KR20110111377A - 혈액 시료 중의 암세포의 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암세포의 존재가 의심되는 혈액 시료를 종양 용해성 바이러스와 인큐베이트함으로써 적어도 상기 암세포 내에서 종양 용해성 바이러스를 증식시키는 공정, 증식 공정에서 처리된 혈액 시료와, 고정화제와, 비이온성 계면활성제를 혼합하는 공정 및 혼합 공정으로부터 얻어진 혈액 시료에 포함되는 종양 용해성 바이러스가 증식한 암세포를 검출하는 공정을 포함하는 혈액 시료 중의 암세포의 검출 방법에 관한 것이다.

Description

혈액 시료 중의 암세포의 검출 방법{METHOD FOR DETECTING CANCER CELLS IN BLOOD SAMPLE}
본 발명은 혈액 시료 중의 암세포의 검출 방법에 관한 것이다. 또, 본 발명은 상기 방법에서 이용할 수 있는 시약 키트에 관한 것이다.
암의 전이는 원발소의 암세포가 혈관이나 림프관을 통해 전신에 퍼져, 상기 세포의 일부가 타부위의 장기 등에 생착하여 증식함으로써 일어난다고 생각되고 있다. 이와 같이 혈중을 순환하는 암세포는 CTC(Circulating Tumor Cell)로 불리고 있다. 혈액 중의 CTC 수는 암의 전이 및 예후와 상관있다는 것이 보고되어 있어, CTC 수의 측정은 전이성암, 예를 들면 전이성 유방암의 예후 및 치료 효과를 예측하는데 유용하다고 생각되고 있다.
종래의 CTC 검출 방법으로서, 암세포에 대한 항체에 의해 혈액 중의 암세포를 포착하고, 포착한 암세포를 형광 표식 항체 등으로 표식하여 검출하는 방법이 알려져 있다(일본 특개2007-178193호(특허문헌 1) 및 일본 특표2002-503814호(특허문헌 2)를 참조).
또, 암세포에 있어서는 텔로머라제(telomerase)의 활성이 항진되어 있지만, 정상세포의 대부분에 있어서는 상기 활성이 거의 검출되지 않는 것을 이용하는 기술도 알려져 있다. 구체적으로는, 텔로머라제 프로모터를 포함하는 복제 카세트와 표식 단백질(예를 들면 녹색 형광 단백질(GFP)) 유전자를 포함하는 표식 발현 카세트를 갖는 바이러스(종양 용해성 바이러스(Oncolytic Virus))를 암세포내에서 증식시킴으로써 암세포를 특이적으로 표식하는 기술이 있다(일본 특개2004-33186호(특허문헌 3) 및 국제공개 제2006/36004호(특허문헌 4)를 참조).
GFP 유전자를 갖는 종양 용해성 바이러스는 텔로메스칸(등록상표)(OBP-401)으로 시판되고 있다. 텔로메스칸(등록상표)은 암세포 내에서 특이적으로 증식하여 GFP를 생산함으로써 암세포를 특이적으로 형광 발광시킬 수 있다.
일본 특개2007-178193호 공보 일본 특표2002-503814호 공보 일본 특개2004-33186호 공보 국제공개 제2006/36004호 팸플릿
텔로메스칸(등록상표)과 같은 종양 용해성 바이러스는 정상적인 혈구계 세포에 대한 감염·증식율이 낮고, 또한 「생존」 암세포 내에서 특이적으로 증식할 수 있으므로, 종양 용해성 바이러스를 이용하여 혈액 중의 「생존」 암세포, 즉 CTC를 검출할 수 있다고 생각된다.
그렇지만, 종양 용해성 바이러스를 이용하여 혈액 중의 암세포를 검출하는 시스템을 확립하기 위해서는 다음과 같은 해결해야 할 과제가 존재한다.
- 적혈구의 제거: 혈액 중에 존재하는 암세포의 수는 매우 적다. 따라서, 혈액 중에 다량으로 존재하는 적혈구에 의해 암세포가 차폐되어 암세포의 검출을 방해할 가능성이 있다.
- 위양성 신호의 억제: 정상적인 혈구계 세포임에도 불구하고 종양 용해성 바이러스가 증식할 수 있는 세포, 예를 들면 백혈구(일부의 단구 및 림프구)가 드물게 존재한다. 이와 같은 정상세포 내에서 종양 용해성 바이러스가 증식하면 암세포의 검출에 위양성의 신호를 줄 가능성이 있다.
본 발명자들은 이러한 과제를 해결하기 위해 검토한 결과, 종양 용해성 바이러스를 증식시킨 혈액 시료를 고정화제 및 비이온성 계면활성제로 처리함으로써 적혈구를 제거할 수 있고, 또한 정상세포, 예를 들면 백혈구로부터의 위양성 신호를 저감할 수 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은
암세포의 존재가 의심되는 혈액 시료를 종양 용해성 바이러스와 인큐베이션함으로써 적어도 상기 암세포 내에서 종양 용해성 바이러스를 증식시키는 공정,
증식 공정에서 처리된 혈액 시료와, 고정화제와, 비이온성 계면활성제를 혼합하는 공정, 및
혼합 공정에서 얻어진 혈액 시료에 포함되는 종양 용해성 바이러스가 증식 한 암세포를 검출하는 공정을 포함하는 혈액 시료 중의 암세포의 검출 방법을 제공한다.
또, 본 발명은 종양 용해성 바이러스를 함유하는 제1 시약, 고정화제를 함유하는 제2 시약 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 제3 시약을 포함하는 혈액 시료 중의 암세포의 검출용 시약 키트도 제공한다.
본 발명의 방법 및 시약 키트에 의해 혈액 시료 중에 존재하는 미량의 암세포, 즉 CTC를 간편하고, 감도 좋게, 또한 정밀도 좋게 검출하는 것이 가능해진다.
