CN110275023A - 基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法 - Google Patents
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Abstract
基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，包括以下步骤：探针1的制备：制备不同种类的荧光编码微球；分别用链霉亲和素标记荧光编码微球；用生物素标记捕获抗体；将链霉亲和素标记的编码微球与生物素标记的捕获抗体偶联；探针2的制备：用荧光染料标记检测抗体；荧光共振能量转移体系进行多组分生物标志物检测的反应体系为：在上述反应体系中，加入样本中存在肿瘤标志物时，探针1与探针2结合到一起，形成荧光共振能量转移体系；通过将检测的编码微球在探针2最大发射波长的荧光强度带入工作曲线，即可得出不同种类肿瘤标志物的浓度。该方法灵敏、快速、高通量、价格低。
Description
技术领域
本发明属于免疫诊断检测领域，涉及肿瘤标志物的检测方法，具体涉及一种基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法。
背景技术
肿瘤标志物是反映肿瘤存在的化学类物质，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。
由于同一肿瘤可含有一种或多种标志物，选择一些特异性较高的肿瘤标志物联合检测有利于提高肿瘤检测的敏感性和特异性。
化学发光免疫分析(CLIA)和电化学发光免疫分析(ECLIA)是医院检测肿瘤标志物的常用方法。CLIA有国产化的仪器和试剂，但监测种类较少，普及率低，目前广大医院仍采用罗氏、贝克曼等进口厂家的仪器和试剂进行检测。ECLIA的仪器和试剂都是进口，检测精度高、操作简单，因此大型医院采用该方法进行免疫或生化指标检测，但检测昂贵。
流式细胞术是近几年才发展起来的新技术，能够使用一个样品对多种指标进行高通量检测，检测速度快，精度高，是生命科学研究中的新工具。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，利用荧光共振能量转移体系快速均相检测肺癌肿瘤标志物CEA、SCC、CYFRA21-1、NSE，该方法灵敏、快速、高通量、价格低，有效解决上述技术问题。
为实现上述目的，本发明是采用如下技术方案实现的：
基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，具体包括以下步骤：
一、探针1的制备
A、制备不同种类的荧光编码微球，所述荧光编码微球的种类与待检测肿瘤标志物的数量相对应；
B、分别用链霉亲和素标记步骤A制备的荧光编码微球；
C、用生物素标记捕获抗体，所述捕获抗体为待检测的肿瘤标志物的捕获抗体；
D、将步骤B链霉亲和素标记的编码微球与步骤C生物素标记的捕获抗体偶联，不同肿瘤标志物与不同种类的荧光编码微球相结合，通过荧光编码微球的荧光强度识别肿瘤标志物；
二、探针2的制备
用荧光染料标记检测抗体，所述检测抗体与捕获抗体为配对抗体；
三、荧光共振能量转移体系进行多组分生物标志物检测的反应体系为：
在上述反应体系中，当加入样本或标准品中存在肿瘤标志物时，就会被所对应的荧光编码微球捕获，探针1与探针2结合到一起，形成荧光共振能量转移体系；此时，通过编码波长的荧光强度判定编码微球，决定被测肿瘤标志物的种类；通过将检测的编码微球在探针2 最大发射波长的荧光强度带入工作曲线，即可得出不同种类肿瘤标志物的浓度；
四、工作曲线
先将浓度为0.05-30ng/ml的不同浓度的肿瘤标志物标准品样本分别与缓冲液、探针1混合后，置于孵箱中恒温避光反应，再加入探针2充分混匀，置于孵箱中恒温避光反应，加终止液充分混匀，将该体系置于流式细胞仪上检测探针2最大发射波长的荧光强度，通过编码波长的荧光强度判定编码微球，决定被测肿瘤标志物的种类；记录流式细胞仪上反应体系在探针2最大发射波长的荧光强度，存在肿瘤标志物时F，不存在肿瘤标志物时F0，以(F-F0) 对不同肿瘤标志物浓度分别绘制标准曲线，拟合方程为浓度和荧光强度的取常用对数后的值；
五、待测样本检测
通过荧光共振能量转移体系检测待测样本的荧光信号，将待测样本的荧光信号值带入标准曲线，得出待测样本中不同种类肿瘤标志物的含量。
