CN106834539A - 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪瘟病毒同时定量检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明先提供了一种同时检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的特异性引物和探针组合，包括用于特异性扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针；以及用于特异性扩增猪瘟病毒的1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针。本发明还提供一种同时检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的检测试剂盒，其具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、可直接定量，无需标准曲线、操作简便等优点，可以在疫情预爆发前便于在早期内确定疫病，做好预防，从源头控制疫情。

Description

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪瘟病毒同时定量检测 试剂盒

技术领域

本发明涉及试剂盒检测技术领域，具体的说涉及一种能同时检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病病毒和猪瘟病毒双重微滴数字RT-P CR绝对定量检测试剂盒。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种高度接触性热性传染病，该传染性高，致病性强，猪是本病唯一的自然宿主，感染的病猪主要表现为特征性病理变化，内脏出血，梗塞和坏死，死亡率很高，给养猪业造成重大的经济损失。病猪是最主要的传染源，易感猪与病猪的直接接触是病毒传播的主要方式。在我国，猪瘟流行呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存、持续感染与隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等形式；在国外，比利时、德国、荷兰最近爆发猪瘟也说明猪瘟流行形式发生了改变。猪瘟新的流行形式给全世界养猪业提出了新的挑战。CSFV与牛病毒性腹泻病毒(bovi ne viraldiarrhea virus，BVDV)和羊边界病毒(Border Disease Virus，BDV)同属黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(pestivirus)。猪瘟病毒基因组为单股正链RNA长约12.3KB，含有一个大的开放阅读框架。病毒粒子呈球形，直径40-50nm，二十面体对称，其芯髓直径29-30nm，有囊膜。

猪繁殖与呼吸综合征病是由猪繁殖与呼吸综合征病病毒(Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，在大多数国家中呈流行性感染。猪发病后临床表现差异极大，是该病的显著特征之一。临床症状主要是繁殖障碍，包括怀孕后期流产、早产和死胎，育成猪的呼吸道症状。发病母猪体温升高，厌食，部分患猪的背侧、双耳的耳尖及边缘呈红蓝色。发病公猪***减退，生产性能下降。发病仔猪出生时死亡或产出后个体小。患猪死亡后的主要病理变化是:眼球肿胀突出，头、臀部皮下水肿，胸腔、心包积水，心室扩张，心肌变化萎缩，肾脏皮质部点状出血，肺脏间质性肺炎病变。1991年病原首次鉴定，病毒是单链RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，但是病毒的来源并未确定。1985年美国猪群猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的存在说明该病毒在发病之前就已经存在。2006年我国南方部分省份出现养猪场(户)暴发猪“高热病”疫情，发病猪以“高热”、“高发病率”和“高死亡率”为主要特征，给我国的养猪业造成了较大的经济损失。中国动物疫病预防控制中心田克恭等研究发现，猪“高热病”的主要致病病原为Nsp2缺失30个氨基酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异引起，后将其命名为“高致病性猪繁殖与呼吸综合征病”(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，HP-PRRSV)，其致病性大大增加，仔猪发病率可达100％、死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上，育肥猪也可发病死亡。

常规的猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病病毒的实验室检验方法是根据免疫反应原理，利用ELISA及双夹心ELISA法进行检测。目前，国内外已对猪瘟的结构蛋白基因进行了详尽的研究，国外有学者分别对CSFVAlfort株和BreSCia株基因进行了全序列测定，并通过免疫学方法证明囊膜糖蛋白El是CSFV诱导保护性中和抗体的重要抗

