CN102257156A - 血样中癌细胞的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从血样中检测癌细胞的方法，包括将怀疑存在癌细胞的血样与溶瘤病毒一起培养，使溶瘤病毒至少在上述癌细胞内增殖，将在增殖步骤中处理过的血样与稳定剂和非离子型表面活性剂混合，及从混合步骤获得的血样中检测有溶瘤病毒增殖的癌细胞。

Description

血样中癌细胞的检测方法

技术领域：

本发明涉及一种检测血样中的癌细胞的检测方法。本发明还涉及一种可以在该方法中使用的试剂盒。

背景技术：

通常认为癌的转移是由于原发部位的癌细胞通过血管或***扩散到全身，且该细胞的一部分移入其他部位的脏器等并增殖而引起的。如此在血液中循环的癌细胞被称为CTC(Circulating Tumor Cell，循环肿瘤细胞)。据报告，血液中的CTC数目与癌转移和预后有关，因此，人们认为测定CTC数目对预测转移性癌症的预后及治疗效果有帮助，比如转移性乳腺癌。

众所周知，传统的CTC检测方法是用癌细胞抗体捕捉血液中的癌细胞，用荧光标记抗体等标记捕捉到的癌细胞，然后进行检测(请参照特开2007-178193号(专利文献1)和特表2002-503814号(专利文献2))。

还有一种广为人知的技术，利用的是下述特征：在癌细胞中，端粒酶的活性非常活跃，而在大部分正常细胞中该活性几乎检测不出来。具体而言，该技术是让具有含端粒酶启动子的复制盒和含标记蛋白质(如绿色荧光蛋白质(GFP))基因的标记表达盒的病毒(溶瘤病毒(Oncolytic Virus))在癌细胞内增殖，以此特异性地标记癌细胞(请参照特开2004-33186号(专利文献3)和国际公开第2006/36004号(专利文献4))。

市场上出售的含GFP基因的溶瘤病毒的名称为TelomeScan(注册商标)(OBP-401)。TelomeScan(注册商标)可在癌细胞内特异性增殖，产生GFP，从而可以特异性地使癌细胞发出荧光。

在先技术文献

专利文献

专利文献1：特开2007-178193号公报

专利文献2：特表2002-503814号公报

专利文献3：特开2004-33186号公报

专利文献4：国际公开第2006/36004号手册

发明内容：

发明要解决的课题

像TelomeScan(注册商标)这样的溶瘤病毒对正常血细胞类细胞的感染和增殖率低，且能够在“活着”的癌细胞内特异性增殖，因此，用溶瘤病毒可以检测出血液中的“活着”的癌细胞，即CTC。

然而，要建立用溶瘤病毒检测血液中癌细胞的***还存在着以下要解决的课题。

--去除红细胞：存在于血液中的癌细胞数量极少，癌细胞往往被血液中大量存在的红细胞遮掩，很可能妨碍癌细胞的检测。

--抑制假阳性信号：正常血细胞类细胞中也会有极少量的溶瘤病毒可以增殖的细胞，如白细胞(部分单核细胞和淋巴细胞)。如果溶瘤病毒在这种正常细胞内增殖，就可能给癌细胞检测造成假阳性信号。

解决课题的手段

本发明人为解决这些课题进行了研究，结果发现，用稳定剂和非离子型表面活性剂处理溶瘤病毒增殖的血样，就可去除红细胞，并减少来自正常细胞，如白细胞的假阳性信号，从而完成了本项发明。

