka University, Osaka, Japan)가 증정하였고, C57BL/6 배경 상으로 10 세대 역교배하였다. 동물을 7 am에서 7 pm까지 12시간:12시간 주야 사이클로 22±0.5℃ 하의 방에서 UCSD 하에 사육 및 유지시켰다. 모든 과정과 프로토콜은 시설내 동물 보호 및 사용 위원회의 승인을 받았다.
화학적 합성
본원에 기재된 화학적 합성 도식은 도 1의 화합물을 참조로 한 경우에 그 번호를 괄호 안에 사용하고, 반응 단계를 참조로 한 경우에는 괄호 안에 글자를 사용한다 (예를 들어, 부가된 화학물질(들) 및/또는 반응 조건). 예를 들어, (a)는 화합물 (1)과 조합되어 반응되는 경우에 화합물 (2)의 형성을 가져다 줄 수 있는 반응물의 부가를 포함하는 반응 단계를 지칭한다. 각 반응 단계에 부가된 화합물 및 반응 조건은 다음과 같다: (a) 리튬 N,N'-메틸에틸렌디아미노알루미늄 수화물 (문헌 [Cha, J. et al., (2002) Selective conversion of aromatic nitriles to aldehydes by lithium N,N'-dimethylethylenediaminoaluminum hydride, Bull. Korean Chem. Soc. 23, 1697-1698] 참조), THF, 0℃; (b) NaI, 클로로트리메틸실란, CH3CN, 실온; (c) PBS, 실온; (d) NaOH:EtOH 1:1, 환류; (e) DOPE, HATU, 트리에틸아민, DMF/DCM 1:1, 실온; (f) O-(2-아미노에틸)-O'-(2-아지도에틸)노나에틸렌 글리콜, HATU, 트리에틸아민, DMF, 실온; (g) 4 펜티노산, 나트륨 아스코르베이트, Cu(OAc)2, t-BuOH/H2O/THF 2:2:1, 실온; 및 (h) DOPE, HATU, 트리에틸아민, DMF/DCM 1:1, 실온.
4-((6-아미노-2-(2-메톡시에톡시)-8-옥소-7H-푸린-9(8H)-일)메틸)벤조산 (도 1, 화합물 5 참조)의 합성. 20 ml의 1:1 에탄올;물 혼합물을 0.10 g (0.28 mmol)의 4-((6-아미노-8-메톡시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-푸린-9 일)메틸)벤조니트릴 (도 1, 화합물 1 참조)에 가하고, 조합물을 8시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 진한 HCl을 이용하여 pH 2로 산성화시켰다. 수성 용액을 DCM으로 추가로 추출시키고 (3x20 ml), MgSO4 상으로 건조시키며, 진공 하에 증발시켜 8-옥소-9-벤조산 (화합물 5), 8-메톡시-9-벤조산 및 8-옥소-9-에틸 벤조에이트의 혼합물을 수득하였다. 일단 건조되면, 생성물을 CH3CN (25 ml)에 용해시키고, NaI (0.14 g, 0.96 mmol)를 가하였다 (도 1, 반응 단계 (b)). 이러한 용액에 12 ㎕ (0.96 mmol)의 클로로트리메틸실란을 교반시키면서 적가하였다. 반응 혼합물을 40℃ 하에 4시간 동안 가열한 다음, 냉각시키고, 여과시키며, 물 (20 ml)로 세척한 다음, 디에틸 에테르 (20 ml)로 세척하여 백색 고체를 85% 수율로 수득하였다. 이로써 생성된 생성물 상에서 핵 자기 공명 (NMR) 분석을 수행하여 다음 결과를 수득하였다:
Figure pct00012
2-(4-((6-아미노-2-(2-메톡시에톡시)-8-옥소-7H-푸린-9(8H)-일)메틸)벤즈아미도)에틸 2,3-비스(올레오일옥시)프로필 포스페이트 (도 1, 화합물 6 참조)의 합성. 1 ml의 무수 N,N-디메틸메탄아미드 (DMF) 중의 0.022 g (0.06 mmol)의 화합물 5의 용액에 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU) (0.026 g, 0.067 mmol) 및 무수 트리에틸아민 (TEA) (17.0 ㎕, 0.12 mmol)을 가하였다. 무수 1:1 디클로로메탄 (DCM):DMF (1 ml) 중의 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (0.05g, 0.067 mmol)의 용액을 제조하고, 상기 반응 혼합물에 서서히 가하였다 (도 1 반응 단계 (e)). 반응 혼합물을 실온 하에 완료될 때까지 교반시킨 다음, 진공 하에 증발시켰다. DCM 중의 15% 메탄올 (MeOH)을 사용하여 섬광 크로마토그래피함으로써 생성물을 정제하여 0.038 g의 백색 고체를 58% 수율로 수득하였다. 이로써 생성된 생성물 상에서 NMR 분석을 수행하여 다음 결과를 수득하였다:
Figure pct00013
4-((6-아미노-8-히드록시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-푸린-9-일)메틸)-N-(32-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-데카옥사도트리아콘틸)벤즈아미드 (도 1, 화합물 7 참조)의 합성. 무수 DMF (5 ml) 중의 화합물 5 (0.100 g, 0.278 mmol)의 용액에 HATU (0.117g, 0.306 mmol) 및 무수 TEA (77.014 ㎕, 0.556 mmol)를 가하였다 (도 1, 반응 단계 (f) 참조). 무수 DMF (1 ml) 중의 O-(2-아미노에틸)-O'-(2-아지도에틸)노나에틸렌 글리콜 (0.150 g, 0.306 mmol)의 용액을 제조하고, 반응 혼합물에 서서히 가하였다.
반응 혼합물을 실온 하에 완료될 때까지 교반시킨 다음, 진공 하에 증발시켰다. DCM 중의 5% MeOH을 사용하여 섬광 크로마토그래피함으로써 생성물을 정제하여 0.224 g의 유백색 오일을 93% 수율로 수득하였다. HPLC 상에서의 체류 시간 = 12분. 이로써 생성된 생성물 상에서 NMR 분석을 수행하여 다음 결과를 수득하였다:
Figure pct00014
3-(1-(1-(4-((6-아미노-8-히드록시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-푸린-9-일)메틸)페닐-1-옥소-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-데카옥사-2-아자테트라트리아콘탄-34-일)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)프로파노산 (도 1, 화합물 8 참조)의 합성. 화합물 7 (0.218 g, 0.251 mmol) 및 4-펜티노산 (0.074 g, 0.753 mmol)을 1:1 t-부탄올:H2O (3 ml)에 용해시켰다 (도 1, 반응 단계 (g) 참조). 1:1 t-부탄올:H2O (1 ml) 중의 나트륨 아스코르베이트 (0.02 g, 100 mmol) 및 Cu(OAc)2 (0.009 g, 50 mmol)를 상기 반응 혼합물에 서서히 가하고, 화합물 7이 TLC에 의해 완전히 반응될 때까지 실온 하에 교반시켰다. 생성물을 DCM (10 ml) 및 H2O (10 ml)로 추출시키고, 유기 상을 MgSO4 상으로 건조시켜 0.230 g의 유백색 오일을 95% 수율로 수득하였다. HPLC 상에서의 체류 시간 = 11.5분. 이로써 생성된 생성물 상에서 NMR 분석을 수행하여 다음 결과를 수득하였다:
Figure pct00015
2-(3-(1-(1-(4-((6-아미노-8-히드록시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-푸린-9-일)메틸)페닐)-1-옥소-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-데카옥사-2-아자테트라트리아콘탄-34-일)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)프로판아미도)에틸 2,3-비스(올레오일옥시)프로필 포스페이트 (도 1, 화합물 9 참조)의 합성. 무수 DMF (1 ml) 중의 화합물 8 (96 mg, 0.1 mmol), HATU (42 mg, 0.11 mmol)의 용액에 무수 TEA (2.7 ㎕, 0.2 mmol)를 가하였다. 1:1 DCM:DMF (1 ml) 중의 DOPE (81.4 mg, 0.11 mmol) 용액을 상기 반응 혼합물에 적가하고, 완료될 때까지 실온 하에 교반시켰다 (도 1, 반응 단계 (h) 참조). 완료되면, 생성물을 진공 하에 증발시킨 다음, DCM 중의 15% MeOH를 사용하여 섬광 크로마토그래피함으로써 단리시켜 155 mg의 유백색 오일을 92% 수율로 수득하였다. 이로써 생성된 생성물 상에서 NMR 분석을 수행하여 다음 결과를 수득하였다:
Figure pct00016
유사한 기술을 이용하여 기타 화합물을 합성하였다 (예를 들어, 표 2에 제시된 화합물). 예를 들어, 4-((6-아미노-8-히드록시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-푸린-9-일)메틸)-N-헥사데실벤즈아민 (화합물 1 Z7) 및 4-((6-아미노-8-히드록시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-푸린-9-일)메틸)-N,N-디헥사데실벤즈아민 (화합물 1 Z9)을 도 1에서 화합물 6을 제조하기 위해 상기 언급된 바와 같이 제조 및 정제하였는데, 단 각각의 일치환된 및 이치환된 헥사데실아민을 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 대신 사용하였다. ESI-MS (양성 이온 방식; C32H50N6O4 m/z [M+1]에 대한 질량 계산치는 582.78임)를 이용하여 화합물 1 Z7에 대한 질량 583.7을 관찰하였다. ESI-MS (양성 이온 방식; C48H82N6O4 m/z [M+1]에 대한 질량 계산치는 807.20임)를 이용하여 화합물 1 Z9에 대한 질량 808.2를 관찰하였다.