原，而国内则对于石门株(Shimen)的基因序列进行了测定。通过RT-PCR技术将编码相应结构蛋白的mRNA反转录成cDNA，转入载体进行表达，并将表达产物进行纯化、定量以及作为抗原包板做ELISA进行感染检测。另外猪瘟兔化弱毒EZ蛋白A/D区的高效表达和蛋白纯化后亦可以作为包被抗原进行ELISA测定，但是由于不能区分自然感染的和免疫接种。PRRSV可以从各种临床样品中分离到，包括血清、血浆、外周血单核细胞、骨髓、扁桃体、肺脏、***、胸腺、脾脏、心、脑、肝、翠丸、附翠、输精管、尿道球腺、***组织、口咽拭子、鼻甲、鼻拭子、胎盘、唾液、尿液、粪便以及***中。一般来说，肺脏深处积液以及血清都是病毒分离最理想的材料。送检材料通常应包括新鲜采集的肺、扁桃体以及***。但是只有当特定滴度的标准病毒在新巨噬细胞生长良好，方可使用。冰冻切片免疫荧光抗体试验(I FA)以及免疫组化试验(IHC)可以检测组织中的PRRSV抗原。冰冻切片直接FA试验成本较低并且快速，这两种方法的特异性很高，但相对来说敏感性不够。样品的质量对FA结果影响非常大，要求组织应该新鲜。IHC可以检测甲醛固定的组织，比FA的敏感性要高，但更费时而且成本更高。通过组织病理学切片，结合IHC以及FA试验的结果可以对PRRSV感染做出准确的诊断。另外，针对上述两种病毒可以用RT-PCR技术进行检测。通常是用异硫氰酸肌一酚一仿一步抽提法提取病料细胞总RNA并进行反转录，再以此产物为模板对可疑的猪瘟或者猪繁殖与呼吸综合征病病料进行了PCR扩增。如果扩增出相应的片段则说明病毒的存在，敏感性要高于荧光抗体染色法、酶标单克隆抗体染色法和电镜负染法，可以作为一种有效的诊断方法。概括来说猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病病毒的检测方法主要包括免疫学检测方法和核酸检测方法两大类。免疫学方法主要是检测血清中是否存猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征病病毒的特异性抗体，具体是用ELISA的方法进行检测，然而这种方法必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且鉴于上述病毒的高度变异性以及与其他病毒血清学的交叉性，其特异性难以保证，容易出现假阳性和假阴性。病毒分离和培养法比较敏感，但是这种方法操作繁琐，不宜在所有检测实验特别是一些基层实验室推广。用普通PCR的方法进行猪瘟或者猪繁殖与呼吸综合征病病毒核酸，虽然灵敏度有所提高，但是容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性，而且普通PCR扩增法其结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作方法不够简化。

为了对疾病的治疗和疫情在早期就有效控制,建立快速、敏感、准确的猪瘟与猪繁殖与呼吸综合征病病毒检测方法是十分必要的。近年荧光PCR技术在病毒等微生物检测领域得到广泛的应用,它利用PC R技术对DNA的高效扩增并结合探针技术的高特异性和敏感性,克服了常规血清学和普通PCR方法的不足,但是荧光PCR技术的检测下限仍很高，不能检测出微量的病毒，所以提出了数字PCR的概念。

数字化PCR的概念早在1999年就由Bert Vogelstein采用并发表相关文献，其初衷是为了能够从临床样品(如尿液、淋巴液、血浆、粪便等)大量的正常体细胞中检测出微量的突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不能非常好地体现数字PCR的核心理念——“无限稀释”(terminal dilution，有些文献上也称partiti on)。

如今，数字PCR技术的浪潮已经来临，Bio-Rad公司的QX200***核心的微滴化技术能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将传统定量PCR的一个反应变成20,000个反应，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是对“无限稀释”这一概念的完美演绎。

由于扩增前的微滴化处理步骤，使得该技术能够以绝对定量的方式直接“数”出靶分子的个数，因此特别适用于依靠传统定量PCR方法不能很好达到分辨效果的应用领域：拷贝数变异、微量核酸的检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序文库定量与结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等，对遗传病、癌症、传染病的研究提供了一种全新的技术思路与手段。需要指出的是，定量PCR检测灵敏度的极限一般在1％，而QX200数字化PCR的检测灵敏度可达0.001％，在这个意义上实现所谓的痕量检测。故QX200***应用于出入境检验检疫领域，如在转基因作物检测、包括各种病毒在内的危险性有害微生物的检测等方面同样提供了创新的技术方法和完美的解决方案。是一种很有应用价值的诊断方法。猪瘟和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病是严重危害猪的病毒性疾病，常以单独或混合感染的方式感染猪，发病率和死亡率都较高。目前还没有能够同时对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病病毒和猪瘟病毒进行同时数字PCR检测的相关试剂和检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、可实现精确定量的微滴数字RT-PCR检测方法和微滴数字R T-PCR测试剂盒，用于同时对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒进行快速精确检测。