因此，本发明提供一种从血样中检测癌细胞的检测方法，其包括以下步骤：

将怀疑有癌细胞存在的血样与溶瘤病毒一起培养，使溶瘤病毒至少在上述癌细胞内增殖，

将在增殖步骤中处理过的血样与稳定剂和非离子型表面活性剂混合，及

从混合步骤获得的血样中检测出溶瘤病毒增殖的癌细胞。

本发明还提供一种检测血样中癌细胞的检测用试剂盒，其包括：含有溶瘤病毒的第一试剂、含有稳定剂的第二试剂和含有非离子型表面活性剂的第三试剂。

发明的效果

采用本发明的方法及试剂盒可以简便、灵敏且准确地检测出血样中存在的微量癌细胞，即CTC。

附图说明：

图1为在实施例1、实施例2、实施例3和比较例1测定的荧光强度图表。

图2(A)为实施例4中使用EMULGEN 2025G作为表面活性剂时的显微镜照片。另外，图中的“WBC”是白细胞的略语。

图2(B)为实施例4中使用NIKKOL BL-9EX作为表面活性剂时的显微镜照片。

图2(C)为实施例4中使用NIKKOL BO-20V作为表面活性剂时的显微镜照片。

图2(D)为实施例4中使用NIKKORL BT-12作为表面活性剂时的显微镜照片。

图2(E)为实施例4中使用EMULGEN 2020G作为表面活性剂时的显微镜照片。

图2(F)为实施例4中使用Nissan Cation AB600作为表面活性剂时的显微镜照片。

图2(G)为实施例4使用Nissan Cation BB作为表面活性剂时的显微镜照片。图中的“RBC”是红细胞的略语。

图2(H)为比较例2获得的显微镜照片。

具体实施方式：

在本发明中，血样中的癌细胞(CTC)不仅是指从固态癌脱落并进入到末梢血中的癌细胞，还包括血液癌，只要是具有端粒酶活性的癌细胞即可，无特别限制。用本实施方式的方法和试剂盒检测出来的CTC无特别限定，但以来源于固态癌的CTC为好，最好是来源于乳腺癌的CTC。

<溶瘤病毒>

在本说明书中所谓“溶瘤病毒”指在正常细胞内通常无法增殖，在活着的癌细胞内可特异性增殖的条件增殖型病毒。

然而，本行业人员都明确地知道，有时造成条件型增殖的结构可能使溶瘤病毒在正常细胞内增殖。即，溶瘤病毒具有可在癌细胞内特异性增殖的结构，如在癌细胞内特异性地表现出启动子活性的启动子，因此可在癌细胞内特异性增殖，但正常细胞中也可能有能使此启动子发挥功能的细胞(如白细胞)。在将溶瘤病毒增殖的细胞作为癌细胞的癌细胞检测方法中，这种正常细胞可能会被作为癌细胞检测出来，因此有可能得出假阳性结果。

但是，本发明的方法是将血样与稳定剂和非离子型表面活剂进行混合，这种处理方法，不对溶瘤病毒增殖的癌细胞产生影响，只对正常细胞进行选择性破坏，从而可以减少该正常细胞可能产生的假阳性信号。

本发明的方法通过上述处理还可以使血样中的红细胞溶血，从而更灵敏地检测出在血样中可能仅微量存在的癌细胞。

在本说明书中，所谓“破坏”细胞是指至少破坏目标细胞细胞膜的一部分，使细胞内成分洗脱。

在本说明书中，所谓“红细胞溶血”指红细胞的细胞膜溶解。

溶瘤病毒无限定，可以是植入了在癌细胞中特异性地表现出启动子活性的启动子的病毒。在癌细胞中特异性地表现出启动子活性的启动子(以下也称“癌细胞特异性启动子”)，比如有人端粒酶启动子、人***癌特异抗原(PSA)启动子、人甲胎蛋白(AFP)启动子、癌胚抗原(CEA)启动子等。在能在多种癌细胞中表现启动子活性这一点上，人端粒酶启动子最理想。其中又以编码人端粒酶逆转录酶的基因——hTERT的启动子最好。

hTERT启动子的核酸序列见序列号1。hTERT启动子可以是序列号1所示全部455bp核酸序列，其中的5’上游的181bp区域被认为是对下游基因表达来说很重要的核心区，因此，只要用至少含有此核心区的核酸序列即可。

