CN1997382A - 调节生物活性的双特异性结合剂 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了提高双特异性结合剂的生物和药物特性的方法，其中所述双特异性结合剂能够通过以下两种结合结构域靶向细胞：靶向第一种细胞表面标记的高亲和力结合结构域，不诱导显著的生物学作用；特异性结合于第二种细胞表面标记的低亲和力结合结构域，引起显著和所需的生物学作用。本发明也提供了这种双特异性结合剂的组合物、其应用和包括它们的试剂盒。

Description

调节生物活性的双特异性结合剂
相关申请的交叉参考
本申请要求2004年5月5日提交的美国临时申请号60/568,656的优先权，将其内容纳入本文作为参考。
关于在联邦政府赞助的研究和开发下进行的发明的权利的说明
无
在光盘上提交的“序列表”、表或计算机程序清单附录的参考。
无
发明背景
许多疾病和失调是由细胞表面受体的活化(如通过与受体特异性配体结合)使信号转导通路出现不适当或过度活化而引起的。参与疾病和失调如癌症和自身免疫病的发生或进展的受体，已成为开发减少或防止受体活化的治疗剂的主要靶点。靶受体的例子包括例如：表皮生长因子受体(“EGFR”)、***1受体(“IGF1-R”)和血小板衍生生长因子受体(“PDGFR”)，它们在许多疾病中倾向于过量表达或异常活化，例如在大多数常见的实体瘤，包括非小细胞肺癌和乳腺癌、***癌和结肠癌，以及许多自身免疫病，如重症肌无力、***性红斑狼疮和类风湿性关节炎。受体活化导致自磷酸化，从而驱动导致疾病进展的信号转导通路。
用受体抑制剂进行的开创性研究已明确证明：通过防止与疾病相关的受体活化，可改变该疾病的发展。但是，通常，造成疾病的受体在除了患病细胞或组织以外的许多不同细胞和组织上表达。虽然临床上可以使用受体抑制剂，如靶向ErbB2(“HER-2”)的贺赛汀，新的挑战包括鉴定将有效靶向患病细胞或组织而不靶向未患病细胞和组织的治疗剂。
将药物特异性靶向患病细胞的一种方法是采用双特异性结合剂，本文中有时称为“bsBA”。双特异性结合剂包含两个结合结构域，各自能特异性识别和结合不同分子(为方便起见，各结合结构域特异性结合的分子可以称为该结合结构域的“配体”)。已试验了双特异性结合剂一段时间，如Schmidt M.等，“对ErbB-2和EGF受体特异的二价单链抗体-毒素”(A bivalent single chain-toxin specific for ErbB-2 and the EGFreceptor)，Int.J.Cancer，65(4)：538-46(1996)，Lu D.等，“用完全人重组双特异性抗体同时阻断癌细胞中的表皮生长因子受体和***受体信号传导途径”(Simultaneous blockade of both the epidermal growth factor receptor and the insulin-likegrowth factor receptor signaling pathways in cancer cell with a fully human recombinantbispecific antibody)J Biol Chem.279(4)：2856-65(2004)和Francois C.等，“抗小鼠IL-2-Rα和β链的抗体协同作用以消除T-细胞体外增殖和延迟型体内超敏反应”(Antibodies directed at mouse IL-2-R alpha and beta chain act in synergy to abolish T-cellproliferation in vitro and delayed type hypersensitivity reaction in vivo)Transpl Int.9(1)：46-50(1996)。因为bsBA常常采用抗体作为一个或两个结合结构域，所以bsBA有时属于称为免疫治疗的药物类型。
不幸的是，可用作bsBA的靶点的分子有限。仅有相对一小部分分子在患病细胞而非正常细胞上表达，因此可用这些分子使药物仅靶向患病细胞。又有一些分子在患病细胞上表达得比正常细胞上更多。这些分子可以允许将药物优先递送到患病细胞而非正常细胞，这取决于与正常细胞相比，该分子在患病细胞中过量表达的程度。
然而，即使靶细胞上靶分子大量过量表达，由于药物与表达该靶分子的正常细胞结合，递送靶向治疗剂常常伴有副作用。例如，作为FDA-批准的免疫治疗剂贺赛汀靶点的HER2(erbB2)受体过量表达，比非癌细胞中HER2受体的表达高约10-100倍。然而，由于贺赛汀与正常细胞结合，一定百分数的患者产生了心律失常和其它副作用。
因此，需要通过开发结合靶细胞而不结合非靶细胞的能力提高的bsBA来增加免疫治疗剂的治疗窗。
发明概述
本发明提供了双特异性结合剂的新组合物，以及包含它们的试剂盒及其方法和应用。
在第一组实施方式中，本发明提供了用双特异性结合试剂调节靶细胞的生物活性的方法，所述双特异性试剂具有以下特征：(i)具有与所述细胞表面上第一种靶分子的Kd至少为10-7M的第一结合结构域和与所述细胞表面上第二种靶分子有亲和力的第二结合结构域，(ii)第二种靶分子与所述第一种靶分子不同，(iii)其中所述第二结合结构域与所述第二种靶分子的所述亲和力比所述第一结合结构域与所述第一种靶分子的Kd至少低10倍，和(iv)当所述第一结合结构域的靶分子是ErbB2时，所述第二结合结构域的靶分子不是ErbB3；所述方法包括将双特异性结合剂与靶细胞相接触，接触条件允许第一和第二结合结构域分别结合于所述第一种和第二种靶分子，其中所述第二结合结构域与第二种靶分子结合调节第二种靶分子的生物活性，从而调节所述靶细胞的生物活性；但所述第一结合结构域与第一种靶分子结合不调节靶细胞的生物活性。在一些实施方式中，双特异性结合剂包含两种抗体。在一些实施方式中，该抗体是双抗体、直接连接或通过接头连接的两条单链Fv、二硫键稳定的Fv或其组合。在一些实施方式中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方式中，第一种靶分子是肿瘤相关性抗原、细胞因子受体或生长因子受体。在一些实施方式中，肿瘤相关性抗原选自MART-1、gp100或MAGE-1。在一些实施方式中，第一种靶分子选自癌胚抗原(CEA)、ErbB2、EGFR、LewisY、MUC-1、EpCAM、CA125、***特异性膜抗原(PSMA)或TAG72。在一些实施方式中，第二种靶分子选自ErbB3、ErbB4、任意FGF受体1-4、HGF受体、IGF1-R、PDGF、受体α和β或C-KIT。在一些实施方式中，靶细胞是乳腺癌细胞，靶分子是选自以下的受体酪氨酸激酶：表皮生长因子受体(EGFR)、ErbB2(HER2/neu)、ErbB3(HER3)或ErbB4(HER4)。在一些实施方式中，第一结合结构域与第一种靶分子的Kd是10-8-10-12M。在一些实施方式中，第二结合结构域与第二种靶分子的Kd比第一结合结构域与第一种靶分子的Kd至少低20倍。
本发明还提供了调节具有靶细胞和非靶细胞的生物体中靶细胞上靶分子的生物活性的方法，其中所述靶细胞的外部有第一种靶分子，外表面上有第二种靶分子，其中(i)第一种和第二种靶分子不共享共有配体，(ii)所述第一种靶分子在所述靶细胞表面上的丰度比也携带第二种靶分子的非靶细胞表面上的丰度至少高10倍，(iii)所述第二种靶分子具有生物活性，但第一种靶分子没有，和(iv)当第一结合结构域的靶分子是ErbB2(HER2)时，第二结合结构域的靶分子不是ErbB3(HER3)，所述方法包括：采用双特异性结合剂，其具有与第一种靶分子的解离常数(Kd)至少为10-7M的第一结合结构域，和与第二种靶分子的Kd比第一结合结构域的所述Kd至少低10倍的第二结合结构域；和将双特异性结合剂与靶细胞相接触，接触条件允许第一和第二结合结构域分别结合于第一种和第二种靶分子，其中所述第二结合结构域的结合调节所述靶细胞上所述第二种靶分子的生物活性。在一些实施方式中，所述双特异性结合剂包含两种抗体。在一些实施方式中，所述抗体是双抗体、直接连接或通过接头连接的两条单链Fv、二硫键稳定的Fv或其组合。在一些实施方式中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方式中，靶分子是肿瘤相关性抗原、细胞因子受体或生长因子受体。在一些实施方式中，肿瘤相关性抗原选自MART-1、gp100或MAGE-1。在一些实施方式中，第一种靶分子选自癌胚抗原(CEA)、ErbB2、EGFR、LewisY、MUC-1、EpCAM、CA125、***特异性膜抗原(PSMA)或TAG72。在一些实施方式中，第二种靶分子选自ErbB3、ErbB4、任意FGF受体1-4、HGF受体、IGF1-R、PDGF、受体α和β或C-KIT。在一些实施方式中，第一结合结构域与第一种靶分子的Kd为10-8M-10-12M。在一些实施方式中，第二结合结构域与第二种靶分子的Kd比第一结合结构域与第一种靶分子的Kd至少低20倍。在一些实施方式中，第二结合结构域与第二种靶分子的Kd比第一结合结构域与第一种靶分子的Kd至少低50倍。在一些实施方式中，调节是受体酪氨酸激酶活性降低。
在另一组实施方式中，本发明提供了双特异性结合剂(bsBA)，其含有与靶细胞上第一种靶分子的解离常数(Kd)至少为10-7M的第一结合结构域，和与靶细胞上第二种靶分子的Kd比第一结合结构域与第一种靶分子的Kd低至少10倍的第二结合结构域，其中(i)第一种和第二种靶分子没有相同的天然配体，(ii)第二种靶分子，而非第一种靶分子，具有生物活性，和(iii)当第一结合结构域的靶分子是ErbB2(HER2)时，第二结合结构域的靶分子不是ErbB3(HER3)，而且当结合于第二种靶分子时，第二结合结构域调节第二种靶分子的生物活性。在一些实施方式中，第二结合结构域的Kd比第一结合结构域的Kd低50倍以上。在一些实施方式中，第二结合结构域的Kd比第一结合结构域的Kd低100倍或更多倍。在一些实施方式中，bsBA包含两种抗体。在一些这类实施方式中，所述抗体是双抗体、直接连接或通过接头连接的两条单链Fv、二硫键稳定的Fv或其组合。在一些实施方式中，第一结合结构域结合于肿瘤相关性抗原、细胞因子受体或生长因子受体。在一些实施方式中，第一种靶分子选自癌胚抗原(CEA)、ErbB2、EGFR、LewisY、MUC-1、EpCAM、CA125、***特异性膜抗原(PSMA)或TAG72。在一些实施方式中，第二种靶分子选自ErbB3、ErbB4、任意FGF受体1-4、HGF受体、IGF1-R、PDGF、受体α和β或C-KIT。在一些实施方式中，第一结合结构域的Kd为10-8-10-12M。在一些实施方式中，与正常细胞上的表达相比，第一种靶分子在靶细胞上过量表达至少10倍。
在另一组实施方式中，本发明提供了含有以下组分的组合物：(a)双特异性结合剂(bsBA)，其包含与靶细胞上第一种靶分子的解离常数(Kd)至少为10-7M的第一结合结构域，和与靶细胞上第二种靶分子的Kd比第一结合结构域的所述Kd低至少10倍的第二结合结构域，其中第一种和第二种靶分子没有相同的天然配体，且其中(i)第二种靶分子，而非第一种靶分子，具有生物活性，(ii)当结合于第二种靶分子时，第二结合结构域调节第二种靶分子的生物活性，和(iii)当第一结合结构域的靶分子是ErbB2(HER2)时，第二结合结构域的靶分子不是ErbB3(HER3)，和(b)药学上可接受的载体。在一些实施方式中，第二结合结构域的Kd比第一结合结构域的Kd低50倍以上。在一些实施方式中，第二结合结构域的Kd比第一结合结构域的Kd低100倍或更多倍。在一些实施方式中，bsBA包含两种抗体。在一些实施方式中，所述抗体是双抗体、直接连接或通过接头连接的两条单链Fv、二硫键稳定的Fv或其组合。在一些实施方式中，所述第一结合结构域结合于肿瘤相关性抗原、细胞因子受体或生长因子受体。在一些实施方式中，第一种靶分子选自癌胚抗原(CEA)、ErbB2、EGFR、LewisY、MUC-1、EpCAM、CA125、***特异性膜抗原(PSMA)或TAG72。在一些实施方式中，第二种靶分子选自ErbB3、ErbB4、任意FGF受体1-4、HGF受体、IGF1-R、PDGF、受体α和β或C-KIT。在一些实施方式中，与也携带第二种靶分子的非靶细胞相比，第一种靶分子在靶细胞上过量表达至少10倍。在一些实施方式中，
在另一组实施方式中，本发明提供了一种双特异性结合剂(bsBA)在制备药物中的应用，所述双特异性结合剂(bsBA)包含与靶细胞上第一种靶分子的解离常数(Kd)至少为10-7M的第一结合结构域，和与靶细胞上第二种靶分子的Kd比第一结合结构域的所述Kd低至少10倍的第二结合结构域，其中(i)第一种和第二种靶分子没有相同的天然配体，(ii)第二种靶分子，而非所述第一种靶分子，具有生物活性，(iii)当结合于第二种靶分子时，第二结合结构域调节第二种靶分子的生物活性，和(iv)当所述第一结合结构域的靶分子是ErbB2时，第二结合结构域的靶分子不是ErbB3。在一些实施方式中，所述第二结合结构域的Kd比第一结合结构域的Kd低50倍以上。在一些实施方式中，所述第二结合结构域的Kd比第一结合结构域的Kd低100倍或更多倍。在一些实施方式中，所述bsBA包含两种抗体。在一些实施方式中，所述抗体是双抗体、直接连接或通过接头连接的两条单链Fv、二硫键稳定的Fv或其组合。在一些实施方式中，通过第一结合结构域和第二结合结构域结合的靶分子独立地选自肿瘤相关性抗原、细胞因子受体或生长因子受体，只要所述第一结合结构域和第二结合结构域不结合相同的肿瘤相关性抗原、细胞因子受体或生长因子受体。在一些实施方式中，所述药物用于抑制癌细胞增殖。在一些实施方式中，与也携带第二种靶分子的非靶细胞相比，第一种靶分子在靶细胞上过量表达至少10倍。
而且，本发明提供了包含以下组分的试剂盒：(a)容器，和(b)双特异性结合剂(bsBA)，其包含与靶细胞上第一种靶分子的解离常数(Kd)至少为10-7M的第一结合结构域，和与靶细胞上第二种靶分子的Kd比第一结合结构域与第一种靶分子的Kd低至少10倍的第二结合结构域，其中(i)第一种和第二种靶分子没有相同的天然配体，(ii)第二种靶分子，而非第一种靶分子，具有生物活性，(iii)当结合于第二种靶分子时，第二结合结构域调节第二种靶分子的生物活性，和(iv)当第一结合结构域的靶分子是ErbB2(HER2)时，所述第二结合结构域的靶分子不是ErbB3(HER3)。在一些实施方式中，第二结合结构域的Kd比第一结合结构域的Kd低50倍以上。在一些实施方式中，第二结合结构域的Kd比第一结合结构域的Kd低100倍或更多倍。在一些实施方式中，所述bsBA包含两种抗体。在一些实施方式中，所述抗体是双抗体、直接连接或通过接头连接的两条单链Fv、二硫键稳定的Fv或其组合。在一些实施方式中，所述第一结合结构域结合于肿瘤相关性抗原、细胞因子受体或生长因子受体。在一些实施方式中，所述第一种靶分子选自癌胚抗原(CEA)、ErbB2、EGFR、LewisY、MUC-1、EpCAM、CA125、***特异性膜抗原(PSMA)或TAG72。在一些实施方式中，第二种靶分子选自ErbB3、ErbB4、任意FGF受体1-4、HGF受体、IGF1-R、PDGF、受体α和β或C-KIT。在一些实施方式中，第一结合结构域的所述Kd为10-8和10-12M。在一些实施方式中，与正常细胞上的表达相比，第一种靶分子在靶细胞上过量表达至少10倍。
发明详述
概述
目前免疫治疗剂的一个问题是它们既结合于正常细胞又结合于患病细胞的倾向引起了不良副作用。因此，科学界的一个目标是开发结合于靶细胞(如患病细胞)而不结合非靶细胞(即正常细胞)的能力得到改进的免疫治疗剂。
本发明提供了组合物和方法，用于提高一类免疫治疗剂结合靶细胞的特异性。这些方法和组合物提供了调节靶细胞生物活性而不影响非靶细胞的相应活性的改进的能力。意外的是，现在已经发现，可通过控制bsBA的两个结合结构域的结合亲和力之差提高称为双特异性结合剂(″bsBA″)的免疫治疗剂靶向患病细胞的特异性。那么，本发明bsBA可用于提高或降低靶细胞上靶分子的生物活性，从而提供调节靶细胞的生物活性、对非靶细胞相应活性的影响降低(如果有)的改进的能力。
顾名思义，bsBA具有两个结合结构域，各自对不同的靶分子特异(为方便起见，被结合结构域特异性结合的分子可以称为该结合结构域的“配体”)。通常用第一结合结构域使bsBA靶向选择的细胞，有时称为″靶细胞″。因此，本文中也将此结合结构域称为″靶向结构域″。在本发明方法中，靶向结构域与其靶分子的结合不在靶细胞中诱导显著生物作用。第二结合结构域结合于靶细胞上的第二种靶分子。第二结合结构域与其配体的结合旨在调节特定生物作用(即提高或抑制该生物活性)。本领域已知能够以不同方式调节生物活性的结合结构域。
结合结构域与其靶分子的结合常常能抑制生物活性。例如，如果结合结构域结合的分子是细胞因子受体的一部分，那么结合结构域与该受体的结合可阻断细胞因子到达该受体，从而抑制此结合诱导的生物活性。类似地，结合结构域与受体的结合可防止该受体形成异源二聚体，此异源二聚体是完全激活某些细胞因子受体如白介素(″IL″)-2受体所必需的。或者，结合结构域的结合可改变受体的构象，以使其不能结合其天然配体并从而被活化。相反地，结合结构域可以是能够通过结合于受体提高生物活性的结构域。例如，结合结构域与受体的结合可模拟天然配体对受体的作用，从而此结合激活了受体，或者结合结构域的结合可诱导构象改变，使低亲和力受体变为其天然配体的高亲和力受体。
如上所述，用本发明bsBA的第一结合结构域使bsBA靶向靶细胞，而第二结合结构域主要用于诱导对靶细胞的作用。因此，为了方便区分这两个结构域，本文中有时将第一结合结构域称为″靶向结构域″，而本文中有时将第二结合结构域称为″效应物结构域″。类似地，为了方便区分这两个结合结构域结合的分子，有时将效应物结构域的靶分子称为″效应物靶分子″，而术语″靶分子″本身指靶向结构域的靶点。
以前一般用与各相应靶分子具有最高可用亲和力的结合结构域构建bsBA。本领域技术人员应理解，一个结构域不可能与另一结构域对相应靶点具有完全相同的亲和力，因此，两个结合结构域的亲和力通常有差异。然而，在以前的bsBA中，亲和力差异一般不大，就实际结合作用而言差异可能显著或不显著。