本发明的第一个技术目的是提供用于同时检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的特异性引物和探针组合，包括用于特异性扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列为：

HP-PRRSV-F2：AGTGGGTCGGCACCAGTTC；

HP-PRRSV-R2：CGCAGACAAATCCAGAGGCT；

HP-PRRSV-P2：FAM-AACTGTGACAACAACGCTGACGCA-B HQ1；

以及用于特异性扩增猪瘟病毒的1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列为：

CSFV-F1：TTCAATTTGGTTCAGGGCCTCC；

CSFV-R1：TACTCAGGACTTAGACCACCCAGG；

CSFV-P1：HEX–ATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGG-BH Q1。

探针的两端添加有荧光染料，如FAM、HEX、BHQ1等。

本发明提供了上述的特异性引物和探针组合在制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒同时检测试剂盒或检测试剂中的应用。

本发明提供了一种含有上述特异性引物和探针组合的试剂盒。所述试剂盒优选为双重微滴数字RT-PCR绝对定量检测试剂盒。

本发明的另一技术目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度和精确度的、操作简单的同时检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的检测试剂盒，包含上述特异性引物和探针组合。

还包含检测试剂；所述检测试剂包括无RNA酶的蒸馏水，一步法RT-ddPCR探针法预混液，探针法RT-ddPCR微滴发生油，质控液，阴性对照和阳性对照。

所述一步法RT-ddPCR探针法预混液中优选的引物和探针用量是：引物探针浓度均为10μM，引物单体系加1.8μL，反应终浓度为900nM，探针单体系加0.5μL，反应终浓度为250nM。

所述阳性对照为含有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒基因组RNA的提取液，阴性对照为无RNA酶蒸馏水。

本发明的试剂盒其工作原理是采用微滴式数字化RT-PCR(RT-dd PCR)，所述试剂盒的工作程序为：

(1)配制RT-ddPCR反应液；RT-ddPCR反应液20μl配方为：一步法ddPCR探针法预混液18μl，待测样品RNA模板为2μl；

(2)制备微滴，然后将微滴转入PCR板，于PCR仪中进行扩增；

(3)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，分析数据，显示检测结果。

在本发明的一个优选实施例中，制备微滴的方法是采用Bio-Rad公司的QX200***中的微滴发生器，按照说明书操作进行微滴制备即可。

其中，步骤(2)中PCR的扩增程序为48℃反转录20min；95℃预变性10min；94℃变性10sec，56℃退火60sec，共40个循环；98℃10min，升降温速度都设为2.5℃/sec，结束反应。

本发明提供的试剂盒在猪疫病检测和预防中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明试剂盒检测结果的判定方法为：(1)阳性对照：100±5c opies/μl；(2)阴性对照：<1copies/μl；待测样本结果判定：(1)阳性：标本检测结果≥1copies/μl。(2)阴性：标本检测结果<1copies/μl。

本发明摸索了引物和探针的浓度，找到了最适RT-ddPCR的引物和探针的工作浓度。摸索了RT-ddPCR反应过程中最适的升降温速度，以提高RT-ddPCR的扩增效率，使本发明方法能够与BIO-RAD公司的QX200***相结合。

本发明试剂盒具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、可直接定量，无需标准曲线、操作简便、适合现场检测等优点，可以在疫情预爆发前便于在早期内确定疫病，做好预防，从源头控制疫情。具体表现在：

(1)高特异性：本发明根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒基因组序列设计了特异性引物和特异探针，其特异性极高，且非常稳定，保证了反应的顺利进行，进一步确保高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒检出的特异性；

(2)高灵敏度：检测浓度低至1/1,000,000的靶分子；能够直接定量待测样本中的拷贝数；

(3)低模板：由于检测的灵敏度很高，可以检测出低丰度的目的基因，所以可以降低模板用量，稀释模板浓度，对于一些珍贵，稀少的样本可以有更多的研究。

(4)可直接定量，无需标准曲线：与传统的PRRSV检测方法相比，该试剂盒可直接定量，无需标准曲线，操作简便、准确无误，更加适合现场检测，有效预防猪疫病的大规模爆发。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1引物及探针的设计与合成