上述溶瘤病毒最好能表达标记蛋白质。即上述溶瘤病毒最好具有编码标记蛋白质的基因。在本说明书中，所谓“标记蛋白质”指在细胞内表达，并可以据此将该细胞与没有该蛋白表达的其他细胞区别开的、可检测出来的蛋白质。标记蛋白质可以使用在生化领域常用的标记蛋白质，可以使用绿色荧光蛋白质(GFP)及其突变体(如增强型人源绿色荧光蛋白(Enhanced-humanized GFP(EGFP))、红移GFP(red-shift GFP(rsGFP)))、黄色荧光蛋白质(YFP)、蓝色荧光蛋白质(BFP)等荧光蛋白质。

标记蛋白质最好是绿色荧光蛋白质。

上述标记蛋白质的基因可以置于上述癌细胞特异性启动子的控制下。上述标记蛋白质的基因也可以置于能在溶瘤病毒内表现出启动子活性的启动子的控制之下。

能够控制标记蛋白质基因表达的启动子如有巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40晚期启动子、MMTV LTR启动子、RSV LTR启动子、SRα启动子等。在这其中，标记蛋白质的基因最好置于CMV启动子或hTERT启动子的控制之下。这些启动子的核酸序列是众所周知的。

至少含有编码上述标记蛋白质的基因和使之表达的启动子(癌细胞特异性启动子或可以在溶瘤病毒内显示启动子活性的启动子)的表达盒可以通过常规基因工程学技术获得。比如，根据众所周知的序列，通过聚合酶链式反应(PCR)等扩增编码标记蛋白质的基因和启动子，将获得的各基因的扩增产物连接到适当的质粒，切出必要的部分，即可获得表达盒(请参照国际公开2006/36004号)。

上述溶瘤病毒也可以具有病毒增殖所需基因连接到上述癌细胞特异性启动子下游的复制盒。病毒增殖所需基因如有早期基因(E1A、E1B等)、对小核糖核酸病毒科具有特异性的蛋白质合成初始信号——IRES等。这些基因的核酸序列是众所周知的。

上述复制盒可以通过常规基因工程学技术获得。比如根据众所周知的序列，依照扩增上述癌细胞特异性启动子或需要，通过PCR(聚合酶链式反应)等扩增病毒增殖所需基因，将获得的各基因的扩增产物连接到适当的质粒，切出必要的部分，即可获得复制盒(请参照国际公开2006/36004号)。

上述病毒可以来源于腺病毒、单纯疱疹病毒、仙台病毒、呼肠孤病毒。其中尤其以人腺病毒为宜。

上述溶瘤病毒也可以使用市场上出售的产品。溶瘤病毒最好使用腺病毒中的TelomeScan(注册商标)(OBP-401)(Oncolys BioPharma公司)，它具有包括hTERT启动子、E1A基因、IRES基因和E1B基因的复制盒；以及包括CMV启动子和GFP基因的表达盒。

<增殖步骤>

本发明的方法包括将疑有癌细胞的血样与上述溶瘤病毒一起培养，使溶瘤病毒至少在血样中的癌细胞内增殖的步骤(以下也称“增殖步骤”)。

上述血样一般可采自癌症疑似患者和癌症患者等想要检测癌细胞的存在的受检者。血样可以是全血或对全血进行前处理而获得的处理血，从进一步提高检测效率这方面考虑，以从全血，特别是末梢血去除血清后的样本为好。

从全血去除血清的方法是众所周知的，如可以对加入抗凝剂(乙二胺四乙酸、柠檬酸钠、肝磷脂等)的全血进行离心分离。离心分离最好以500-3500rpm进行3-30分钟。

上述血样和溶瘤病毒的培养最好在动物细胞培养常用的培养基中进行。作为该培养基如有RPMI-1640培养基、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)及最低基础培养基(MEM)等。

上述溶瘤病毒最好按每1ml血样6×10⁴-6×10⁸PFU(蚀斑形成单位)的量与血样进行培养。

至于上述血样与溶瘤病毒进行培养的时间和温度，只要该条件可以使溶瘤病毒至少在血样中的癌细胞内增殖即可，可根据溶瘤病毒的种类适当调节。这种培养条件以25-40℃温度中进行1-36小时为宜，最好是在30-37℃进行12-24小时。