바이오티닐화 유도체 N-(4-((6-아미노-8-히드록시-2-(2-메톡시에톡시)-9H-푸린-9-일)벤질)-5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미드 (화합물 1 Z18)를 아미노메틸 유도체 (1 V184)로부터 제조하였고, 이를 상기 언급된 바와 동일한 과정을 이용하여 비오틴과 접합시켰다. ESI-MS (양성 이온 방식; C26H34N8O5S m/z [M+1]에 대한 질량 계산치는 570.66임)를 이용하여 질량 571.5를 관찰하였다.
실험적 방법
시험관내 방법
사이토킨 유도의 시험관내 측정은 마우스 백혈병 단구 대식 세포주 RAW264.7을 이용하여 수행하였다. Raw264.7 마우스는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD))으로부터 수득하였고, DMEM 완전 배지 [10% 열 불활성화 태아 송아지 혈청, 2 mM L-글루타민 및 100 U/ml 페니실린/100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 보충시킨 둘벡코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium; 공급처; Irvine Scientific, Irvine, CA)]에서 배양하였다. BMDM은 문헌 ([Wu, C.C et al., (2007) "Immunotherapeutic activity of a conjugate of a Toll-like receptor 7 ligand", Proc Natl Acad Sci U S A 104, 3990-5] 참조)에 기재된 바와 같이 C57BL/6 및 TLR7 결핍성 마우스로부터 제조하였다.
일반적으로, RAW264.7 세포 또는 BMDM을 37℃, 5% CO2 하에 18시간 동안 각종 농도의 접합체와 함께 항온 배양하고, 배양 상등액을 수집하였다. 이러한 상등액 중의 사이토킨 (IL-6, IL-12 또는 TNF-α) 수준을 ELISA (공급처: BD Biosciences Pharmingen, La JoIIa, CA)에 의해 결정하였고 (문헌 [Cho, H.J et al., "Immunostimulatory DNA-based vaccines induce cytotoxic lymphocyte activity by a T-helper cell-independent mechanism" [see comments], Nat Biotechnol 18, 509-14 (2000)] 참조), 그 결과를 도 2a-d에 제시하였다. 데이터는 세 번 되풀이한 결과치의 평균 ± SEM이고, 3가지 독립적인 실험을 표시한다. 이들 사이토킨의 최소 탐지 수준은 15 pg/ml였다.
대략 1 x 106/ml RAW 264.7 세포를 상기 언급된 바와 같이 각종 접합체 또는 대조군과 함께 항온 배양함으로써 TNFα 수준을 측정하였다 (도 2a 참조). 0.5 x 106/ml BMDM을 상기 언급된 바와 같이 각종 접합체 또는 대조군과 함께 항온 배양함으로써 IL-6 및 IL12 수준을 측정하였다 (도 2b-d 참조). 접합체를 스톡 용액으로서 제조하고 (SM, 및 화합물 (6), (8) 및 (9)의 경우, 10 ㎛이고, 화합물 (4a)의 경우에는 0.1 ㎛임), 이로부터 일련의 희석물 (1;5)을 제조하였다.
BMDM을 또한 사용하여 본원에 기재된 합성 도식을 이용하여 합성된 TLR7 접합체의 내독소 오염 수준을 평가하였다. C3H/HeJ (LPS 비반응성 돌연변이체) 또는 C3H/HeOuJ (야생형)으로부터 유래된 0.5 x 106/ml BMDM을 TLR7 접합체 (10 μM SM, 0.1 μM 화합물 4a, 10 μM 화합물 6, 10 μM 화합물 8 또는 10 μM 화합물 9)와 함께 18시간 동안 항온 배양하였다. 배양 상등액 중의 IL-6 또는 IL-12 수준을 ELISA에 의해 측정하고, 그 결과를 도 2b에 제시하였다. 각각의 TLR7 접합체는 TLR4 돌연변이체와 야생형 마우스 둘 다에서 유사한 수준의 IL-6을 유도시켰는데, 이는 이들 접합체의 LPS 오염이 최소라는 사실을 나타낸다.
인간 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 문헌 ([Hayashi, T et al., "Enhancement of innate immunity against Mycobacterium avium infection by immunostimulatory DNA is mediated by indoleamine 2,3-dioxygenase", Infect lmmun 69:6156-64, (2001)] 참조)에 기재된 바와 같이, 더 산 디에고 블러드 뱅크 (The San Diego Blood Bank; San Diego, CA)로부터 구입한 인간 연막으로부터 단리시켰다. PBMC (1 X 106/ml)를 37℃, 5% CO2 하에 18시간 동안 각종 농도의 TLR7 접합체와 함께 항온 배양하고, 배양 상등액을 수집하였다. 이러한 상등액 중의 사이토킨 (IL-6, TNF-α 또는 IFNα1) 수준을 루미넥스 비드 (Luminex bead) 검정 (공급처: Invitrogen, Carlsbad, CA)에 의해 결정하였고, 그 결과를 도 3a-b에 제시하였다. 데이터는 세 번 되풀이한 결과치의 평균 ± SEM이고, 3가지 독립적인 실험을 표시한다. IL-6, TNF-α 및 IFNα1의 최소 탐지 수준은 각각 6 pg/ml, 10 pg/ml 및 15 pg/ml였다.
생체내 방법
TLR7 접합체에 의한 프로-염증성 사이토킨 유도의 약동학은 6주 내지 8주생 C57BL/6 마우스를 이용하여 조사하였다. 이 마우스에게 TLR7 효능제 및 그들의 접합체를 정맥내 주사하였다 (마우스 1마리당 40 nmol 화합물 (4a) 또는 200 nmol SM 및 화합물 (6), (8), 또는 (9)). 주사 후 2, 4, 6, 24 또는 48시간에 혈액 샘플을 수집하였다. 혈청을 분리하고, 사용할 때까지 -20℃ 하에 유지시켰다. 혈청 중의 사이토킨 (예를 들어, IL-6 및 TNF-α) 수준은 루미넥스 비드 미소검정에 의해 측정하였고, 그 결과를 도 4a-b에 제시하였다. 데이터는 5마리 마우스의 평균 ± SEM이고, 2가지 독립적인 실험을 표시한다. IL-6 및 TNF-α의 최소 탐지 수준은 각각 5 pg/ml 및 10 pg/ml였다.