1、引物、探针设计

根据Genbank已发表的猪繁殖与呼吸综合征美洲型变异株病毒H P-PRRSV的基因组序列，猪瘟病毒CSFV的基因组系列，用primer pr emier 5.0软件设计荧光定量专用的HP-PRRSV和CSFV的引物探针，设计完成后送合成英潍捷基公司合成。

2、进行适用于ddPCR的特异性引物和探针的筛选。

选择用软件设计出的其中几对备选引物进行筛选，备选引物如下，见表1：

表1

2.1引物的筛选

(1)HP-PRRSV的引物随机配为四对：F1R1、F1R2、F2R1、F2R2；CSFV的引物随机配为四对：F1R1、F1R2、F2R1、F2R2。

(2)然后两种病毒分别用染料法做荧光定量PCR，PCR体系配方：2X one-step SYBRGreen Supermix 10μL，上游引物，下游引物分别为1μL，RNase Free dH₂O 3μL，阳性模板5μL。PCR的扩增程序为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，60℃退火60sec，共40个循环；60℃-95℃每5秒升高0.5℃溶解曲线，结束反应。

(3)结果分析，HP-PRRSV的引物选择没有非特异性扩增的引物对F2R2，CSFV的引物选择没有非特异性扩增的引物对F1R1。

3、探针的筛选

(1)引物探针的组合为：

1、HP-PRRSV-F2R2P1+CSFV-F1R1P1；

2、HP-PRRSV-F2R2P1+CSFV-F1R1P2；

3、HP-PRRSV-F2R2P2+CSFV-F1R1P1；

4、HP-PRRSV-F2R2P2+CSFV-F1R1P2。

(2)然后在ddPCR平台上，ddPCR体系配方：2X One-step RT-ddPCR Supermix 10μL，上游引物，下游引物分别为1μL，探针分别0.5μL，RNAse Free dH₂O 3μL，阳性模板2μL，总体积20μL(引物和探针的浓度均为10μM)。然后生成微滴。

(3)上PCR仪扩增，PCR的扩增程序为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，退火60℃sec，共40个循环；98℃10min结束反应。上微滴数字PCR检测仪检测。

(4)分析结果：根据实验结果选择HP-PRRSV-F2R2P2+CSFV-F1R1P1引物探针组合。

实施例2在ddPCR平台上检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的PCR方法退火温度的优化。

1、选择引物探针的组合为：HP-PRRSV-F2R2P2+CSFV-F1R1P1，提取猪繁殖与呼吸综合征美洲型变异株病毒和猪瘟病毒RNA为模板。

2、然后在ddPCR平台上，ddPCR体系配方：2X One-step RT-dd PCR Supermix 10μL，上游引物，下游引物分别为1μL，探针0.5μL，RNase Free dH₂O 3μL，阳性模板2μL，总体积20μL(引物和探针的浓度均为10μM)。做8个复孔，然后生成微滴，转移到96孔板内，封铝膜。

3、上PCR仪扩增，为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30sec，50～60℃(仪器自动分布8个温度梯度)退火60sec，共40个循环；98℃10min，升降温速度都设2.5℃/sec，结束反应。上微滴数字PCR检测仪检测。

4、分析结果：在56℃的退火温度时扩增效率最好，病毒拷贝数最多，所以选择56℃的退火温度。

实施例3引物、探针浓度的优化实验

设计引物探针浓度均为10μM,组合为：HP-PRRSV–F2R2P2+CSF V-F1R1P1，提取猪繁殖与呼吸综合征美洲型变异株病毒和猪瘟病毒RNA为模板。配数字PCR反应液。

第一组：5X one-step ddPCR mix：5μL，Reverse transcriptas e(逆转录酶，RE)：2μL，DTT：1μL，上下游引物各1.3μL(终浓度650nM)，探针0.3μL(终浓度150nM)，无RNA酶的蒸馏水：4.2μL，RNA模板：2μL，总体积20μL。