通过上述培养，溶瘤病毒可感染血样中所含癌细胞，并在该细胞内增殖。

然而，血样中的白细胞(单核细胞、淋巴细胞等)也偶尔会表达像端粒酶那样的癌细胞特异性表达的酶。因此，在上述培养后，溶瘤病毒也有可能在这种正常(非癌细胞)白细胞中增殖。

<混合步骤>

本发明的方法包括将上述增殖步骤中处理过的血样与稳定剂和非离子型表面活性剂混合的步骤(以下也称“混合步骤”)。

在混合步骤中，可以将血样与非离子型表面活性剂混合后，再混合稳定剂，也可以混合血样与稳定剂后再混合非离子型表面活性剂，还可以同时混合血样、稳定剂和非离子型表面活性剂。最好的混合顺序是先混合血样和稳定剂，再混合非离子型表面活性剂。

上述血样也可以在与稳定剂和非离子型表面活性剂混合前通过离心分离去除细胞成分以外的成分。

在上述混合步骤中，与血样混合时的非离子型表面活性剂的浓度以不损伤癌细胞只破坏白细胞为宜。这种浓度可根据非离子型表面活性剂的种类适当决定，但以0.003-0.4重量％为宜，最好为0.030-0.037重量％。

本说明书中所谓“与血样混合时的非离子型表面活性剂的浓度”除“血样与非离子型表面活性剂直接混合时的浓度”外，还包括“非离子型表面活性剂混入血样与稳定剂的混合物时的浓度”。即在混合步骤中，当血样和稳定剂混合后再与非离子型表面活性剂混合时，上述浓度表示非离子型表面活性剂在血样、稳定剂和非离子型表面活性剂的混合液中的浓度。

上述非离子型表面活性剂可以是聚氧乙烯型表面活性剂及聚氧化合物的脂肪酸酯型表面活性剂的任何一种，以聚氧乙烯型表面活性剂为宜。聚氧乙烯型表面活性剂如有高级醇·环氧乙烷加成物、烷基酚·环氧乙烷加成物、高级脂肪酸·环氧乙烷加成物、高级脂肪胺·环氧乙烷加成物、高级脂肪酸酰胺·环氧乙烷加成物等。其中尤其以高级醇·环氧乙烷加成物为佳。

高级醇·环氧乙烷加成物的高级醇的烷基可以是直链和支链中的任何一种，以碳数为12～30为佳，最好是15-25。高级醇·环氧乙烷加成物以环氧乙烷的聚合数为15-40为宜，最好是20-30。

更具体而言，高级醇的烷基为支链的高级醇和环氧乙烷加成物如下式(I)所示。

式(I)

(式中，I为6-24的整数，m为1-19的整数，n为15-40的整数。)

非离子型表面活性剂最好是使用高级醇的烷基为支链，碳数为20，环氧乙烷的聚合数为25的聚氧乙烯辛基十二烷基醚(POLYOXYETHYLENEOCTYLDODECYL ETHER)。

在上述混合步骤中，与血样混合时的稳定剂的浓度以可以使得红细胞溶血为宜。这种浓度以1-7重量％为佳，最好是2-4重量％。

在本说明书中，所谓“与血样混合时的稳定剂的浓度”不仅指“血样与稳定剂直接混合时的浓度”，也包括“稳定剂与血样和非离子表面活性剂的混合物混合时的浓度”。即混合步骤中，先混合血样和非离子表面活性剂，再混合稳定剂时，上述浓度表示稳定剂在血样、稳定剂和非离子表面活性剂的混合液中的浓度。

