CN105755014B

CN105755014B - CaHV-TNFR特异基因及应用

Info

Publication number: CN105755014B
Application number: CN201610172024.4A
Authority: CN
Inventors: 张奇亚; 曾小涛; 陈中元
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2016-03-23
Filing date: 2016-03-23
Publication date: 2019-03-19
Anticipated expiration: 2036-03-23
Also published as: CN105755014A

Abstract

本发明公开了CaHV‑TNFR特异基因及应用，所述的CaHV‑TNFR特异基因序列为SEQ ID NO.1所示。针对该基因设计了用于鲫鳃出血症引物：CaHV‑MCP F/R、CaHV‑TNFR F/R。用这两对引物进行复合PCR扩增，当同时扩增到436bp和915bp两个片段时，可诊断为被CaHV感染；当仅扩增到436bp一个片段时，可检测为被CyHVs感染。本发明提供的基因序列和引物特别适合对急性鲫鳃出血症疱疹病毒病的基因诊断和分子流行病学调查，还适用于对水产动物疱疹病毒的监测预警，阳性检出率与准确率均超过98%，待检样品中含CaHV基因量为10pg/μL就可检出。

Description

CaHV-TNFR特异基因及应用

技术领域

本发明属于病毒学、渔业生物技术及水产动物医学领域，更具体涉及一种CaHV-TNF R特异基因，同时还涉及一种CaHV-TNFR特异基因的用途。

背景技术

世界动物卫生组织(OIE)已将鱼类疱疹病毒列为重点水生动物疫病名录，我国也已将其列入二类疫病名录[农业部渔业渔政管理局.2014年中国水生动物卫生状况报告.中国农业出版社,北京,2015]。疱疹病毒是一类有囊膜、含双链线性大DNA基因组的病毒。已知鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)是鱼蛙疱疹病毒科(Alloherpesviridae)的成员，称为鲤疱疹病毒组(C yprinid herpesviruseses)，含1型,2型和3型(CyHV1,CyHV2和CyHV3)[张奇亚,桂建芳.中国科学:生命科学,2014,44:1236–1252]，可缩写为CyHVs。疱疹病毒可感染养殖及野生鱼群，引起大规模死亡[Hanson et al,Viruses.2011,3(11):2160–2191；Lovy&Friend.Dis Aquat Org,2014,108:1–9]。

鲫(Carassius auratus)是我国重要淡水养殖鱼类，且其养殖规模和潜力越来越大。但近些年，由疱疹病毒引起的急性鲫鳃出血症给水产养殖带来严重危害，大量病死鱼还对水环境造成不良影响。该病具有突发性、流行广和致死率高的特点。急性鲫鳃出血的典型病症是鳃肿胀、出血，也伴有体表和体内组织出血。对病鲫作组织病理观察显示：除鳃之外，肝，脾，肾和头肾组织也出现不同程度的病变。研究表明，急性鲫鳃出血症就是由鲫疱疹病毒(Carassius aruatus herpesvirus,CaHV)[方进等，中国水产科学2016年3月,23(2)::336-343]所致。一旦有鱼发病，很快就在鱼群中传播，通过症状和病理来判断为时已晚。尤其在鲫鳃出血症流行区同时出现CyHVs感染，就更难鉴别。因此，需要尽快建立高效和特异的诊断方法，以便针对性的开展鲫疱疹病毒病的诊断和免疫防控。

针对上述问题，申请人在分离鉴定鲫鳃出血症病毒CaHV的基础上，完成其全基因组测序。经基因组和同源序列比对显示，CaHV与CyHVs之间存在保守序列，如：CaHV编码主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的基因88R[Davison et al.J Virol,2013,87:2908–2922]。已通过不同聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)方法，包括TaqMan实时荧光定量PCR、环介导等温[周勇等,水产学报,2013,37(4):607-613；Gotesmanet al,Dis Aqua t Organ.2013,105(2):163–174]，扩增单一MCP基因，用于检测鱼类疱疹病毒。但在同时流行CaHV和CyHVs的地区，就难以鉴别和诊断。同源序列比对还显示，CaHV存在独特基因，如:CaHV编码肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor receptor,TNFR)的基因146R，而CyH Vs(如CyHV1和CyHV3)或缺此基因，或同源基因内存在显著差异的序列区段(见图2)。据此，我们分别设计针对CaHV一个保守基因MCP和一个独特基因TNFR的两对引物CaHV-MCP F/R及CaHV-TNFR F/R，并创建既适合诊断病毒性鲫鳃出血症，同时又能检测出CyHVs的复合PCR方法。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种CaHV-TNFR特异基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的是在于提供了基于CaHV-TNFR特异基因设计的引物，优选的引物序列为：CaHV-TNFR F：ctacccaccagactaccc和CaHV-TNFR R：tcacaaccaccgtcccacta。