도 1은 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3 및 비교예 1에서 측정된 형광 강도를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 실시예 4에 있어서, 계면활성제로 에마르겐 2025G를 이용한 경우의 현미경 사진이다. 또한, 도면 중의 「WBC」는 백혈구의 약어이다.
도 2b는 실시예 4에 있어서, 계면활성제로 니콜 BL-9EX를 이용한 경우의 현미경 사진이다.
도 2c는 실시예 4에 있어서, 계면활성제로 니콜 BO-20V를 이용한 경우의 현미경 사진이다.
도 2d는 실시예 4에 있어서, 계면활성제로 니콜 BT-12를 이용한 경우의 현미경 사진이다.
도 2e는 실시예 4에 있어서, 계면활성제로 에마르겐 2020G를 이용한 경우의 현미경 사진이다.
도 2f는 실시예 4에 있어서, 계면활성제로 닛산카치온 AB600을 이용한 경우의 현미경 사진이다.
도 2g는 실시예 4에 있어서, 계면활성제로 닛산카치온 BB를 이용한 경우의 현미경 사진이다. 또한, 도면 중의 「RBC」는 적혈구의 약어이다.
도 2h는 비교예 2에서 얻어진 현미경 사진이다.
본 발명에 있어서, 혈액 시료 중의 암세포(CTC)는 고형암으로부터 탈락하여 말초혈 중에 들어온 암세포뿐만 아니라 혈액암도 포함하며, 텔로머라제 활성을 갖는 암세포이면 특별히 제한되지 않는다. 본 실시형태의 방법 및 시약 키트에 의해 검출되는 CTC는 특별히 한정되지 않지만, 고형암 유래의 CTC가 바람직하고, 유방암 유래의 CTC가 보다 바람직하다.
<종양 용해성 바이러스>
본 명세서에 있어서, 「종양 용해성 바이러스」란 정상세포 내에서는 통상 증식하지 못하고, 생존해 있는 암세포 내에서 특이적으로 증식 가능한 제한 증식형 바이러스를 말한다.
그러나, 제한 증식형으로 하기 위한 기구에 따라서는 종양 용해성 바이러스가 정상세포 내에서도 증식할 가능성이 부정되지 않는 것은 당업자에게 명확하게 인식된다.
즉, 종양 용해성 바이러스는 암세포 내에서 특이적으로 증식 가능하게 하는 기구, 예를 들면 암세포에서 특이적으로 프로모터 활성을 나타내는 프로모터를 가짐으로써 암세포 내에서 특이적으로 증식할 수 있지만, 정상세포 중에도 이 프로모터를 기능시킬 수 있는 세포가 존재할 수 있다(예를 들면 백혈구). 이와 같은 정상세포는 종양 용해성 바이러스가 증식한 세포를 암세포로서 검출하는 암세포의 검출 방법에 있어서는 암세포로 검출될 수 있으므로, 위양성의 결과를 도출할 가능성이 있다.
그렇지만, 본 발명의 방법에서는 혈액 시료를 고정화제 및 비이온성 계면활성제와 혼합하는 처리를 수행함으로써, 종양 용해성 바이러스가 증식한 암세포에 영향을 주지 않고 정상세포에 선택적으로 손상을 주므로, 상기 정상세포로부터 생길 수 있는 위양성의 신호를 저감할 수 있다.
아울러, 본 발명의 방법에서는 상기의 처리에 의해 혈액 시료 중의 적혈구도 용혈할 수 있으므로, 혈액 시료 중에 미량밖에 존재하지 않을 가능성이 있는 암세포를 보다 높은 감도로 검출할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 세포에 「손상을 준다」란 대상 세포의 세포막의 적어도 일부분을 파괴하여 세포내 성분을 용출시키는 것을 말한다.
또, 본 명세서에 있어서, 「적혈구가 용혈한다」란 적혈구의 세포막이 가용화되는 것을 말한다.
종양 용해성 바이러스로는, 한정되지 않지만, 암세포에서 특이적으로 프로모터 활성을 나타내는 프로모터가 편입된 바이러스를 들 수 있다. 암세포에서 특이적으로 프로모터 활성을 나타내는 프로모터(이하, 「암세포 특이적 프로모터」라고도 말함)로는 인간 텔로머라제 프로모터, 인간 전립선암 특이 항원(PSA) 프로모터, 인간 알파단백질(AFP) 프로모터, 태아성 암항원(CEA) 프로모터 등을 들 수 있다. 많은 종류의 암세포에서 프로모터 활성을 나타낼 수 있다는 점에서 인간 텔로머라제 프로모터가 바람직하다. 그 중에서도 인간 텔로머라제 역전사효소를 코드하는 유전자인 hTERT의 프로모터가 보다 바람직하다.
hTERT 프로모터의 핵산 서열을 서열번호 1에 나타낸다. hTERT 프로모터로는 서열번호 1에 나타내는 455 bp의 핵산 서열의 전체라도 되지만, 그 중의 5' 상류의 181 bp의 영역이 하류의 유전자 발현에 중요한 코어 영역이라고 생각되므로, 이 코어 영역을 적어도 포함하는 핵산 서열을 이용하면 된다.
상기의 종양 용해성 바이러스는 표식 단백질을 발현하는 것이 바람직하다. 즉, 상기의 종양 용해성 바이러스는 표식 단백질을 코드하는 유전자를 갖는 것이 바람직하다. 본 명세서에 있어서, 「표식 단백질」이란 세포 내에서 발현됨으로써 상기 단백질이 발현되어 있지 않은 다른 세포와의 구별을 가능하게 하는 검출 가능한 단백질을 말한다. 표식 단백질로는 생화학 분야에서 통상 이용되는 표식 단백질을 이용할 수 있고, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 그 변이체(예를 들면 Enhanced-humanized GFP(EGFP), red-shift GFP(rsGFP)), 황색 형광 단백질(YFP), 청색 형광 단백질(BFP) 등의 형광 단백질 등을 이용할 수 있다.