作为上述稳定剂可以使用固化组织常用的使蛋白质交联的物质，如有多聚甲醛、戊二醛、甲醛等醛化合物。其中尤以多聚甲醛为佳。

混合步骤最好在不伤害癌细胞的条件下进行。这种条件最好是pH6-9，渗透压200-400mOsm。

<检测步骤>

本发明的方法还包括检测出混合步骤获得的血样中所含溶瘤病毒增殖了的癌细胞的步骤(以下也称“检测步骤”)。检测步骤最好是检测由于溶瘤病毒增殖而表达的上述标记蛋白质。

检测标记蛋白质的方法可根据标记蛋白质的种类适当选择。当标记蛋白质为荧光蛋白质时，可通过在荧光显微镜下观察和用流式细胞仪进行检测等检测出标记蛋白质。

在荧光显微镜下进行观察时，比如可以用混合步骤中获得的血样以常规方式在载玻片上制作涂片标本，在具备CCD照相机的荧光显微镜下观察涂片标本，检测发出荧光的细胞，并根据需要计数。

用流式细胞仪进行检测时可，以将混合步骤获得的血样放入能检测出荧光的流式细胞仪，检测出发出荧光的细胞，并根据需要计数。

<追加步骤>

本发明的方法还可以包括死细胞染色步骤。加入这种步骤可以检测出“活着”的癌细胞和“死亡”的癌细胞，从而可以计算出血样中的癌细胞存活率。这一步骤最好在将血样与稳定剂和非离子表面活性剂混合之前进行。

染色死细胞的步骤可以通过让特异性染色死细胞的试剂和血样接触来完成。所谓“特异性染色死细胞的试剂”指能区分活着的细胞和死细胞且只对死细胞进行染色的试剂。特异性染色死细胞的试剂可以使用市场出售的试剂盒，比如可固定红死细胞染色试剂盒(Live/Dead Fixable Red Dead CellStain Kit)(英杰生命技术(Invitrogen)有限公司)。

<试剂盒>

本发明还提供检测血样中癌细胞的试剂盒。本发明的试剂盒包括含有上述溶瘤病毒的第一试剂、含有上述稳定剂的第二试剂和含有上述非离子型表面活性剂的第三试剂。

上述第一试剂、第二试剂和第三试剂可以是液态，也可以是在使用时添加适当溶剂就能变成液体的固态。

上述第一试剂以液体形态与血样进行培养时，最好它所带有的溶瘤病毒浓度为平均每1ml血样对应溶瘤病毒6×10⁴-6×10⁸PFU。

上述第二试剂与血样混合时，它所含有的稳定剂的浓度最好可使得红细胞溶血。具体而言，第二试剂与血样混合时，稳定剂浓度以1-7重量％为宜，最好是2-4重量％。先混合血样和第三试剂时，也使第二试剂含有的稳定剂在血样、第二试剂和第三试剂的混合液中达到上述浓度。

上述第三试剂所含非离子表面活性剂的量，最好是不破坏癌细胞但能破坏白细胞的浓度。具体而言，第三试剂与血样混合时，它所含有非离子表面活性剂的量，以浓度达到0.003-0.4重量％为宜，最好是0.030-0.037重量％。当先混合血样和第二试剂时，使第三试剂含有的非离子型表面活性剂在血样、第二试剂和第三试剂的混合液中的浓度达到上述浓度。

上述第二试剂和第三试剂可以包含适当的缓冲剂和渗透压调节剂，以满足与血样混合时不破坏癌细胞的条件。不破坏癌细胞的条件最好是pH 6-9、渗透压200-400mOsm。因此，上述缓冲剂可以使用磷酸生理缓冲液(PBS)、柠檬酸缓冲液和HEPES等。渗透压调节剂可以使用乙二醇、氯化钠等。

实施例

面用实施例进一步详细说明本项发明，但本发明不限于以下实施例。

1.溶瘤病毒在单核细胞成分中增殖的影响

在使用溶瘤病毒检测血样中的癌细胞时，若溶瘤病毒在试样中的单核细胞内增殖，就会将单核细胞作为癌细胞检测出来。

因此，从采自人体的血液中回收单核细胞成分，用本发明的方法对此成分进行处理(用稳定剂和非离子表面活性剂进行处理)，验证了该处理能否降低单核细胞对检测的影响。所谓单核细胞是单细胞和淋巴细胞的总称。