本发明的最后一个目的是在于提供了一种CaHV-TNFR特异基因或基于其设计的引物在制备鲫鳃出血症诊断试剂中的应用，所述的试剂特别适用于由鲫疱疹病毒(Carassiusarua tus herpesvirus,CaHV)引起的急性鲫鳃出血症的诊断。

为了达到上述目的，本发明采取如下技术措施：

一种CaHV-TNFR特异基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。

基于CaHV-TNFR特异基因设计的引物均为本发明的保护范围，优选的引物序列为：CaHV-TNFR F：ctacccaccagactaccc和CaHV-TNFR R：tcacaaccaccgtcccacta。

CaHV-TNFR特异基因或基于其设计的引物在制备鲫鳃出血症诊断试剂盒中的应用：包括CaHV-TNFR特异基因或基于其设计的引物单独使用来制备鲫鳃出血症诊断试剂盒；或是CaHV-TNFR特异基因或基于其设计的引物与其他基因序列或基于其他基因设计的引物用来制备鲫鳃出血症诊断试剂盒。制备出的试剂盒包括但不限于用于急性鲫鳃出血症，或是鲤疱疹病毒病流行趋势及预警，或是由鲫疱疹病毒(Carassius aruatus herpesvirus,CaH V)引起的病症。

另外，通过构建含CaHV-MCR(88R)和CaHV-TNFR基因(146R)的载体、转染细胞并进行表达后，用表达产物制备抗体，然后可进一步研发鱼类疱疹病毒免疫检测技术与制剂。

一种鲫鳃出血症诊断试剂盒，该试剂盒的设计思路为基于申请人新测定的CaHV的全基因组序列与其他鱼类疱疹病毒基因组同源比对，分别设计合成针对CaHV主要衣壳蛋白基因(CaHV-MCP)高度保守区段和CaHV肿瘤坏死因子受体(CaHV-TNFR)特异序列区段的两对引物：CaHV-MCP-F/R和CaHV-TNFR-F/R，并进行复合PCR扩增。经凝胶电泳显示：感染了CaHV的样品可同时扩增出分子量各为436bp和915bp的两条核酸带；而感染了其它鲤疱疹病毒(CyHVs)的样品仅扩增出436bp的一条核酸带。这样，经一次复合PCR就可同时对CaHV和CyHVs进行诊断或检测。核酸带大小易辨，清晰明亮，便于结果判断。

这是一种既针对鲫鳃出血症疱疹病毒CaHV、又可识别其它鲤疱疹病毒CyHVs的高效、稳定、特异的水产病毒病检测方法，适用于对疱疹病毒引起的急性鲫鳃出血症进行早期诊断。运用该方法，阳性检出率与准确率均达到100％。

所述的试剂盒包括引物：

CaHV-MCP F：cagaccaagaactacgtggg；

CaHV-MCP R：cctcggccttggcgatgttgta；

CaHV-TNFR F：ctacccaccagactaccc；

CaHV-TNFR R：tcacaaccaccgtcccacta。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)本发明实现了对急性鲫鳃出血症疱疹病毒病的高效和准确诊断。

2)本发明是基于新测定的CaHV全基因组序列及与CyHVs基因组和同源基因比对，采用复合PCR扩增方法，在提高效率，节约时间、降低成本的同时，还能检测CyHVs，从而获得更丰富的数据。

3)利用本发明所述引物，不仅可从疱疹病毒感染后有病症或无病症的鱼体中检出病毒核酸带，而且也可从疱疹病毒感染发病鱼的不同组织中检出病毒核酸带，阳性检出率与准确率均超过98％。