TLR7 접합체에 의한 면역학적 반응 개시 (예를 들어, 아주반트성)를 또한 조사하였다. C57BL/6 마우스 군 (n=5)을 0일 및 7일째에 각종 TLR7 접합체의 대략 10 nmol과 혼합된 20 ㎍ 오브알부민 (OVA)으로 피하 면역시켰는데, 10 nmol이 접합체의 TLR7 부분에 대한 투여량 표적이고, 실제 량은 각 접합체의 실제 화학식에 좌우될 것이다. TLR9-활성화 면역자극성 올리고뉴클레오티드 서열 (ISS-ODN; 1018)을 Th1 유도성 아주반트에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다 (문헌 [Roman, M et al., Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1-promoting adjuvants (1997), Nat Med 3:849-54] 참조). 0, 7, 14, 21, 28, 42 및 56일째에 혈청을 수집하였다. 염수로 면역시켰거나 비히클과 혼합된 OVA로 면역시킨 마우스가 대조군으로서 제공되었다. 56일째에 마우스를 희생시키고, 비장 세포 및 조직학적 슬라이드의 제조를 위해 비장을 수거하였다. 대략 200 마이크로리터의 2.5 x 106/ml 비장 세포 스톡을 총 용적 200 ㎕의 RPMI 1640 완전 배지 [10% 열 불활성화 FCS, 2 mM L-글루타민, 및 100 U/ml 페니실린/100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 보충시킨 RPMI1640 (공급처: Irvine Scientific, Irvine, CA)]로 환저 조직 배양 미세역가 판 내로 세 번 되풀이 하여 등분하고, 100 ㎍/ml OVA 또는 배지 단독으로 다시 자극하였다. 일부 실험에서는, 염증이나 국소 반응 징후를 알아보기 위해 면역 후 24시간에 주사 부위를 조사하였다. 마우스를 대상으로 하여, 면역에 대한 잠재적 "질병" 반응의 측정치로서 활성에 관하여 관찰한 다음, 매주 체중을 쟀다. 비장 수거 이외에도, 폐, 간, 심장 및 신장을 56일째에 또한 수집하고, 10% 완충 포르말린 (공급처: Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)에 고정시킨 다음, 파라핀에 봉매시켰다. 5 ㎛ 두께의 박편을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색시키고, 현미경으로 평가하였다.
IgG 아부류 (및 일부 실시양태에서는 구체적으로 IgG1 및 lgG2)의 항-OVA 항체를 문헌 ([Cho, H.J et al., "Immunostimulatory DNA-based vaccines induce cytotoxic lymphocyte activity by a T-helper cell-independent mechanism" [see comments], Nat Biotechnol 18, 509-14 (2000)] 참조)에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 측정하고, 그 결과를 도 5a 및 5b에 제시하였다. 각 ELISA 판은 표준 곡선을 생성시키기 위해 기존에 정량화된 혈청의 적정을 함유하였다. 이러한 표준의 역가는 배경의 두배가 되는 흡광도 판독치를 제공하는 가장 높은 혈청 희석도로서 계산하였다. 각종 혈청 샘플을 1:100 희석도 하에 시험하였다. 그 결과는 표준 혈청의 단위/ml를 기준으로 하여 계산된 단위/ml로 표현하였고, 각 군의 5마리 동물의 평균 + SEM으로 나타내었다. * 및 T는 비히클과 혼합된 OVA로 면역시킨 마우스와 비교한 1-방식 ANOVA에 의한 P<0.05 및 P<0.01을 각각 의미한다.
수거된 비장으로부터 비장 세포를 제조하였다. 이어서, 비장 세포 배양물 (재자극된 100 ㎍/ml OVA 또는 배지 단독)을 37℃, 5% CO2 하에 항온 배양하고, 72시간 후에 상등액을 수거하였다. 배양 상등액 중의 IFNγ 수준을 제조업자의 지시에 따라서 ELISA (공급처: BD Bioscience PharMingen)에 의해 측정하였고 (문헌 [Kobayashi, H et al., Prepriming: a novel approach to DNA-based vaccination and immunomodulation", Springer Semin lmmunopathol 22:85-96 (2000)] 참조), 그 결과를 도 5c에 예시하였다. 각 군의 평균 총 비장 세포 수를 계산하고, 이를 PBS-면역시킨 군과 비교하여 비장 세포 증식을 모니터링하였다. 데이터는 5마리 마우스의 평균 ± SEM이고, 3가지 독립적인 실험을 나타낸다.
TLR7 접합체의 가능한 부작용에 관한 평가를 3배 분석에 의해 수행하였다 (주사 면적과 처리된 마우스의 일반적인 총체적 건강 및 행위 모두를 가시적으로 평가하고, 총 비장 세포를 계수하며, 조직학적으로 검사한다). C57BL/6 마우스를 TLR7 접합체, 비히클 또는 대조군 효능제 (올리고뉴클레오티드 서열 ISS-ODN)과 혼합된 20 ㎍ OVA로 면역시켰다. 56일째에, 마우스를 희생시키고, 총 비장 세포 수를 계수하며, 그 결과를 도 6a에 제시하였다. 비장을 수집하고, 도 6b에 도시된 바와 같이 조직학적 검사용으로 제출하였다 (배율 인자 = 100 x). 도 6c에 도시된 바와 같이 주사한 지 24시간 후에 주사 부위 피부를 검사하였다. OVA + TLR7 접합체로 면역시킨 마우스와 OVA 단독으로 면역시킨 마우스 간에는 계수된 비장 세포 수에 있어 유의적 차이가 없었다 (도 6a 참조). TLR7 접합체와 혼합된 OVA로 면역시킨 마우스로부터의 비장을 조직학적으로 조사한 결과, 백색 속질의 어떠한 붕괴도 관찰되지 않았거나 적색 속질 상의 세포충실성도 증가하지 않았다 (도 6b 참조). 주사 부위 피부는 가시적인 발적이나 녹내장성 반응을 나타내지 않았다 (도 6c 참조).
화합물 (8)을 이용한 치료 효능은 처리된 마우스의 복막을 침입하는 호중구의 수 감소를 측정함으로써 평가하였고, 또한 유도된 실험적 자가면역성 뇌척수염 (EAE)에 대한 효과에 의해 평가하였다. 복막 호중구 침윤 저하는 C57BL/6 마우스를 50 nmole의 자유 약리작용단 (1V136) 또는 화합물 (8)의 정맥내 주사액 (i.v.)으로 3일 동안 처치함으로써 측정하였다. 마지막 화합물 주사 후 18시간에 2 ml 3% 티오글리콜레이트 (TG)를 복강내 (i.p.) 주사하여 호중구 동원을 유도시켰다. TG 주사한 지 4시간 후에 복막 세포를 수집하였다. 총 세포를 혈구측정기에 의해 계수하고, 호중구를 형태학적으로 확인하였다. 그 결과를 도 7a 및 7b에 제시하였다.
실험적 자가면역성 뇌척수염 (EAE)에 대한 화합물 (8)의 효과는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG)로 처치한 C57BL/6 마우스를 이용하여 결정하였다. MOG는 희소돌기아교세포 세포 표면 및 미엘린 초 (sheath)의 최외 표면 상에서 발현된 막 단백질이다. MOG는 파괴될 경우에, 예를 들어 다발성 경화증과 연관된 증상과 유사한, 신경세포의 탈수초화를 특징으로 하는 질병을 발생시킬 수 있는 자가-항원 단백질이다. MOG는 설치류에서 고도로 뇌염유발성이고 강력한 T 및 B 세포 반응을 유도시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. EAE는 중추 신경계 (CNS)의 염증성 탈수초화 질병이고, 인간 CNS 탈수초화 질병 (이에는 다발성 경화증 및 급성 파종성 뇌척수염 (ADEM)이 포함된다)의 동물 모델로서 광범위하게 연구되고 있을 뿐만 아니라 유용한 뇌 염증 연구이다.