但是，在本发明方法和组合物中，选择与其配体的结合亲和力比效应物结构域与其配体的亲和力高至少一个数量级的靶向结构域。即，靶向结构域与它识别和结合的分子的亲和力比效应物结构域与它识别和结合的分子的亲和力大至少10倍或更多。在一些实施方式中，靶向结构域与其配体的亲和力比效应物结构域高至少15倍，在其它情况下高20倍或更多，在其它实施方式中，高25倍或更多，在一些实施方式中，它的亲和力比效应物结构域与其靶的亲和力高30倍、40倍、50倍、甚至100倍或更高，更优选较高的亲和力。由于本发明bsBA的两个结合结构域的结合亲和力至少相差一个数量级，所以本文偶尔将bsBA称为″hi-lo″bsBA。
相对于现有双特异性分子，靶点结合结构域和效应物结合结构域之间结合亲和力的有意和显著差异提供了意外和以前未识别的优点。如上所述，以前已知的双特异性物质具有与靶配体的亲和力尽可能高的结合部分。但是，与本发明组合物和方法相比，具有亲和力相似的结合部分的双特异性分子受限于它们可靶向的分子和它们可应用的情况。通过参照假拟范例，可理解本发明的一些优点。
考虑具有两种受体A和B的癌细胞的情况，受体A在癌细胞上过量表达(与正常细胞相比)，受体B在正常细胞上表达的拷贝数与癌细胞上表达的基本相同。具有对两种受体的亲和力大约相等的结合结构域的双特异性结合剂对癌细胞和正常非癌细胞的作用倾向于基本相等。具体说，在获得高浓度bsBA的情况下尤其如此，因为bsBA倾向于通过单价结合使两种受体饱和。
相反，本发明bsBA具有靶向受体A的较高亲和力靶向结构域和靶向受体B的较低亲和力效应物结构域，并且与受体A的亲和力比受体B高10倍、20倍、30倍、或甚至更多倍，因此本发明bsBA优先结合于癌细胞，并且通过正常的动力学相互作用，本发明bsBA将结合于更大量的癌细胞(与正常细胞相比)。因此，效应物结构域不会不加选择地结合于携带受体B的细胞(包括大量正常细胞)，而是被选择性递送至癌细胞。因此，本发明能够更有选择地将效应物结构域靶向靶细胞。
而且，亲和力较高的结合结构域与受体A的结合使亲和力较低的效应物结构域接近细胞表面，在接近细胞表面的地方它才能够与受体B相互作用一段时间。这使效应物结构域能够结合受体B，即使如果以″独立式″(free standing)、单价(或″一价″)实体提供效应物结构域时，它与受体B相对低的亲和力通常可能不足以使其维持在受体上。
本领域技术人员将理解，抗体或其它配体的解离常数(″Kd″)由配体的k开和k关确定。即，Kd代表抗体或其它配体结合于靶分子的时间和抗体或其它配体不结合的时间之间的平衡。因此，亲和力低的结合结构域常常具有低亲和力，因为它非常倾向于与其靶分子解离。在结合结构域与其靶分子解离期间，可通过作用于结合结构域分子的布朗运动、液流或其它动力学力去除结合结构域。bsBA的高亲和力结构域与低亲和力结构域的联系有助于维持低亲和力结构域与低亲和力结构域靶向的受体接近，从而有助于增加低亲和力结构域能够在任何时间点上结合其靶分子的概率。由于在此假拟情况下本发明bsBA的低亲和力结构域的靶分子是受体激酶，这有助于提高bsBA结合于靶受体激酶的能力，从而增加它们对靶细胞的生物学作用。
在优选实施方式中，本发明bsBA的两个结合结构域结合于通常不与相同配体结合的靶分子。本领域技术人员了解，一些配体如白介素IL-2被两条不同的受体链结合，结合有IL-2的这两条链然后相互作用形成有完全生物活性的单元。虽然指向这两条受体链的bsBA可因此防止这种受体的完全活化，但此bsBA的两个结合结构域当然指向同一受体。
最后，bsBA与通过结合结构域结合的这两个靶分子之间形成的三聚体具有额外优点：使靶分子紧密地互相结合和防止通常它们通过细胞膜的脂质双层扩散。相信bsBA使不同受体交联本身有助于bsBA对靶细胞的细胞毒作用或细胞抑制效应。例如，一般通过两种蛋白质相互结合形成异源二聚体或通过修饰(通常是磷酸化)起始级联反应中下一种蛋白的激酶来活化信号转导级联反应。不同受体的交联可干扰受体形成其正常异源二聚体的能力或干扰受体修饰蛋白质(通常是起始级联反应中的下一步骤)的能力。
在一组实施方式中，bsBA的靶向结构域结合于优先在与疾病或失调相关的靶细胞(如乳腺癌细胞)上表达或过量表达的细胞表面受体，效应物结构域结合于在靶细胞和非靶细胞上不加选择地或普遍表达的细胞表面受体。以下描述本发明bsBA可靶向的示范性细胞表面受体。在优选实施方式中，使靶向结构域结合的分子在靶细胞上表达的水平高于该分子被效应物结构域结合的水平。因此，本发明bsBA和方法特别可用于提高效应物分子特异性递送至含有靶分子的细胞，所述靶分子会被常规抗体或双特异性试剂或二者不加选择地结合。本领域技术人员熟知，与另一种不同癌症类型的细胞相比，不同的癌细胞可过量表达不同的抗原或不同程度地过量表达相同抗原。因此，在设计本发明bsBA中，考虑到实施者可选择靶向结构域，该靶向结构域能靶向在具体bsBA靶向的具体细胞上过量表达的细胞表面受体。
在一些实施方式中，bsBA的靶向结构域结合于第一种细胞表面受体，该受体优先在与疾病或失调相关的靶细胞(如癌细胞)上表达或过量表达，效应物结构域结合于与正常细胞相比、在患病细胞(如癌细胞)上过量表达的第二种细胞表面受体，但第二种细胞表面受体的表达水平低于第一种细胞表面受体。在这些实施方式中，第一种和第二种细胞表面受体表达水平的差异再一次改进了效应物分子向含有靶分子的细胞的特异性递送。
如背景部分所述，即使HER2在乳腺癌细胞中过量表达的水平是正常细胞上表达水平的约10-100倍，但仍然观察到患者中免疫治疗剂贺赛汀与正常细胞结合引起的一些副作用。因此，即使靶分子大量过量表达也不一定足以保持高亲和力结合物不与正常细胞结合而产生副作用。
相反，本发明bsBA中选择的靶向结构域与其靶分子的亲和力比效应物结构域与其靶分子的亲和力至少高10倍、常常高更多倍。靶向结构域与其靶分子的解离常数优选为10-8-10-12M。选择靶分子是因为它不存在于正常细胞上，或者因为与正常细胞相比它在癌细胞上高度过量表达，优选比正常细胞上的表达过量至少20倍，甚至更优选100倍。如上所述，由于靶向结构域与靶分子的亲和力高，它倾向于使bsBA优先结合于靶细胞。因此，预计效应物结构域可靶向正常细胞上表达的靶分子，仍能实现选择性结合，提供大于常规bsBA的治疗窗。
本领域技术人员应理解，具体说，癌细胞倾向于上调许多正常蛋白的表达，包括具有维持正常细胞体内稳态的作用的许多蛋白。因此，即使通常认为不是癌或肿瘤抗原的蛋白质在癌细胞上也倾向于上调。例如，与正常细胞相比，不认为是肿瘤抗原的胰岛素受体在肿瘤细胞中常常上调3-5倍(参见例如Milazzo等，Cancer Res.52(14)：3924-30(1992))。
又例如，与正常细胞相比，ErbB3受体在一些癌细胞上有些过量表达。然而，当靶向结构域指向过量表达程度更高的靶分子时，ErbB3受体可用作bsBA的效应物靶分子。实施例公开了本发明示范性bsBA，其中靶向结构域指向EGFR，效应物结构域靶向ErbB3。
需要靶向结构域指向在靶细胞上过量表达的靶分子(如癌抗原)，而效应物结构域指向表达水平低于靶向结构域的靶分子的分子(如受体激酶)。虽然仅需要靶分子的表达水平高于效应物结构域靶向的分子，通常，靶分子表达和效应物分子表达之间的显著性差异是有利的，因为在bsBA浓度低于靶向结构域的Kd时可使效应物分子饱和。
通常，靶向结构域的靶分子的过量表达水平比非靶细胞上该分子的表达水平优选高10倍、20倍、50倍、100倍或更多倍，更优选较高水平。通常，还优选效应物分子表达水平等于非靶细胞上的表达水平，或者，如果效应物分子过量表达，它的过量表达水平是非靶细胞的2-5倍。换句话说，相对于效应物结构域结合的分子，靶向分子表达(或过量表达)水平优选较高。
当靶细胞是患病细胞如癌细胞时，相对于与癌细胞起源的组织类型相同的正常细胞上相同分子的表达来衡量靶分子的表达水平。即，如果该患病细胞是乳腺癌细胞，就相对于正常乳腺细胞衡量表达水平，而相对于正常卵巢细胞上的表达水平衡量卵巢癌细胞中分子的表达水平。通常，采用细胞群体，测定表达水平的平均值(如每个细胞上表达的分子数)。
而且，在一些优选实施方式中，选择具有可通过效应物结构域结合来调节其生物活性的效应物结构域识别和结合的细胞表面抗原。例如，效应物结构域靶向的细胞表面抗原可以是细胞因子或生长因子受体，用结构域阻断所述抗原将有助于使靶细胞恢复正常表型。预计受体的阻断将导致被受体活化的通路下调，降低细胞的增殖速率。
如上所述，也知道可用作细胞因子受体激动剂的抗体等；即，它们的作用能提高靶分子活性。因此，根据实施者选择的靶分子和结合物，本发明bsBA的效应物结构域可抑制靶分子的活性，或可增强该活性。能够选择提高或降低效应物结构域的靶分子活性的结合结构域为实施者提供了设计有效用于一系列情况的bsBA的相当大的弹性。为了说明在实施者看来可通过明智地选择结合物而提高或降低靶分子的活性，本文中有时将bsBA对靶分子的作用称为″调节″靶分子的活性。
例如，一些癌症由编码用作酪氨酸激酶的受体的基因突变引起，导致受体变成组成性活化或过量表达，以致于细胞比具有正常受体或具有以正常量表达的受体的情况下增殖得更多。为了降低此受体活性，在此范例中，实施者可选择结合物，其中已知该结合物能通过结合而改变组成性活化受体的构象以降低其活性，或者在过量表达受体的情况下，仅阻断它与其天然配体的结合，从而防止过量表达导致的靶细胞中信号转导的不适当增加。相反，如果靶分子是需要提高其活性的分子，实施者可选择已知其结合能用作该活性的激动剂的结合物。
使用具有一个高亲和力结合结构域的bsBA足以特异性结合感兴趣的细胞。研究证明，含有指向一个靶分子的两个高亲和力结合结构域的结合物的亲和力仅约为含有同一结合结构域的一价结合物的亲和力的3倍。Nielsen，U.等，Cancer Res.60(22)：6434-40(2000)。因此，一价结合物的Kd一般在纳摩尔范围。由于治疗剂的给予量一般高到微摩尔浓度，它是结合物Kd的一千倍，所以相对于高亲和力靶向结构域的Kd，高浓度的结合物预期可允许结合物与携带靶分子的靶细胞结合。因此，预期本发明bsBA的高亲和力靶向结构域能在给药条件下提供bsBA的特异性结合。
预计实施者可选择靶向结构域和效应物结构域的靶分子的适当组合。虽然以下描述了许多优选的靶分子和效应物靶分子，但列举出一些优选的靶分子和效应物靶分子可能是有帮助的。一些优选的靶分子是EGFR和ErbB2。一些优选的效应物靶分子是：ErbB3、ErbB4、任意成纤维细胞生长因子(FGF)受体1-4、肝细胞生长因子受体、***1受体(IGF1-R)、胰岛素受体、血小板衍生生长因子(PDGF)受体α和β或C-KIT。本领域已知这些分子，在随后的章节中用SWISS-PROT数据库中的参比号码标识各分子。
最后，本发明bsBA不包括用一个结合结构域结合HER3并且用第二结合结构域结合HER2/neu的bsBA。
定义
以S国际单位制联合会(SI)接受的形式表示单位、前缀和符号。数字范围包括限定该范围的数字。除非另有说明，核酸从左至右是5′至3′取向；氨基酸序列从左至右是氨基至羧基取向。本文提供的标题并不限制本发明的各个方面或实施方式，它们可参考整个说明书。因此，以下所定义的术语更全面的定义需参照整个说明书。本文未限定的术语具有本领域技术人员所理解的通常含义。
一般根据解离常数或″Kd″说明结合物的″亲和力″。有用的结合物的Kd一般是纳摩尔浓度级。本领域技术人员应了解，Kd为10-8M的抗体的亲和力是Kd为10-7M的抗体的10倍，是Kd为10-6M的抗体的亲和力的100倍。因此，亲和力较高的物质的Kd数值较小(即数值10-8小于10-6)。
为了方便叙述，除非文中另有说明，本文所用术语″抗体″包括完整抗体、通过修饰完整抗体而产生或用重组DNA方法从头合成的保留了抗原识别和结合能力的抗体片段、单克隆抗体、多克隆抗体和抗体模拟物。抗体可以是IgM、IgG(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgD、IgA或IgE。
术语″抗体片段″指包含完整抗体的一部分(通常是完整抗体的抗原结合区或可变区)的分子。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；螺旋-稳定的抗体(参见例如，Arndt等，J MoI Biol 312：221-228(2001)；双抗体(见下)；单链Fv(″scFv″，参见例如，美国专利号5,888,773)；二硫键稳定的抗体(″dsFv″，参见例如，美国专利号5,747,654)和结构域抗体(″dAb″，参见例如，Holt等，Trends Biotech 21(11)：484-490(2003)，Ghahroudi等，FEBS Lett.414：521-526(1997)，Lauwereys等，EMBO J17：3512-3520(1998)，Reiter等，J.Mol.Biol.290：685-698(1999)，Davies和Riechmann，Biotechnology，13：475-479(2001))。
术语″双抗体″指具有两个抗原-结合位点的小抗体片段，该片段包含可变重链结构域(VH)，其在同一多肽链(VH-VL)中连接于可变轻链结构域(VL)。采用太短以致于不能使同一链上这两个结构域之间配对的接头，强迫这两个结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原-结合位点。以下文献中更全面地描述了双抗体，例如，EP 404，097；WO93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)。
免疫球蛋白一般含有重链和轻链。重链和轻链各自含有恒定区和可变区(这些区域也称为“结构域”)。轻链和重链可变区含有由三个高变区(也称为″互补决定区″或″CDR″)间隔开的″构架″区。已限定了构架区和CDR的区域。参见，Kabat和Wu，同上。不同轻链或重链的构架区序列在物种内相对保守。抗体的构架区，即组成性轻链和重链的构架区组合，用于在三维空间中定位和排列CDR。
CDR主要负责结合于抗原表位。各链的CDR一般称为CDR1、CDR2和CDR3(从N末端开始依次编号)，一般也用具体CDR所在链识别。因此，VHCDR3位于发现它的抗体重链的可变区中，而VLCDR1是发现它的抗体轻链的可变区的CDR1。
提到″VH″时或″VL″指免疫球蛋白重链可变区，包括Fv、scFv、dAb、dsFv或Fab。提到″VL″时或″VL″指免疫球蛋白轻链可变区，包括Fv、scFv、dsFv、dAb或Fab。
术语″单链Fv″或″scFv″指传统双链抗体的重链和轻链的可变结构域连接在一起形成一条链的抗体。任选地，将接头(通常是肽)***两条链之间以进行适当的折叠并产生活性结合位点。
″双特异性结合剂″或″bsBA″是能够同时特异性结合一种以上类型的靶分子的结合分子。
″结合物″是能够特异性结合靶分子的任何分子，包括抗体、抗体片段、适体、肽(如，Williams等，J Biol Chem 266：5182-5190(1991))和抗体模拟物，如可由第十种纤连蛋白III型结构域产生的模拟物(参见例如，Xu，L，等，Chem Biol.9(8)：933-42(2002)，Koide等，J Mol Biol 284：1141-1151，Skerra，J Mol Recognit 13：167-187(2000)，Main等，Cell，71：671-678(1992)和Dickinson等，J Mol Biol，236：1079-1092(1994))，可包括天然蛋白质和经修饰或工程改造包含非天然残基的蛋白质。在一些实施方式中，“结合物”也可指受体的天然配体。例如，IL-13可用作IL-13受体的结合物。
“适体”通常指一种序列确定的寡核苷酸或所述寡核苷酸的混合物，其中所述混合物保持了特异性结合于靶分子的特性。因此，本文所用“适体”指一个或多个寡核苷酸序列。从结构上说，本发明适体是特异性结合的寡核苷酸。寡核苷酸不仅包括具有常规碱基、糖残基和核苷酸间连接的寡核苷酸，也包括这三部分中任一部分或所有部分被修饰的寡核苷酸。纳入本文作参考的美国专利号5,756,291描述了适体、制备和测试适体的方法，及其应用。
本文所用“靶分子”指由本发明双特异性结合剂的结合结构域特异性结合的分子。本文所用术语“第一种靶分子”和“第二种靶分子”指两种不同分子种类的分子，而不是相同分子种类的两种分子。这种分子种类可以是(例如)两种不同的受体酪氨酸激酶(如碱性成纤维细胞生长因子受体1和肝细胞生长因子受体)。一些细胞因子受体和其它受体由称为“链”的亚基组成，在一些情况下一旦该受体的配体结合于这些链之一后通过征集链使这些受体完全活化。如本文所用，认为具体受体(如IL-2受体)的所有链都来自相同的分子种类；因此，如果给定受体的链是本发明bsBA的第一结合结构域结合的“第一种靶分子”，“第二种靶分子”不可能是同一受体的第二条链。
本文所用″生物活性″指靶分子进行的确定的已知活性。最常见的，被本发明bsBA靶向的分子的生物活性是信号转导。例如，本说明书靠后一部分列举了许多生长因子受体，作为可以是靶分子的分子。这些受体一般具有细胞胞外表面上的配体结合结构域、跨膜结构域和具有酪氨酸激酶酶活的胞浆结构域。酪氨酸激酶活性一般由配体与配体结合结构域结合而激活。然后，受体激酶活性启动信号级联反应。因此，这些靶分子的生物活性是信号转导。本领域技术人员将理解，靶分子的生物活性最终会影响靶分子所在细胞。例如，通过活化过量表达生长因子受体的癌细胞中的该受体而启动的信号转导级联反应可能增加该细胞的生长和增殖，而抑制该受体的活性可能抑制或减慢其增殖。因此，本文所用术语″生物活性″也可更宽泛地与细胞活性联用，与靶分子活性形成对比。在具体上下文中会明确指出其含义。
如上所述，已知可用作本发明bsBA的靶分子的一些分子不具有生物活性。出于本发明目的，可通过以下方式确定细胞表面上的给定分子是否具有生物活性。可将携带细胞表面分子的人细胞培养物分开形成两份单独培养物。使第一组培养物接触特异性结合于细胞表面分子并且预计能阻断任何天然配体与该分子结合的结合结构域。另一组培养物不接触该结构域。然后在其它条件完全相同的情况下培养这两组培养物。出于本发明目的，如果结合物与该分子结合没有引发细胞增殖、细胞活力、凋亡、激活下游激酶、转录激活、表面粘附或在软琼脂中产生集落的能力出现可观察到的差异，则认为该靶分子没有″生物活性″。本领域熟知观察这些特性差异的试验，以下更详细地描述几种试验。