4)本发明提供的基因序列或其引物，可研发准确、快速、便捷的免疫检测技术和/或制剂，广泛用于水产动物疱疹病毒的流行病调查及预警。

5)利用本发明提供的复合PCR检测引物灵敏，待检样品中含CaHV基因量为10pg/μL就可检出。

6)所扩增的基因CaHV-TNFR具有可预测的功能或保守结构域；基因大小适中，扩增后易于分析和判断。

附图说明

图1CaHV-MCP基因88R与鲤疱疹病毒同源基因的保守序列(灰色背景)及所标注的引物名称和位点。

CaHV：鲫疱疹病毒(Carassius aruatus herpesvirus,CaHV)；

CyHV1：鲤疱疹病毒Ⅰ型(NC_019491)；

CyHV2：鲤疱疹病毒Ⅱ型(NC_019495)：

CyHV3：鲤疱疹病毒Ⅲ型(NC_009127)。

图2CaHV-TNFR基因146R与鲤疱疹病毒同源基因序列(灰色背景)及其引物名称和位点。

短线表示在相应位置缺失碱基。

图3复合PCR扩增待检样品DNA产物的电泳图。

待检样品依次来自，泳道：1:鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV)基因组；2:沼泽绿牛蛙蛙病毒(Rana grylio virus,RGV)基因组；3:大鲵蛙病毒(Andrias davidianu s ranavirus,ADRV)基因组；4:DNA Marker DL2000；5:鲫疱疹病毒(Carassius aruatus herpesv irus,CaHV)基因组；6:CaHV人工感染鲫头肾；7:江苏病鲫头肾；8:湖北病鲫头肾；9:来自曾发病鱼池，暂无病症的鲫头肾；10:正常鲫头肾。

图4复合PCR扩增病鲫不同组织DNA产物的电泳图。

M.DNA Marker DL2000；L.病鲫肝；S.病鲫脾；K.病鲫肾；HK.病鲫头肾；G.病鲫鳃；CaHV.阳性对照；NC.阴性对照。

图5不同浓度模板CaHV DNA扩增产物的电泳图。

待检模板DNA浓度依次为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7μg/μL。至10^-5μg/μL仍可见较弱的两条核酸带。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特备说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特备说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

一种鲫鳃出血症诊断试剂盒，包括引物如表1所示：

表1 引物基本信息

以上引物是依据鲫疱疹病毒CaHV(Carassius aruatus herpesvirus,本发明或称为急性鲫鳃出血症疱疹病毒)与鲤疱疹病毒CyHVs基因组和同源基因序列比对，选择针对CaHV主要衣壳蛋白CaHV-MCP基因88R的高同一性序列和CaHV肿瘤坏死因子CaHV-TNFR基因146R的低同一性序列，各设计一对引物CaHV-MCP-F/R和CaHV-TNFR-F/R。即是根据Ca HV-MCP基因88R相应序列(图1)，设计合成了一对引物CaHV-MCP F与CaHV-MCP R(这对引物缩写为CaHV-MCP F/R)；同时，根据CaHV-TNFR基因146R相应序列(图2),设计合成了另一对引物CaHV-TNFR F与CaHV-TNFR R(这对引物缩写为CaHV-TNFR F/R)。这两对引物的序列与长度等基本信息见表1。

当样品DNA中含CaHV基因，电泳后出现两条核酸带，分别是由CaHV-MCP F/R扩增长度为436bp的一条核酸带，和由CaHV-TNFR F/R扩增长度为915bp的核酸带。

实施例2：

一种鲫鳃出血症诊断试剂盒的应用，应用过程包括:

1)提取待检样品DNA：

用DNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0，Clontech公司产品)，提取待检样品DNA作为模板DNA，进行复合PCR扩增。DNA提取步骤参见试剂盒说明书。

2)复合PCR扩增及其产物分析

先将各种反应组分加入PCR反应管中，然后设置循环参数，再进行循环扩增。具体方法如下：在PCR反应管内加入步骤1)所述待检样品DNA 1μl(0.1～1.0μg)，引物CaHV-M CPF/R和CaHV-TNFR F/R每条各加0.5μl 10μM；加1μl、10mM的dNTP Mix；加2.5μl 1 0×TranStart Taq Buffer(Mg²⁺)和0.5μl TranStart Taq DNA Polymerase(北京全式金生物技术有限公司产品)，加18μl ddH2O，使终体积为25μl，混匀后，离心15s使反应组分集中在管底。进行PCR扩增，循环程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min,12℃结束。

PCR结束后，向体系中加入3μl 6×Loading buffer，混匀，取5μl上样至1.2％浓度琼脂糖凝胶孔中，199V，97mA，电泳30min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶放入1％浓度的E B液中，浸泡5min，在凝胶成像***(GBOX全自动凝胶成像及分析***，美国SYNGEN E公司生产)中成像。