MOG (또는 MOG 펩티드)를 이용한 처치를 사용하여 EAE를 유도시킬 수 있다. 마우스를 MOG 단백질로 6일 동안 처치하였다. 6일째부터 계속해서 (도 8 참조), 50 nmole의 화합물 (8) 또는 PBS를 매일 정맥내 (i.v.) 주사하였다. EAE 임상 스코어를 탈수초화에 대한 임상적 계량치로서 사용하고, 가시적으로 결정하였다. 도 8에 표시된 바와 같이 화합물 (8) 처리 11일 내지 17일째에 통계상 유의적 임상 스코어가 관찰되었다 (이들 위에 *가 표시된 데이터 점 참조).
일부 실험에서는 통계적 평가를 수행하여, 관찰된 결과의 통계적 유의성을 결정하였다. 회귀 분석을 포함한 통계적 분석을 위해, 통계적 소프트웨어 패키지 (Prism 4.0, GraphPad, San Diego CA)를 사용하였다. 데이터를 플롯하고 비-선형 회귀에 의해 고정하여, 군 간에 균일한 표준 편차를 수반한 가우스 분포를 추정하였다. 아주반트성 실험에서는, 군 간의 통계적 차이를 본페로니 (Bonferroni) 후-시험을 수행하는 2-방식 ANOVA에 의해 분석하여 대조군 마우스와 OVA로 면역시킨 마우스와 비교하였다. P<0.05 값이 통계상 유의적인 것으로 간주되었다.
결과 및 논의
화학적 합성
화합물 (1)로부터 화합물 (4)를 합성하면 5:1의 UC1V150 대 MSA 단백질의 일관된 접합 비가 산출되었다 (문헌 [Wu, C.C et al., "Immunotherapeutic activity of a conjugate of a Toll-like receptor 7 ligand", Proc Natl Acad Sci U S A 104, 3990-5 (2007)] 참조). 화합물 (1)의 9-벤질니트릴의 염기성 가수분해 (도 1, 반응 단계 (d))는 다양한 벤조산 관능기 (화합물 (5))를 제공하였고, 접합체 (6), (8) 및 (9)의 어셈블리를 허용해준다. 이러한 벤조산을 무수 DMF 중의 TEA의 존재 하에 HATU로 활성화시킴으로써 DOPE와 커플링시켜 (도 1, 반응 단계 (e)) 화합물 6을 58%의 수율로 수득하였다.
시험용으로 적합한 용매 중에 화합물 (6)을 용해시키는 것이 곤란하기 때문에, PEG 스페이서를 커플링시켜 개선된 용해도를 제공하였다. 무수 DMF 중의 TEA의 존재하에 HATU로 활성화시킴으로써, 용이하게 입수 가능한 아민/아지드 이관능성 PEG를 벤조산과 커플링시켰다 (화합물 (7)을 생성시키는 도 1, 반응 단계 (f) 참조). 4-펜티노산을 이용한 구리 (I)-촉매된 아지드-알킨 시클로부가 반응을 통하여 1,2,3-트리아졸을 형성시켜 (도 1, 반응 단계 (g)) 화합물 (8)을 95% 수율로 수득하였다. 최종적으로, DOPE를 이용한 HATU 활성화 아미드 형성 (도 1, 반응 단계 (h)) 및 화합물 (8)에 의해 화합물 (9)을 제조하였다.
지질- 접합된 TLR7 효능제에 의한 사이토킨 유도의 시험관내 측정
마우스 혈청 알부민과 공유적으로 커플링된 경우에 TLR7 효능제 화합물 (4a)은 접합되지 않은 약물 (SM)과 비교해서 시험관내 및 생체 내에서의 사이토킨 유도에 있어서 10배 또는 그 초과의 효력을 나타내었다 (문헌 [Wu, C.C et al., "Immunotherapeutic activity of a conjugate of a Toll-like receptor 7 ligand", Proc Natl Acad Sci U S A 104, 3990-5 (2007)] 참조). 유사한 검정을 이용하여, 뮤린 대식 세포주, RAW264 및 일차 골수 유래된 대식 세포 (BMDM)를 사용하여 지질-TLR 효능제 접합체 (도 1, 화합물 6), PEG-TLR7 효능제 접합체 (도 1, 화합물 8) 및 PEG-지질 (도 1, 화합물 9) 접합체의 시험관내 효력을 비교하였다. 각각의 세포를 18시간 동안 일련의 희석된 TLR7 접합체로 자극하고, 배지 중에 방출된 사이토킨의 수준을 ELISA에 의해 측정한 다음, 이를 접합되지 않은 TLR7 효능제 (SM)와 비교하였다 (도 2a, 패널 a-d 참조).
화합물 (4a) (예를 들어, TLR7-MSA 접합체)은 기존에, 접합되지 않은 효능제와 비교해서 사이토킨 유도인자로서 100배 더 강력한 것으로 밝혀진 반면, 지질-TLR7 접합체는 접합되지 않은 효능제의 몰 수준으로 표준화시킨 경우에 10배 더 강력한 것으로 밝혀졌다. PEG-TLR7 접합체 (화합물 8)가 접합되지 않은 TLR7 (SM)과 비교해서 덜 강력한 것으로 밝혀지긴 하였지만, 지질을 PEG-TLR7 접합체와 접합시키면 (지질PEG-TLR7) (화합물 9) 그들의 효력이 접합되지 않은 TLR7 (SM)과 유사한 수준으로 복원되었다. 접합된 형태의 가장 높은 수준 하에서, TLR7 접합을 수반하지 않는 MSA, 지질 또는 PEG의 실질적으로 유사한 농도를 음성 대조군으로서 사용하였고, 이는 RAW264.7 세포 및 BMDM 각각에서 최소한의 사이토킨 수준을 유도시키거나 사이토킨 수준을 전혀 유도시키지 못하였다 (데이터는 제시되지 않음).
접합된 형태의 TLR7 효능제가 비-TLR7 대식 세포 자극과는 반대로 대식 세포 자극만을 유도시켰는 지를 평가하기 위해, 야생형 및 TLR7 결핍성 마우스 (TLR7-KO 또는 녹아웃 (knock out) 마우스)로부터 유래된 BMDM을 화합물 (4a), (6), (8), (9) 및 SM으로 처리하였다. 화합물 (4a), (6), (8), (9) 및 SM은 IL-12 및 IL-6을 거의 또는 전혀 유도시키지 못한 반면, 이들 접합체는 야생형 BMDM에서 활성이었는데, 이는 효능제 활성이 이들 접합체의 TLR7 활성에 기인하였다는 것을 나타낸다 (도 2c-d 참조). 내독소 평가 (도 2b 및 상기 언급됨)는 효능제 활성이 이들 접합체의 TLR7 활성에 기인하였다는 결론을 추가로 뒷받침해주었다 (예를 들어, 생성된 IL-6 수준에 있어 유의적 통계 차이가 전혀 없다).
인간 세포에서 면역학적 활성을 추가로 연구 조사하기 위하여, 3명의 공여자로부터의 인간 PBMC를 TLR7 접합체로 처리하고, IL-6 및 IFNa1의 수준을 루미넥스 검정에 의해 결정하였다 (도 3a-b). TLR7과 접합된 인간 혈청 알부민 (HSA)(4b)을 본 실험에서 MSA-접합체 (4a) 대신 사용하였다. TLR7 접합체 효력 상태는 뮤린 대식 세포에서 관찰된 상태와 유사하였다 ((4b)>(6)> (9)>/=SM>(8)) (도 3a). 화합물 효력에 있어 일관된 경향이 모든 공여자로부터의 PBMC에서 관찰되었다. 화합물 (4a)와는 달리, 화합물 (4b) (예를 들어, TLR7-HSA 접합체)는 인간 PBMC에서 최소 수준의 IFNa1을 유도시켰다 (3명의 공여자에서 관찰됨) (도 3b).