本文所用生物活性的″调节″指按实施者所需提高或抑制靶分子的生物活性。例如，如果靶分子是认为能增加癌细胞增殖的受体(如ErbB3受体)，那么实施者可能想用结合结构域结合于受体来抑制受体活性，阻断该受体的天然配体与该受体结合。这些靶分子常常是与天然配体结合后用作酪氨酸激酶的受体。相反，如果靶分子的生物活性是实施者想要增加的一种活性，那么实施者可以(例如)用本领域已知抗体作为结合结构域，用作该靶分子的激动剂。结果应有利于治疗的疾病或病症；如治疗恶性肿瘤和一些自身免疫病，所需作用通常是抑制细胞生长或诱导凋亡，或者可能是诱导某种细胞类型(如治疗自身免疫病的T调节性T细胞)增殖。
应理解，细胞表面受体具有特异性结合于这些受体的配体。因此，对于给定的受体，术语″天然配体″指在正常生理过程中结合于该受体的分子。例如，白介素(″IL″)-13是IL-13受体的天然配体，IL-2是IL-2受体的天然配体，表皮生长因子是EGF受体的天然配体，等等。
术语″有效量″或″治疗有效量″包括足以产生所需结果的药物剂量，所需结果是例如抑制至少50％的细胞蛋白质合成或杀伤细胞。
″效应物分子″定义为可用于在与结合分子如本发明bsBA的效应物结构域接触时，通过(例如)信号转导、磷酸化、诱导增殖或诱导细胞死亡而调节细胞行为的细胞表面受体。
″Kd″是以下反应类型的反向速率常数和正向速率常数之比：
A+B＝AB。
平衡时，平衡常数(K)等于反应物浓度除以产物浓度的结果，具有浓度单位。Kd＝(浓度A×浓度B)/(浓度AB)。
与(例如)具有两个结合结构域的完整免疫球蛋白G分子相反，″一价结合物″和″一价结合组合物″定义为具有一个结合细胞表面标记的结构域的结合分子。一价结合物一般是形成双特异性抗体的两个结合结构域之一的分离片段，如scFv、Fab′、单结构域抗体等。
″靶细胞″是本发明双特异性抗体结合物以其高亲和力靶向结构域优先结合的细胞。
术语″接触″包括布置上具有直接物理联系。
本领域通常理解，细胞以含有脂质双层的质膜(通常称为″细胞膜″)为界，各种蛋白质如转运蛋白、离子通道和细胞因子受***于质膜中。通常参见Alberts等，Molecular Biology of the Cell，Garland Publishing，Inc.，纽约(第3版，1994)，第10章。可以认为细胞膜具有面向胞浆或细胞内部的表面和面向细胞外部或胞外空间的表面。跨膜蛋白常常是两亲性分子，即它们具有疏水性区域和亲水性区域。通过膜的区域是疏水性区域，并且与包括双层的脂质分子的疏水尾相互作用。亲水性区域接触膜的胞浆侧或胞外侧的水。跨膜蛋白的跨膜结构域是α螺旋或多条β链。参见例如Lodish等，Molecular Cell Biology，W.E.Freeman & Co.，纽约(第4版，2000)，第3章。
″细胞因子″是一种细胞群体释放的作为胞间介导物对相同细胞群体起作用(自分泌)或另一细胞群体起作用(旁分泌)的蛋白质的总称。所述细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子包括生长激素如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、***(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和β；米勒管抑制物；小鼠促性腺素-相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；整联蛋白；血栓形成素(TPO)；神经生长因子如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；***(IGF)如IGF-I和IGF-II；红细胞生成素(EPO)；成骨诱导因子；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL9、IL-11、IL-12；以及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL，也称为青灰因子)。
除非另有说明，本文提到抗体重链或轻链的氨基酸位置指采用″Kabat和Wu″***的氨基酸编号。参见Kabat，E.等，《免疫学感兴趣的蛋白质序列》(Sequences ofProteins ofImmunological Interest)，美国政府印刷厂，NIH出版号91-3242(1991)，纳入本文作参考(在本文中Kabat和Wu的数据库和编号***也称为″Kabat″***和编号)。Kabat和Wu数据库是本领域中最广泛采用的抗体氨基酸残基编号***，现在该数据库太大以致于不能方便地印刷。现在该数据库以在线订阅服务来维持，可通过输入″http://″然后是″immuno.bme.nwu.edu/″找到。以Kabat和Wu***编码的残基编号不一定对应于从该链氨基末端数出的给定重链或轻链的残基编号。
术语″残基″或″氨基酸残基″或″氨基酸″包括掺入蛋白质、多肽或肽(总称为″肽″)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另有限制，氨基酸可包括与天然存在的氨基酸作用方式相似的天然氨基酸类似物。
当描述蛋白质时，″保守取代″指基本上不改变蛋白质活性的蛋白质的氨基酸组成改变。因此，具体氨基酸序列的″保守修饰的变异″指对蛋白质活性来说不重要的氨基酸的氨基酸取代或用具有相似特性的其它氨基酸进行氨基酸取代(如酸性、碱性、带正电或带负电、极性或非极性等)，以致即使取代了重要氨基酸也不显著改变活性。本领域熟知提供功能上相似的氨基酸的保守取代表。以下表A中的六组各自含有互为保守取代的氨基酸：
表A
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
也参见，Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Company，纽约(1984)。
提到抗原时，术语″选择性反应性″和″选择性结合″指整个或部分抗体优先与携带该抗原的细胞或组织结合，而不与缺少该抗原的细胞或组织结合。当然应了解，在分子与非靶细胞或组织之间可发生某种程度的非特异性相互作用。然而，可通过由抗原的特异性识别来介导而区分出选择性反应性。虽然选择性反应性抗体结合抗原，但它们的结合可能是低亲和力结合。另一方面，特异性结合导致抗体和携带该抗原的细胞之间比结合抗体与缺少该抗原的细胞之间的结合得强得多。与缺少某靶抗原或标记的细胞或组织相比，特异性结合一般导致与携带该靶抗原或标记的细胞或组织结合的抗体量(每单位时间)多2倍、优选多5倍、更优选多10倍、最优选多100倍。在这种条件下特异性结合于蛋白质需要根据其对具体蛋白的特异性而选择的抗体。多种免疫测定形式适合用于选择与具体蛋白有特异性免疫反应性的抗体。例如，固相ELISA免疫测定通常用于选择与某蛋白有特异性免疫反应性的单克隆抗体。参见Harlow和Lane，《抗体，实验室手册》(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，纽约(1988)，其中描述了可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件。
术语″免疫反应条件″包括以下条件：针对具体表位产生的抗体结合于该表位的程度可检测性高于与基本上所有其它表位结合的程度、和/或基本排除与基本上所有其它表位的结合。免疫反应条件取决于抗体结合反应的形式，一般是免疫测定方案中所用条件或体内所处条件。参见Harlow和Lane，同上，其中描述了免疫测定形式和条件。用于本发明方法的免疫反应条件优选为″生理条件″，包括活哺乳动物或哺乳动物细胞内的一般条件(如温度、渗透压、pH)。虽然了解一些器官可处于极端条件下，但生物体内和细胞内的环境通常约为pH7(即pH6.0-pH8.0，更一般是pH6.5-7.5)，含有水作为主要溶剂，并存在于0℃以上和50℃以下的温度中。渗透压在支持细胞存活和增殖的范围内。
将bsBA偶联于治疗剂或标记
虽然bsBA与其配体的结合本身旨在通过(例如)阻断细胞因子到达其受体来调节靶细胞的生物活性，但可通过将治疗剂偶联于bsBA增强bsBA对生物活性的作用。因此，在一些实施方式中，使bsBA衍生化，以引入允许连接治疗剂的官能团。可使bsBA衍生化，以引入(例如)以酰肼、肼、伯胺或仲胺基团为末端的侧链。可通过(例如)席夫碱(Schiffs base)连接、腙或酰腙键、或酰肼接头偶联治疗剂(参见例如，美国专利号5,474,765和5,762,918，特别将各文献纳入本文作参考)。本领域熟知适合用于将治疗剂与本发明bsBA偶联的化学方法，如Hermanson，G，《生物偶联技术》(Bioconjugate Techniques)，Academic Press，加利福尼亚州圣地亚哥(1996)所述。
治疗剂可选自例如：抗肿瘤剂、抗代谢剂、放射性物质、细胞毒剂或化疗剂。
细胞毒剂包括抗癌剂，例如：吉西他滨；甲氨蝶呤；5-FU；FUDR；FdUMP；羟基脲；多西他赛；discodermolide；大环内酯类；长春新碱；长春碱；长春瑞滨；meta-pac；伊立替康；SN-38；10-OH喜树碱；拓扑替康；依托泊甙；多柔比星；flavopiridol；顺铂；卡铂；博来霉素；丝裂霉素C；普卡霉素；卡培他滨；阿糖胞苷；2-氯-2′脱氧腺苷；米托蒽醌；米托唑胺；喷司他丁和雷替曲塞。
还可修饰或标记本发明bsBA以有利于诊断或治疗应用。例如，可检测性标记如放射性标记、荧光标记、重金属标记或其它标记可偶联于本发明bsBA。bsBA的单标记、双标记或多标记可能是有利的。例如，bsBA可以是通过以下方式双标记的：放射性碘化一个或多个残基并且通过螯合基团将(例如)90Y与含胺-侧链或反应性基团偶联。此组合标记可用于特殊诊断需要，如鉴定广泛散布的小肿瘤细胞团块。
放射性标记本发明bsBA的放射性同位素包括可偶联或连接于bsBA残基的任何放射性同位素。放射性同位素可选自发射β或γ射线的放射性同位素，或者，可修饰肽物质使其含有(例如)可共价连接于该类似物的赖氨酸残基的螯合基团。然后可修饰该螯合基团，使其含有各种放射性同位素，如镓、铟、锝、镱、铼或铊(如125I、67Ga、111In、99mTc、169Yb、186Re)。
可用螯合基团将可检测标记或其它分子间接偶联于本发明bsBA。例如，可通过防止埃德曼降解的异硫氰酸酯β-丙氨酸或合适的非α-氨基酸接头将双功能稳定螯合剂连接于一个或多个末端或内部氨基酸反应性基团。本领域已知的螯合基团的例子包括例如，亚氨基羧基(ininocarboxylic)反应性基团和聚氨基聚羧基反应性基团、DTPA(N，N-双[2-[双(羧甲基)氨基]乙基]甘氨酸)和DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸)。
在癌症诊断和治疗方面，可用本发明bsBA制备诊断和成像组合物，以及将bsBA用于诊断和成像方法(如体内和体外诊断方法)的试剂盒。例如，可用诊断有效量的连接于体内诊断成像剂的bsBA使血管化肿瘤成像，所述bsBA至少包含结合于肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤基质的可及(accessible)组分的第一种结合分子。
在疾病或失调是癌症的另一优选实施方式中，可通过以下方式在癌症治疗前进行预成像：(a)给予动物或患者诊断有效量的包含可检测标记的本发明bsBA的药物组合物，所述bsBA具有以高亲和力结合于高表达的肿瘤细胞特征性受体、或者结合于肿瘤血管或肿瘤基质的第一种结合分子，和以至少低一个数量级的亲和力与第二种普遍表达的受体(如ErbB3或ErbB4)结合的第二种结合分子；和(b)然后检测结合于肿瘤细胞、肿瘤血管或肿瘤基质的可检测标记的bsBA；从而获得肿瘤、肿瘤血管和/或肿瘤基质的图像。
不希望受限于理论，bsBA可通过与天然配体竞争与细胞表面受体的结合而降低、阻断或抑制细胞信号转导。在这种情况下，bsBA通过阻断配体结合后诱导的细胞信号转导而起作用。bsBA也可通过诱导细胞表面受体的内化/下调而起作用。内化/下调引起的细胞表面受体数量减少导致活化受体减少，这降低或防止了沿这些受体的信号转导通路进行细胞信号转导。最后，在需要受体二聚化进行信号转导的情况下，bsBA可通过防止两种细胞表面受体二聚化而起作用。
选择用作靶点和效应物的细胞标记
用于靶向bsBA的细胞标记在靶细胞上的表达水平一般高于非靶细胞，或者不在非靶细胞上表达。例如，与非靶细胞相比，靶标记可在具体癌症中高度过量表达，或者在非癌性细胞上不表达。
用作效应物的细胞标记一般参与细胞信号转导，如生长因子、细胞因子或趋化因子受体，在给定病理条件下调节这些效应物是有利的。由于本发明hi-lo bsBA提供的选择性，bsBA效应物结构域结合的标记的表达不需要被限定于靶细胞，也可以在生物的其它细胞上表达。
测定Kd
可用本领域已知的方法测定bsBA的结合分子的结合亲和力，如纳入本文作参考的美国专利号6,703,020所述。可通过竞争性结合试验测定bsBA的第一种和第二种结合分子与其相应靶受体的结合亲和力以及bsBA-受体复合物的脱离速率。竞争性结合试验的一个例子是放射性免疫试验，该试验包括：在递增量的未标记受体的存在下，将(例如)3H或125I标记的一种或两种受体与感兴趣的bsBA一起孵育，并检测结合于标记受体的bsBA。可通过(例如)Scatchard图分析从数据中确定感兴趣bsBA与具体受体的亲和力和结合脱离速率。也可用流式细胞术测定Kd，如Nielsen等(CancerRes.60(22)：6434-40(2000))所述。实施例中列出了用于测定Kd的示范性试验。
在优选方法中，通过用BIAcore表面等离振子共振***(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)测定的结合和解离速率常数来确定bsAb的受体结合亲和力。一般通过将合适量(如500共振单位)的bsBA固定在生物传感器芯片(BIAcore)上测定bsBA与配体分子的亲和力。一般在PBS中通过以下方法测定bsBA的结合和解离速率：将25μg/ml的bsBA注射到芯片表面上5分钟，然后用缓冲溶液在芯片上冲洗5分钟使结合物质解离。可用(例如)BIAevaluation 2.1软件(BIAcore)分析结合动力学。出于测定具体bsBA是否属于本发明范围的目的，在形成bsBA后测定bsBA的结合结构域的亲和力(与将其置入bsBA中之前单独测定结构域的亲和力相反)，以便测定结合结构域的相对亲和力。
测定所需生物学作用
优选首先在体外测定本发明bsBA的所需治疗或预防活性。例如，可用于证明bsBA的治疗或预防用途的体外试验包括bsBA对细胞系或患者组织样品的作用。
可用本领域技术人员已知的技术测定bsBA对细胞系和/或组织样品的作用，包括例如：细胞增殖试验、细胞活力试验、蛋白质磷酸化试验、蛋白激酶活性试验、凋亡试验和蛋白质合成抑制研究等。可用抗体微阵列测定对蛋白通路中多种蛋白的作用。如Nielsen等(Proc Natl Acad Sci USA.，100(16)：9330-5.(2003))(″Nielsen 2003″)所述。然后在开始人类临床试验之前，测定bsBA在非人动物体内的功效。
产生一价结合组合物
当通过化学交联产生bsBA时，非交联片段本身是一价结合片段。在遗传连接(即重组表达)的bsBA的情况下，可通过将单独的结合蛋白克隆入可以表达和分离单价结合蛋白的表达载体中产生单价结合组合物。然后，可如上所述测定这种一价结合组合物的亲和力。
测定等效Kd
可通过上述方法、用一价结合组合物测定等效Kd。
比较bsBA和一价结合组合物的结合
可对一价结合组合物和bsBA进行生物活性试验，(例如)以评价其作为治疗剂的有效性并比较bsBA的有效性。本领域已知这种试验并取决于靶抗原。例子包括用调蛋白或其它生长因子活化后用ELISA或免疫印迹测定AKT磷酸化，生长抑制试验(如WO89/06692所述)；或凋亡试验。
为了测定磷酸化，可用标准的免疫印迹测定结合分子对(例如)效应物分子本身或下游激酶活化的作用，或可采用抗体试验，如Nielsen 2003(同上)所详述。
为了测定凋亡，可在体外用标准电泳或检测凋亡细胞中DNA缺口的TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记)试验检测DNA片段化。一旦细胞被固定，可用哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)原位检测DNA链断裂，TdT以不依赖模板的方式使标记的核苷酸共价结合于这些DNA片段的3′-羟基端。
可用各种化学和生物试剂监测细胞活力和增殖。例如，细胞周期相关标记的抗体或基于荧光的细胞活力和增殖试验如氚标记的胸苷试验、锥虫蓝排除试验、ATCCBioproductsTM MTT细胞增殖试验(美国典型培养物保藏中心，弗吉尼亚州马纳萨斯)、或CellTiter-Blue细胞活力试验(Promega，威斯康星州麦迪逊)。
采用bsBA结合生长因子受体
本发明bsBA的效应物结构域可结合许多分子。在一系列重要的实施方式中，效应物结构域结合细胞表面上的生长因子受体，如酪氨酸激酶受体。已知许多重要的生长因子受体和其配体(如属于表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、***(IGF-I)、血小板衍生生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF)家族的受体和配体)的过量表达或不适当活化与疾病和失调如癌症和自身免疫病的发生和发展相关或造成了这些疾病和失调。人们认为，这些生长因子以自分泌和/或旁分泌方式起作用，以刺激患病细胞的存活、增殖或迁移。生长因子与其受体结合导致该受体通过(例如)受体二聚化而活化，这导致受体自磷酸化，然后通过一系列不同信号转导分子进行信号转导。
干扰这些细胞中生长因子的结合活性或酪氨酸激酶受体的活化可恢复非癌表型或降低患病细胞的增殖速率。即受体与本发明bsBA接触能阻断配体如生长因子与其细胞表面受体结合后产生的信号。bsBA通过防止或减少配体与受体结合，或通过防止或降低配体诱导的受体二聚化而防止或降低信号转导通路的活化。
可与bsBA效应物结构域结合以产生本发明方法中的有用结果的示范性酪氨酸激酶受体(括号中显示了替代名称)包括：
ALK(间变性淋巴瘤激酶)，间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)中表达为嵌合NPM-ALK蛋白的一部分的酪氨酸激酶受体；
盘蛋白结构域受体(DDR)，通过与凝集素盘蛋白I同源的独特胞外结构域区分的受体酪氨酸激酶(盘蛋白受体酪氨酸激酶)(酪氨酸-蛋白激酶CAK)(细胞粘附激酶)(TRK E)(蛋白酪氨酸激酶RTK6)(CD167a抗原)；
