JP4986449B2 - 浮遊細胞の検査方法 - Google Patents
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Description
上記した市販のECKIT(商品名)を用い、その添付文書に記載された通りの操作を行い末梢血中のCTC数を測定した。すなわち、キットに含まれる専用採血管で乳癌患者から末梢血10mlを採血した。次に、採血した血液7.5mlをチューブに移し、キットに含まれる希釈バッファー6.5mlを加えた。その後、転倒混和をおこない、800g、10分間、室温で遠心した。遠心後、チューブをCellTracks (商品名)AutoPrep Systemの機器にかけた。機器の操作は、機器使用説明書に従った。ここで、上記した、磁性ビーズへのCTCの結合、PE標識抗サイトケラチンモノクローナル抗体及びAPC標識抗CD45モノクローナル抗体による細胞表面の蛍光染色並びにDAPIによる核の染色が自動的に行なわれる。次にCellTracks(商品名) AnalyzerIIを用いて、機器手順書に従い操作し、CTC数を計測した。ここでは、磁気ビーズ上に結合し、細胞表面がPE標識抗サイトケラチンモノクローナル抗体で染色され、APC標識抗CD45モノクローナル抗体で染色されず、核がDAPIで染色された細胞が自動的に計数される。
CTC計数後、専用カートリッジからサンプルをピペットでとり、サイトスピン法で固定した。すなわち、CTC計数後、専用カートリッジからサンプルをピペットでとり、サイトスピン専用カートリッジに入れた。1400rpm、10分間室温で遠心し、細胞をスライドガラス上に貼り付けた。遠心後、細胞をドライヤーで乾燥した。
FISH法は、EGFR遺伝子を検出するための、上記した市販のキットである「LSI EGFR/CEP 7 Dual Color Probe」(商品名)を用い、キットの添付文書に従って行なった。すなわち、細胞を固定したスライドを73-74℃の70%ホルムアミド/2xSSC溶液中に入れ、2分間静置した。直ちに、スライドを氷温の70%エタノールに中に入れ、5分間静置した。次に、スライドを氷温の100%エタノールに入れ替え、5分間以上静置した。スライドをドライヤーで乾燥させた。スライド1枚につき、キットに含まれるEGFR DNAプローブとCEP7 DNAプローブの溶液2μLを0.5mlのマイクロチューブに加え、恒温槽で75℃、5分間暖めた。マイクロチューブを直ちに氷中に移し、5分間以上静置した。このプローブ溶液をスライドに固定されている細胞に2μLを滴下した。気泡が入らないように注意して、カバーガラスを載せた。次に、カバーガラスより一回り大きいパラフィルム(商品名)を載せ、ボンドで封入した。モイスト・チェンバーにスライドを移し、37℃のインキュベーターで一晩反応させた。パラフィルム(商品名)を剥がし、室温の2xSSC溶液に入れ、カバーガラスが自然に剥がれるのを待った。45-47℃の50% Formamid/2xSSC溶液で15分間洗浄した。続いて、45-47℃の2xSSC溶液で10分間、45-47℃の2xSSC/0.1%Tween 20溶液で5分間洗浄した。洗浄後、ドライヤーで乾燥させた。乾燥させたスライドに、DAPI封入剤で封入した。なお、FISH法は、CTC計数から24時間経過後に操作を開始した。
解析は、蛍光顕微鏡で、倍率1000倍で観察することにより行なった。核はDAPIにより弱い青色に染色され、EGFR DNAプローブ及びCEP7 DNAプローブがハイブリダイズした位置は、細胞表面の蛍光標識に妨害されることなく明瞭に観察することができた。
Claims (6)
- 細胞表面抗原が蛍光染色された浮遊細胞を、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法に供し、次いで細胞の核にピントを合わせて核を蛍光顕微鏡で観察することを含む、浮遊細胞の検査方法であって、前記浮遊細胞が、血液中を循環している癌細胞であり、前記蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法に供される浮遊細胞は、核も蛍光染色されたものであり、かつ、前記蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法における観察を、細胞表面抗原の蛍光染色後15時間以上経過した後に行なう、浮遊細胞の検査方法。
。 - 前記癌細胞が乳癌細胞である請求項1記載の方法。
- 前記表面抗原がサイトケラチンである請求項2記載の方法。
- 前記蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法に用いるプローブが、EGFR遺伝子とハイブリダイズする、EGFR/遺伝子検出用プローブ又はHER-2/neu遺伝子とハイブリダイズする、HER-2/neu遺伝子検出用プローブである請求項2又は3記載の方法。
- 前記蛍光顕微鏡による観察は、蛍光顕微鏡を最大倍率にして行なう請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 倍率を1000倍にして行なう請求項5記載の方法。
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