作为本发明的优选，步骤A中制备荧光编码微球的方法为：取羧基化聚苯乙烯微球，用溶胀液清洗羧基化聚苯乙烯微球，将清洗后的羧基化聚苯乙烯微球平均分成几份，分别向编码微球中加入发射波长565nm的量子点和发射波长605nm的量子点进行编码，加入发射波长 645nm的量子点为荧光染料荧光共振能量转移提供能量，加入量子点后的编码微球分别在溶胀体系中室温孵育，反应完成后离心处理，得到量子点编码微球，将得到的量子点编码微球清洗、离心、真空干燥，即得到不同量子点编码的荧光微球。
作为本发明的优选，步骤B中链霉亲和素标记编码微球的方法为：取步骤A不同量子点编码后的羧基化聚苯乙烯荧光微球，溶解在吗啉乙磺酸缓冲液中，同时加入链霉亲和素，碳二亚胺盐酸盐以及N-羟基丁二酰亚胺酯，混合后反应，之后离心，清洗，即可得到链霉亲和素修饰的荧光编码微球。
作为本发明的优选，步骤C中用生物素标记捕获抗体的方法为：用无水DMF溶解活化的生物素，加入捕获抗体后室温孵育，用PBS溶液对生物素标记的捕获抗体过夜透析，除去未反应的生物素，即可得到生物素标记的捕获抗体。
作为本发明的优选，步骤二中荧光染料标记检测抗体1的方法为：用PBS缓冲液充分溶解荧光素APC，平分为4份，分别加入CEA、SCC、CYFRA21-1、NSE检测抗体1，同时均加入碳二亚胺盐酸盐以及N-羟基丁二酰亚胺酯，室温孵育，通过纯化柱进行洗脱分离，得到 APC标记的检测抗体，即探针2。
作为本发明的优选，所述步骤三中的终止液为含0.1％SDS的PBS缓冲液。
作为本发明的进一步优选，所述步骤A中的编码微球为四种，记为编码微球1、2、3、4；编码微球1中加入5μL发射波长565nm的量子点、5μL发射波长645nm的量子点；编码微球 2中加入3μL发射波长565nm的量子点、7μL发射波长605nm的量子点、5μL发射波长645nm 的量子点；编码微球3中加入7μL发射波长565nm的量子点、3μL发射波长605nm的量子点、 5μL发射波长645nm的量子点；编码微球4中加入5μL发射波长605nm的量子点、5μL发射波长645nm的量子点；步骤C中的捕获抗体为CEA、SCC、CYFRA21-1、NSE的捕获抗体1；编码微球1、2、3、4分别与CEA、SCC、CYFRA21-1、NSE的捕获抗体偶联，得探针1。
作为本发明的更进一步优选，所述溶胀液为5％氯仿和95％正丁醇的混合液。
作为本发明的更进一步优选，所述量子点为CdSe量子点。
本发明的有点和有益效果：
(1)本发明提供的方法是基于流式细胞术进行检测，操作简单，快速，不需要对反应体系中未连接的抗体进行分离；且不同的编码微球与抗体偶联，可用于基于荧光共振能量转移的多组分生物标志物分析体系，具有高通量的特点，能同时检测多人份。
(2)本发明与传统的检测手段比较，具有高灵敏度，高准确性，特异性强，所需血量少，快速检测等优点。现有肿瘤检测方法中影像学检测和病理学检测往往较难发现早期的病例。而且由于恶性肿瘤的生长是极其复杂的多病因过程，仅检测一个指标，其灵敏度和准确性都不高，容易漏检，而本发明的方法可实现多组分肿瘤标志物联合检测，可同时检测4种肺癌相关性肿瘤标志物，大大提高了检测的灵敏度和准确性，弥补了现行肿瘤检测方法单一指标检测的不足。
(3)本发明提供的方法无创伤性，检测安全，简便易行，采静脉血2ml，分离出血清即可检测，且无任何放射性污染，对患者没有任何伤害。
附图说明
图1为本发明荧光共振能转移体系图。
图2为本发明CEA的标准曲线图。
图3为本发明SCC的标准曲线图。
图4为本发明CYFRA21-1的标准曲线图。
图5为本发明NSE的标准曲线图。
图6为本发明制备的量子点编码微球的流式细胞仪分析图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但这并非是对本发明的局限，本领域的技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改和替换，只要不脱离本发明的基本思路，均在本发明的范围之内。
本发明的技术方案具体如下：
一、探针1的制备
A、编码微球的制备
用溶胀法对CdSe量子点进行包埋：
取羧基化聚苯乙烯微球100mg，溶胀液(5％氯仿，95％正丁醇)1mL清洗羧基化聚苯乙烯微球两次，将清洗后的羧基化聚苯乙烯微球平均分成四份，记为编码微球1、2、3、4，分别向编码微球1、2、3、4中加入发射波长565nm的量子点和发射波长605nm的量子点进行编码，加入发射波长645nm的量子点为APC荧光共振能量转移提供能量；