TLR 접합체에 의한 프로-염증성 사이토킨 유도의 생체내 역학
TLR7 접합체의 생체내 면역학적 특성을 비교하기 위하여, C57BL/5 마우스에게 TLR7 효능제 접합체를 정맥내 투여하고, 혈청 중의 프로-염증성 사이토킨의 역학을 연구 하였다 (도 4a 및 4b). 기존의 연구를 기초로 하여 (문헌 [Wu, C.C et al., Proc Natl Acad Sci U S A 104, 3990-5 (2007)] 참조), 화합물 (4a)을 화합물 SM, (6), (8) 및 (9) (동물당 200 nmol) 보다 더 낮은 농도 (동물당 40 nmol)로 사용하였다. 모든 TLR7 접합체에 대해 주사 후 2시간째에 TNFα 및 IL-6의 최대 유도가 관찰되었다 (각각 도 4a-b). 접합되지 않은 TLR7 (SM)에 의해 유도된 사이토킨 수준은 2시간 후에 신속하게 낮아졌다. 화합물 (4a), (6), 및 (9)에 의한 사이토킨 유도는 6시간 이하 동안 지속되었다. 화합물 (8)은 단지 저 수준의 IL-6을 유도시켰고 (도 4b 참조), 주사 후 어느 시점에서도 TNFα의 유의적 유도가 없었다 (도 4b 참조). 염수, MSA 또는 DOPE를 투여한 대조군 마우스로부터의 혈청은 탐지 가능한 사이토킨 수준을 거의 또는 전혀 나타내지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
지질- TLR7 접합체는 신속하고도 장기 지속되는 체액성 반응을 증진시킨다
아주반트성의 효율은 백신이 유도시키는 항원-특이적 IgG, 특히 IgG1 및 IgG2의 수준과 이소형을 측정함으로써 평가하였다 (문헌 [Mosmann, T. R., and Coffman, R. L., 'TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties', Annual Review Immunology 7:145-73 (1989)] 참조). C57BL/6 마우스 군 (군당 5마리 동물)을 TLR7 접합체와 혼합된 OVA (오브알부민)로 피하 면역시켰다. ISS-ODN을 강력한 Th1 아주반트 양성 대조군으로서 사용하였다. 염수 또는 OVA + 비히클 (0.1% DMSO)로 면역시킨 마우스를 음성 대조군으로서 사용하였다. OVA-특이적 IgG1 및 IgG2a 혈청 유도 역학을 0, 7, 14, 21, 28, 42, 및 56일째에 ELISA에 의해 모니터링하였다 (도 5a-b). 화합물 (4a) 또는 화합물 (6)과 혼합된 OVA로 면역시킨 마우스에서는 14일 정도로 이른 시기에 IG 아부류의 항체 유도가 관찰되었다 (도 5a 참조). OVA/화합물 (6) 혼합물로 면역시킨 마우스에서는 항-OVA IgG2a 수준이 지속적으로 증가한 반면, OVA/화합물 (4a) 혼합물로 면역시킨 마우스에서는 상기 수준이 연속해서 떨어졌다 (도 5a에 예시된 바와 같음). 이들 데이터는 화합물 (4a) 또는 (6)과 조합된 OVA로 면역시킨 마우스의 비장 세포에 의해 OVA-특이적 IFNγ 분비가 증강된 것과 일치한다 (도 5c 참조).
부작용의 생체내 평가
TLR7 효능제 (SM)는 마우스에서 식욕 부진 효과와 체온 저하를 유도시켜 (문헌 [Hayashi, T et al., "Mast cell dependent anorexia and hypothermia induced by mucosal activation of Toll like Receptor 7", Am J Physiol Regul lntegr Comp Physiol 295, R123-32 (2008)] 참조), 마우스에서 체중 손실을 유발시킬 수 있다. 따라서, 실험적 프로토콜의 일부로서, 지질-TLR7 효능제 접합체로 면역시킨 마우스의 체중과 피부 반응 (주사 부위에서)을 모니터링하였다. 마우스에서 식욕 부진 반응을 유도시킨 접합되지 않은 TLR7 효능제 (SM)의 최소 용량은 점액 투여시 마우스당 50 nmole였다 (문헌 [Hayashi, T et al., Am J Physiol Regul lntegr Comp Physiol 295, R123-32 (2008)] 참조). 아주반트 실험을 위한 용량 (마우스당 10 nmole)을 선택하여 TLR7 효능제에 의해 유발된 질병 반응을 피하였다. 화합물 (6)과 혼합된 OVA로 면역시킨 마우스의 평균 체중과 염수를 주사한 마우스의 평균 체중 간에는 유의적 차이가 전혀 관찰되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
TLR7을 만성 투여하면, 골수성 세포 증식이 유도될 수도 있다 (문헌 [Baenziger, S et al., "Triggering TLR7 in mice induces immune activation and lymphoid system disruption, resembling HIV-mediated pathology", Blood 113: 377-388 (2009)] 참조). 비장 세포의 총 수를 비장 골수성 세포 증식의 지표로서 계산하였다 (도 6a 참조). OVA, TLR7 효능제 접합체 및 염수 대조군으로 면역시킨 마우스 간에는 비장 세포의 총 수에 있어 유의적인 차이가 없었다 (도 6b 참조). TLR7 효능제와 혼합된 OVA로 면역시킨 마우스로부터의 비장을 조직학적으로 조사한 결과, 백색 소질의 구조적 붕괴가 없었고 적색 소질 상의 세포충실성도 증가하지 않은 것으로 밝혀졌다 (도 6b 참조). 부가적으로, 각 군으로부터 수집한 간, 폐, 심장 및 신장 샘플을 조직학적으로 조사한 것에서는 유의적 차이가 관찰되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 또한, 지질-TLR7 접합체를 주사한 부위에서 또는 부위 근처에서는 육안으로 가시적인 발적이나 녹내장성 반응이 없었다 (도 6c 참조).
티오글리콜레이트 (TG)가 백혈구 및 대식 세포를 염증 부위로 동원시키기 위한 유발 작용제로서 사용될 수 있다. 감염이나 염증에 반응하여, 호중구는 전형적으로, 감염이나 염증 부위에 도달하는 첫 번째 과립구 세포 유형이다. 따라서, 티오글리콜레이트로 처리하면, TLR7 접합체의 투여와 연관된 잠재적 부작용을 결정하는 데에 유용할 수 있는 많은 면역 반응 세포 유형의 동원이 유발된다. 이들 연구에 사용된 방법은 마우스를 3일 동안 각종 TLR7 접합체 화합물로 전처리시킨 다음, 마지막 TLR7 접합체 처리 후 18시간째에 2 ml의 3% 티오글리콜레이트 용액을 주사하는 것이었다. TG 주사한 지 4시간 후에, 총 복막 세포를 수거하고 계수하였다. 호중구를 형태학적으로 확인하고 계수하였다. 그 결과를 도 7a-b에 제시하였다.