盘蛋白结构域受体2前体(受体蛋白-酪氨酸激酶TKT)(酪氨酸-蛋白激酶TYRO10)(神经营养性酪氨酸激酶，受体相关3)；
表皮生长因子受体(受体蛋白-酪氨酸激酶ErbB-1)；
受体蛋白-酪氨酸激酶erbB-2(p185erbB2)(NEU原癌基因)(C-erbB-2)；
受体蛋白-酪氨酸激酶erbB-3前体(c-erbB3)(酪氨酸激酶型细胞表面受体)；
受体蛋白-酪氨酸激酶erbB-4(p180erbB4)(酪氨酸激酶型细胞表面受体)；
碱性成纤维细胞生长因子受体1(FGFR-I)(bFGF-R)(Fms样酪氨酸激酶-2)(c-fgr)；
FL细胞因子受体(酪氨酸-蛋白激酶受体FLT3)(干细胞酪氨酸激酶1)(STK-1)(CD135抗原)；
肥大细胞/干细胞生长因子受体(SCFR)(原癌基因酪氨酸-蛋白激酶Kit)(c-kit)(CD117抗原)；
白细胞酪氨酸激酶受体(蛋白酪氨酸激酶-1)；
肝细胞生长因子受体(Met原癌基因酪氨酸激酶)(c-met)(HGF受体)(HGF-SF受体)；
蛋白-酪氨酸磷酸酶-η(R-PTP-η)(HPTPη)(J型蛋白-酪氨酸磷酸酶受体)(密度提高的磷酸酶-1)(DEP-1)(CD148抗原)；
原癌基因酪氨酸-蛋白激酶受体ret(C-ret)；
酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体ROR1(神经营养性酪氨酸激酶，受体相关1)；
酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体ROR2(申经营养性酪氨酸激酶，受体相关2)；
酪氨酸-蛋白激酶受体Tie-1；
促血管生成素1受体(酪氨酸-蛋白激酶受体TIE-2)(酪氨酸-蛋白激酶受体TEK)(P140TEK)(内膜内皮细胞激酶)(CD202b抗原)；
高亲和神经生长因子受体(TRK1转化酪氨酸激酶蛋白)(p140-TrkA)(Trk-A)；
BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB酪氨酸激酶)(GP145-TrkB)(Trk-B)；
NT-3生长因子受体(TrkC酪氨酸激酶)(GP145-TrkC)(Trk-C)；
血管内皮生长因子受体1(VEGFR-1)(血管通透性因子受体)(酪氨酸-蛋白激酶受体FLT)(Flt-1)(酪氨酸-蛋白激酶FRT)(Fms样酪氨酸激酶1)；
血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)(激酶***结构域受体)(蛋白-酪氨酸激酶受体Flk-1)；和
血管内皮生长因子受体3前体(EC 2.7.1.112)(VEGFR-3)(酪氨酸-蛋白激酶受体FLT4)。
以下讨论描述了关于尤其可用于与效应物结构域结合的酪氨酸激酶受体，以及可用本发明方法调节的其它受体家族的更具体信息。
表皮生长因子受体(EGFR)/ErbB受体
一次跨膜的酪氨酸激酶受体EGFR/ErbB家族由四个成员组成：表皮生长因子受体(EGFR)、ErbB2(HER2/neu)、ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)。鉴定了能结合并激活ErbB受体的许多配体，它们都是不同基因的产物。这些受体和配体在正常细胞生长和分化中起到关键作用。
异常信号转导和/或ErbB受体蛋白活化不受调节与许多癌症的发生和发展相关。可在各种上皮来源的实体瘤中发现功能障碍的ErbB受体通路介导的不受控制的细胞增殖，数据将肿瘤ErbB受体表达、过量表达和/或调节异常与晚期疾病、转移性表型、化疗耐药性和总体预后较差相关联。而且，数据也表明，ErbB受体涉及肿瘤入侵增加、抑制细胞凋亡、细胞粘附增加和新生血管发生。具体说，在更具侵袭性的乳腺癌、膀胱癌、肺癌和胃癌等癌症中观察到EGFR表达增加(Modjtahedi和Dean，Int.J.Oncol.4：277-296，(1994))。人ErbB2过量表达与乳腺癌和卵巢癌(Slamon等，Science235：177-182(1987)和Slamon等，Science 244：707-712(1989))以及胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌和膀胱癌相关。ErbB3水平显著提高与某些人***肿瘤细胞系相关，这说明与ErbB1和ErbB2相似，ErbB3在人恶性肿瘤中起作用。具体说，发现ErbB3在乳腺癌(Lemoine等，Br.J.Cancer 66：1116-1121，1992)、胃肠癌(Poller等，J.Pathol.168：275-280，1992；Rajkumer等，J.Pathol.170：271-278，1993；和Sanidas等，Int.J.Cancer 54：935-940，1993)和胰腺癌(Lemoine等，J.Pathol.168：269-273，1992，和Friess等，Clinical Cancer Research 1：1413-1420，1995)中过量表达。最后，ErbB4表达增加也与人类癌症如上皮来源的癌(包括乳腺癌)紧密相关。
在许多情况下，在配体诱导受体异源二聚化后发生蛋白受体ErbB家族介导的信号转导。异源二聚化后发生的″受体串话(cross-talking)″导致ErbB受体激酶结构域激活和ErbB受体交叉磷酸化，已知受体串话在(例如)EGFR和ErbB2、ErbB2和ErbB3以及ErbB2和ErbB4之间发生(参见例如，Wada等，Cell 61：1339-1347(1990)；Plowman等，Nature 336：473-475(1993)；Carraway和Cantley，Cell 78：5-8(1994)；Riese等，Oncogene 12：345-353(1996)；Kokai等，Cell58：287-292(1989)；Stem等，EMBO J.7：995-1001(1988)；和King等，Oncogene 4：13-18(1989))。
用于制备本发明bsBA的优选结合分子参见例如：美国专利号5,183,884、5,480,968、5,968,511、5,977,322和6,512,097；Kraus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：9193-9197(1989)；欧洲专利申请号444,961 A1；和Kraus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2900-2904(1993)，各自纳入本文作参考。治疗方法的实施方式包括癌症以及除了癌症以外的疾病，如免疫病、神经病如神经纤维瘤病和周围神经病、以及心脏病如心脏肥大。
胰岛素受体(IR)和***受体(IGF-R)
胰岛素受体和IGF-1受体是紧密相关的蛋白质，它们是开发两种主要疾病(糖尿病和癌症)的新型治疗剂的重要靶点。糖尿病是越来越重要的全球健康问题。它是世界卫生组织分类为流行病的唯一一种非感染性疾病。全球糖尿病发病率为2-3％，在美国和其它西方国家提高到6％。
越来越多的证据证明，***受体(IGFR)在某些癌症和牛皮癣中起重要作用。通过这些受体下调信号转导与以下发病机理有关，例如，肾母细胞瘤发生(Wilm’s tumorigenesis)、肝母细胞瘤、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、腺皮质癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、***癌和肺癌，它们对放疗和化疗有抗性。胰岛素和IGF受体与ErbB受体家族紧密相关。
***受体(IGFR)参与维持身体许多细胞的正常功能。肿瘤细胞通常表达IGF-II受体，该受体可用作自分泌生长因子；偶尔甚至到达靶组织并引起肿瘤诱导的低血糖症。在许多癌症中通常过量表达IGF-I受体，许多最近的研究鉴定到从影响癌细胞增殖、粘附、迁移和细胞死亡的IGF-I受体开始的新信号传导途径；对癌细胞存活和转移很重要的功能(参见例如，LeRoith等，Cancer Lett.195：127-137(2003))。仍未将IGF-I受体看作癌症治疗剂的可能靶点，因为许多正常细胞也表达此受体。科学证据说明，IGF-I受体抑制影响了与细胞增殖或肿瘤发生相关的多种胞内信号，并提供了解释IGF-I受体抑制如何使肿瘤细胞对常规化疗或其它抗癌剂更敏感的可能机制。也许最重要的是，抑制IGF-I受体的信号转导在多发性骨髓瘤和其它恶性血液肿瘤的临床相关小鼠模型中抑制肿瘤生长、延长患者存活期和提高化疗的抗肿瘤作用。因此，应理解，以低亲和力结合分子结合于IGF-I受体的bsBA将克服优先靶向IGF-I受体的现有技术治疗剂的缺陷(即通过避免非靶、未患病细胞的IGF-I受体信号转导的抑制)。在这种情况下，bsBA的高亲和力结合分子优选结合于使bsBA特异性靶向患病细胞(如需要抑制IGF-I受体受过度刺激的细胞)的细胞表面受体。一旦优先靶向患病细胞后，bsBA的低亲和力结合分子可结合于IGF-I并抑制与疾病相关的不适当的细胞信号转导。
晚期乳腺癌患者的治疗方案常常包括采用细胞毒性化疗。IGF-I受体是细胞周期调节中的关键因子，它在晚期乳腺癌中常常过量表达，代表了这些癌症中的主要靶点。也注意到，用抗-HER2/neu受体单克隆抗体(曲妥珠单抗，也称为贺赛汀)(它能抑制过量表达ErbB2的乳腺癌细胞生长)治疗乳腺癌的患者，通常会产生对该抗体的抗性。观察到活化细胞存活信号的***-I(IGF-I)干扰了曲妥珠单抗的生长抑制作用。用本发明bsBA通过IGF-I受体而阻断、降低或抑制细胞信号转导后，可以恢复曲妥珠单抗诱导的生长抑制作用(参见例如，Lu等，J.Natl.Cancer Inst.93：1852-1857，2001)。因此，本发明bsBA的一个可能用途是靶向IGF-I受体信号转导，以防止或延迟对曲妥珠单抗或者其它现有或未来的抗癌治疗剂产生抗性。
中枢神经***(CNS)非典型畸胎样/杆状肿瘤(ATT/RhT)属于预后最差和可能致死的儿科恶性肿瘤。迄今仍不能解释它们对细胞抑制药物和放疗的显著抗性。IGF-I受体在细胞存活、增殖、转化和调节凋亡中起到重要作用。IGF-I受体保护癌细胞免受各种抗癌药和射线诱导的凋亡，但当该受体被抑制剂如反义方案、显性负突变体或形成三螺旋而阻碍时，肿瘤细胞会大量凋亡，导致在实验动物模型中抑制肿瘤发生和转移。靶向IGF-I受体的本发明bsBA可用于防止或降低通过活化IGF-I受体发生的信号转导，从而治疗疾病如癌症。
***(IGF)-和***受体(ER)-信号转导途径之间的串话导致协同生长。***通过诱导IGF-I受体及其下游信号转导分子和胰岛素受体底物(IRS)-I和IRS-2的表达而增强了IGF信号转导。***诱导IGF-I受体和IRS表达导致IGF-I刺激后IRS-I的酪氨酸磷酸化增加，然后是促***原活化的蛋白激酶活化增加。这说明，IGF-I受体活化参与了***-介导的生长和乳腺癌发病(参见例如，Lee等，Mol.Endocrinol.13：787-796，1999)。因此，靶向IGF-I受体的本发明bsBA可用于防止或降低通过活化IGF-I受体而发生的信号转导，从而治疗***-诱导的乳腺癌。
血管内皮生长因子受体(VEGFR)
血管内皮生长因子(VEGF)是缺氧和癌基因突变诱导的多功能细胞因子。VEGF是在胚胎发生中产生和维持血管网络的主要刺激物。它用作强效渗透性诱导剂、内皮细胞趋化剂、内皮存活因子和内皮细胞增殖因子(Thomas，J.Biol.Chem.271：603-606，1996；和Neufeld等，FASEB J.13：9-22，1999)。VEGF是在许多生理和病理过程中驱动新生血管发生或血管生成的重要因子，这些生理和病理过程包括伤口愈合(Frank等，1995；Burke等，1995)、糖尿病性视网膜病(Alon等，1995；Malecaze等，1994)、牛皮癣(Detmar等，1994)、动脉粥样硬化(Inoue等，1998)、类风湿性关节炎(Harada等，1998；Nagashima等，1999)和实体瘤生长(Plate等，1994；Claffey等，1996)。
多种细胞和组织都产生VEGF。VEGF二聚体以高亲和力结合于两种良好表征的受体VEGFR1(FLT-1)和VEGFR2(KDR/Flk-1)，它们在内皮细胞上选择性表达(Flt-1和Flk-1是小鼠类似物)。VEGF与VEGFR1和VEGFR2结合的Kd分别为15-100pM和400-800pM(Terman等，1994)。最近鉴定到的第三种细胞表面蛋白一神经毡蛋白-1也以高亲和力结合VEGF(如Soker等，Cell.92(6)：735-45(1998))。
VEGFR1和VEGFR2是III型受体酪氨酸激酶(RTK III)家族的成员，该家族的特征是七个胞外IgG-样重复、一次跨膜结构域和胞内***的酪氨酸激酶结构域(Mustonen和Alitalo，J Cell Biol 129：895-898(1995))。直到最近，认为VEGFR1和VEGFR2几乎仅在内皮细胞上表达(同前)。最近的研究证明，VEGF、VEGFR1和VEGFR2各自是血管生成、新生血管发生和胚胎发育所必需的。VEGFR1对VEGF的亲和力高于VEGFR2，但它的酪氨酸激酶活性较低。
相信VEGF二聚体与VEGF受体结合能诱导受体二聚化。然后，受体二聚化引起特定酪氨酸残基的自身转磷酸化，这导致信号转导级联反应。仍不太清楚VEGF-诱导的信号转导中再下游的胞内事件，但许多研究小组证明，在VEGF活化VEGFR2后产生一氧化氮(NO)(Kroll和Waltenberger，Biochem Biophys Res Commun.252(3)：743-6(1998))。也已证明，VEGF活化VEGFR2而非VEGFR1能激活Src和Ras-MAP激酶级联反应，包括MAP激酶、ERK1和2(Kroll和Waltenberger，J Biol Chem.272(51)：32521-7(1997))。
用于制备本发明bsBA的优选结合分子参见例如，美国专利号5,840,301、5,874,542、6,703,020和WO99/40118，各自纳入本文作参考。用于制备bsBA的优选结合分子是单克隆抗体2C3(ATCC PTA 1595)。抗VEGF受体的RNA适体、反义分子和核酶也可用作bsBA中的结合分子。优选的RNA反义分子、适体和核酶参见例如，Saleh等，Cancer Res.56(2)：393-401(1996)；Cheng等，Proc Natl Acad Sci USA.93(16)：8502-7(1996)；Ke等，Int J Oncol.12(6)：1391-6(1998)；和Parry等，NucleicAcidsRes.27(13)：2569-77.(1999)；各自纳入本文作参考。
使用本发明的组合物和方法尤其可用于患有以下疾病或处于发生以下疾病的风险中的动物和患者(如人患者)：任何形式的血管化肿瘤；黄斑变性，包括与年龄相关的黄斑变性；关节炎，包括类风湿性关节炎；动脉粥样硬化和动脉粥样硬化斑块；糖尿病性视网膜病和其它视网膜病；甲状腺增生，包括格雷夫斯病；血管瘤；新生血管性青光眼和牛皮癣，这些疾病与VEGF受体的不适当或过度活化相关。
使用本发明的组合物和方法还可用于治疗患有以下疾病或处于发生以下疾病的风险中的动物和患者：动静脉畸形(AVM)、脑膜瘤和血管再狭窄，包括血管成形术后再狭窄，也与VEGF受体的不适当或过度活化相关的疾病。所考虑的治疗方法和应用的其它靶点是患有以下VEGF受体相关性疾病或处于发生这种疾病的风险中的动物和患者：血管纤维瘤、皮炎、子宫内膜异位、血友病性关节、肥厚性瘢痕、炎性疾病和失调、化脓性肉芽肿、硬皮病、滑膜炎、沙眼和血管粘附。
上述治疗组并未穷举可用本发明bsBA治疗的疾病。纳入本文作为参考的美国专利号5,712,291公开了当效应物结构域指向VEGF受体之一时可用本发明bsBA有效治疗的许多其它疾病的鉴定方法。而且，可用具有结合VEGFR的效应物结构域的本发明bsBA治疗的其它疾病可参见(例如)美国专利号6,703,020，纳入本文作参考。
肿瘤坏死因子受体(TNFR)
肿瘤坏死因子(TNF)α和β是通过TNF受体调节许多生物学过程(包括保护免受感染以及诱导休克和炎性疾病)的细胞因子。TNF分子属于″TNF-配体″超家族，与其受体或反配体(″TNF-受体″超家族)一起起作用。迄今为止，鉴定了TNF配体超家族的九个成员，表征了TNF受体超家族的十个成员。这些配体包括TNF-、淋巴毒素-(LT-，也称为TNF-β)、LT-β(在复合型异源三聚体LT-2-β中发现)、FasL、CD40L、CD27L、CD30L、4-1BBL、OX40L和神经生长因子(NGF)。TNF受体超家族包括p55TNF受体、p75TNF受体、TNF受体相关蛋白、FAS抗原或APO-I、CD40、CD27、CD30、4-1BB、OX40、低亲和p75和NGF-受体(参见例如，A.Meager，Biologicals22：291-295，1994)。
活化的T细胞使TNF-配体超家族的许多成员得以表达，说明它们是T细胞与实现细胞个体发生和功能的其它细胞类型相互作用所必需的。(Meager 1994，同上)。对TNF受体家族几个成员的必要功能的深入了解获自鉴定和产生了消除这些蛋白表达的突变。例如，FAS抗原和其配体中天然产生的突变引起淋巴组织增生病(参见例如，Watanabe-Fukunaga等，Nature 356：314，1992)，可能反映出程序化细胞死亡失败。CD40配体的突变引起X-联锁免疫缺陷疾病，特征是血浆中高水平的免疫球蛋白M和低水平的免疫球蛋白G，表明错误的T细胞依赖性B细胞活化(参见例如，R.C.Allen等，Science 259：990，1993)。低亲和神经生长因子受体的靶向突变引起一种疾病，其特征是***结构的错误的感受创新(sensory innovation)(参见例如，Lee等，Cell 69：737，1992)。
TNFR配体TNF和LT-能够结合于两种TNF受体(55-和75-kd TNF受体)。TNF和LT-(通过它们的受体)引发的大量生物学作用包括移植肿瘤的出血性坏死、细胞毒性、在内毒素性休克中的作用、炎症、免疫调节、增殖和抗病毒反应、以及保护免受电离辐射的有害作用。TNF和LT-参与了多种疾病的发病机理，包括内毒素性休克、脑型疟、肿瘤、自身免疫病、AIDS和移植物-宿主排斥(Beutler和Von Huffel，Science264：667-668，1994)。p55受体中的突变引起对微生物感染的易感性增加。