第二组：5X one-step ddPCR mix：5μL，RE：2μL，DTT：1μL，上下游引物各1.8μL(终浓度900nM)，探针0.5μL(终浓度250nM)，无RNA酶的蒸馏水：1.8μL，RNA模板：2μL，总体积20μL。阴性对照是用第二组的体系配置，因为第二组引物探针的浓度是BIO-RAD厂家推荐浓度。

第三组：5X one-step ddPCR mix：5μL，RE：2μL，DTT：1μL，上下游引物各2.1μL(终浓度1050nM)，探针0.7μL(终浓度350nM)，无RNA酶的蒸馏水：0.2μL，RNA模板：2μL，总体积20μL。

3、生成微滴后，转移到96孔板内，封铝膜，上PCR仪扩增，为48℃反转录20min；95℃预变性10min；94℃变性10sec，56℃退火60sec，共40个循环；98℃10min，升降温速度都设2.5℃/sec，结束反应。上微滴数字PCR检测仪检测。

4、分析结果：第二组扩增效率好，得到的病毒拷贝数多，所以选择第二组，引物单体系加1.8μL，终浓度900nM，探针单体系加0.5μL，终浓度为250nM。

实施例5病毒RNA提取

1样品采集：病死或扑杀猪，取肺、扁桃体和脑组织：待检活猪，用注射器取血5mL。2～8℃保存，送实验室检测。(要求送检病料新鲜，严禁反复冻融病料。)

2样品处理：每份样品分别处理。

2.1组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.05g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中。

2.2全血样品处理：待血凝后取血清100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

2.3阳性对照处理：取阳性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

2.4阴性对照处理：取阴性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

3病毒RNA的提取

3.1取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600μL，充分颠倒混匀，室温静置3～5min。

3.2将液体吸入吸附柱中(吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱)，13000rmp离心30s。

3.3弃去收集管中液体，加入600μL洗液，13000rmp离心30s。

3.4重复步骤3.3。

3.5弃去收集管中液体，13000rmp空柱离心2min，以除去残留的洗涤液。

3.6将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，向柱中央加入洗脱液50μL，室温静置1min，13000rmp离心30s，离心管中液体即为模板R NA。

实施例6检测猪繁殖与呼吸综合征美洲型变异株病毒和猪瘟病毒双重ddPCR方法的建立

1、制备ddPCR反应液，5X one-step ddPCR mix：5μL，RE：2μL，DTT：1μL，上下游引物各1.8μL(终浓度900nM)，探针0.5μL(终浓度250nM)，无RNA酶的蒸馏水：1.8μL，模板RNA：2μL，总体积20μL。空白对照：以RNase Free dH₂O代替模板，同样条件下扩增。

2、取微滴发生卡置于卡托中固定，将20μL反应液加入到微滴发生卡中间一排的8个孔内，不足8个样品时用20μL 1×control buffer补足，建议使用8通道20μL排枪和20μL枪头(不能用200μL枪头)，加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡。

3、在微滴发生卡最底下一排8个孔中各加入70μL微滴生成油，同样不能有空着的孔。

4、盖上胶垫，注意两边的小孔都要钩牢。

5、将以上卡托轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般2分钟之内完成。

6、微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，建议使用8通道排枪和200μL枪头小心缓慢吸取，调整吸取体积为40μL，将卡托放平，枪头以与孔壁呈30～45°角放入，轻触孔底，约5秒吸取40μL，再同样缓慢地打入96孔板相应位置孔内(约5秒)，枪头贴近孔壁接近孔底，注意封上盖以防油挥发，每次弃去已使用过的微滴发生卡和胶垫。

7、转移油滴进入96孔板内完成后，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜(膜亮面朝上，暗面向下)，推荐的运行程序为：180℃，10s，一般无需颠倒方向二次封膜；

8、封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR，可在任意一台96孔PCR仪上完成。反应条件：为48℃反转录20min；95℃预变性10min；94℃变性10sec，56℃退火60sec，共40个循环；98℃10min，升降温速度都设2.5℃/S，结束反应。

9、将之前完成PCR的96孔板放入pLate hoLder中组装好，注意板斜角方位，组装好之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中。