(实施例1)

<单核细胞成分的制备>

用真空采血管(VENOJECT(注册商标)II真空采血管(4.5ml)，含有3.8％柠檬酸钠，泰尔茂株式会社)从二名健康女性身上采集血液。非常小心地将采集后二小时以内的血液5.0ml加入到预先装有5.0ml分离单核细胞用试剂——Polymorphprep(商标)(第一化学药品株式会社)的15ml的离心管中。然后用悬臂旋转器(Swing Rotor)在室温下对离心管进行500×g、30分钟的离心分离。用巴氏吸管(Pasteur pipette)将单核细胞浮游液移至另一离心管，加入等量PBS(-)并进行混合。在室温下以400×g对此液离心分离10分钟后，去上清，获得沉淀的单核细胞。将所得单核细胞在PBS(-)中进行悬浊，并以400×g离心分离10分钟后，去上清，获得单核细胞成分。

<病毒增殖>

在所得单核细胞成分中加入RPMI-1640，混合至10ml。在此加入溶瘤病毒(TelomeScan(注册商标)(OBP-401)，Oncolys BioPharma公司)至最终浓度为6×10⁶PFU/ml，在37℃边旋转边培养24小时。将所得培养液以弱制动以1500rpm离心分离5分钟后，去上清，获得有溶瘤病毒增殖的细胞(以下也称增殖细胞)。

<用稳定剂和非离子表面活性剂进行处理>

向所得增殖细胞中加入与之同体积的4％多聚甲醛(PFA)，室温下静置20分钟。在此，加入体积为增殖细胞和PFA合计体积的2倍的非离子型表面活性剂(EMULGEN 2025G，花王株式会社)的PBS(-)溶液(浓度0.05重量％)并使之悬浊，边搅拌边在40℃下培养5分钟，获得处理试剂。EMULGEN 2025G的结构式如以下式(II)所示。

式(II)

(式中，n为25。)

<制作载玻片及显微镜观察>

以弱制动、1500rpm离心分离所得处理试样5分钟后，去上清，取沉淀物。再将所得沉淀物悬浊于1ml的PBS中。然后以弱制动、1500rpm离心分离所得悬浊液5分钟后，去上清，用细胞离心涂片器(1000rpm、4分钟)制作载玻片。在该载玻片上放上封片剂(荧光封片剂，S3032、丹科(Dako)公司)，再盖上盖玻片，用研究级倒置显微镜(Power IX 71、奥林巴斯株式会社制)在曝光时间20ms、50ms、100ms、200ms及400ms的条件下测定荧光浓度。

再在与上述同样的条件下拍摄具有各不相同的、已知的荧光强度的七种微珠[7峰微珠(7Peaks Beads)(Cyto-Cal多色荧光强度校准仪(Cyto-CalMultifluor Fluorescence Intensity Calibrator)、FC3M、赛默飞世尔科技(Thermo Scientific)公司)]，制作各曝光时间下的检量线。根据所得检量线将来自上述处理试样的荧光信号转为数值。所得结果见图1(No.4及5)。

(实施例2)

除用NIKKOL BO-20V(日本化工品销售株式会社)取代实施例1中的EMULGEN 2025G作为非离子表面活性剂外，其他均与上述同样地制备处理试样。与实施例1同样地从该处理试样制备载玻片，在与实施例1相同的条件下对该载玻片进行荧光强度测定，将荧光信号转为数值。所得结果见图1(No.6)。

(实施例3)

除用EMULGEN 2020G(花王株式会社)取代实施例1中的EMULGEN 2025G作为非离子表面活性剂外，其他均与上述同样地制备处理试样。与实施例1同样地从该处理试样制备载玻片，在与实施例1同样的条件下对该载玻片进行荧光强度测定，将荧光信号转为数值。所得结果见图1(No.7)。另外，EMULGEN 2020G的结构式如以下式(III)所示。