另一种TNFR，TNF-相关性凋亡诱导配体或“TRAIL”在许多人组织中表达(如脾、肺、***、胸腺、卵巢、小肠、结肠、外周血淋巴细胞、胎盘、肾)。据证明，TRAIL独立于FAS配体起作用，并快速激活凋亡，其激活凋亡的时间范围类似于Fas/Apo-1L死亡信号途径，但比TNF-诱导的凋亡快得多。
已知肿瘤坏死因子(TNF)家族配体属于最多效的细胞因子，诱导许多细胞应答，包括细胞毒性、抗病毒活性、免疫调节活性和几种基因的转录调节。对TNF-家族配体的细胞应答不仅包括正常生理应答，还包括与凋亡增加或凋亡抑制相关的疾病。凋亡-程序性细胞死亡是参与清除免疫***的外周T淋巴细胞的生理机制，其失调可导致许多不同的病理过程。与细胞存活增加或凋亡抑制相关的疾病包括癌症、自身免疫病、病毒感染、炎症、移植物抗宿主病、急性移植排斥和慢性移植排斥。与凋亡增加相关的疾病包括AIDS、神经变性疾病、骨髓发育异常综合征、局部缺血伤口、毒素诱导的肝病、感染性休克、恶病质和食欲缺乏。
可制备本发明bsBA，使两个结合结构域中至少一个特异性结合于TNFR。那么，这种bsBA可通过活化TNFR如结合TNFR，而促进凋亡以及防止或降低不适当的细胞生长(如在癌症的情况下)，从而可用于治疗以下疾病的方法中：癌症、自身免疫病、病毒感染、炎症、移植物抗宿主病、急性移植排斥和慢性移植排斥。在优选实施方式中，bsBA的结合分子之一结合于TNFR，第二种结合分子结合于已知在靶细胞上表达的第二受体(如第二种不同的TNFR，或疾病特异性受体)。在癌症的情况下，优选的第二受体是ErbB家族的受体，如ErbB2。优选的是，结合TNFR的bsBA结合分子的亲和力比第二种结合分子对其受体的亲合力低。
或者，可制备本发明bsBA，以使bsBA的两个结合分子中至少一个特异性结合于TNFR，(例如)通过阻断配体与TNFR结合防止和减少了TNFR活化。那么，这种bsBA可通过(例如)防止和减少配体与TNFR结合而防止和减少TNFR活化，从而防止或减少凋亡，从而用于治疗以下疾病的方法中：AIDS、神经变性疾病、骨髓发育异常综合征、局部缺血伤口、毒素诱导的肝病、感染性休克、恶病质和食欲缺乏。优选地，用两种结合分子中至少一种特异性结合于TNFR的bsBA治疗显示出凋亡增加的疾病(如局部缺血伤口)。在优选实施方式中，bsBA的靶向结构域指向靶细胞上表达的抗原或第二受体(即除了TNFR以外的受体)，它用于使bsBA靶向靶细胞。
成纤维细胞生长因子受体(FGFR)
成纤维细胞生长因子(FGF)信号传导途径是正常发育和伤口愈合的重要部分。FGF通过细胞表面受体产生其作用，其是酪氨酸激酶家族成员。在人类中鉴定了4种不同的成纤维细胞生长因子受体(FGFR)(FGFRl-FGFR4)。
FGFR在二聚化后通过自磷酸化而活化。在硫酸乙酰肝素的存在下配体结合后发生二聚化，导致FGFR的胞质结构域中几个酪氨酸残基磷酸化。FGFR的磷酸化激活激酶活性并导致MAPK、PD激酶和Stat1/3通路激活。
FGFR基因中的突变一般产生获能(gain-of-function)突变，造成由于受体被不适当活化引起的疾病或失调。FGFR突变与几种发育失调相关，包括例如发否综合征、杰-韦综合征(Jackson-Weiss Syndrome)、克鲁宗综合征、阿佩尔综合征、Beare-Stevenson Cutis Gyrata综合征、塞-科综合征、软骨发育不全、侏儒性发育不良、软骨发育不良、Muenke综合征以及严重性软骨发育不全伴发发育迟缓和黑棘皮病(SADDAN)的发育异常。通过免疫组化与正常组织比较时也发现FGFR在许多肿瘤样品中过量表达。例如，在原发性结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和结肠癌中鉴定到FGFR过量表达。FGF分子用作促***原因子、新生血管发生因子和抗凋亡因子，并可能参与了癌症发生。
可制备本发明bsBA，以使bsBA的两个结合分子中至少一个特异性结合于FGFR，(例如)通过阻断配体与FGFR结合或者防止或减少FGFR二聚化而防止和减少FGFR的活化。那么，这种bsBA可用于通过防止或减少FGFR活化而治疗以下疾病的方法中：发否综合征、杰-韦综合征、克鲁宗综合征、阿佩尔综合征、Beare-Stevenson Cutis Gyrata综合征、塞-科综合征、软骨发育不全、侏儒性发育不良、软骨发育不良、Muenke综合征以及严重性软骨发育不全伴发发育迟缓和黑棘皮病(SADDAN)的发育异常、原发性结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和结肠癌。在优选实施方式中，bsBA的靶向结构域指向靶细胞上表达的第二种受体(即除FGFR以外的受体)，该靶向结构域用于使bsBA靶向靶细胞。
血小板衍生生长因子受体(PDGFR)
PDGFR家族能活化下游信号转导酶，这些酶刺激***细胞如血管平滑肌细胞(VSMC)、少突胶质细胞(包裹神经纤维的组织的细胞)和软骨细胞的生长和运动。PDGF β受体是指导VSMC分化所必需的。
PDGFR通路的过量表达与多种严重疾病(包括动脉粥样硬化和癌症)相关，这些疾病与PDGFR的不适当活化或活化增加有关。或者，可能需要促进PDGFR活化，以促进骨、牙周组织、韧带和软骨的修复。
可制备本发明bsBA，以使bsBA的两个结合分子中至少一个特异性结合于PDGFR，(例如)通过阻断配体与PDGFR结合而防止和减少PDGFR活化。那么，这种bsBA可用于通过防止或减少PDGFR活化而治疗以下疾病的方法中：如动脉硬化和癌症。在优选实施方式中，bsBA的第二种结合分子指向靶细胞上表达的第二种受体(即除了PDGFR以外的受体)，它用于使bsBA靶向靶细胞。优选地，结合PDGFR的bsBA结合分子的亲和力比第二种分子与其受体的亲和力低。
或者，可制备本发明bsBA，以使bsBA的两个结合分子中至少一个特异性结合于并活化PDGFR。那么，此种bsBA可用于通过活化PDGFR而促进骨、牙周组织、韧带和软骨的修复的方法。在优选实施方式中，bsBA的效应物结构域结合PDGFR，靶向结构域结合于已知在靶细胞上表达的抗原或第二种受体(如第二种不同的PDGFR，或骨-、牙周组织-、韧带-或软骨-特异性受体)。
C-Kit受体(也称为青灰因子受体)
c-Kit原癌基因是黑色素细胞发育和增殖中重要的跨膜酪氨酸激酶类型的受体。原癌基因c-Kit编码的跨膜酪氨酸激酶受体与血小板衍生生长因子PDGF/CSF-1(c-fms)受体亚家族有关。发现C-Kit在胚胎黑色素母细胞的正常生长和分化中起核心作用。黑色素细胞的恶性转化和人黑色素瘤的进展与缺少c-Kit原癌基因表达有关。在肿瘤生长和人黑色素瘤侵入期间，c-Kit原癌基因编码的酪氨酸激酶受体的表达逐渐降低。
可制备本发明bsBA，以使bsBA的两个结合分子中至少一个特异性结合于和活化c-Kit受体。那么，此种bsBA可用于治疗(例如)黑色素瘤的方法中。在优选实施方式中，bsBA的靶向结构域指向靶细胞上表达的抗原或第二种受体(即除了c-Kit受体以外的受体)，它用于使bsBA靶向靶细胞。
Fc受体(FcR)
Fc受体是抗原-抗体复合物或聚集的免疫球蛋白的特异性细胞表面受体，其结合免疫球蛋白分子Fc部分中的位点，并可能对具体免疫球蛋白类型具有特异性。在B细胞、K细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和嗜伊红粒细胞上，以及在一些发育阶段的T细胞上发现FcR；在K细胞、巨噬细胞和中性粒细胞上的FcR结合于与抗原结合的调理抗体并引发抗原的吞噬作用。
已知人FcR与自身免疫病(如***性红斑狼疮、自身免疫性血小板生成性紫癜、重症肌无力、多发性硬化、葡萄膜炎和甲状腺相关性眼病)和对过敏原的过敏反应的发生和发展相关。FcR的天然抑制负责维持外周耐受，从而防止发生自身免疫和自身免疫病。相反，FcR活化的缺陷产生保护性表型，将自身免疫与自身免疫病分开。
可制备本发明bsBA，以使bsBA的两个结合分子中至少一个特异性结合于FcR，(例如)通过阻断FcR与免疫细胞上的Ig分子结合而防止和减少FcR的活化。那么，此种bsBA可用于治疗以下疾病的方法中：例如，自身免疫病，如***性红斑狼疮、自身免疫性血小板生成性紫癜、重症肌无力、多发性硬化、葡萄膜炎和甲状腺相关性眼病。bsBA的靶向结构域一般指向靶细胞上表达的抗原或第二种受体(即除FcR以外的受体)，它用于使bsBA靶向靶细胞。
用bsBA结合细胞因子受体
在一组重要的实施方式中，可用靶向结构域或效应物结构域结合细胞表面上的细胞因子受体。在一些较不优选的实施方式中，结合物可以是细胞因子受体的天然配体(例如IL-13可用作结合IL-13受体的结合物)或保留了结合受体的能力的这种配体的片段。
可按需与bsBA的靶向结构域或效应物结构域结合以产生本发明方法的有用结果的示范性细胞因子受体(括号中显示了可选名称)包括：
细胞因子受体普通γ链(γ-C)(白介素-2受体γ链)(IL-2R γ链)(P64)(CD132抗原)；
白介素-10受体α链(IL-10R-A)(IL-10R1)；
白介素-10受体β链(IL-10R-B)(IL-10R2)(II型细胞因子受体CRF2-4)；
白介素-12受体β-1链(IL-12R-β1)(白介素-12受体β)(IL-12受体β组分)(IL-12RB1)；
白介素-12受体β-2链(IL-12受体β-2)(IL-12R-β2)；
白介素-13受体α-1链(IL-13R-α-1)(IL-13RA-1)(CD213a1抗原)；
白介素-13受体α-2链(白介素-13结合蛋白)；
白介素-17受体(IL-17受体)；
白介素-17B受体(IL-17B受体)(IL-17受体同源物1)(IL-17Rh1)(IL17Rh1)(细胞因子受体CRL4)(UNQ2501/PRO19612)；
白介素21受体前体(IL-21R)；
白介素-1受体，I型(IL-1R-1)(IL-1R-α)(P80)(抗原CD121a)；
白介素-1受体，II型(IL-1R-2)(IL-1R-β)(抗原CDw121b)；
白介素-1受体拮抗性蛋白(IL-1ra)(IRAP)(IL1抑制物)(IL-1RN)(ICIL-1RA)；
白介素-2受体α链(IL-2受体α亚基)(P55)(TAC抗原)(CD25抗原)；
白介素-2受体β链(IL-2受体)(P70-75)(高亲和力IL-2受体β亚基)(CD122抗原)；
白介素-3受体α链(IL-3R-α)(CD123抗原)；
白介素-4受体α链(IL-4R-α)(CD124抗原)；
白介素-5受体α链(IL-5R-α)(CD125抗原)；
白介素-6受体α链(IL-6R-α)(IL-6R1)(CD126抗原)；
白介素-6受体β链(IL-6R-β)(白介素6信号转导物)(膜糖蛋白130)(gp130)(制瘤素M受体)(CDw130)(CD130抗原)；
白介素-7受体α链(IL-7R-α)(CDw127)(CD127抗原)；
高亲和力白介素-8受体A(IL-8RA)(IL-8受体1型)(CXCR-1)(CDw128a)；
高亲和力白介素-8受体B(IL-8R B)(CXCR-2)(GRO/MGSA受体)(IL-8受体2型)(CDw128b)；
白介素-9受体(IL-9R)；
白介素-18受体1(IL1受体-相关蛋白)(IL-1Rrp)；
白介素-1受体-样1前体(ST2蛋白)；
白介素-1受体-样2(IL-1Rp2)(白介素-1受体相关蛋白2)(ILlR-rp2)；
Toll样受体1(Toll/白介素-1受体-样)(TIL)；
Toll样受体2(Toll/白介素1受体样蛋白4)；
Toll样受体5(Toll/白介素-1受体样蛋白3)；
CX3C趋化因子受体1(C-X3-C CKR-I)(CX3CR1)(Fractalkine受体)(GPR13)(V28)(β趋化因子受体样1)(CMK-BRL-1)(CMKBLR1)；
C-X-C趋化因子受体3型(CXC-R3)(CXCR-3)(CKR-L2)(CD183抗原)；
C-X-C趋化因子受体4型(CXC-R4)(CXCR-4)(基质细胞衍生因子1受体)(SDF-I受体)(融蛋白)(白细胞衍生的七次跨膜结构域受体)(LESTR)(LCR1)(FB22)(NPYRL)(HM89)(CD184抗原)；
C-X-C趋化因子受体5型(CXC-R5)(CXCR-5)(伯基特淋巴瘤受体1)(单核细胞衍生的受体15)(MDR15)；
C-X-C趋化因子受体6型(CXC-R6)(CXCR-6)(G蛋白偶联受体bonzo)(G蛋白偶联受体STRL33)；
趋化因子结合蛋白2(趋化因子-结合蛋白D6)(C-C趋化因子受体D6)(趋化因子受体CCR-9)(CC-趋化因子受体CCR10)；
C-C趋化因子受体1型(C-C CKR-1)(CC-CKR-1)(CCR-1)(CCR1)(巨噬细胞炎性蛋白-1α受体)(MIP-1α-R)(RANTES-R)(HM145)(LD78受体)；
C-C趋化因子受体2型(C-C CKR-2)(CC-CKR-2)(CCR-2)(CCR2)(单核细胞化学引诱物蛋白1受体)(MCP-1-R)；
C-C趋化因子受体3型(C-C CKR-3)(CC-CKR-3)(CCR-3)(CCR3)(CKR3)(嗜伊红粒细胞趋化蛋白受体)；
C-C趋化因子受体4型(C-C CKR-4)(CC-CKR-4)(CCR-4)(CCR4)(K5-5)；
C-C趋化因子受体5型(C-C CKR-5)(CC-CKR-5)(CCR-5)(CCR5)(HIV-I融合共同受体)(CHEMR13)(CD195抗原)；
C-C趋化因子受体6型(C-C CKR-6)(CC-CKR-6)(CCR-6)(LARC受体)(GPR-CY4)(GPRCY4)(趋化因子受体样3)(CKR-L3)(DRY6)；
C-C趋化因子受体7型前体(C-C CKR-7)(CC-CKR-7)(CCR-7)(MIP-3β受体)(EBV诱导的G蛋白偶联受体1)(EBI1)(BLR2)；
C-C趋化因子受体8型(C-C CKR-8)(CC-CKR-8)(CCR-8)(GPR-CY6)(GPRCY6)(趋化因子受体样1)(CKR-L1)(TER1)(CMKBRL2)(CC-趋化因子受体CHEMR1)；
C-C趋化因子受体9型(C-C CKR-9)(CC-CKR-9)(CCR-9)(GPR-9-6)；
C-C趋化因子受体10型(C-C CKR-10)(CC-CKR-10)(CCR-10)(G-蛋白偶联受体2)；
C-C趋化因子受体11型(C-C CKR-11)(CC-CKR-11)(CCR-11)(趋化因子受体样1)(CCRL1)(CCX CKR)；
趋化因子受体样1(G-蛋白偶联受体DEZ)(G蛋白偶联受体ChemR23)，
趋化因子受体样2(IL8-相关受体DRY12)(流动诱导的内皮G蛋白偶联受体)(FEG-1)(G蛋白偶联受体GPR30)(GPCR-BR)；
趋化因子XC受体1(XC趋化因子受体1)(淋巴细胞趋化蛋白受体)(G蛋白偶联受体5)。
用bsBA结合肿瘤相关性抗原
在一组特别重要的实施方式中，bsBA的靶向结构域结合于肿瘤相关性抗原。顾名思义，肿瘤相关性抗原(TAA)一般是具体肿瘤细胞上表达的抗原，但这些抗原一般不在正常细胞中表达。TAA常常是仅在生物发育的特定阶段上(如胎儿发育期间)在细胞中正常表达的抗原和在生物目前的发育阶段中不适当表达的抗原，或者是在现在表达该抗原的器官的正常组织或细胞中不表达的抗原。本领域已知许多TAA，包括MART-1、癌胚抗原(“CEA”)、gp100、MAGE-1、HER-2和LewisY抗原，以及(例如)美国专利号5,922,566和6,020,478以及WO2004/016643 A2中鉴定的抗原。
适合用本发明bsBA靶向的其它肿瘤相关性抗原包括：
-造血分化抗原--通常与分化群(CD)分组相关的糖蛋白，如CD5、CD19、CD20、CD22、CD33、CD45、CD52和CD147；
-细胞表面分化抗原，包括糖蛋白，如癌胚抗原(CEA，Swiss-Prot编号P06731)，肿瘤相关性糖蛋白(TAG-72，也称为CA72-4，参见例如，Hombach等，Gastroenterology.113(4)：1163-70(1997))，多态性上皮粘蛋白(PEM)，上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)，MUC-1，A33，G250，E-钙粘着蛋白，***特异性膜抗原(PSMA，Swiss-Prot编号Q04609)和***特异性抗原(PSA)，糖脂，如神经节苷脂，如GD2、GD3、GM2)和糖，如血型相关抗原，包括LEY和LEb(LEY是“LewisY”，也称为“CD174”；它是在糖脂和糖蛋白的2型血型寡糖上发现的二海藻糖基化四糖)；
-生长因子受体，包括表皮生长因子受体(EGFR，ErbB1，Swiss-Prot编号P00533)和其突变形式EGFRvIII、ErbB2(HER-2/neu，Swiss-Prot编号P04626)、ErbB3(HER-3，Swiss-Prot编号P21860)和IL-2受体。
-新生血管发生和基质抗原，包括成纤维细胞活化蛋白(FAP)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、腱生蛋白和整联蛋白；和
-Frizzled受体家族(如Fz-2)
在一些实施方式中，bsBA的靶向结构域靶向结合TAA，而效应物结构域结合于生长因子受体。
在一些优选实施方式中，靶向结构域靶向选自下组的分子：CEA(Swiss-Prot编号P06731)、ErbB2(Swiss-Prot编号P04626)、EGFR(Swiss-Prot编号P00533)、LewisY、MUC-1(Swiss-Prot编号P15941)、EpCAM(mAb17-1A(依决洛单抗，Panorex，GlaxoWellcome GmbH)的靶点)、CA125(Swiss-Prot编号Q96RK2)、PSMA(Swiss-Prot编号Q04609)、TAG72、CD20(Swiss-Prot编号P11836)、CD19(Swiss-Prot编号P15391)、CD22(Swiss-Prot编号P20273)或CD36(Swiss-Prot编号P16671)。应注意到，特别是CD抗原常常在正常细胞上表达但在某些癌症上过量表达或是某些癌症的标记。