10、打开QuantaSoft软件，建议每次实验之前做一次***清洗，若一周以上未使用建议先做一次填充油路再做***清洗。之后对96孔板中样品信息进行设置，主要是提供实验名称、实验类型以及探针信息等，完成后即可运行仪器，结束后结果会被自动分析，人工核实后保存结果。

实施例7特异性检验

用制备的试剂盒分别检测，PRRSV美洲型经典株，猪圆环病毒2型，猪传染性胃肠炎病毒，猪流行性腹泻病毒，***病毒，结果全为0copies/μL；检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的组织样本，FAM通道结果为129copies/μL；检测猪瘟病毒感染的组织样本，HEX通道结果为89copies/μL。

实施例8敏感性实验

将0.8ng/μL的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的合成质粒和0.75ng/μL猪瘟病毒的合成质粒，分别10倍稀释，稀释7个梯度，在依次混合，编号H C1、H C2、H C3、H C4、HC5、H C6、H C7用已建立的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒微滴数字RT-PCR绝对定量方法在QX200的平台上做数字PCR实验。

结果：FAM通道检测出1.8copies/μL的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒，上样的样本浓度为0.8*10^-4ng/μL，HEX通道检测出1.3copies/μL的猪瘟病毒，上样的样本浓度为0.0.75*10^-4ng/μL。

以上检测结果证明了本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、可直接定量，检测方便快捷、结果准确可靠。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京市动物疫病预防控制中心

<120> 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪瘟病毒同时定量检测试剂盒

<130> P1610230

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccactgatg acacctttg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacagaggct catcctggt 19

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcgtagaac tgacaacaac gctga 25

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agtgggtcgg caccagttc 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcagacaaa tccagaggct 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aactgtgaca acaacgctga cgca 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttcaatttgg ttcagggcct cc 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tactcaggac ttagaccacc cagg 24

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgcccatag taggactagc aaacgg 26

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttcaatttgg ttcagggcct 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tactcaggac ttagaccacc cag 23

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgcccatagt aggactagca aacggag 27

Claims (10)

1.一种用于同时检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的特异性引物和探针组合，包括用于特异性扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列为：

HP-PRRSV-F2：AGTGGGTCGGCACCAGTTC；

HP-PRRSV-R2：CGCAGACAAATCCAGAGGCT；

HP-PRRSV-P2：FAM-AACTGTGACAACAACGCTGACGCA-BHQ1；

以及用于特异性扩增猪瘟病毒的1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列为：

CSFV-F1：TTCAATTTGGTTCAGGGCCTCC；

CSFV-R1：TACTCAGGACTTAGACCACCCAGG；

CSFV-P1：HEX-ATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGG-BHQ1。

2.权利要求1所述的特异性引物和探针组合在制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒同时检测试剂盒或检测试剂中的应用。

3.一种含有权利要求1所述特异性引物和探针组合的试剂盒。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其为双重微滴数字RT-PCR绝对定量检测试剂盒。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含病毒总RNA提取试剂和检测试剂；所述检测试剂包括无RNA酶的蒸馏水，一步法RT-ddPCR探针法预混液，探针法RT-ddPCR微滴发生油，质控液，阴性对照和阳性对照。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒基因组RNA的提取液，阴性对照为无RNA酶蒸馏水。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述一步法RT-ddPCR探针法预混液中引物探针浓度均为10μM，引物单体系加1.8μL，反应终浓度为900nM，探针单体系加0.5μL，反应终浓度为250nM。

8.如权利要求4-7任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的工作程序为：

(1)配制RT-ddPCR反应液；RT-ddPCR反应液20μl配方为：一步法RT-ddPCR探针法预混液18μL，待测样品RNA模板为2μL；

(2)制备微滴，然后将微滴转入PCR板，于PCR仪中进行扩增；

(3)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，分析数据，显示检测结果。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，步骤(2)中PCR的扩增程序为48℃反转录20min；95℃预变性10min；94℃变性10sec，56℃退火60sec，共40个循环；98℃10min，升降温速度都设为2.5℃/sec，结束反应。

10.权利要求3-9任一所述的试剂盒在猪疫病检测和预防中的应用。