其中，编码微球1中加入5μL发射波长565nm的量子点、5μL发射波长645nm的量子点；
编码微球2中加入3μL发射波长565nm的量子点、7μL发射波长605nm的量子点、5μL发射波长645nm的量子点；
编码微球3中加入7μL发射波长565nm的量子点、3μL发射波长605nm的量子点、5μL发射波长645nm的量子点；
编码微球4中加入5μL发射波长605nm的量子点、5μL发射波长645nm的量子点；
加入量子点后的编码微球1、2、3、4分别在溶胀体系中室温孵育30min；反应完成后3000rpm/min条件下离心1min，得到量子点编码微球1、2、3、4；将得到的量子点编码微球依次用1mL清洗液、1mL无水乙醇清洗，清洗液为正丁醇和乙醇的混合液(50％正丁醇， 50％乙醇)，清洗后在3000rpm/min条件下离心1min，上述操作重复2次，之后37℃真空干燥24h，得到四种不同量子点编码的荧光微球。
B、链霉亲和素标记编码微球
取步骤A不同量子点编码后的羧基化聚苯乙烯荧光微球20mg溶解在1mL的吗啉乙磺酸缓冲液中(0.1mol/L，pH＝6.0)，同时加入1mg链霉亲和素，0.4mg碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及0.6mg N-羟基丁二酰亚胺酯(NHS)，混合后反应30min，3000rpm/min条件下离心1 min，然后使用去离子水清洗3次即可得到链霉亲和素修饰的荧光编码微球。
C、生物素标记捕获抗体1
用活化的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(Bio-NHS)标记捕获抗体1，具体如下：用1ml无水DMF溶解10mg活化的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯，取10ul加入800ul(200ug)捕获抗体1后室温孵育1h，用100mL PBS溶液(0.1mol/L，pH＝7.0)对生物素标记的捕获抗体在4℃条件下过夜透析，除去未反应的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯，即可得到生物素标记的捕获抗体2。
D、编码微球与抗体偶联
由于生物素与链霉亲和素之间高度亲和力效应，可将链霉亲和素修饰的荧光编码微球与生物素标记的捕获抗体2通过亲和作用进行结合，结合后的复合物成为探针1，探针1即可进行抗原捕获，从而建立标志物检测免疫分析方法；其中的编码微球1、2、3、4分别与癌胚抗原(CEA)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)四种肿瘤标志物的捕获抗体1偶联，分别记为CEA-探针1、SCC- 探针1、CYFRA21-1-探针1、NSE-探针1。
二、探针2的制备
用4ml PBS缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.0)充分溶解4mg荧光素APC，平分为4份，分别加入0.2mg的CEA、SCC、CYFRA21-1、NSE检测抗体1，同时均加入0.4mg碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及0.6mg N-羟基丁二酰亚胺酯(NHS)，室温孵育1h，通过SephacrylS-300 HR分子排阻纯化柱进行洗脱分离，洗脱速率1ml/min，得到APC标记的检测抗体2，即探针 2，分别记为CEA-探针2、SCC-探针2、CYFRA21-1-探针2、NSE-探针2。
三、荧光共振能量转移体系制备
荧光共振能转移体系如图1所示，其中488nm为激发波长，同时激发发射波长为565nm， 605nm和645nm的量子点，565nm和605nm的波长作为编码波长，根据565nm和605nm处不同的荧光强度即可确定编码微球1、2、3、4；若样本中存在CEA、SCC、CYFRA21-1、 NSE等待测物质时，那么CEA、SCC、CYFRA21-1、NSE就会将编码微球(探针1)和APC 标记的检测抗体(探针2)结合到一起，从而分别形成探针1-CEA-探针2、探针1-SCC-探针2、探针1-CYFRA21-1-探针2、探针1-NSE-探针2的荧光共振能量转移体系；此时，作为给体的量子点所发出的645nm的光就会被APC所吸收，吸收后APC发出680nm的荧光，此时分别检测编码微球1、2、3、4的680nm的荧光强度即可分别得出CEA、SCC、CYFRA21-1、 NSE的浓度；