在一些优选实施方式中，效应物结构域结合于选自下组的分子：ErbB3(Swiss-Prot编号P21860)、ErbB4(Swiss-Prot编号Q15303)、FGF受体1-4(Swiss-Prot编号P22455、P11362、P21802、P22607)、HGF受体(Swiss-Prot编号P08581)、IGF1-R(Swiss-Prot编号P08069)、胰岛素受体(Swiss-Prot编号P06213)、PDGF受体α和β(Swiss-Prot编号分别为P16234、P09619)或C-KIT(Swiss-Prot编号P10721)。在一些尤其优选的实施方式中，靶向结构域结合于上一自然段所述分子，效应物结构域结合于本自然段所述分子。
适体
可如纳入本文作参考的美国专利号5,756,291所述，制备结合分子之一或二者是适体的BsBA。通常通过“SELEX”(“配体通过指数富集进行***进化”的缩写)法制备适体。这是重复的过程，用于鉴定所选择分子靶点的适体。一开始，产生一个大的核酸分子“文库”。在选择步骤中，分离与感兴趣靶点亲和力最大的分子。使此核苷酸序列文库暴露于细胞表面蛋白，孵育一段时间。洗掉文库中与靶点亲和力弱或无亲和力的分子，从靶点上纯化掉靶点结合分子(其中是亲和力最高的适体)，用于SELEX方法的后续步骤。
用酶学方法拷贝或“扩增”捕获的纯化序列，产生新的分子文库，该文库中大量富集了可结合靶点的分子。用富集的文库启动新一轮选择、划分和扩增。整个过程进行5-15个循环后，该分子文库从1015个独特序列减少到与感兴趣细胞表面蛋白紧密结合的少量序列。然后，分离混合物中的单个分子，测定它们的核苷酸序列，并测定它们的结合亲和力特性(主要是与抗体的结合亲和力)。还常常提纯适体，以清除不产生靶点结合或适体结构的核苷酸。截短至其核心结合结构域的适体的长度一般为15-60个核苷酸。可通过核苷酸接头或化学交联连接两种适体，形成双特异性适体，或者类似地，可将一种适体连接于抗体或抗体片段，形成嵌合抗体-DNA分子。
通过化学交联产生双特异性BA
可用本领域技术人员已知的常规偶联方法连接双特异性阻断剂如双特异性抗体的两种结合分子，如Hermanson，同上所述。在一些实施方式中，用化学连接连接bsBA的这两种结合分子。用化学连接制备的现有双特异性抗体的一个例子见Brennan等，(Science，229：81(1985))，也可用于制备本发明bsBA。蛋白酶水解切割完整抗体，产生F(ab′)2片段。在二巯基络合剂***的存在下还原这些片段，以稳定邻近的二巯基并防止形成分子间二硫键。然后将产生的Fab′片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，再通过巯基乙胺还原将Fab′-TNB衍生物之一转化为Fab′-硫醇，将其与等摩尔量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作选择性固定酶的试剂。
另一优选的化学连接采用双马来酰亚氨基己烷或双马来酰亚氨基乙烷来交联。也可用重组方法制备含有-SH基团用于交联的抗体片段(如Shalaby等，J.Exp.Med.，175：217-225(1992))，以避免蛋白酶水解切割全长抗体。
通过重组或合成技术产生bsBA
也可用重组技术制备BsBA。可通过任何合适方法制备编码bsBA的核酸序列，这些方法包括例如，克隆合适序列或通过以下方法直接化学合成：例如Narang等，Meth.Enzymol.68：90-99(1979)的磷酸三酯法；Brown等，Meth.Enzymol.68：109-151(1979)的磷酸二酯法；Beaucage等，Tetra.Lett.22：1859-1862(1981)的二乙基亚磷酰胺法；Beaucage和Caruthers，Tetra.Letts.22(20)：1859-1862(1981)所述的固相亚磷酰胺三酯法，如采用自动化合成仪，例如Needham-VanDevanter等，Nucl.Acids Res.12：6159-6168(1984)所述；以及，美国专利号4,458,066的固体支持物法。化学合成产生单链寡核苷酸。可通过与互补序列杂交，或用此单链为引物以DNA聚合酶聚合，将它转变成双链DNA。本领域技术人员应了解，虽然化学合成DNA仅限于约100个碱基的序列，但可通过连接较短序列获得较长序列。
在优选实施方式中，用克隆技术制备编码bsBA的核酸序列。合适的克隆和测序技术的例子以及足以指导技术人员进行许多克隆操作的说明参见Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL)(第二版)，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory(1989))，Berger和Kimmel(编)，《分子克隆技术指南》(GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES)，AcademicPress，Inc.，San Diego CA(1987))，或Ausubel等(编)，《新编分子生物学指南》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，Greene Publishing and JohnWiley&Sons，Inc.，(1987，1995增刊)(Ausubel))。生物试剂和实验设备的生产商提供的产品信息也提供有用信息。这些生产商包括SIGMA化学品公司(密苏里州圣路易斯)、R&D***(明尼苏达州明尼阿波利斯)、PharmaciaAmersham(新泽西州皮斯卡塔市)、CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)、ChemGene Corp.、Aldrich化学品公司(威斯康星州密尔沃基)、Glen Research，Inc.、GIBCO BRL Life Technologies，Inc.(马里兰州盖瑟斯堡)、Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG，Buchs，瑞士)、Invitrogen(加利福尼亚州圣地亚哥)和Applied Biosystems(加利福尼亚州福斯特城)，以及本领域技术人员已知的许多其它商业来源。
一旦克隆了编码bsBA的核酸后，可以在重组工程改造的细胞如细菌、植物、酵母、昆虫和哺乳动物细胞中表达所需蛋白。预计本领域技术人员了解，许多表达***可用于表达蛋白质，包括大肠杆菌(E.coli)、其它细菌宿主、酵母和各种更高级的真核细胞如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系。不再赘述已知用于在原核细胞或真核细胞中表达蛋白的各种方法。
本领域技术人员将认识到，可对编码bsBA的核酸进行修饰，而不降低其生物活性。可进行一些修饰以帮助克隆、表达或将靶分子掺入融合蛋白。本领域技术人员已知这些修饰，包括例如：终止密码子，在氨基末端加入甲硫氨酸以提供启动位点，在两个末端各加入其它氨基酸以产生方便定位的限制性位点。
除了重组方法以外，也可用标准肽合成技术构建整个或部分bsBA。可通过以下方法固相合成长度少于约50个氨基酸的本发明多肽：将该序列的C-末端氨基酸连接于不溶性支持物，然后依次加入该序列中其余的氨基酸。固相合成技术见Barany和Merrifield，《肽：分析、合成、生物学》(The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology)，第2卷：“肽合成中的特殊方法”(Special Methods in Peptide Synthesis)，A部分.3-284页；Merrifield等，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2156(1963)和Stewart等，《固相肽合成》(Solid Phase Peptide Synthesis)，第二版，Pierce Chem.Co.，Rockford，111.(1984)。可通过缩合较短片段的氨基和羧基末端来合成较长的蛋白。通过活化羧基末端(如采用偶联试剂N，N′-二环己基碳二亚胺)形成肽键的方法是本领域技术人员已知的。
一旦表达后，可根据本领域标准方法纯化重组bsBA，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析等(通常参见R.Scopes，《蛋白质纯化》(Protein Purification)，Springer-Verlag，纽约(1982))。药用中优选均一性至少约为90-95％的基本上纯的组合物，最优选均一性为98-99％或更高的组合物。一旦部分纯化或纯化至所需均一性后，如果打算用于治疗性目的，该多肽应基本不含内毒素。
已经描述和熟知由细菌如大肠杆菌表达单链抗体和/或再折叠成合适活性形式(包括单链抗体)的方法，可将它们施用于本发明bsBA，尤其是采用抗体的方法。参见Buchner等，Anal.Biochem.205：263-270(1992)；Pluckthun，Biotechnology9：545(1991)；Huse等，Science 246：1275(1989)和Ward等，Nature 341：544(1989)，将所有文献纳入本文作参考。
大肠杆菌或其它细菌的功能性异源蛋白常常分离自包含体，并且需要用强变性剂溶解和后续再折叠。在溶解步骤期间，如本领域所熟知，必须存在还原剂以分离二硫键。含有还原剂的示范性缓冲液是：0.1 M Tris pH8，6 M胍，2mM EDTA，0.3M DTE(二硫赤藓糖醇)。可在还原形式和氧化形式的低分子量巯基试剂的存在下再氧化二硫键，如纳入本文作参考的Saxena等，Biochemistry 9：5015-5021(1970)所述，尤其是Buchner等，同上所述。
一般通过将变性和还原的蛋白质稀释(如100倍)到再折叠缓冲液中完成复性。示范性缓冲液是0.1 M Tris，pH8.0，0.5M 1-精氨酸，8mM氧化性谷胱甘肽(GSSG)和2mM EDTA。
作为对双链抗体纯化方法的修改，独立地溶解和还原重链和轻链区，然后在再折叠溶液中混合。当一种蛋白比另一种蛋白摩尔过量不超过5倍时，以此摩尔比混合的两种蛋白获得优选产率。氧化还原改组完成后，需要将过量的氧化性谷胱甘肽或其它氧化性低分子量化合物加入再折叠溶液。
基于BsBA的治疗应用
本发明还涉及基于bsBA的治疗，该治疗包括将本发明bsBA给予动物，优选哺乳动物，最优选人类患者，以治疗一种或多种所述疾病或失调。本发明治疗性化合物包括但不限于本发明bsBA。本发明bsBA可用于治疗、抑制或预防与细胞表面受体的异常表达和/或活性相关的本文所述疾病和失调。治疗和/或预防与细胞表面受体的异常表达和/或活性相关的疾病和失调包括但不限于：缓解与这些疾病和失调相关的症状。可在本领域所知或本文所述药学上可接受的组合物中提供本发明bsBA。通过本文提供的内容，本领域普通技术人员将知道如何将本发明bsBA用于诊断、监测或治疗目的而无需过多实验。
本发明bsBA可单独给予或与其它类型治疗(如放疗、化疗、激素治疗、免疫治疗和抗肿瘤剂)联合给予。
基于bsBA的治疗/预防组合物及其给药
本发明提供了通过给予对象有效量的本发明bsBA，优选本发明双特异性抗体来治疗、抑制和预防的方法。在优选方面，bsBA是基本纯化的(如基本不含限制其作用或产生不良副作用的物质)。对象优选为动物，包括但不限于诸如牛、猪、马、鸡、猫和狗等动物，优选哺乳动物，最优选人。
已知各种递送***可用于给予本发明bsBA，如包裹到脂质体、微颗粒、微胶囊中，能够表达bsBA的重组细胞，受体介导的胞吞作用(参见例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432，1987)，构建核酸作为逆转录病毒或其它载体的一部分等。引入方法包括但不限于：皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口腔途径。可通过任何方便途径给予bsBA，例如通过输注或推注、通过上皮或粘膜皮肤内层(如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其它生物活性物质一起给予。给药可以是全身给予或局部给予。此外，可能需要通过任何合适途径将本发明bsBA引入中枢神经***，这些途径包括心室内和鞘内注射；借助(例如)连接于贮存库如Ommaya贮存库的心室内导管可能有助于心室内注射。也可采用肺部给药，如采用吸入器或喷雾器，以及含有雾化剂的制剂。
在具体实施方式中，可能需要将本发明bsBA局部给予需要治疗的部位；这可通过以下方式实现，例如但不限于：在手术期间局部输注、局部施用如术后与伤口敷料联用、注射、导管方式、栓剂方式或植入方式，所述植入物是多孔性材料、非多孔性材料或明胶材料，包括膜如唾液酸膜(sialastic membrane)或纤维。优选地，当给予本发明bsBA如抗体时，必须注意采用bsBA不吸附的材料。
在另一实施方式中，可在囊泡，具体是脂质体中递送bsBA(参见Langer，Science249：1527-1533，1990；和Treat等，《感染性疾病和癌症治疗中的脂质体》(Liposomesin the Therapy ofInfectious Disease and Cancer)，Lopez-Berestein和Fidler(编)，Liss，纽约，353-365页，1989)。
在又一实施方式中，可在控释***中递送bsBA。在一个实施方式中，可采用药泵(参见Langer，同上；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201，1987；Buchwald等，Surgery 88：507，1980；Saudek等，N.Engl.J.Med.321：574，1989)。在另一实施方式中，可采用聚合材料(参见《控释的医学应用》(Medical Applications ofControlledRelease)，Langer和Wise(编)，CRC Pres.，Boca Raton，Fla.(1974)；《控制的药物生物利用度、药物产品设计和性能》(Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Designand Performance)，Smolen和Ball(编)，Wiley，纽约(1984)；Ranger和Peppas，J.，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；也参见Levy等，1985，Science 228：190；During等，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71：105)。在又一实施方式中，可将控释***安置在治疗靶点(如患病的身体器官，如脑、肺、肾、肝、卵巢、睾丸、结肠、胰、乳腺和皮肤)附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如，Goodson，《控释的医学应用》(Medical Applications of ControlledRelease)，同上，第2卷，115-138页(1984))。Langer的综述(1990，Science 249：1527-1533)讨论了其它控释***。
本发明也以药物组合物提供了bsBA。这种组合物包含治疗有效量的bsBA和药学上可接受的载体。在具体实施方式中，术语“药学上可接受的”指经联邦政府或州政府的管理机构批准、或列于美国药典或其它普遍认可的药典中可用于动物(更具体是人)。术语“载体”指与治疗剂一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。这种药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在静脉内给予药物组合物时，水是优选的载体。盐溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可用作液体载体，尤其用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物也可含有少量湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可取溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。可将该组合物制成含有传统的粘合剂和载体如三甘油酯的栓剂。口服制剂可包含标准载体如药品级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的例子见《雷明顿：药物科学和实践》(Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy)，A.R.Gennaro编，Lippincott Williams和Wilkins，宾西法尼亚州费城(第20版，2003)。这种组合物含有治疗有效量的化合物和合适量的载体以提供适合给予患者的形式，其中化合物优选为纯化形式。该制剂应适合给药方式。
在优选实施方式中，根据常规方法将组合物制成适合静脉内给予人的药物组合物。静脉内给药的组合物一般是无菌等渗水性缓冲液的溶液。需要时，组合物也可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。通常，分别提供这些成分或将这些成分混合在单位剂型中，例如，成为说明活性物质含量的密封容器如安瓿或药囊中的冻干粉末或无水浓缩物。当通过输注给予组合物时，可用含有无菌药品级水或盐水的输注瓶分散该组合物。当通过注射给予组合物时，可提供含有用于注射的无菌水或盐水的安瓿，以便在给药前混合这些成分。
制成药物组合物时，bsBA可制成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子形成的盐，和与阳离子如衍生自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸或普鲁卡因的阳离子形成的盐。