표식 단백질은 녹색 형광 단백질이 바람직하다.
상기의 표식 단백질의 유전자는 상기의 암세포 특이적 프로모터의 제어 하에 둘 수 있다. 또, 상기의 표식 단백질의 유전자는 종양 용해성 바이러스 내에서 프로모터 활성을 나타낼 수 있는 프로모터의 제어 하에 둘 수도 있다.
표식 단백질 유전자의 발현을 제어할 수 있는 프로모터로는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 후기 프로모터, MMTV LTR 프로모터, RSV LTR 프로모터, SRα 프로모터 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 표식 단백질의 유전자는 CMV 프로모터 또는 hTERT 프로모터의 제어 하에 두는 것이 바람직하다. 이들 프로모터의 핵산 서열은 공지이다.
상기의 표식 단백질을 코드하는 유전자와 그것을 발현하기 위한 프로모터(암세포 특이적 프로모터 또는 종양 용해성 바이러스 내에서 프로모터 활성을 나타낼 수 있는 프로모터)를 적어도 포함하는 발현 카세트는 통상의 유전자 공학적 수법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 표식 단백질을 코드하는 유전자 및 프로모터를 공지의 서열에 기초하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 등에 의해 증폭시키고, 얻어진 각 유전자의 증폭 산물을 적절한 플라스미드에 연결하고, 필요한 부분을 잘라 냄으로써 발현 카세트를 얻을 수 있다(예를 들면, 국제공개 2006/36004호 참조).
상기의 종양 용해성 바이러스는 상기의 암세포 특이적 프로모터의 하류에 바이러스의 증식에 필요한 유전자를 연결한 복제 카세트를 갖는 것이라도 된다. 바이러스의 증식에 필요한 유전자로는 초기 유전자(E1A, E1B 등), 피코르나바이러스 과에 특이적인 단백질 합성 개시 신호인 IRES 등을 들 수 있다. 이들 유전자의 핵산 서열은 공지이다.
상기의 복제 카세트는 통상의 유전자 공학적 수법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들면, 상기의 암세포 특이적 프로모터 및 필요에 따라 바이러스의 증식에 필요한 유전자를 공지의 서열에 기초하여 PCR 등에 의해 증폭시키고, 얻어진 각 유전자의 증폭 산물을 적절한 플라스미드에 연결하고, 필요한 부분을 잘라 냄으로써 복제 카세트를 얻을 수 있다(예를 들면, 국제 공개 2006/36004호 참조).
상기의 바이러스로는 아데노바이러스, 단순 헤르페스바이러스, 센다이바이러스, 레오바이러스에서 유래하는 것을 들 수 있다. 그 중에서도 인간 아데노바이러스가 바람직하다.
상기의 종양 용해성 바이러스는 시판되는 것을 이용할 수도 있다. 종양 용해성 바이러스로는 hTERT 프로모터, E1A 유전자, IRES 유전자 및 E1B 유전자를 포함하는 복제 카세트와 CMV 프로모터 및 GFP 유전자를 포함하는 발현 카세트를 갖는 아데노바이러스인 텔로메스칸(등록상표)(OBP-401)(온콜리스 바이오파마 주식회사)이 바람직하다.
<증식 공정>
본 발명의 방법은 암세포의 존재가 의심되는 혈액 시료를 상기의 종양 용해성 바이러스와 인큐베이트하여 혈액 시료 중의 적어도 암세포 내에서 종양 용해성 바이러스를 증식시키는 공정(이하, 「증식 공정」이라고도 말함)을 포함한다.
상기의 혈액 시료는 통상 암의 이환이 의심되는 환자, 암환자 등의 암세포의 존재를 검출하려고 하는 피험자로부터 채취될 수 있다. 혈액 시료는 전혈 및 전혈을 사전 처리하여 얻어진 처리 혈액 중 어느 것이라도 되지만, 검출 효율이 보다 향상된다는 점에서 전혈, 특히 말초혈로부터 혈청을 제거한 것이 바람직하다.
전혈로부터 혈청을 제거하는 방법은 공지이며, 예를 들면 항응고제(예를 들면 에틸렌디아민 4아세트산, 구연산나트륨, 헤파린 등)를 첨가한 전혈을 원심분리하는 방법을 들 수 있다. 원심분리는 500∼3,500 rpm, 3∼30분간 수행하는 것이 바람직하다.
상기의 혈액 시료와 종양 용해성 바이러스의 인큐베이트는 동물세포 배양에 통상 사용되는 배지의 존재 하에 수행하는 것이 바람직하다. 상기 배지로는 RPMI-1640, 둘베코 개변 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지(MEM) 등을 들 수 있다.
상기의 종양 용해성 바이러스는 혈액 시료 1 ㎖ 당 6×104∼6×108 PFU(Plaque Forming Unit)의 양으로 혈액 시료와 인큐베이트하는 것이 바람직하다.
상기의 혈액 시료를 종양 용해성 바이러스와 인큐베이트하는 시간 및 온도는 종양 용해성 바이러스가 혈액 시료 중의 적어도 암세포 내에서 증식할 수 있는 조건이면 되고, 종양 용해성 바이러스의 종류에 따라 적당히 조절할 수 있다. 그러한 인큐베이트의 조건은 바람직하게는 25∼40℃의 온도에서 1∼36시간, 보다 바람직하게는 30∼37℃에서 12∼24시간 수행된다.
상기의 인큐베이션에 의해 종양 용해성 바이러스는 혈액 시료 중에 포함될 수 있는 암세포에 감염하여 상기 세포 내에서 증식할 수 있다.
그러나, 혈액 시료 중에 존재하는 백혈구(단구, 림프구 등)도 텔로머라제와 같은 암세포가 특이적으로 발현하는 효소를 드물게 발현한다. 따라서, 상기의 인큐베이션에 의해 이와 같은 정상적인(암세포가 아닌) 백혈구에 있어서도 종양 용해성 바이러스가 증식할 가능성이 있다.