3)判定：

若样品DNA中扩增出两条大小分别为436bp和915bp的核酸带，则表明样品被CaHV感染；

若样品DNA仅扩增出一条大小为436bp的核酸带，则表明样品未被CaHV感染，而仅感染了其它鲤疱疹病毒(CyHVs)。

实施例3：

鲫鳃出血症诊断试剂盒的特异性

1)模板核酸样品制备：

提取不同水生动物非疱疹病毒基因组核酸：按氯仿-酚抽提法[Chen etal.Veterinary Res earch 2013,44:101]，分别制备鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsirhabdovirus，SCRV)基因组RNA，沼泽绿牛蛙蛙病毒(Rana grylio virus,RGV)基因组DNA，及大鲵蛙病毒(Andrias dav idianus ranavirus,ADRV)基因组DNA。鱼弹状病毒基因组RNA先经RT-PCR逆转录扩增，由RNA合成cDNA。再分别以SCRV基因组经逆转录合成的cDNA、RGV基因组DNA和ADRV基因组DNA，作为水生动物非疱疹病毒基因组模板，为阴性对照。

提取急性鲫鳃出血症疱疹病毒(Carassius aruatus herpesvirus,CaHV，方进等，中国水产科学2016年3月,23(2)::336-343)基因组DNA，作为模板DNA，为阳性对照。

提取不同来源鲫头肾DNA：先分别取有典型鳃出血症的病鲫头肾、CaHV经人工感染的病鲫头肾、江苏发病鱼池并有典型鳃出血症的病鲫头肾、湖北发病鱼池并有典型鳃出血症的病鲫头肾、曾发生过典型鳃出血病的鱼池但暂无病症的鲫头肾，及健康鲫头肾。使用DNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0，Clontec h公司产品)提取鲫头肾DNA。提取方法参见说明书，具体步骤是：取鱼头肾组织25mg，并尽可能剪碎，置于1.5ml EP管中；加入180μl的Buffer GL，20μl的Proteinase K和10 μl、10mg/ml的RNaseA，于56℃水浴中温浴约3小时，至组织充分消化；在裂解液中加2 00μl Buffer GB和200μl 100％乙醇，吸打混匀。将离心柱Spin Column安置于收集管Collection Tube之上，将吸打混匀的溶液移至Spin Column中，15,294×g(eppendorf，FA-45-30-1 1)离心2分钟，弃滤液；将500μl的Buffer WA加人Spin Column中，15,294×g离心1分钟，弃滤液；将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，15,294×g离心1分钟，弃滤液，重复此操作一次；另再15,294×g离心2分钟；取出Spin Column，安置于新的1.5ml的离心管上，加入100μl灭菌水或Elution Buffer，室温静置5分钟，15,294×g离心2分钟洗脱DNA；取洗脱液重新加入Spin Column膜中，重复静置和离心一次，洗脱DNA。所提取的鲫头肾DNA将作为待检样品模板DNA，进行PCR扩增。

2)按实施例2中步骤2)经复合PCR扩增，进行鲫鳃出血症疱疹病毒病的诊断，所用引物为实施例1所示。

3)结果如图3所示：泳道1～3.三种水生动物非疱疹病毒基因组模板扩增的结果均为阴性。4.分子量标记DNA Marker DL2000。泳道5.以CaHV基因组模板扩增的结果，清晰出现两条核酸带，其大小分别为436bp和915bp。泳道6～8.待检样品均出现与阳性对照C aHV完全一致的两条核酸带，诊断这些待检样品已被CaHV感染。泳道9.待检样品是来自曾发病鱼池，虽暂无症状的鱼，也出现与阳性对照CaHV大小一致、但亮度较弱的两条核酸带，诊断为已被CaHV感染、但病毒基因含量较低。泳道10.未被CaHV感染的健康鲫。

实施例4：

鲫鳃出血症诊断试剂盒的检测限：

1)将急性鲫鳃出血症疱疹病毒(Carassius aruatus herpesvirus,CaHV)基因组DNA依次10倍系列稀释：10^-2μg/μL、10^-3μg/μL…至10^-7μg/μL，作为模板DNA。

2)使用实施例1中所设计合成的引物。

3)按实施例2中步骤2)经复合PCR扩增。

4)结果稀释至10^-5μg/μL(10pg/μL)的模板，仍能扩增出两条大小分别为436bp和915bp的核酸带(见图5)。表明该鲫鳃出血症诊断试剂盒的检测限可达10pg/μL。

实施例5：

鲫鳃出血症诊断试剂盒在测试病毒基因在感病鱼不同组织中分布的应用

1)分别提取感染鲫鳃出血症疱疹病毒(Carassius aruatus herpesvirus,CaHV)的病鲫的肝、脾、肾、头肾和鳃组织的DNA，作为待检样品模板DNA。