可通过标准临床技术确定能有效治疗、抑制或预防与细胞表面受体的异常表达和/或活性相关的疾病或失调的本发明bsBA的量。此外，可任选地用体外试验帮助鉴定最优剂量范围。用于制剂的准确剂量也取决于给药途径和疾病或失调的严重程度，并且应该根据实践者的判断和各患者的具体情况决定。可从衍生自体外或动物模型测试***的剂量-反应曲线外推有效剂量。
对于bsBA，给予患者的剂量一般为0.1-100mg/kg患者体重。给予患者的剂量优选为0.1-20mg/kg患者体重，更优选1-10mg/kg患者体重。通常，由于对外来多肽的免疫应答，人抗体在人体内的半衰期比其它物种的抗体长。因此，衍生自人抗体的bsBA的给药剂量可以较少，给药频率较低。而且，通过修饰如脂化提高抗体的摄取量和组织穿透性，从而可降低给予本发明bsBA的剂量和频率。
试剂盒
本发明还包括试剂盒，用于在体内或生物样品中检测表达或过量表达靶分子的细胞。在一些优选实施方式中，该试剂盒包括双特异性scFv抗体靶向的bsBA。根据应用，可用接头或螯合剂或二者使抗体官能化，以偶联于效应物(如放射性部分、脂质体、细胞毒素、另一种抗体等)，如本文所述。该试剂盒还任选地包括用于检测bsBA的缓冲液和组合物。
该试剂盒也可包括说明材料，说明抗体用于检测(如)癌细胞的用途、和/或说明抗体与官能化试剂的组合或说明官能化抗体在成像和/或治疗应用中的用途。在某些实施方式中，提供了用接头和/或螯合剂(在一个容器中)官能化的bsBA以及一种或多种效应物如细胞毒素、放射性标记(在第二个容器中)，从而可分别给予这两种组分(如预先靶向方法)，或者可在临用前给予这两种组分。
某些说明性材料提供了推荐的剂量方案、禁忌症(counter indication)等。说明性材料一般包括手写或印刷的材料，本发明也考虑了能够储存这些说明材料并将它们传达给最终用户的任何媒体。这种媒体包括但不限于：电子存储媒体(如磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学媒体(如CD ROM)等或提供说明书的互联网址。本发明也提供包括一个或多个容器的药包或药盒，所述容器中充满了本发明药物组合物的一种或多种成分。任选与这种容器相联系的是由管理药物或生物制品生产、使用或销售的政府机构所颁发形式的通知，该通知反映了政府机构批准以人用产品进行生产、使用或销售。
实施例
实施例1
双抗体和(scFv)2
双抗体的产生参见例如EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))。用接头由抗体片段(通常由两个scFv)构建双抗体，所述接头太短，以致于不能在相同链的两个结构域之间进行配对；强迫结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原-结合位点。或者，可用遗传编码的接头连接两条scFv(共价连接这两个分子)，从而形成(ScFv)2，即二价抗体。
实施例2
可用不同类型的“二聚化结构域”使两个抗体片段异源二聚化。例如，通过绞链区将双特异性/二价双抗体与IgG的CH(3)结构域的N末端遗传融合(Lu等，JImmunol Methods，279(1-2)：219-32(2003))，产生称为“双-双抗体”的构建物。结果是绞链区和CH(3)结构域之间二聚化产生的四价双抗体二聚体。
也可通过将单链Fv(scFv)与抗原结合特异性不同的Fab片段的轻链或重链的C末端遗传融合，从而用抗体的天然CH1结构域使两个抗体片段异源二聚化(Lu等，Immunol Methods，267(2)：213-26(2002))。也可采用IgG重链和轻链之间的天然二聚化机制。两条特异性不同的单链Fv(scFv)可与人κ链的恒定结构域(C(L))和人重链的第一恒定结构域(C(H1))融合，形成两条多肽，分别为(scFv)(1)-C(L)和(scFv)(2)-C(H1)-C(H2)-C(H3)。在哺乳动物细胞中共表达两条多肽导致形成具有双特异性的共价连接的IgG样异源-四聚体Bs(scFv)(4)-IgG(Zuo等，Protein Eng.13(5)：361-7(2000)，Lu等，J.Biol Chem.23；279(4)：2856-65(2004))。
也可通过二聚化结构域中的非共价相互作用强迫两个抗体片段之间形成异源二聚体，如采用形成异源二聚体的亮氨酸拉链Fos和Jun，当它们分别与两种不同的Fab′片段融合时介导形成双特异性F(ab′)2(Tso等，J Hematother.4(5)：389-94(1995))。
实施例3测定合适的靶标记和效应物标记
可用许多方式确定合适的靶标记，这些方式是例如：靶组织和非靶组织的mRNA分布型分析，以鉴定靶组织中过量表达的靶分子；或通过蛋白质组学方法如靶细胞和非靶细胞的2D电泳来比较蛋白质表达水平，然后通过质谱鉴定。例如，mRNA分布型分析一般采用Affymetrix微阵列，如Cao等所述进行(BMC Genomics.27；5(1)：26(2004))，比较由靶组织和非靶组织(如肿瘤和邻近的正常组织)产生的cRNA。
在蛋白质组学方法中，一般是裂解或匀浆靶细胞和非靶细胞，然后进行二维电泳。然后将蛋白质固定在凝胶中，染色观察。来自靶细胞和非靶细胞的凝胶图像分析可显示差异表达的蛋白质点。然后，可通过剪下蛋白质点、在凝胶中用胰蛋白酶消化和质谱分析鉴定这些点。该过程参见例如，Van Greevenbroek等，45，1148-1154(2004)。
可以许多方式鉴定合适的效应物标记，如用推定的磷酸化位点鉴定受体。蛋白质或DNA序列可获自GenBank或其它公共数据库，可用公众可用的搜索引擎预测可能的磷酸化位点，如ScanSite(通过输入“http://”，然后是“scansite.mit.edu/”在线搜索)或NetPhos(通过输入“www.”，然后是“cbs.dtu.dk/services/NetPhos/”找到该网页)。含有磷酸化位点的受体更可能是良好的效应物标记，因为这些受体常常参与信号转导。或者，可通过将靶细胞与细胞标记的抗体相接触、然后如上所述测定所需生物活性来鉴定合适的效应物标记。
实施例4：测定一价和二价结合结构域
为了测定结合结构域或双特异性结合分子的一价亲和力，如上所述产生bsBA。为通过表面等离振子共振测定结合动力学，可根据厂商(BIAcore)说明书活化生物传感器芯片，用盐酸N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)共价偶联受体。然后，通过(例如)在10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)中注射来偶联标记，以获得理想情况下固定材料应答单位(RU)小于400的信号。为了测定动力学，在25℃下，将PBS/吐温缓冲液(0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲盐水溶液)两倍连续稀释的一价或双特异性结合结构域注射到抗原芯片上，所用流速为20μl/分钟。然后将解离数据拟合于单位点模型，获得k关，可计算各结合曲线的假一阶速率常数(ks)，并作为蛋白质浓度的函数作图，获得k开+/-s.e。然后，可通过k关/k开计算SPR测定的平衡解离常数Kd。必须对密度不同(如100、200和400 RU)的几种表面进行上述测定，以确定不存在实验假象，如解离bsBA的再结合。
或者，也可通过流式细胞术测定它们的亲和力，如Nielsen等(Cancer Res.60(22)：6434-40(2000))所述。
实施例5：在细胞中测定效应物功能
可通过将培养物中生长的靶细胞与不同浓度的效应物结合结构域接触(如)30分钟，测定结合结构域的效应物功能。此时，在一些情况下用外源性生长因子刺激细胞以促进该分子想要改变的生物作用。通过如下方法制备6孔或12孔组织培养板中培养的处理细胞的抽提物：在冰上使细胞在含有蛋白酶抑制剂(1mM PMSF，1μg/mL亮抑肽酶，1μg/mL胃蛋白酶抑制剂)的裂解缓冲液(20mM Tris(pH7.5)，150mMNaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1％Triton X-100，0.5％NP40，10mM β-甘油磷酸酯，10mM NaF，1mM Na3VO4)中通过27G针头5次。裂解前，用冷的PBS洗涤细胞两次。然后，通过(例如)用磷酸化特异性抗体进行免疫印迹来分析裂解物：用7.5％SDS-PAGE预浇铸凝胶(Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)电泳分析全细胞蛋白质抽提物(50μg总蛋白质/泳道)，转移到硝酸纤维素滤膜上，与检测该标记的活化或下游相关蛋白的抗体一起孵育。或者，可通过抗体微阵列分析裂解物，如Nielsen等(ProcNatl Acad Sci USA，100(16)：9330-5(2003))所述。
也可通过所需生物功能的其它读出方法，如细胞增殖试验，测定结合结构域的效应物功能。可在含有DMEM和5％FCS和不同浓度的结合结构域的96孔板中以5×103/孔接种靶细胞。72小时后，裂解细胞，可根据厂商说明通过CellTiter-Glo发光细胞活力试验(Promega，Madison，WI)测定ATP量。
可将抑制程度作为浓度对数的函数对磷酸化和增殖试验的结果作图，通过拟合到下述等式测定效应物和靶向结构域的IC50：
实施例6：测定BsBA
为了测定bsBA阻断、降低或抑制ErbB受体介导的细胞信号转导的能力，将癌细胞如A431(***依赖性乳腺癌细胞系，国立生物信息中心(National Center forBiotechnology Information)登录GDS 121)与各种浓度的bsBA一起孵育30分钟，然后用生长因子(如调蛋白或EGF)刺激细胞长达两小时。然后用Triton缓冲液裂解细胞，再超声处理。然后，通过免疫印迹或采用对蛋白质磷酸化敏感的抗体微阵列来分析裂解物中的磷酸化改变(参见例如Nielsen等，2003，PNAS 100：9330)。
例如，我们的计算机建模预计，靶向结构域与以1百万份拷贝/细胞表达的细胞表面抗原结合的亲和力为1nM和效应物结构域与ErbB3(因此竞争调蛋白结合)结合的亲和力为1μM的bsBA，与靶向结构域和效应物结构域均以1nM亲和力结合的bsBA同样有效(如IC50所测定)。
BsBA可用于抑制表达合适抗原的癌生长。可通过将小分子药物与bsBA偶联来加强bsBA的作用。药物可以是(例如)标准的细胞毒剂，如化疗剂或酪氨酸激酶抑制剂，如格列卫(伊马替尼甲磺酸盐)。
实施例7：ErbB BsBA
计算机模拟A431细胞中调蛋白(HRG)-诱导的ERK和AKT活化显示，如果bsBA的ErbB受体结合分子之一与其受体的亲和力低于其它ErbB结合分子与其受体的亲和力，则这种ErbB bsBA最有效。
如果本发明bsBA的低亲和力结合分子涉及ErbB3或ErbB4，bsBA的高亲和力结合分子涉及另一种ErbB受体(如ErbB1或ErbB2)，那么相信bsBA是通过将ErbB3或ErbB4螯合成由ErbB3或ErbB4受体、bsBA和ErbB1或ErbB2受体组成的三聚体复合物(即ErbB3/4:bsBA:ErbB1/2)而降低、阻断或抑制ErbB受体介导的细胞信号转导。
bsBA的结合分子也可涉及ErbB3和ErbB4。相信这种bsBA能抑制这些ErbB受体与ErbB1或ErbB2的二聚化。因为ErbB3或ErbB4与ErbB1或ErbB2的二聚化是信号转导所必需的，所以bsBA通过阻断二聚体形成而有效阻断、减少或抑制细胞信号转导。此bsBA的低亲和力结合分子优选结合于ErbB3。
可制备bsBA的结合分子，以使它们结合于ErbB1和ErbB2，从而交联这两种受体。此bsBA通过减少、防止或抑制ErbB1和ErbB2与ErbB3或ErbB4的二聚化起作用，如上所述，ErbB1和ErbB2与ErbB3或ErbB4的二聚化是信号转导所必需的。此bsBA的低亲和力结合分子优选结合于ErbB1。
示范性bsBA包括结合于ErbB3的低亲和力结合分子和(结合于)EGFR或ErbB4的高(亲和力)结合分子。BsBA也可用于将细胞毒剂或化疗剂定位于表达ErbB受体的细胞。这些物质具有各自对不同ErbB受体特异的两种结合分子，和偶联于bsBA的细胞毒剂或化疗剂(如皂草毒蛋白、抗-干扰素-α、长春花属生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)。BsBA可制备成全长抗体或抗体片段(如F(ab′)2或(Fv)2双特异性抗体)、双抗体或制备成具有两个不同结合分子的适体。
用ErbB受体家族测定该模型。用EGF或HRG刺激ErbB受体使导致ERK和AKT磷酸化的通路被同时激活，在信号级联反应内的各个水平串话。分析的灵敏度使我们能够将该模型输出的不确定性分摊到模型输入中不确定性的不同来源。由于肿瘤细胞的特征是受体表达水平不同，当HRG是配体时，我们将ErbB3和ErbB4鉴定为非常灵敏的靶点。
通常，当bsBA的结合分子是抗体或其片段时，可用生化方法良好表征这些结合分子，因为不难测定它们的解离常数或者甚至是结合和解离速率。同样，不难用数学模型描述抗体作用机制，可在计算机上测定采用已知抗体作为抑制剂的效果。采用我们的计算机模型，我们测试了采用双特异性抗体(即具有两个不同的结合分子的抗体，其中各结合区结合不同的ErbB受体)阻断ErbB细胞信号传导途径的想法。计算机结果证实，对两种不同的ErbB受体具有结合特异性并且对一种ErbB受体的结合亲和力大于对另一种ErbB受体的结合亲和力的抗体，能理想地阻断或防止通过ErbB通路的细胞信号转导。
采用计算机方法，我们比较了靶向两种不同的ErbB受体的双特异性抗体在ErbB受体表达有差异(表1)的三种不同细胞系中阻断或防止ErbB信号传导途径活化的能力与仅靶向一种ErbB受体的常规抑制剂的能力。用计算机对双特异性抗体以及现有治疗性单特异性抗体在各细胞系中的信号抑制建模。我们的模型预计，对两种不同的ErbB受体亲和力不同的双特异性抗体对细胞信号转导的抑制比传统的单受体抑制剂介导的细胞信号转导的抑制高得多。我们的计算机建模产生的数据见表2。根据肿瘤中存在的受体比例，预计具有高亲和力结合分子和低亲和力结合分子的不同bsAb是比单特异性抗体或两个结合分子以相同结合亲和力结合于各自抗原的双特异性抗体强得多的抑制剂。
表1：ErbB受体在不同细胞系上的受体表达分布型
  细胞类型A   细胞类型B   细胞类型C
    ErbB1   XXX   XX   X
    ErbB2   XX   XXX   XX
    ErbB3   X   XX   X
    ErbB4   --   XX   X
表2：BsBA与传统单特异性受体抑制剂的抑制作用的比较
BsAb(1-2)ERK|AKT BsAb(1-3/4)ERK|AKT BsAb(2-3/4)ERK|AKT BsAb(3-4)ERK|AKT  ErbB1-InhERK|AKT  ErbB2-InhERK|AKT  ErbB3/4-InhERK|AKT
细胞类型A   EGF +|+ ++|++ --|+ --|+  +|+     --|--     --|+
  HRG +|+ ++|++ ++|++ --|--  --|--     +|+     +|+
细胞类型B   EGF +|+ ++|++ --|+ --|+  +|+     --|--     --|+
  HRG +|+ +|+ ++|++ +|+  --|--     +|+     +|+
细胞类型C   EGF +|+ ++|++ --|++ --|+  +|+     +|+     --|+
  HRG +|+ ++|++ ++|++ +|+  --|--     +|+     +|+
我们将抗ErbB1(高亲和力)和ErbB3或ErbB4(低亲和力)的双特异性抗体鉴定为在所有刺激条件下防止由于ErbB通路活化进行的信号转导的最有效阻断剂。在所有刺激条件下，ErbB1-ErbB2 bsAb作为ErbB细胞信号转导阻断剂也相当有效。当HRG用作激活剂时，ErbB3-ErbB4 bsAb是非常有效的ErbB途径阻断剂。因此，优选的bsBA是阻断试剂的至少一个特征是能够靶向ErbB3或ErbB4受体(采用低亲和结合分子)的bsBA。实际上，借助于计算机模型，我们已经鉴定了ErbB3/4具有强信号转导特性。ErbB3/4与其本身交联，或与更典型的癌抗原如ErbB1或ErbB2交联，成为通过同时抑制两种受体或通过受体螯合而抑制ErbB3/4信号转导的机制。
与采用bsBA而非传统单特异性阻断剂如单特异性抗体相关的优点之一是双特异性阻断剂形成稳定的三聚体(即ErbB受体-双特异性阻断剂-ErbB受体)。因此，bsBA的效率比传统单受体抑制剂高得多，如表2所示。
通过结合于两种不同的ErbB受体，本发明bsBA通过与相同或不同的ErbB受体相互作用而螯合ErbB受体。bsBA形成非常稳定(不可逆)的三聚体复合物，它能防止、降低或抑制结合的ErbB受体的细胞信号转导活性。bsBA与ErbB1、ErbB2、ErbB3或ErbB4的初始结合步骤可以是可逆步骤，与其余ErbB受体的第二结合步骤导致形成非常稳定的三聚体。或者，bsBA与ErbB1、ErbB2、ErbB3或ErbB4的第一结合步骤可以是不可逆步骤，第二结合步骤可以是可逆步骤，从而允许bsBA形成多种不同的三聚体复合物。ErbB受体：bsBA:ErbB受体三聚体的形成产生不可诱导细胞信号转导的复合物。而且，通过螯合ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4，bsBA防止、减少或抑制这些ErbB受体与相同或不同ErbB受体的二聚化。优选的是，bsBA与ErbB1或ErbB2的亲和力较高，与ErbB3或ErbB4的亲和力较低，如果当bsBA的一个结合结构域与ErbB2的结合亲和力高时，第二结合结构域不结合ErbB3。
形成不完全的bsBA-ErbB受体二聚物(bsBA的两个结合分子中仅有一个参与结合)不产生妨碍细胞信号转导的复合物；只有形成了三聚体复合物(即ErbB受体:bsBA:ErbB受体)才能阻断信号转导。而且，bsBA结合的两个ErbB受体之间不可能形成三聚体。
bsBA的其它特征包括一个结合结构域能够通过与天然配体如HRG竞争ErbB受体而减少、阻断或抑制细胞信号转导。