<혼합 공정>
본 발명의 방법은 상기의 증식 공정에서 처리된 혈액 시료를 고정화제 및 비이온성 계면활성제와 혼합하는 공정(이하, 「혼합 공정」이라고도 말함)을 포함한다.
혼합 공정에 있어서는 혈액 시료와 비이온성 계면활성제를 혼합한 후에 고정화제를 혼합해도 되고, 혈액 시료와 고정화제를 혼합한 후에 비이온성 계면활성제를 혼합해도 되며, 혈액 시료, 고정화제 및 비이온성 계면활성제를 동시에 혼합해도 된다. 보다 바람직한 혼합 순서로는 혈액 시료와 고정화제를 혼합한 후에 비이온성 계면활성제를 혼합하는 순서이다.
상기의 혈액 시료는 고정화제 및 비이온성 계면활성제의 혼합 전에 원심분리 등에 의해 세포 화분(畵分) 이외의 화분을 제거한 것이어도 된다.
상기의 혼합 공정에 있어서, 혈액 시료와 혼합한 때의 비이온성 계면활성제의 농도는 암세포에 손상을 주지 않고 백혈구에 손상을 주는 농도인 것이 바람직하다. 이와 같은 농도는 비이온성 계면활성제의 종류에 의해 적당히 결정할 수 있지만, 바람직하게는 0.003∼0.4 중량%, 보다 바람직하게는 0.030∼0.037 중량%이다.
또한, 본 명세서에 있어서, 「혈액 시료와 혼합한 때의 비이온성 계면활성제의 농도」란 「혈액 시료와 비이온성 계면활성제를 직접 혼합한 경우의 농도」에 추가하여 「비이온성 계면활성제를 혈액 시료 및 고정화제의 혼합물에 혼합한 경우의 농도」도 포함하는 것을 의도한다. 즉, 혼합 공정에 있어서, 혈액 시료와 고정화제를 혼합한 후에 비이온성 계면활성제를 혼합하는 경우, 상기의 농도는 혈액 시료, 고정화제 및 비이온성 계면활성제의 혼합액에서의 비이온성 계면활성제의 농도를 나타낸다.
상기의 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌계 계면활성제 및 폴리옥시 화합물의 지방산 에스테르계 계면활성제의 어느 것이라도 되지만, 폴리옥시에틸렌계 계면활성제가 바람직하다. 폴리옥시에틸렌계 계면활성제로는 고급 알코올·에틸렌옥시드 부가물, 알킬페놀·에틸렌옥시드 부가물, 고급 지방산·에틸렌옥시드 부가물, 고급 지방족 아민·에틸렌옥시드 부가물, 고급 지방산 아미드·에틸렌옥시드 부가물 등을 들 수 있다. 그 중에서도 고급 알코올·에틸렌옥시드 부가물이 바람직하다.
고급 알코올·에틸렌옥시드 부가물의 고급 알코올의 알킬기는 직쇄상 및 분지쇄상의 어느 것이라도 되고, 바람직하게는 탄소수가 12∼30, 보다 바람직하게는 15∼25이다. 고급 알코올·에틸렌옥시드 부가물은 바람직하게는 에틸렌옥시드의 중합수가 15∼40, 보다 바람직하게는 20∼30이다.
보다 구체적인 고급 알코올의 알킬기가 분기쇄인 고급 알코올·에틸렌옥시드 부가물을 이하의 식 (Ⅰ)에 나타낸다.
식 (Ⅰ)
Figure pct00001
(식 중, l은 6∼24의 정수, m은 1∼19의 정수 및 n은 15∼40의 정수이다)
비이온성 계면활성제로는 고급 알코올의 알킬기가 분기쇄이고, 탄소수가 20이며, 에틸렌옥시드의 중합수가 25인 폴리옥시에틸렌 옥틸도데실 에테르가 바람직하다.
상기의 혼합 공정에 있어서, 혈액 시료와 혼합한 때의 고정화제의 농도는 적혈구를 용혈하는 농도인 것이 바람직하다. 이와 같은 농도는 바람직하게는 1∼7 중량%, 보다 바람직하게는 2∼4 중량%이다.
또한, 본 명세서에 있어서, 「혈액 시료와 혼합한 때의 고정화제의 농도」란 「혈액 시료와 고정화제를 직접 혼합한 경우의 농도」에 추가하여 「고정화제를 혈액 시료 및 비이온성 계면활성제의 혼합물에 혼합한 경우의 농도」도 포함하는 것을 의도한다. 즉, 혼합 공정에 있어서, 혈액 시료와 비이온성 계면활성제를 혼합한 후에 고정화제를 혼합하는 경우, 상기의 농도는 혈액 시료, 고정화제 및 비이온성 계면활성제의 혼합액에서의 고정화제의 농도를 나타낸다.
상기의 고정화제로는 조직의 고정을 위해 통상 이용되는 단백질을 가교시키는 물질을 이용할 수 있고, 파라포름알데히드, 글루타르알데히드, 포름알데히드 등의 알데히드 화합물이 바람직하다. 그 중에서도 파라포름알데히드가 보다 바람직하다.
혼합 공정은 암세포에 손상을 주지 않는 조건 하에서 수행하는 것이 바람직하다. 이와 같은 조건으로는 pH 6∼9, 침투압 200∼400 mOsm이 바람직하다.
<검출 공정>
본 발명의 방법은 혼합 공정으로부터 얻어진 혈액 시료에 포함되는 종양 용해성 바이러스가 증식한 암세포를 검출하는 공정(이하, 「검출 공정」이라고도 말함)을 포함한다.
검출 공정은 종양 용해성 바이러스가 증식함으로써 발현되는 상기의 표식 단백질을 검출하는 공정인 것이 바람직하다.