式(III)

(式中n为20。)

(比较例1)

取代实施例1中用稳定剂和非离子表面活性剂进行的处理，用溶血时常用的氯化铵和稳定剂进行处理，验证了单核细胞对检测的影响。

与上述<单核细胞的制备>和<病毒增殖>中同样地获取增殖细胞，并向该增殖细胞中中加入其30倍体积的1％氯化铵溶液进行悬浮，在室温下静置20分钟。再加入2％PFA，在室温下静置20分钟，获得处理试样。

以弱制动方式以1500rpm离心分离所得处理试样5分钟后，去上清，获得沉淀物。将所得沉淀物悬浮于1ml的PBS(-)中。再以弱制动方式以1500rpm离心分离所得悬浮液5分钟后，去上清，用细胞离心涂片器(1000rpm、4分钟)制作载玻片。在该载玻片上放上封片剂(荧光封片剂，S3032、Dako公司)，盖上盖玻片后，在实施例1的条件下测定荧光强度，并将荧光信号数值化。

阳性对照使用的是乳腺癌细胞株(MB468)。与实施例1同样地让溶瘤病毒在MB468内增殖，不用稳定剂和非离子表面活性剂对此MB468进行处理，在与实施例1同样的条件下用荧光显微镜测定荧光强度。

结果见图1。图1中显示了阳性对照(No.1)、比较例1(No.2及3)、实施例1(No.4及5)、实施例2(No.6)和实施例3(No.7)的结果。

从图1得知，用比较例1(No.2及3)的方法未能除去与癌细胞显示出同样强度的荧光信号的单核细胞。而用本发明的方法(No.4、5、6及7)降低了来源于单核细胞的强荧光信号。

至于非离子型表面活性剂，使用高级醇的烷基为支链的高级醇·环氧乙烷加成物EMULGEN 2025G和EMULGEN 2020G时(No.4、5及7)，比用高级醇的烷基为直链的高级醇·环氧乙烷加成物NIKKOLBO-20V(No.6)时能够更有效地降低来源于单核细胞的信号。

2.血样中的癌细胞的检测

用各种表面活性剂对实际存在于血样中癌细胞的检测进行了研究。

(实施例4)

在采自健康人体的7.5ml末梢血中加入1120μl抗凝血保存液(CPD液：l00ml无菌水中含有柠檬酸3Na·2H₂O 2.63g、柠檬酸·2H₂O 0.327g、D(+)-葡萄糖2.32g、磷酸二氢钠·2H₂O 0.251g)，充分颠倒混合。再以弱制动方式以1500rpm离心分离此混合液5分钟后，用吸管尽可能去除上清(血清)。在此加入PBS(-)混合至14ml，进行悬浊。反复进行4次与上述同样的离心分离和血清去除。然后，添加乳腺癌细胞株(MB468)至3×10⁵个/ml，获得含有癌细胞的血样。

对所得试样进行与实施例1一样的<病毒增殖>、<用稳定剂和非离子型表面活性剂进行处理>及<制作载玻片及显微镜观察>，然后拍摄显微镜照片。所得照片见图2(A)。

除使用NIKKOLBL-9EX(非离子型表面活性剂，日本化工品销售株式会社)、NIKKOLBO-20V(日本化工品销售株式会社)、NIKKOLBT-12(非离子表面活性剂，日本化工品销售株式会社)、EMULGEN 2020G(花王株式会社)、Nissan Cation AB600(阳离子表面活性剂，日油株式会社)及Nissan CationBB(阳离子表面活性剂，日油株式会社)取代EMULGEN 2025G作为表面活性剂外，其它均与实施例1同样地对上述含癌细胞血样进行<病毒增殖>、<用稳定剂和非离子型表面活性剂进行处理>及<制作载玻片及显微镜观察>，然后拍摄显微镜照片。