我们的计算机数据证明，在阻断细胞信号转导方面，ErbB3-ErbB4 bsBA比单特异性ErbB3或ErbB4抑制剂更有效。仅针对ErbB3或ErbB4的单特异性抑制剂不能像ErbB3-ErbB4 bsBA那样有效地抑制AKT磷酸化，主要是由于ErbB3和ErbB4的细胞表面表达水平高。仅当同时采用ErbB3和ErbB4单特异性抑制剂时才能防止AKT磷酸化。
因为bsBA在未结合状态或仅与一种ErbB受体形成二聚体复合物时不具有任何抑制作用，所以抑制剂浓度增加，以致于用bsBA饱和了ErbB受体，导致bsBA的抑制效果降低。可通过提供对ErbB2的亲和力提高的bsBA逆转此作用，从而bsBA对ErbB3的结合亲和力大于ErbB4(即KdErbB3＞ErbB4)。
上述bsBA在HRG显性(dominant)方案中特别有效。通常，与仅靶向一种受体的ErbB受体抑制剂相比，bsBA在低得多的剂量下有效。
本发明另一优选实施方式是bsBA，其中bsBA的一个结合分子具有与ErbB1的结合特异性(高亲和力结合)、另一个结合分子具有与ErbB3或ErbB4的结合特异性(低亲和力结合)。通常，肿瘤细胞表达大量ErbB1(即常常大于100,000个受体/细胞)，而ErbB3和ErbB4的受体表达范围是5,000-20,000个受体/细胞。拮抗配体结合的bsBA成功抑制了受体信号转导，即使受体表达水平相差10倍以上。
我们的计算机分析证实了双特异性ErbB1/ErbB3和ErbB1/ErbB4 bsBA的有效性。在HRG显性的方案中，抑制ErbB3受体抑制了信号转导。
根据我们对ErbB细胞信号传导途径进行的计算机分析，我们将ErbB1结合分子鉴定为具有低解离常数KD＜1nM的高亲和结合位点，但其结合不是不可逆结合。ErbB3和ErbB4受体的表达水平比ErbB1受体低得多。因为bsBA结合于ErbB1和ErbB3/ErbB4受体，并且因为bsBA对丰度更高的ErbB1受体具有较高亲和力，所以bsBA在比常规单特异性ErbB抑制剂低得多的浓度下可有效阻断ErbB1与ErbB3或ErbB4的二聚化介导的信号转导。bsBA与ErbB1的高特异性导致低bsBA浓度下的高有效性。
我们的方法利用计算机建模鉴定用于交联的最优受体以及两种结合分子的所需亲和力。bsBA的两种结合分子的不同亲和力将bsBA有效靶向受体如ErbB3，所述受体被认为不是癌细胞特异的。将ErbB3与更典型的癌抗原如ErbB1交联提供了特异性靶向癌细胞和在这些细胞中调节ErbB3受体活性的方式。
采用我们的计算机模型，我们了解到bsBA的两种结合分子具有不同亲和力的必要性。亲和力差异有助于bsBA三聚体复合物的稳定。通常，与失活或活性较低的结合分子相比，bsBA的活性结合分子应该具有较低的亲和力。如果bsBA的两种结合分子都失活或活性较低，那么靶向表达较高的信号转导受体或较强的信号转导受体的结合分子应该具有较高的亲和力。对靶向的受体之一的亲和力有差异导致以下结果：如果给予bsBA的浓度高于较高亲和力相互作用(如ErbB1)的Kd，但低于较低亲和力相互作用(如ErbB3)的Kd，bsBA仅应该聚集在表达亲和力相互作用较高的抗原的细胞上。bsBA的另一端可用于与这些细胞上的低亲和力抗原相互作用，以干扰其生物功能(如ErbB3；阻断下游信号转导)。哪一种受体是低亲和力相互作用或高亲和力相互作用取决于受体具体的信号转导强度(作为靶点的重要性)和bsBA的作用方式。
应理解，本文所述实施例和实施方式仅为了说明，本领域技术人员能够根据它们作出各种修改和改变，这些修改和改变应包括在本申请的构思和范围以及所附权利要求书的范围内。将本文引用的所有发表物、专利和专利申请全文纳入本文作参考用于所有目的。

Claims (60)

1.一种用双特异性结合剂调节靶细胞的生物活性的方法，所述双特异性结合剂
(i)具有与所述细胞表面上第一种靶分子的Kd至少为10-7M的第一结合结构域和与所述细胞表面上第二种靶分子有亲和力的第二结合结构域，
(ii)第二种靶分子与所述第一种靶分子不同，
(iii)其中所述第二结合结构域与所述第二种靶分子的所述亲和力比所述第一结合结构域与所述第一种靶分子的Kd至少低10倍，和
(iv)当所述第一结合结构域的靶分子是ErbB2时，所述第二结合结构域的靶分子不是ErbB3，
所述方法包括：
将所述双特异性结合剂与靶细胞相接触，接触条件允许第一和第二结合结构域分别结合于第一种和第二种靶分子，
其中所述第二结合结构域与所述第二种靶分子的结合调节第二种靶分子的生物活性，从而调节靶细胞的生物活性，其中所述第一结合结构域与所述第一种靶分子的结合不调节靶细胞的生物活性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双特异性结合剂包含两种抗体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗体是双抗体、直接连接或通过接头连接的两条单链Fv、二硫键稳定的Fv或其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是癌细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种靶分子是肿瘤相关性抗原、细胞因子受体或生长因子受体。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述肿瘤相关性抗原选自MART-1、gp100或MAGE-1。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种靶分子选自癌胚抗原(CEA)、ErbB2、EGFR、LewisY、MUC-1、EpCAM、CA125、***特异性膜抗原(PSMA)或TAG72。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二种靶分子选自ErbB3、ErbB4、任意FGF受体1-4、HGF受体、IGF1-R、PDGF、受体α和β或C-KIT。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是乳腺癌细胞，靶分子是选自下组的受体酪氨酸激酶：表皮生长因子受体(EGFR)、ErbB2(HER2/neu)、ErbB3(HER3)或ErbB4(HER4)。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一结合结构域与所述第一种靶分子的Kd为10-8-10-12M。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二结合结构域与所述第二种靶分子的Kd比所述第一结合结构域与所述第一种靶分子的Kd至少低20倍。
12.一种调节具有靶细胞和非靶细胞的生物体中靶细胞上靶分子的生物活性的方法，其中所述靶细胞的外部有第一种靶分子，外表面上有第二种靶分子，其中
(i)所述第一种和第二种靶分子不共享共有配体，
(ii)所述第一种靶分子在所述靶细胞表面上的丰度比也携带第二种靶分子的非靶细胞表面上的丰度至少高10倍，
(iii)所述第二种靶分子具有生物活性，但所述第一种靶分子没有，和
(iv)当所述第一结合结构域的靶分子是ErbB2(HER2)时，所述第二结合结构域的靶分子不是ErbB3(HER3)，
所述方法包括：
采用双特异性结合剂，其具有与第一种靶分子的解离常数(Kd)至少为10-7M的第一结合结构域，和与第二种靶分子的Kd比第一结合结构域的所述Kd至少低10倍的第二结合结构域；和
将所述双特异性结合剂与靶细胞相接触，接触条件允许第一和第二结合结构域分别结合于第一种和第二种靶分子，
其中所述第二结合结构域的所述结合调节所述靶细胞上所述第二种靶分子的生物活性。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述双特异性结合剂包含两种抗体。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述抗体是双抗体、直接连接或通过接头连接的两条单链Fv、二硫键稳定的Fv或其组合。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是癌细胞。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述靶分子是肿瘤相关性抗原、细胞因子受体或生长因子受体。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述肿瘤相关性抗原选自MART-1、gp100或MAGE-1。
18.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一种靶分子选自癌胚抗原(CEA)、ErbB2、EGFR、LewisY、MUC-1、EpCAM、CA125、***特异性膜抗原(PSMA)或TAG72。
19.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第二种靶分子选自ErbB3、ErbB4、任意FGF受体1-4、HGF受体、IGF1-R、PDGF、受体α和β或C-KIT。
20.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一结合结构域与所述第一种靶分子的Kd为10-8M-10-12M。
21.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第二结合结构域与所述第二种靶分子的Kd比所述第一结合结构域与所述第一种靶分子的Kd至少低20倍。
22.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第二结合结构域与所述第二种靶分子的Kd比所述第一结合结构域与所述第一种靶分子的Kd至少低50倍。
23.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述调节是降低受体酪氨酸激酶的活性。
24.一种双特异性结合剂(bsBA)，其含有与靶细胞上第一种靶分子的解离常数(Kd)至少为10-7M的第一结合结构域，和与靶细胞上第二种靶分子的Kd比第一结合结构域与第一种靶分子的Kd低至少10倍的第二结合结构域，其中
(i)所述第一种和第二种靶分子没有相同的天然配体，
(ii)所述第二种靶分子，而非所述第一种靶分子，具有生物活性，和
(iii)当所述第一结合结构域的靶分子是ErbB2(HER2)时，所述第二结合结构域的靶分子不是ErbB3(HER3)，而且当结合于第二种靶分子时，所述第二结合结构域调节第二种靶分子的生物活性。
25.如权利要求24所述的bsBA，其特征在于，所述第二结合结构域的所述Kd比所述第一结合结构域的所述Kd低50倍以上。
26.如权利要求24所述的bsBA，其特征在于，所述第二结合结构域的所述Kd比所述第一结合结构域的所述Kd低100倍或更多倍。
27.如权利要求24所述的bsBA，其特征在于，所述bsBA包含两种抗体。
28.如权利要求26所述的bsBA，其特征在于，所述抗体是双抗体、直接连接或通过接头连接的两条单链Fv、二硫键稳定的Fv或其组合。
29.如权利要求24所述的bsBA，其特征在于，所述第一结合结构域结合于肿瘤相关性抗原、细胞因子受体或生长因子受体。
30.如权利要求24所述的bsBA，其特征在于，所述第一种靶分子选自癌胚抗原(CEA)、ErbB2、EGFR、LewisY、MUC-1、EpCAM、CA125、***特异性膜抗原(PSMA)或TAG72。
31.如权利要求24所述的bsBA，其特征在于，所述第二种靶分子选自ErbB3、ErbB4、任意FGF受体1-4、HGF受体、IGF1-R、PDGF、受体α和β或C-KIT。
32.如权利要求24所述的bsBA，其特征在于，所述第一结合结构域的所述Kd是10-8-10-12M。
33.如权利要求24所述的bsBA，其特征在于，与正常细胞上的表达相比，所述第一种靶分子在靶细胞上过量表达至少10倍。
34.一种组合物，含有：
(a)双特异性结合剂(bsBA)，其包含与靶细胞上第一种靶分子的解离常数(Kd)至少为10-7M的第一结合结构域，和与靶细胞上第二种靶分子的Kd比第一结合结构域的所述Kd低至少10倍的第二结合结构域，其中所述第一种和第二种靶分子没有相同的天然配体，其中
(i)所述第二种靶分子，而非所述第一种靶分子，具有生物活性，
(ii)当结合于所述第二种靶分子时，所述第二结合结构域调节所述第二种靶分子的生物活性，和
(iii)当所述第一结合结构域的靶分子是ErbB2(HER2)时，所述第二结合结构域的靶分子不是ErbB3(HER3)，
和(b)药学上可接受的载体。
35.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述第二结合结构域的所述Kd比所述第一结合结构域的所述Kd低50倍以上。
36.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述第二结合结构域的所述Kd比所述第一结合结构域的所述Kd低100倍或更多倍。
37.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述bsBA包含两种抗体。
38.如权利要求37所述的组合物，其特征在于，所述抗体是双抗体、直接连接或通过接头连接的两条单链Fv、二硫键稳定的Fv或其组合。
39.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述第一结合结构域结合于肿瘤相关性抗原、细胞因子受体或生长因子受体。
40.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述第一种靶分子选自癌胚抗原(CEA)、ErbB2、EGFR、LewisY、MUC-1、EpCAM、CA125、***特异性膜抗原(PSMA)或TAG72。
41.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述第二种靶分子选自ErbB3、ErbB4、任意FGF受体1-4、HGF受体、IGF1-R、PDGF、受体α和β或C-KIT。
42.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，与也携带第二种靶分子的非靶细胞相比，所述第一种靶分子在靶细胞上过量表达至少10倍。
43.一种双特异性结合剂(bsBA)在制备药物中的应用，所述双特异性结合剂包含与靶细胞上第一种靶分子的解离常数(Kd)至少为10-7M的第一结合结构域，和与靶细胞上第二种靶分子的Kd比第一结合结构域的所述Kd低至少10倍的第二结合结构域，其中
(i)所述第一种和第二种靶分子没有相同的天然配体，
(ii)所述第二种靶分子，而非所述第一种靶分子，具有生物活性，
(iii)当结合于所述第二种靶分子时，所述第二结合结构域调节所述第二种靶分子的生物活性，和
(iv)当所述第一结合结构域的靶分子是ErbB2时，所述第二结合结构域的靶分子不是ErbB3。
44.如权利要求43所述的应用，其特征在于，所述第二结合结构域的所述Kd比所述第一结合结构域的所述Kd低50倍以上。
45.如权利要求43所述的应用，其特征在于，所述第二结合结构域的所述Kd比所述第一结合结构域的所述Kd低100倍或更多倍。
46.如权利要求44所述的应用，其特征在于，所述bsBA包含两种抗体。
47.如权利要求46所述的应用，其特征在于，所述抗体是双抗体、直接连接或通过接头连接的两条单链Fv、二硫键稳定的Fv或其组合。
48.如权利要求43所述的应用，其特征在于，被第一结合结构域和第二结合结构域结合的所述靶分子独立地选自肿瘤相关性抗原、细胞因子受体或生长因子受体，只要所述第一结合结构域和所述第二结合结构域不结合相同的肿瘤相关性抗原、细胞因子受体或生长因子受体。
49.如权利要求43所述的应用，其特征在于，所述药物用于抑制癌细胞增殖。
50.如权利要求43所述的应用，其特征在于，与也携带第二种靶分子的非靶细胞相比，所述第一种靶分子在靶细胞上过量表达至少10倍。
51.一种试剂盒，包含：
(a)容器，和
(b)双特异性结合剂(bsBA)，其包含与靶细胞上第一种靶分子的解离常数(Kd)至少为10-7M的第一结合结构域，和与靶细胞上第二种靶分子的Kd比第一结合结构域与第一种靶分子的Kd低至少10倍的第二结合结构域，其中
(i)所述第一种和第二种靶分子没有相同的天然配体，
(ii)所述第二种靶分子，而非所述第一种靶分子，具有生物活性，
(iii)当结合于所述第二种靶分子时，所述第二结合结构域调节所述第二种靶分子的生物活性，和
(iv)当所述第一结合结构域的靶分子是ErbB2(HER2)时，所述第二结合结构域的靶分子不是ErbB3(HER3)。
52.如权利要求51所述的试剂盒，其特征在于，所述第二结合结构域的所述Kd比所述第一结合结构域的所述Kd低50倍以上。
53.如权利要求51所述的试剂盒，其特征在于，所述第二结合结构域的所述Kd比所述第一结合结构域的所述Kd低100倍或更多倍。
54.如权利要求51所述的试剂盒，其特征在于，所述bsBA包含两种抗体。
55.如权利要求54所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体是双抗体、直接连接或通过接头连接的两条单链Fv、二硫键稳定的Fv或其组合。
56.如权利要求51所述的试剂盒，其特征在于，所述第一结合结构域结合于肿瘤相关性抗原、细胞因子受体或生长因子受体。
57.如权利要求51所述的试剂盒，其特征在于，所述第一种靶分子选自癌胚抗原(CEA)、ErbB2、EGFR、LewisY、MUC-1、EpCAM、CA125、***特异性膜抗原(PSMA)或TAG72。
58.如权利要求51所述的试剂盒，其特征在于，所述第二种靶分子选自ErbB3、ErbB4、任意FGF受体1-4、HGF受体、IGF1-R、PDGF、受体α和β或C-KIT。
59.如权利要求51所述的试剂盒，其特征在于，所述第一结合结构域的所述Kd为10-8-10-12M。
60.如权利要求51所述的试剂盒，其特征在于，与正常细胞上的表达相比，所述第一种靶分子在靶细胞上过量表达至少10倍。
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