표식 단백질을 검출하는 방법은 표식 단백질의 종류에 따라 적당히 선택할 수 있다. 표식 단백질이 형광 단백질인 경우, 형광 현미경 하에서의 관찰, 플로우 사이토미터에 의한 검출 등에 의해 표식 단백질을 검출할 수 있다.
형광 현미경 하에서의 관찰은, 예를 들면, 혼합 공정으로부터 얻어진 혈액 시료를 이용하여 통상의 방법에 의해 슬라이드 글래스에 대한 도말 표본을 제작하고, CCD 카메라를 구비한 형광 현미경 하에서 도말 표본을 관찰하여 형광을 발하는 세포를 검출하고, 필요에 따라 계수함으로써 수행할 수 있다.
플로우 사이토미터를 이용하는 검출은, 예를 들면, 혼합 공정으로부터 얻어진 혈액 시료를 형광을 검출할 수 있는 플로우 사이토미터에 제공하여 형광을 발하는 세포를 검출하고, 필요에 따라 계수함으로써 수행할 수 있다.
<추가 공정>
본 발명의 방법은 추가로 죽은 세포의 염색 공정을 포함할 수 있다. 이와 같은 공정을 포함함으로써 「생존해 있는」 암세포와 「죽어 있는」 암세포를 검출할 수 있어 혈액 시료 중의 암세포의 생존율을 산출할 수 있다. 이 공정은 혈액 시료를 고정화제 및 비이온성 계면활성제와 혼합하는 공정의 전에 수행하는 것이 바람직하다.
죽은 세포를 염색하는 공정은 죽은 세포를 특이적으로 염색하는 시약과 혈액 시료를 접촉시킴으로써 수행할 수 있다. 「죽은 세포를 특이적으로 염색하는 시약」이란 생존 세포와는 구별 가능하게 죽은 세포를 염색하는 시약인 것이다. 죽은 세포를 특이적으로 염색하는 시약으로는 시판되는 키트를 이용할 수 있고, 예를 들면 Live/Dead Fixable Red Dead Cell Stain Kit(Invitrogen사)가 바람직하다.
<시약 키트>
본 발명은 혈액 시료 중의 암세포를 검출하기 위한 시약 키트도 제공한다. 본 발명의 시약 키트는 상기의 종양 용해성 바이러스를 함유하는 제1 시약과, 상기의 고정화제를 함유하는 제2 시약과, 상기의 비이온성 계면활성제를 포함하는 제3 시약을 포함한다.
상기의 제1 시약, 제2 시약 및 제3 시약은 액체의 형태라도 되고, 사용시에 적절한 용매를 첨가함으로써 액체로 할 수 있는 고체의 형태라도 된다.
상기의 제1 시약은 액체의 형태로 혈액 시료와 인큐베이트할 때에 혈액 시료 1 ㎖ 당 6×104∼6×108 PFU 양의 종양 용해성 바이러스를 제공하게 되는 농도로 종양 용해성 바이러스를 포함하는 것이 바람직하다.
상기의 제2 시약은 혈액 시료와 혼합할 때에 적혈구를 용혈하는 농도가 되는 양으로 고정화제를 포함하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 제2 시약은 혈액 시료와 혼합할 때에, 바람직하게는 1∼7 중량%, 보다 바람직하게는 2∼4 중량%의 고정화제의 농도가 되는 양으로 고정화제를 포함한다. 또한, 혈액 시료와 제3 시약을 먼저 혼합한 경우, 혈액 시료, 제2 시약 및 제3 시약의 혼합액에서의 고정화제의 농도가 상기의 농도가 되도록 제2 시약은 고정화제를 포함한다.
상기의 제3 시약은 혈액 시료와 혼합한 때에 암세포에 손상을 주지 않고 백혈구에 손상을 주는 농도가 되는 양으로 비이온성 계면활성제를 포함하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 제3 시약은 혈액 시료와 혼합한 때에, 바람직하게는 0.003∼0.4 중량%, 보다 바람직하게는 0.030∼0.037 중량%의 비이온성 계면활성제의 농도가 되는 양으로 비이온성 계면활성제를 포함한다. 또한, 혈액 시료와 제2 시약을 먼저 혼합한 경우, 혈액 시료, 제2 시약 및 제3 시약의 혼합액에서의 비이온성 계면활성제의 농도가 상기의 농도가 되도록 제3 시약은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
상기의 제2 시약 및 제3 시약은 혈액 시료와 혼합한 때에 암세포에 손상을 주지 않는 조건으로 하기 위한 적절한 완충제 및 침투압 조정제를 포함할 수 있다. 암세포에 손상을 주지 않는 조건은 pH 6∼9, 침투압 200∼400 mOsm가 바람직하다. 따라서, 상기의 완충제로는 인산 생리 완충액(PBS), 구연산 완충액, HEPES 등을 이용할 수 있다. 또, 침투압 조정제로는 에틸렌글리콜, 염화나트륨 등을 이용할 수 있다.
이하에 실시예를 이용하여 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
1. 단핵구 화분에 대한 종양 용해성 바이러스의 증식에 의한 영향
종양 용해성 바이러스를 이용하는 혈액 시료 중의 암세포의 검출에 있어서는 시료 중의 단핵구 내에서 종양 용해성 바이러스가 증식하면 단핵구가 암세포로서 검출되어 버린다.
이에, 인간 대상으로부터 채취한 혈액으로부터 단핵구 화분을 회수하고, 이 화분에 본 발명의 방법에 의한 처리(고정화제 및 비이온성 계면활성제에 의한 처리)를 수행함으로써, 단핵구에 의한 검출에 대한 영향을 저감할 수 있는지 여부를 검토하였다. 또한, 단핵구란 단구 및 림프구의 총칭이다.