염수로만 처치한 마우스를 음성 대조군으로서 사용하였고, 처치하지 않은 마우스에 대해 동원된 호중구의 총 수 및 총 복막 세포의 기본 수준을 확립시켰다. TG (염수 중)로 처치하였지만 TLR7 접합체로 전처리시키지 않은 마우스를 동원에 대한 양성 대조군으로서 사용하였는데, 대략 5x106개 총 세포가 복막으로 동원되었고, 그 중 대략 90%가 호중구였다 (5x106개 총 세포 중에서 4x106개 초과가 호중구임). TLR7 자유 약리작용단 (1V136) 또는 TLR7 접합체 (1V282, 화합물 (8))로 전처리시킨 마우스는 동원된 총 세포와 동원된 호중구 둘 다에 있어 감소를 나타냈는데, 이는 자유 약리작용단 또는 화합물 (8)을 이용한 처리가, 백혈구, 과립구 및 대식 세포가 반응하는 염증/감염 반응 수준을 감소시킬 수 있지만, 동원된 세포 유형의 분포도 (예를 들어, 각 세포 유형의 상대적 양)에 대해서는 거의 또는 전혀 영향을 미칠 수 없다는 것을 나타낸다. 따라서, 자유 약리작용단 및 화합물 (8)은 TG와 비교해서 부가의 부작용 (예를 들어, 상기 언급된 바와 같은 질병 반응)을 전혀 나타내지 않으며, 백혈구, 과립구 및 대식 세포 동원을 저하시킬 수 있다.
MOG 단백질을 또한 사용하여, 상기 언급된 바와 같은 각종 TLR7 접합체의 잠재적 부작용을 평가하였다. 결과 평가는 MOG 유도된 EAE와 연관된 각종 증상 (예를 들어, 뇌 염증, 신경 세포의 탈수초화 등)을 관찰함으로써 이루어졌다. 증상의 중증도는 "임상 스코어"로서 기록하였고, MOG 처리 개시 6일 후에, 처리하지 않은 마우스 (PBS)와 화합물 (8)로 처리한 마우스 간을 비교하였다 (도 8 참조). 임상 스코어 상의 통계상 유의적 차이는 11일 내지 17일 위에 *로 표시하였다. 화합물 (8)로 처리하면, 11일과 17일 사이에 EAE 증상의 중증도가 상당히 저하되었을 뿐만 아니라 8일째에 시작하여 11일까지 조사된 두 라인의 기울기 상의 차이로써 표시된 바와 같은 증상 중증도 상의 초기 증가가 감소되었다. 따라서, 화합물 8은 부가의 부작용 (예를 들어, 상기 언급된 바와 같은 질병 반응)을 전혀 유발시키지 않고, MOG 유도된 EAE와 연관된 증상의 중증도를 감소시킬 수도 있다.
결론
접합되지 않은 TLR7 (SM)은 수용액 중에서 불용성이다. 수-용해도는 약물 확산을 증가시키거나 또는 세포로의 흡수를 증진시킴으로써 약물 이용 효율을 제어하는 데에 있어서 특정 역할을 할 수 있다. PEG화는 약물 용해도를 개선시킬 수 있고, 면역원성을 저하시킬 수 있다 (문헌 [Veronese, F. M., and Mero, A, "The impact of PEGylation on biological therapies", BioDrugs 22, 315-29 (2008)] 참조). PEG화는 또한, 약물 안정성, 즉 혈중 접합체의 체류 시간을 증가시킬 수 있고, 단백질 분해 및 신 배출을 감소시킬 수 있다 (문헌 [Veronese, F. M., and Mero, A, BioDrugs 22, 315-29 (2008)] 참조). TLR7을 PEG (예를 들어, 화합물 (8))과 접합시킨 경우, 용해도는 극적으로 개선된다 (데이터는 제시되지 않음). 그러나, 사이토킨 유도 효력은 변형되지 않은 TLR7 효능제와 비교해서 시험관내 (도 2a, 패널 a 및 b) 및 생체 내에서 (도 4a 및 4b) 약화된다. 시험관내 및 생체내 활성 둘 다는 DOPE (화합물 (9))와의 추가 접합에 의해 복원될 수 있다. 화합물 (9)은 최소 Th1 반응 (IgG2a 수준으로써 표시됨)을 나타내면서 Th2 면역 반응 (IgG1 수준으로써 표시됨)을 유도시킬 수 있다.
TLR7 효능제 접합체 화합물 (4a) (MSA 접합체) 및 (6) (지질 접합체)는 IgG2a 역가의 신속한 상승을 증진시켰다 (도 5a). MSA-TLR7 접합체 (화합물 (4a))로 면역시킨 마우스에서의 IgG2a 수준은 마지막 면역 후 3주째에 떨어진 반면, 지질TLR7 접합체 (화합물 (6))와 혼합된 OVA로 면역시킨 마우스는 지속적이고도 추가로 가속된 수준의 항원-특이적 IgG2a를 나타내었다 (도 5a). 화합물 (4a)이 IgG2a 수준을 유지시키지 못하였지만, 화합물 (4a)과 혼합된 OVA로 면역시킨 마우스에서 비장 세포에 의한 OVA-특이적 IFNγ의 분비는 비교적 고 수준으로 유지되었다 (도 5c). 별개의 면역 프로파일을 제공하는 상이한 부분과 접합된 동일한 TLR7 효능제는 별개의 질병 카테고리, 예를 들어 감염 및 자가면역 질환을 치료하기 위한 아주반트의 설계에 유용할 수 있다.
TLR7 효능제의 각종 접합체를 합성하였는데, 이는 생체내 및 시험관내 둘 다에서 별개의 면역학적 프로파일을 갖고 있는 것으로 밝혀졌다. 보고된 TLR7 효능제 접합체의 물리적 특성 상의 다양성으로 인해, 상이한 질병을 치료하는 데에 있어서 보다 광범위하게 적용할 수 있게 된다. 수용성 접합체는 전신 투여 경로를 제공할 수 있다. 지질 함유 접합체는 인접한 면역 세포의 영속적인 자극을 요구하는 국소 투여에 적합할 수 있다 (예를 들어, 감염성 질병에 대한 아주반트의 적용). 지질 부분은 피부 장벽을 통한 약물 침투를 촉진시킬 수 있고, 피부 장애를 치료하는 데에 유익할 수 있다. TLR7 효능제를 지질 또는 PEG 부분과 접합시키는 것은 감염, 암 또는 자가면역 질환의 임상 치료를 확대시키기 위한 전도 유망한 전략일 수 있다.
본원에 제시된 데이터로부터, 화합물 (8)이 특정 조건 하에 길항 활성을 지니고 있다고 결론지을 수 있다. 도 4a-b는 화합물 (8)이 IL-6 또는 TNFα 자극 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않으며, IL-6 또는 TNFα 활성 증가와 통상적으로 연관된 염증 또는 감염 반응의 특정 측면을 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다 (도 7a-b, 및 도 8 참조). 이들 관찰 결과는 길항 활성과 일치한다 (예를 들어, 화합물이 결합할 수는 있지만, 수용체 활성화를 자극하지 않는다).
선천 면역계 세포 상에서의 톨-유사 수용체 (TLR)의 활성화는 항원-특이적 후천성 면역 반응을 개시하고, 증폭시키며, 지시한다. 따라서, TLR을 자극하는 리간드는 잠재적 면역 아주반트를 나타낸다. 본 연구에서는, 강력한 TLR7 효능제를 다양한 벤조산 관능기를 통하여 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 지질 또는 지질-PEG와 접합시켰다. 변형되지 않은 TLR7 효능제와 비교해서, 각 접합체는 시험관내 및 생체 내에서 독특한 면역학적 프로파일을 표시하였다. 마우스 대식 세포 및 인간 말초혈 단핵 세포에서는, 지질-TLR7 접합체가 자유 TLR7 리간드 보다 100배 이상 더 강력하였지만, PEG 및 PEG-지질 접합체의 효력은 자유 형태와 유사하였다. 접합체를 생체 내에서 전신 투여한 경우, 지질 및 지질-PEG TLR7 접합체는 변형되지 않은 TLR7 활성화제와 비교해서 지속된 수준의 혈청중 면역자극성 사이토킨을 제공하였다. 상기 접합체를 백신 접종 동안 아주반트로서 사용한 경우, 지질-TLR7 접합체 만이 지속된 Th1 뿐만 아니라 Th2 항원-특이적 반응을 유도시켰다. 이들 데이터는 TLR7 리간드의 면역자극성 활성이 증폭될 수 있고 접합에 의해 집중될 수 있으므로, 이들 작용제의 잠재적 치료 적용을 잠재적으로 확대시킬 수 있다는 것을 보여준다.