本发明荧光共振能量转移体系进行多组分生物标志物检测的反应体系为：
四、工作曲线
先将不同浓度的标准品样本CEA(0.5-500ng/ml)、SCC(0.5-100ng/ml)、CYFRA21-1(0.5-100ng/ml)、NSE(0.5-250ng/ml)分别与缓冲液、探针1(CEA、SCC、CYFRA21-1、 NSE)混合后，置于37℃孵箱中恒温避光反应15min，再加入探针2(CEA、SCC、CYFRA21-1、 NSE)充分混匀，置于37℃孵箱中恒温避光反应15min，加终止液充分混匀，将该体系置于流式细胞仪上检测680nm处荧光强度，标准品样本具体取值如下表1所示。
表1标准曲线绘制各标准样本取值(浓度单位为ng/mL)
| 名称 | 浓度1 | 浓度2 | 浓度3 | 浓度4 | 浓度5 | 浓度6 | 浓度7 |
| CEA | 0 | 0.5 | 5.0 | 40 | 100 | 250 | 500 |
| SCC | 0 | 0.5 | 2 | 8 | 20 | 50 | 100 |
| CYFRA21-1 | 0 | 0.5 | 2 | 8 | 20 | 50 | 100 |
| NSE | 0 | 0.5 | 5 | 20 | 50 | 125 | 250 |
通过565和605处不同的荧光判定微球体的编码(不同量子点编码微球的流式细胞仪分析图见图6，图6中A部分为编码微球4，B为部分编码微球3，C部分为编码微球1，D部分为编码微球2)，从而决定被测肿瘤标志物的种类，记录流式细胞仪上反应体系在探针2 最大发射波长(680nm处)的荧光强度，存在CEA时F1，不存在CEA时F1 0，存在SCC时 F2，不存在CEA时F2 0，存在CYFRA21-1时F3，不存在CYFRA21-1时F3 0，存在NSE时F4，不存在NSE时F4 0，以(F-F0)对CEA、SCC、CYFRA21-1、NSE浓度分别绘制标准曲线，结果见图2至图5，拟合方程为浓度和荧光强度的取常用对数后的值。
五、待测样本检测
通过探针1-CEA、SCC、CYFRA21-1、NSE-探针2荧光共振能量转移体系，检测待测样本的荧光信号，如表2所示，将待测样本的荧光强度值带入标准曲线，即可得出待测样本中CEA、SCC、CYFRA21-1、NSE的含量。
表2待测样本中CEA、SCC、CYFRA21-1、NSE的含量表
| 名称 | 样本1<sup>a</sup> | 浓度<sup>b</sup>(ng/ml) | 样本2 | 浓度(ng/ml) |
| CEA | 1123 | 7.48 | 5327 | 42.56 |
| SCC | 438 | 1.18 | 3364 | 10.33 |
| CYFRA21-1 | 874 | 4.16 | 5709 | 34.12 |
| NSE | 1753 | 10.86 | 10183 | 100.25 |
a：测试样本的680nm处荧光强度
b：将荧光强度取对数后分别带入拟合方程进行计算，计算出的结果再次进行指数计算即可得到浓度值。
以对于CAE，荧光强度1123进行说明：
CEA的拟合方程为y＝2.267+0.896x
Lg(1123)＝3.05，即3.05＝2.267+0.896x，求得x＝0.874
那么CEA的浓度为100.874＝7.48(ng/ml)。
Claims (9)
1.基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
一、探针1的制备
A、制备不同种类的荧光编码微球，所述荧光编码微球的种类与待检测肿瘤标志物的数量相对应；
B、分别用链霉亲和素标记步骤A制备的荧光编码微球；
C、用生物素标记捕获抗体，所述捕获抗体为待检测的肿瘤标志物的捕获抗体；
D、将步骤B链霉亲和素标记的编码微球与步骤C生物素标记的捕获抗体偶联，不同肿瘤标志物与不同种类的荧光编码微球相结合，通过荧光编码微球的荧光强度识别肿瘤标志物；
二、探针2的制备
用荧光染料标记检测抗体，所述检测抗体与捕获抗体为配对抗体；
三、荧光共振能量转移体系进行多组分生物标志物检测的反应体系为：