(실시예 1)
<단핵구 화분의 조제>
진공 채혈관(베노젝트(등록상표) II 진공 채혈관(4.5 ㎖), 3.8% 구연산나트륨 함유, 테르모 주식회사)을 이용하여 2명의 건강한 여성으로부터 혈액을 채취하였다. 채취로부터 2시간 이내의 혈액 5.0 ㎖를 단핵구를 분리하기 위한 시약인 Polymorphprep(상표)(제일화학약품 주식회사) 5.0 ㎖를 미리 넣은 15 ㎖의 원심 튜브에 주의 깊게 중층하였다. 그 다음에, 원심 튜브를 스윙 로터를 이용하여 실온에서 500×g, 30분간 원심분리하였다. 그리고, 파스퇴르 피펫을 이용하여 단핵구 부유액을 다른 원심 튜브로 옮기고, 이것에 등량의 PBS(-)를 첨가하여 혼화하였다. 이 액을 실온에서 400×g, 10분간 원심분리한 후, 상청을 제거하여 침전한 단핵구를 얻었다. 그리고, 얻어진 단핵구를 PBS(-)로 현탁하고, 이것을 400×g, 10분간 원심분리한 후, 상청을 제거하여 단핵구 화분을 얻었다.
<바이러스 증식>
얻어진 단핵구 화분에 RPMI-1640을 첨가하여 10 ㎖로 매스업하였다. 이것에 종양 용해성 바이러스(텔로메스칸(등록상표)(OBP-401), 온콜리스 바이오파마 주식회사)를 최종 농도 6×106 PFU/㎖가 되도록 첨가하고, 37℃에서 로테이션하면서 24시간 배양하였다. 얻어진 배양액을 1,500 rpm에서 5분간, 약(弱) 브레이크로 원심분리한 후, 상청을 제거하여 종양 용해성 바이러스가 증식한 세포(이하, 증식 세포라고도 함)를 얻었다.
<고정화제 및 비이온성 계면활성제에서의 처리>
얻어진 증식 세포에 이것과 동일한 부피의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 첨가하고 실온에서 20분간 정치하였다. 여기에, 증식 세포 및 PFA의 합계 부피의 2배 부피의 비이온성 계면활성제(에마르겐 2025G, 카오 주식회사)의 PBS(-) 용액(농도 0.05 중량%)을 첨가하여 현탁하고, 교반하면서 40℃에서 5분간 인큐베이트하여 처리 시료를 얻었다. 또한, 에마르겐 2025G의 구조식을 이하의 식 (Ⅱ)에 나타낸다.
식 (Ⅱ)
Figure pct00002
(식 중, n은 25이다)
<슬라이드 제작 및 현미경 관찰>
얻어진 처리 시료를 1,500 rpm에서 5분간, 약 브레이크로 원심분리한 후, 상청을 제거하여 침전물을 얻었다. 그 다음에, 얻어진 침전물을 1 ㎖의 PBS에 현탁하였다. 그리고, 얻어진 현탁액을 1,500 rpm에서 5분간 약 브레이크로 원심분리한 후, 상청을 제거하고, 사이트 스핀을 이용하여(1,000 rpm, 4분) 슬라이드를 제작하였다. 상기 슬라이드에 마운팅 배지(Fluorescent Mounting Medium, S3032, Dako사)를 얹어 놓고, 그 다음에 커버 유리를 얹어 놓은 후, 도립형(倒立型) 리서치 현미경(Power IX 71, Olympus 주식회사제)을 이용하여 노광 시간 20 ms, 50 ms, 100 ms, 200 ms 및 400 ms의 조건 하에 형광 강도를 측정하였다.
또한, 상기와 같은 조건 하에서 각각이 상이한 기존의 형광 강도를 갖는 7종의 비즈(7 Peaks Beads(Cyto-Cal Multifluor Fluorescence Intensity Calibrator, FC3M, Thermo Scientific사))를 촬상하고, 각각의 노광 시간에서의 검량선을 작성하였다. 얻어진 검량선에 기초하여 상기의 처리 시료로부터의 형광 신호를 수치화하였다. 얻어진 결과를 도 1(No.4 및 5)에 나타낸다.
(실시예 2)
실시예 1에 있어서, 비이온성 계면활성제로서 에마르겐 2025G 대신에 니콜 BO-20V(일본 케미컬즈 판매 주식회사)를 이용한 것 이외에는 상기와 동일하게 하여 처리 시료를 조제하였다. 그리고, 실시예 1과 동일하게 하여 상기 처리 시료로부터 슬라이드를 제작하고, 상기 슬라이드에 대해 실시예 1과 동일한 조건으로 형광 강도를 측정하여 형광 신호를 수치화하였다. 얻어진 결과를 도 1(No.6)에 나타낸다.
(실시예 3)
실시예 1에 있어서, 비이온성 계면활성제로서 에마르겐 2025G 대신에 에마르겐 2020G(카오 주식회사)를 이용한 것 이외에는 상기와 동일하게 하여 처리 시료를 조제하였다. 그리고, 실시예 1과 동일하게 하여 상기 처리 시료로부터 슬라이드를 제작하고, 상기 슬라이드에 대해 실시예 1과 동일한 조건으로 형광 강도를 측정하여 형광 신호를 수치화하였다. 얻어진 결과를 도 1(No.7)에 나타낸다. 또한, 에마르겐 2020G의 구조식을 이하의 식 (Ⅲ)에 나타낸다.
식 (Ⅲ)
Figure pct00003
(식 중, n은 20이다)
(비교예 1)
실시예 1에 있어서, 고정화제 및 비이온성 계면활성제에서의 처리 대신에 용혈을 위하여 종래 이용되는 염화암모늄 및 고정화제에서의 처리를 수행하여 단핵구에 의한 검출에 대한 영향을 조사하였다.