2)按实施例2中步骤2)和3)进行复合PCR扩增及其产物分析。

结果如图4所示：M.分子量标记DNA Marker DL2000；L.liver,病鲫肝；S.spleen,病鲫脾；K.kidney,病鲫肾；HK.head kidney,病鲫头肾；G.gill，病鲫鳃；CaHV.阳性对照；NC.阴性对照。结果显示，来自病鲫的肝、脾、肾、头肾和鳃五种组织都出现与阳性对照CaHV大小一致、亮度相同的两条核酸带，表明在病鲫不同组织中都存在CaHV的基因。

实施例6：

CaHV-MCP基因和CaHV-TNFR基因在制备鱼类疱疹病毒免疫制剂中的应用

1)CaHV-MCP基因(88R)和CaHV-TNFR基因(146R)表达载体构建、原核表达及表达产物的纯化

用常规基因克隆方法，将上述两个基因扩增和***表达载体pET32a上，将构建好的载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达，收集表达产物，并经镍柱亲和层析纯化。

2)单克隆抗体制备

将纯化的CaHV-MCP和CaHV-TNFR蛋白作为抗原免疫小鼠，再取免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，选择性培养，筛选杂交瘤阳性克隆并扩大培养，持续收集所产生的单克隆抗体。

3)免疫诊断试剂盒/试纸条的制备

优化单抗制备工艺和质量检测标准，将上述单克隆抗体开发成可直接用于水产养殖现场使用的免疫诊断试剂盒或试纸条。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院水生生物研究所

<120> CaHV-TNFR特异基因及应用

<130> CaHV-TNFR特异基因及应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 975

<212> DNA

<213> Carassius aruatus herpesvirus

<400> 1

atgcttctaa tcgctgtcct cttgacccta tcgggcctgg acgctgttcg actcataccc 60

ctacccacca gactacccac cagacgtgca atcaccaagc caacaatcaa aaagagcttg 120

gacgagcttt ttgtcatcgc gaccaatgac agtgaatggt tggaaaccga cgttgctctc 180

gatccgcgag tatgccccaa caagtttgga ttctacggga ctcttctcga cggctcgttt 240

gttatcaaat gtgattatca cgtccagatg atcaacatga aatacgaaaa caacacagaa 300

atcatgcaca tttacgacta caaatggcct gtccatttca accggtctga ttataccgag 360

gacatcgtac agatatgtga tcggtgtttg ccttgcaagg gacgcttcga ttaccagagt 420

ccgaacggca cctgttgtca accgtgcccc gccggatttt acgccgctga acattgtacg 480

gtggacggag aaaggagtgt atgcaagagg tgtcctctgg accattacaa ggacaacagc 540

tacgttggta ctctgcaaca cgaagaagtg tgccgaccac tgaaaacgaa cgctacgtgt 600

ccaaggaaca cacacatcag aaagcgcgaa aatcgccagt cggaggacgg ataccaccgg 660

gataacatat gcgatccgaa cgttggctat tactgtccag gtatcgggat cggccagagc 720

tgctctcacg atgctgtatt gggtacgtgt ccgtccggac agtacacgtt cgctcataac 780

acgagggaaa acaatgccgt ttgtggacat tgtaactctg accagtacgc caaaacgaac 840

ctcgatacgg gactcactgt gtgtgtcaac caggttacgt gtcccaatgg tactatatcg 900

acgggaggta gtaaaacaac caaggctacg tgttctccac aaacttcaaa ctggatagtg 960

ggacggtggt tgtga 975

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cagaccaaga actacgtggg 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctcggcctt ggcgatgttg ta 22

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctacccacca gactaccc 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcacaaccac cgtcccacta 20

Claims

1.一种CaHV-TNFR特异基因，所述基因为SEQ ID NO.1所示。

2.针对权利要求1所述基因设计的引物为：CaHV-TNFR F：ctacccaccagactaccc和CaHV-TNFR R：tcacaaccaccgtcccacta。

3.权利要求1所述的基因或权利要求2所述的引物在制备鲫鳃出血症诊断试剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，所述试剂包含引物：

CaHV-MCP F：cagaccaagaactacgtggg；

CaHV-MCP R：cctcggccttggcgatgttgta；

CaHV-TNFR F：ctacccaccagactaccc；

CaHV-TNFR R：tcacaaccaccgtcccacta。

5.权利要求1所述的基因或权利要求2所述的引物在制备由鲫疱疹病毒引起的疾病诊断试剂中的应用。