부가의 화합물 및 그의 특성
생물학적 활성
각종 쇄 길이의 PEG와 접합된 TLR7 효능제의 시험관내 활성은 젠블레저셀센서 (GeneBlazerCellSensor) 세포주 NFkB-bla RAW 264.7 (공급처: Invitrogen) 및 일차 마우스 BMDM에 의해 결정하였다. 세포를 각종 농도의 TLR7 효능제 PEG 접합체와 함께 항온 배양하였다. 셀센서 세포주의 NFkB 활성을 제조업자의 지시에 따라서 결정하였다. BMDM을 접합체와 함께 밤새 항온 배양하고, 상등액 중의 IL-6의 수준을 ELISA에 의해 평가하였다. 평가된 EC50은 프리즘 (Prism)을 이용하여 계산하였다.
6, 10, 및 18 PEG 쇄와의 접합체는 NFkB-bla RAW 세포 및 BMDM 둘 다에서 유사한 효력을 나타내었다 (도 9a-d). NFkB-bla RAW 세포를 이용하는 검정에서는, 보다 긴 PEG 쇄를 함유하는 접합체가 NFkB를 활성화시키는 데에 있어 덜 활성이었다 (도 9d-e). 이와는 달리, 보다 긴 쇄의 접합체는 BMDM에 의한 IL-6 분비에 대해 보다 높은 활성을 나타내었다 (도 9d-e). 6 PEG 쇄와의 접합체 내에서는, NH2 말단기를 갖는 접합체가 COOH 또는 N3 말단기를 갖는 접합체 보다 약간 더 높은 활성을 나타내었다 (도 9a).
C57BL/6 마우스에게 100 ㎕ 염수 중의 200 nmole의 각종 TLR7 효능제-PEG 접합체를 주사하였다. 표시된 시점에서 혈청을 수집하였고, 사이토킨 (TNF알파, IL-6, IL-12)의 수준을 루미넥스 비즈 검정에 의해 결정하였다 (도 10a-b). 본 연구에 사용된 모든 화합물은 0.1 내지 0.2% DMSO-염수 용액 중에서 가시적으로 가용성이었다. 자유 TLR7 효능제를 6 PEG 쇄 (1 Z2)와 접합시킨 경우, 그 활성은 감소되었다 (도 10a-b). 보다 긴 쇄를 함유하는 접합체, 예컨대 1 V303 (18 PEG 쇄) 및 1 Z3 (약 47 PEG 쇄)는 접합되지 않은 효능제 (1 V136) 수준에서 사이토킨을 유도시켰다. 대략 271-PEG 쇄를 함유하는 1 Z5는 접합되지 않은 TLR7 효능제 보다 더 높은 수준의 사이토킨을 유도시켰다.
NH2 말단기와 COOH 말단기 간의 생체내 생활성을 비교하기 위해, TLR7 효능제와 접합된 6 PEG 쇄 및 10 PEG 쇄를 이용하였다 (도 10c). NH2 말단 기를 함유하는 1 Z2 및 1 V298은 COOH 말단 기를 함유하는 그들의 상응하는 접합체 보다 비교적 더 높은 수준의 사이토킨 유도를 나타내었다 (도 10c-d).
TLR7 효능제-PEG 접합체의 항염증 효능을 인간 염증성 질환 (혈청 전이 관절염, 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE) (상기 참조) 및 티오글리콜레이트 유도된 복막염)의 마우스 모델에서 시험하였다. 혈청 전이된 관절염의 경우에는 (도 11), C57BL/6 마우스에게 0일째에 K/BxN 혈청을 주사하고, 1 V282를 매일 섭식에 의해 처치하거나 (도 11a) 피하 주사하였다 (도 11b). 1 V282를 매일 투여하면, 피하 처치와 섭식 처치 둘 다에서 발 부종이 저하되었다.
티오글리콜레이트 복막염의 경우에는 (도 12), C57BL/6 마우스에게 1 V282를 3일 동안 정맥내 또는 경구 투여하였다. 마지막 투여 후 1일째에, 마우스에게 2 ml의 티오글리콜레이트 매질을 복강내 주사하였다. 1 V136의 정맥내 및 피하 투여를 양성 대조군으로서 사용하였다.
티오글리콜레이트 주사한 지 3시간 후에, 복막에 대한 호중구 침윤을 평가하였다. 전신 경로와 경구 경로 둘 다에 의한 1 V282의 투여는 복강 내로의 세포 침윤, 특히 호중구 침윤을 저하시켰다.
인간에게서 유형 1 당뇨병은 통상적으로 면역-매개된 손상과 연관된 췌장 β 세포의 특이적 파괴를 특징으로 한다. 화학적으로 유도된 당뇨병 모델을 이용하여, TLR7 효능제-PEG 접합체의 만성 투여가 해당 질병의 중증도 또는 발병을 감소시킬 수 있는 지를 시험하였다. 다수의 소 용량의 스트렙토조토신 (알킬화제)을 사용하였다 (예를 들어, 5일 연속해서 40 mg/kg). 감수성 설치류에서는, 이것이 인간 유형 1 당뇨병에서와 같이 면역 파괴가 특정 역할을 하는 인슐린결핍 당뇨병을 유도시킨다. 기타 관련된 질병에서 관찰된 작용 방식을 기초로 하여, TLR7-PEG 접합체는 상기 질병 과정을 개선시킬 것이다.
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본원에 참조된 각 특허, 특허 출원, 공개 공보 및 문헌의 전문이 참고로 포함된다. 상기 특허, 특허 출원, 공개 공보 및 문헌의 인용이, 전술 내용의 어느 것도 선행 기술 분야와 관련된다는 것을 인정하는 것이 아니고, 또한 이것이 이들 공개 공보 또는 문헌의 내용이나 일자에 관한 어떠한 승인도 되지 않는다.
본 발명의 기본적 측면으로부터 벗어나지 않고서도 전술 내용에 대한 변형이 이루어질 수 있다. 본 발명이 한 가지 이상의 구체적 실시양태를 참고로 하여 상당히 상세하게 기재되긴 하였지만, 당업자는 본 출원에 구체적으로 기술된 실시양태에 대한 변화가 이루어질 수 있지만, 이들 변형 및 개선이 본 발명의 범위 및 요지 내에 있다는 것을 인식할 것이다.
본원에 적합하게 예시적으로 기재된 본 발명은 본원에 구체적으로 기술되지 않은 어떠한 요소(들)의 부재 하에서도 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어 각 경우에 있어 본원에서 용어 "포함하는", "~로 필수적으로 이루어지는" 및 "이루어지는"은 다른 두 가지 용어 중의 어느 하나로 대체될 수 있다. 이용된 용어 및 표현들은 설명의 관점에서 사용된 것이고 이로써 제한되지 않으며, 이러한 용어 및 표현의 사용은 제시되거나 기재된 특징 또는 그의 일부의 모든 등가를 배제하지 않으며, 청구된 본 발명의 범위 내에서 각종 변형이 가능하다. "단수"는 문맥상으로 요소들 중의 1개 또는 요소들 중의 1개 초과가 기재되는지 명백하지 않는 다면, 단수 형태가 수식하는 요소들 중의 1개 또는 복수 개를 지칭할 수 있다 (예를 들어, "시약"은 1개 이상의 시약을 의미할 수 있다). 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 근원이 되는 파라미터의 10% 이내 값 (즉, ± 10%)을 지칭하고, 일련의 수치를 시작할 때의 용어 "약"을 사용하는 것은 각각의 수치를 수식한다 (즉, "약 1, 2 및 3"은 약 1, 약 2 및 약 3임). 예를 들어, "약 100 그램"의 중량에는 90 그램과 110 그램 사이의 중량이 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명이 대표적인 실시양태 및 임의의 특징으로써 구체적으로 기재되긴 하였지만, 본원에 기술된 개념의 변형 및 변동이 당업자에 의해 호소될 수 있고, 이러한 변형 및 변동은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 인지해야 한다.