상기의 <단핵구의 조제> 및 <바이러스 증식>과 동일하게 하여 얻어진 증식 세포에 이것의 30배 부피의 1% 염화암모늄 용액을 첨가하여 현탁하고, 실온에서 20분간 정치하였다. 그 다음에, 여기에 2% PFA를 첨가하고, 실온에서 20분간 정치하여 처리 시료를 얻었다.
얻어진 처리 시료를 1,500 rpm에서 5분간 약 브레이크로 원심분리한 후, 상청을 제거하여 침전물을 얻었다. 그 다음에, 얻어진 침전물을 1 ㎖의 PBS(-)에 현탁하였다. 그리고, 얻어진 현탁액을 1,500 rpm에서 5분간 약 브레이크로 원심분리한 후, 상청을 제거하고, 사이트 스핀을 이용하여(1,000 rpm, 4분) 슬라이드를 제작하였다. 상기 슬라이드에 마운팅 배지(Fluorescent Mounting Medium, S3032, Dako사)를 얹어 놓고, 그 다음에 커버 유리를 얹어 놓은 후, 실시예 1의 조건으로 형광 강도를 측정하여 형광 신호를 수치화하였다.
또한, 양성 대조로서 유방암세포주(MB468)를 이용하였다. 실시예 1과 동일하게 하여 종양 용해성 바이러스를 MB468 내에서 증식시키고, 이 MB468을 고정화제 및 비이온성 계면활성제에서 처리하지 않고 실시예 1과 동일한 조건으로 형광 현미경을 이용하여 형광 강도를 측정하였다.
결과를 도 1에 나타낸다. 도 1에서는 양성 대조(No.1), 비교예 1(No.2 및 3), 실시예 1(No.4 및 5), 실시예 2(No.6) 및 실시예 3(No.7)의 결과를 나타낸다.
도 1로부터, 비교예 1의 방법(No.2 및 3)에서는 암세포와 동일한 정도의 강한 형광 신호를 나타내는 단핵구 세포를 제거할 수 없었다. 한편, 본 발명의 방법(No.4, 5, 6 및 7)에서는 단핵구 세포 유래의 강한 형광 신호를 저감할 수 있다는 것을 알 수 있다.
또, 비이온성 계면활성제로서 고급 알코올의 알킬기가 분기쇄의 고급 알코올·에틸렌옥시드 부가물인 에마르겐 2025G 및 에마르겐 2020G를 이용한 경우(No.4, 5 및 7)는 고급 알코올의 알킬기가 직쇄인 고급 알코올·에틸렌옥시드 부가물인 니콜 BO-20V(No.6)를 이용한 경우보다도 단핵구 세포 유래의 신호를 보다 효과적으로 저감할 수 있다는 것을 알 수 있다.
2. 혈액 시료 중의 암세포의 검출
여러 가지 계면활성제를 이용하여 실제 혈액 시료 중에서의 암세포의 검출에 대해 검토하였다.
(실시예 4)
건강한 사람으로부터 채취한 말초 혈액 7.5 ㎖에 혈액 항응고 보존액(CPD 액; 100 ㎖의 멸균수 중에 구연산 3Na·2H2O 2.63 g, 구연산·2H2O 0.327 g, D(+)-글루코오스 2.32 g, 인산 2수소나트륨·2H2O 0.251 g를 함유) 1,120 ㎕를 첨가하여 충분히 전도혼화하였다. 그 다음에, 이 혼합액을 1,500 rpm에서 5분간 약 브레이크로 원심분리한 후, 피펫을 이용하여 상청(혈청)을 가능한 한 제거하였다. 여기에 PBS(-)를 첨가해 14 ㎖로 매스업하여 현탁하였다. 그리고, 상기와 같은 원심분리 및 혈청의 제거를 4회 반복하였다. 그 후, 여기에 유방암세포주(MB468)를 3×105개/㎖가 되도록 첨가하여 암세포 함유 혈액 시료를 얻었다.
얻어진 시료를 실시예 1의 <바이러스 증식>, <고정화제 및 비이온성 계면활성제에서의 처리> 및 <슬라이드 제작 및 현미경 관찰>과 동일하게 하여 처리하고, 현미경 사진을 촬영하였다. 얻어진 사진을 도 2a에 나타낸다.
상기의 암세포 함유 혈액 시료를 계면활성제로서 에마르겐 2025G 대신에 니콜 BL-9EX(비이온성 계면활성제, 일본 케미컬즈 판매 주식회사), 니콜 BO-20V(일본 케미컬즈 판매 주식회사), 니콜 BT-12(비이온성 계면활성제, 일본 케미컬즈 판매 주식회사), 에마르겐 2020G(카오 주식회사), 닛산카치온 AB600(양이온 계면활성제, 일유 주식회사) 및 닛산카치온 BB(양이온 계면활성제, 일유 주식회사)를 이용한 것 이외에는 실시예 1의 <바이러스 증식>, <고정화제 및 비이온성 계면활성제에서의 처리> 및 <슬라이드 제작 및 현미경 관찰>과 동일하게 하여 처리하고, 현미경 사진을 촬영하였다.
계면활성제로서 니콜 BL-9EX, 니콜 BO-20V, 니콜 BT-12, 에마르겐 2020G, 닛산카치온 AB600 및 닛산카치온 BB를 이용한 경우의 사진을 각각 도 2b∼도 2g에 나타낸다.
(비교예 2)
실시예 4와 동일하게 하여 얻어진 암세포 함유 혈액 시료에 실시예 1의 <바이러스 증식>과 동일하게 하여 바이러스를 증식시켜 증식 세포를 얻었다. 이것과 동일한 부피의 4% PFA를 첨가해 현탁하고, 실온에서 20분간 정치하였다. 그 다음에, 증식 세포 및 PFA의 합계 부피의 2배 부피의 1% 염화암모늄 용액을 첨가하여 현탁하고, 교반하면서 40℃에서 5분간 인큐베이트하여 처리 시료를 얻었다.