使用NIKKOLBL-9EX、NIKKOLBO-20V、NIKKOLBT-12、EMULGEN 2020G、Nissan Cation AB600及Nissan Cation BB作为表面活性剂的情况下的照片分别见图2(B)-(G)。

(比较例2)

与实施例1的<病毒增殖>同样，对用与实施例4同样方法获得的含癌细胞血样进行病毒增殖处理，获得增殖细胞。加入与之同体积的4％PFA，进行悬浊，在室温静置20分钟。再加入增殖细胞和PFA合计体积二倍体积的1％氯化铵溶液进行悬浊，边搅拌边在40℃培养5分钟，获得处理试样。

进行与实施例1同样的<制作载玻片及显微镜观察>，拍摄该处理试样的显微镜照片。所得照片见图2(H)。

从图2(H)可以看出，用比较例2的方法处理的血样，其癌细胞周围未溶血的红细胞(未溶血RBC)和红细胞碎片(RBC血影)密集。从图2(F)和(G)可以看出，用阳离子表面活性剂作为表面活性剂进行了处理后的血样与比较例2相同，在癌细胞周围聚集有来源于未溶血RBC和RBC血影的碎片。

另一方面，从图2(A)-(E)得知，使用了本发明的非离子型表面活性剂的方法处理的血样可以几乎除去全部红细胞，癌细胞清晰可见。

本申请与2008年12月18日申请的日本国特许出愿特愿2008-322439号相关，其权利要求范围、说明书、附图及摘要全部作为本说明书的参考内容。

Claims (20)

1.一种从血样中检测癌细胞的方法，包括以下步骤：

增殖步骤，将怀疑有癌细胞存在的血样与溶瘤病毒一起培养，使溶瘤病毒至少在所述癌细胞内增殖；

混合步骤，将在增殖步骤中处理过的血样与稳定剂和非离子型表面活性剂混合；及

检测步骤，从混合步骤获得的血样中检测出溶瘤病毒增殖的癌细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：混合步骤是在混合了血样和稳定剂后再混合非离子型表面活性剂。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在混合步骤中非离子型表面活性剂与血样混合时的浓度为不破坏癌细胞只破坏红细胞和白细胞的浓度。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：非离子型表面活性剂是聚氧乙烯型非离子表面活性剂。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：聚氧乙烯型非离子型表面活性剂是高级醇·环氧乙烷加成物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：高级醇·环氧乙烷加成物的高级醇的烷基为支链。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在混合步骤中，与血样混合时的稳定剂的浓度为红细胞溶血的浓度。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：稳定剂为多聚甲醛、戊二醛或甲醛。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：溶瘤病毒是表达标记蛋白质的溶瘤病毒。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：溶瘤病毒是植入了端粒酶启动子的溶瘤病毒。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：检测步骤是检测来自标记蛋白质的信号的步骤。

12.一种检测血样中癌细胞用的试剂盒，包括：

含有溶瘤病毒的第一试剂、

含有稳定剂的第二试剂、和

含有非离子型表面活性剂的第三试剂。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于：第三试剂所含非离子型表面活性剂的量要使得与血样混合时的非离子型表面活性剂的浓度不破坏癌细胞但能破坏红细胞和白细胞。

14.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于：非离子型表面活性剂是聚氧乙烯型非离子表面活性剂。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于：聚氧乙烯型非离子表面活性剂是高级醇·环氧乙烷加成物。

16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于：高级醇·环氧乙烷加成物的高级醇的烷基为支链。

17.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于：第二试剂含有的稳定剂的量要使得与血样混合时的稳定剂的浓度可使得红细胞溶血。

18.根据权利要求12所述试的剂盒，其特征在于：稳定剂为多聚甲醛、戊二醛或甲醛。

19.根据权利要求12所述试的剂盒，其特征在于：溶瘤病毒是表达标记蛋白质的溶瘤病毒。

20.根据权利要求12所述试的剂盒，其特征在于：溶瘤病毒是植入了端粒酶启动子的溶瘤病毒。

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