在上述反应体系中，当加入样本或标准品中存在肿瘤标志物时，就会被所对应的荧光编码微球捕获，探针1与探针2结合到一起，形成荧光共振能量转移体系；此时，通过编码波长的荧光强度判定编码微球，决定被测肿瘤标志物的种类；通过将检测的编码微球在探针2最大发射波长的荧光强度带入工作曲线，即可得出不同种类肿瘤标志物的浓度；
四、工作曲线
先将浓度为0.05-30ng/ml的不同浓度的肿瘤标志物标准品样本分别与缓冲液、探针1混合后，置于孵箱中恒温避光反应，再加入探针2充分混匀，置于孵箱中恒温避光反应，加终止液充分混匀，将该体系置于流式细胞仪上检测探针2最大发射波长的荧光强度，通过编码波长的荧光强度判定编码微球，决定被测肿瘤标志物的种类；记录流式细胞仪上反应体系在探针2最大发射波长的荧光强度，存在肿瘤标志物时F，不存在肿瘤标志物时F0，以(F-F0)对不同肿瘤标志物浓度分别绘制标准曲线，拟合方程为浓度和荧光强度的取常用对数后的值；
五、待测样本检测
通过荧光共振能量转移体系检测待测样本的荧光信号，将待测样本的荧光信号值带入标准曲线，得出待测样本中不同种类肿瘤标志物的含量。
2.权利要求1所述的基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，步骤A中制备荧光编码微球的方法为：取羧基化聚苯乙烯微球，用溶胀液清洗羧基化聚苯乙烯微球，将清洗后的羧基化聚苯乙烯微球平均分成几份，分别向编码微球中加入发射波长565nm的量子点和发射波长605nm的量子点进行编码，加入发射波长645nm的量子点为荧光染料荧光共振能量转移提供能量，加入量子点后的编码微球分别在溶胀体系中室温孵育，反应完成后离心处理，得到量子点编码微球，将得到的量子点编码微球清洗、离心、真空干燥，即得到不同量子点编码的荧光微球。
3.权利要求1所述的基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，步骤B中链霉亲和素标记编码微球的方法为：取步骤A不同量子点编码后的羧基化聚苯乙烯荧光微球，溶解在吗啉乙磺酸缓冲液中，同时加入链霉亲和素，碳二亚胺盐酸盐以及N-羟基丁二酰亚胺酯，混合后反应，之后离心，清洗，即可得到链霉亲和素修饰的荧光编码微球。
4.权利要求1所述的基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，步骤C中用生物素标记捕获抗体的方法为：用无水DMF溶解活化的生物素，加入捕获抗体后室温孵育，用PBS溶液对生物素标记的捕获抗体过夜透析，除去未反应的生物素，即可得到生物素标记的捕获抗体。
5.权利要求1所述的基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，步骤二中荧光染料标记检测抗体1的方法为：用PBS缓冲液充分溶解荧光素APC，平分为4份，分别加入CEA、SCC、CYFRA21-1、NSE检测抗体1，同时均加入碳二亚胺盐酸盐以及N-羟基丁二酰亚胺酯，室温孵育，通过纯化柱进行洗脱分离，得到APC标记的检测抗体，即探针2。
6.权利要求1所述的基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤三中的终止液为含0.1％SDS的PBS缓冲液。
7.权利要求2所述的基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述步骤A中的编码微球为四种，记为编码微球1、2、3、4；编码微球1中加入5μL发射波长565nm的量子点、5μL发射波长645nm的量子点；编码微球2中加入3μL发射波长565nm的量子点、7μL发射波长605nm的量子点、5μL发射波长645nm的量子点；编码微球3中加入7μL发射波长565nm的量子点、3μL发射波长605nm的量子点、5μL发射波长645nm的量子点；编码微球4中加入5μL发射波长605nm的量子点、5μL发射波长645nm的量子点；步骤C中的捕获抗体为CEA、SCC、CYFRA21-1、NSE的捕获抗体1；编码微球1、2、3、4分别与CEA、SCC、CYFRA21-1、NSE的捕获抗体偶联，得探针1。
8.权利要求2所述的基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，溶胀液为5％氯仿和95％正丁醇的混合液。
9.权利要求2所述的基于流式细胞术的联合检测肺癌肿瘤标志物的方法，其特征在于，所述量子点为CdSe量子点。
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