실시예 1의 <슬라이드 제작 및 현미경 관찰>과 동일하게 하여 상기 처리 시료의 현미경 사진을 촬영하였다. 얻어진 사진을 도 2h에 나타낸다.
도 2h로부터, 비교예 2의 방법에 의해 처리된 혈액 시료에서는 암세포의 주위에 미용혈된 적혈구(미용혈 RBC) 및 적혈구의 파편(RBC 고스트)이 밀집해 있는 것을 알 수 있다. 또, 도 2f 및 도 2g로부터, 계면활성제로서 양이온 계면활성제를 이용한 방법으로 처리된 혈액 시료에서는 비교예 2와 동일하게 암세포의 주위에 미용혈 RBC 및 RBC 고스트로부터 유래하는 찌꺼기(debris)가 밀집해 있는 것을 알 수 있다.
한편, 도 2a∼도 2e로부터, 본 발명의 비이온성 계면활성제를 이용한 방법에 의해 처리된 혈액 시료에서는 적혈구가 거의 제거되어 암세포를 보다 선명하게 확인할 수 있다는 것을 알 수 있다.
본 출원은 2008년 12월 18일에 출원된 일본 특허 출원 특원2008-322439호에 관한 것으로서, 이 특허청구범위, 명세서, 도면 및 요약서의 전부는 본 명세서 중에 참조로서 포함된다.
<110> Sysmex Corporation <120> METHOD FOR DETECTING CANCER CELLS IN BLOOD SAMPLE <130> 2011-fpa-4596 <150> JP2008-322439 <151> 2008-12-18 <160> 1 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 455 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tggcccctcc ctcgggttac cccacagcct aggccgattc gacctctctc cgctggggcc 60 ctcgctggcg tccctgcacc ctgggagcgc gagcggcgcg cgggcgggga agcgcggccc 120 agacccccgg gtccgcccgg agcagctgcg ctgtcggggc caggccgggc tcccagtgga 180 ttcgcgggca cagacgccca ggaccgcgct ccccacgtgg cggagggact ggggacccgg 240 gcacccgtcc tgccccttca ccttccagct ccgcctcctc cgcgcggacc ccgccccgtc 300 ccgacccctc ccgggtcccc ggcccagccc cctccgggcc ctcccagccc ctccccttcc 360 tttccgcggc cccgccctct cctcgcggcg cgagtttcag gcagcgctgc gtcctgctgc 420 gcacgtggga agccctggcc ccggccaccc ccgcg 455

Claims (20)

  1. 암세포의 존재가 의심되는 혈액 시료를 종양 용해성 바이러스와 인큐베이트함으로써 적어도 상기 암세포 내에서 종양 용해성 바이러스를 증식시키는 공정,
    증식 공정에서 처리된 혈액 시료와, 고정화제와, 비이온성 계면활성제를 혼합하는 공정, 및
    혼합 공정에서 얻어진 혈액 시료에 포함되는 종양 용해성 바이러스가 증식 한 암세포를 검출하는 공정을 포함하는 혈액 시료 중의 암세포의 검출 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    혼합 공정이 혈액 시료와 고정화제를 혼합한 후에 비이온성 계면활성제를 혼합하는 공정인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    혼합 공정에 있어서, 혈액 시료와 혼합한 때의 비이온성 계면활성제의 농도가 암세포에 손상을 주지 않고 적혈구 및 백혈구에 손상을 주는 농도인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌계의 비이온성 계면활성제인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    폴리옥시에틸렌계의 비이온성 계면활성제가 고급 알코올·에틸렌옥시드 부가물인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    고급 알코올·에틸렌옥시드 부가물의 고급 알코올의 알킬기가 분기쇄인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    혼합 공정에 있어서 혈액 시료와 혼합한 때의 고정화제의 농도가 적혈구를 용혈하는 농도인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    고정화제가 파라포름알데히드, 글루타르알데히드 또는 포름알데히드인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    종양 용해성 바이러스가 표식 단백질을 발현하는 종양 용해성 바이러스인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서,
    종양 용해성 바이러스가 텔로머라제 프로모터가 포함된 종양 용해성 바이러스인 방법.
  11. 청구항 9에 있어서,
    검출 공정이 표식 단백질로부터의 신호를 검출하는 공정인 방법.
  12. 종양 용해성 바이러스를 함유하는 제1 시약, 고정화제를 함유하는 제2 시약 및 비이온성 계면활성제를 함유하는 제3 시약을 포함하는 혈액 시료 중의 암세포의 검출용 시약 키트.
  13. 청구항 12에 있어서,
    제3 시약이 혈액 시료와 혼합한 때에 암세포에 손상을 주지 않고 적혈구 및 백혈구에 손상을 주는 농도가 되는 양으로 비이온성 계면활성제를 함유하는 키트.
  14. 청구항 12에 있어서,
    비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌계의 비이온성 계면활성제인 키트.
  15. 청구항 14에 있어서,
    폴리옥시에틸렌계의 비이온성 계면활성제가 고급 알코올·에틸렌옥시드 부가물인 키트.
  16. 청구항 15에 있어서,
    고급 알코올·에틸렌옥시드 부가물의 고급 알코올의 알킬기가 분기쇄인 키트.
  17. 청구항 12에 있어서,
    제2 시약이 혈액 시료와 혼합한 때에 적혈구를 용혈하는 농도가 되는 양으로 고정화제를 함유하는 키트.
  18. 청구항 12에 있어서,
    고정화제가 파라포름알데히드, 글루타르알데히드 또는 포름알데히드인 키트.
  19. 청구항 12에 있어서,
    종양 용해성 바이러스가 표식 단백질을 발현하는 종양 용해성 바이러스인 키트.
  20. 청구항 12에 있어서,
    종양 용해성 바이러스가 텔로머라제 프로모터가 편입된 종양 용해성 바이러스인 키트.
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