Claims (34)

  1. 하기 화학식 I에 따른 구조를 갖는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 수화물:
    <화학식 I>
    Figure pct00025

    상기 식에서,
    X는 N 또는 CR2이고;
    R은 -OR1, -SR1, 또는 -NRaRb이며;
    X1은 -O-, -S-, 또는 -NRc-이고;
    Rc는 수소, C1-C10 알킬, 또는 치환된 C1-C10 알킬이거나, 또는 Rc와 R1은 질소 원자와 함께, 헤테로시클릭 고리 또는 치환된 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있으며;
    R1은 각각 독립적으로, 수소, C1-C10 알킬, 치환된 C1-C10 알킬, C1-C10 알콕시, 치환된 C1-C10 알콕시, C1-C10 알킬 C1-C10 알콕시, 치환된 C1-C10 알킬 C1-C10 알콕시, C5-C10 아릴, 치환된 C5-C10 아릴, C5-C9 헤테로시클릭, 치환된 C5-C9 헤테로시클릭, C3-C9 카르보시클릭 또는 치환된 C3-C9 카르보시클릭이고;
    R2는 각각 독립적으로, 수소, -OH, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 치환된 C1-C6 알콕시, -C(O)-C1-C6 알킬 (알카노일), 치환된 -C(O)-C1-C6 알킬, -C(O)-C6-C10 아릴 (아로일), 치환된 -C(O)-C6-C10 아릴, -C(O)OH (카르복실), -C(O)O-C1-C6 알킬 (알콕시카르보닐), 치환된 -C(O)O-C1-C6 알킬, -NRaRb, -C(O)NRaRb (카르바모일), 치환된 C(O)NRaRb, 할로, 니트로, 또는 시아노이며;
    이러한 알킬, 알콕시, 아릴 또는 헤테로시클릭 기 상의 치환기는 히드록시, C1-C6 알킬, 히드록시 C1-C6 알킬렌, 카르복시 C1-C6 알킬렌, C1-C6 알콕시, C3-C6 시클로알킬, C1-C6 알콕시 C1-C6 알킬렌, 아미노, 시아노, 할로겐 또는 아릴이며;
    Ra 및 Rb는 각각 독립적으로, 수소, C1-C20 알킬, C3-C8 시클로알킬, C1-C6 알콕시, 할로 C1-C6 알킬, C3-C8 시클로알킬 C1-C6 알킬, C1-C6 알카노일, 히드록시 C1-C6 알킬, 아릴, 아릴 C1-C6 알킬, Het, Het C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시카르보닐이고;
    Rx는 각각 독립적으로, -X2-((R3)r-(R4)s)p, -C(O)NRaRb, 또는 -CH2NH-비오틴이며;
    X2는 각각 독립적으로, 결합 또는 연결 기이고;
    R3은 각각 독립적으로, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 부분이며;
    R4는 각각 독립적으로, H, -C1-C6 알킬, -C1-C6 알콕시, -NRaRb, -N3, -OH, -CN, -COOH, -COOR1, -C1-C6 알킬-NRaRb, -C1-C6 알킬-OH, -C1-C6 알킬-CN, -C1-C6 알킬-COOH, -C1-C6 알킬-COOR1, 5-6원 고리, 치환된 5-6원 고리, -C1-C6 알킬-5-6원 고리, -C1-C6 알킬-치환된 5-6원 고리, C2-C9 헤테로시클릭, 또는 치환된 C2-C9 헤테로시클릭이고;
    m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이며;
    n은 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
    p는 1 내지 100이며;
    q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
    r은 1 내지 1,000이며;
    s는 1 내지 1,000이고;
    n과 q의 합은 5이다.
  2. 제1항에 있어서, X1이 산소인 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R1이 치환된 C1-C6 알킬인 화합물.
  4. 제3항에 있어서, R1이 C1-C10 알킬 C1-C10 알콕시 부분인 화합물.
  5. 제4항에 있어서, R1이 -CH2CH2OCH3인 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, X2가 아미도 연결 기인 화합물.
  7. 제6항에 있어서, X2가 -C(O)NH-, -NH(O)C-, -C1-C6 알킬-C(O)NH-, -C1-C6 알킬-NH(O)C-, -C(O)NH-C1-C6 알킬-, -NH(O)C-C1-C6 알킬-, -C1-C6 알킬-NH(O)C-C1-C6 알킬-, -C1-C6 알킬-C(O)NH-C1-C6 알킬-, 또는 -C(O)NH-(CH2)t- (여기서, t는 1, 2, 3 또는 4임)인 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, n이 4이고, R2가 각 경우에 있어 수소인 화합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 부분이 약 1 내지 약 1,000 PEG 단위를 포함하는 것인 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 각 PEG 단위가 -O-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-O-인 화합물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, r이 약 5 내지 약 100인 화합물.
  12. 제11항에 있어서, r이 약 5 내지 약 50인 화합물.
  13. 제12항에 있어서, r이 약 5 내지 약 25인 화합물.
  14. 제13항에 있어서, r이 약 5 내지 약 15인 화합물.
  15. 제14항에 있어서, r이 약 10인 화합물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, s가 약 5 내지 약 100인 화합물.
  17. 제16항에 있어서, s가 약 5 내지 약 50인 화합물.
  18. 제17항에 있어서, s가 약 5 내지 약 25인 화합물.
  19. 제18항에 있어서, s가 약 5 내지 약 15인 화합물.
  20. 제19항에 있어서, s가 약 10인 화합물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 PEG 부분이 선형인 것인 화합물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 PEG 부분이 분지된 것인 화합물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, R4 치환기가 각각 독립적으로, H, C1-C2 알킬, -C1-C2 알콕시 (예를 들어, -OCH3), -NRaRb, -OH, -CN, -COOH, -COOR1, -C1-C2 알킬-NRaRb, C1-C2 알킬-OH, C1-C2 알킬-CN, C1-C2 알킬-COOH 또는 C1-C2 알킬-COOR1인 화합물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, m이 1인 화합물.
  25. 제24항에 있어서, R2가 수소이고, n이 4이며, q가 1이고, p가 1이며, r이 약 10이며, s가 1인 화합물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 화합물의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 제약상 허용되는 염이 염산, 브롬화수소산, 황산, 술팜산, 인산 및 질산으로 이루어진 군으로부터 선택된 산을 이용하여 제조되는 것인 제약 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 제약상 허용되는 염이 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 파모산, 말레산, 히드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 술파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 에탄 디술폰산, 옥살산, 및 이세티온산으로 이루어진 군으로부터 선택된 산을 이용하여 제조되는 것인 제약 조성물.
  29. 제26항에 있어서, 제약상 허용되는 염이 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화암모늄, 카페인 및 아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기를 이용하여 제조되는 것인 제약 조성물.
  30. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 제약 조성물을, 자가면역 질환을 예방, 억제 또는 치료하는 데에 유효한 양으로 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에게서 자가면역 질환을 예방, 억제 또는 치료하는 방법.
  31. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 제약 조성물을, 염증 질환을 예방, 억제 또는 치료하는 데에 유효한 양으로 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에게서 염증 질환을 예방, 억제 또는 치료하는 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
  33. 자가면역 장애 또는 질환, 또는 염증 장애 또는 질환의 의학적 요법에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 부분을 통하여 인지질에 접합된 TLR7 효능제를 포함하는 화합물의 용도.
  34. 제33항에 있어서, 화합물이 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 것이거나 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 제약 조성물 중에 존재하는 것인 용도.
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