CN102146346B - 一株酿酒酵母及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
一株酿酒酵母及其制备方法与应用，特别涉及一株通过基因工程技术改造而得到的IAH1基因过量表达的酿酒酵母菌株以及其构建方法，属于生物工程技术领域。一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2，该菌株2010年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号：CGMCC NO.4355。本发明所述菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2遗传稳定性良好，连续传代20次不发生基因丢失现象，而且各项性能指标稳定。
Description
技术领域
一株酿酒酵母及其制备方法与应用，特别涉及一株通过基因工程技术改造而得到的IAH1基因过量表达的酿酒酵母菌株以及其构建方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
酯类是啤酒酿造过程中啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的代谢产物，对影响啤酒风味的最主要的化合物之一。啤酒中酯类浓度的改变会影响到啤酒的风味。因此通过改变酯类的浓度可以得到不同风味的啤酒。目前的啤酒工业中调控酯类形成主要通过控制以下几个因素来来进行：酵母菌株、麦汁组成、溶氧量、压力、发酵温度、接种量、主酵时间、储酒时间等。但这些外部因素的改变对酵母自身代谢的影响较小，对最终啤酒中酯类的浓度影响也较小。而通过调节啤酒酵母中酯类代谢过程中的关键酶的表达，打破本身的酯类代谢平衡，突出某种或某几种酯的风味，将赋予啤酒独特的风味。虽然改变原料的组成，比如添加果汁、蔬菜汁等可以改变所酿啤酒的风味，得到特殊风味的啤酒，但这种方法引入的风味稍显片面，不够醇厚。
将啤酒生产菌株进行改造，过量表达酯酶的编码基因来提高酯酶的表达水平，从而改变啤酒中的酯类水平，用这种方式来筛选可以酿造独特风味啤酒的酵母菌株的方法国内还没有报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株酿酒酵母及其构建方法与应用。
一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2，该菌株2010年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，菌种保藏号：CGMCC NO.4355。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2细胞为卵圆形，菌落为白色，表面光滑，湿润，边缘整齐。其最适生长温度为30℃，最适生长pH为5.5。
上述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2的构建方法，步骤如下：
(1)以啤酒酵母的DNA为模板进行PCR扩增，引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，得到基因PGK1的启动子PGK1P，然后用内切酶KpnⅠ和BamHⅠ双酶切启动子PGK1P和质粒pUC18(购自大连宝生物工程有限公司)，再用连接酶连接后，得到质粒pUC18-P；
(2)以啤酒酵母的DNA为模板进行PCR扩增，引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，得到IAH1基因片段，然后用内切酶BamHⅠ和SmaⅠ双酶切IAH1基因片段和步骤(1)制得的质粒pUC18-P，再用连接酶连接后，得到质粒pUC18-PI；
(3)以啤酒酵母的DNA为模板进行PCR扩增，引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，得到ADH1基因的终止子片段，然后用内切酶SmaⅠ和EcoRⅠ双酶切ADH1基因的终止子片段和步骤(2)制得的质粒pUC18-PI，再用连接酶连接后，得到质粒pUC18-PIT；
(4)以质粒pUG6(购自EUROSCARF公司，genebank号：AF298793)为模板进行PCR扩增，引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，得到KanMX基因片段，然后用内切酶SalⅠ和KpnⅠ双酶切KanMX基因片段和步骤(3)制得的质粒pUC18-PIT，再用连接酶连接 后，得到质粒pUC18-KPIT；
(5)将步骤(4)制得的质粒pUC18-KPIT和酵母整合载体YIP-5分别用内切酶SalⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，然后用连接酶连接，得到载体YIP-KPIT；
(6)将步骤(5)制得的载体YIP-KPIT电击转化酿酒酵母感受态细胞，转化的酿酒酵母细胞涂布筛选平板，28℃培养72h后进行克隆子鉴定，选取阳性菌株，即得酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2。
所述步骤(1)中PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，30循环；最后72℃延伸7min。
所述步骤(2)中PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，30循环；最后72℃延伸7min。
所述步骤(3)中PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，30循环；最后72℃延伸7min。
所述步骤(4)中PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 75s，30循环；最后72℃延伸7min。
所述步骤(6)中筛选平板组分如下：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂，500μg/mL G418，余量水。
上述啤酒酵母购自安琪酵母股份有限公司，商品名称：安琪啤酒高活性干酵母，货号：80000005。
上述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2在啤酒酿造中的应用。
本发明所述菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2遗传稳定性良好，连续传代20次不发生基因丢失现象，而且各项性能指标稳定。
附图说明
图1是PGK1P、ADH1T、IAH1基因扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图；
其中：1泳道：DNA Marker(从上到下各片段的长度：4500、3000、2250、1500、1000、750、500、250bp)，2泳道：PGK1P，3泳道：ADH1T，4泳道：IAH1基因；
图2是KanMX扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图；
其中：1泳道：DNA Marker(从上到下各片段的长度：4500、3000、2250、1500、1000、750、500、250bp)，2泳道：KanMX扩增片段；
图3是质粒pUC18-KPIT的PCR及酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；
其中：1泳道：DNA Marker(从上到下各片段的长度：4500、3000、2250、1500、1000、750、500、250bp)，2泳道：PGK1P+IAH1+ADH1T，3泳道：KanMX+PGK1P+IAH1+ADH1T，4泳道：pUC18-KPIT的SalⅠ和EcoRⅠ双酶切；
图4是质粒YIP5-KPIT的的PCR及酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；
其中：1泳道：DNA Marker(从上到下各片段的长度：4500、3000、2250、1500、1000、750、500、250bp)；2泳道：PCR扩增的KanMX+PGK1P+IAH1+ADH1T片段；3泳道：YIP5-KPIT的SalⅠ和EcoRⅠ双酶切；
图5是菌株AU2基因组中IAH1基因表达单元的PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；
其中：1泳道：DNA Marker(从上到下各片段的长度：2000、1000、750、500、250、 100bp)；2泳道：PGK1P+IAH1+ADH1T；3泳道：PGK1P+IAH1；5泳道：IAH1+ADH1T；
图6是菌株AU2传代稳定性检测的琼脂糖凝胶电泳图；
其中：1泳道：DNA Marker(从上到下各片段的长度：4500、3000、2250、1500、1000、750、500、250bp)；2-11泳道：随机挑取10个菌落的IAH1基因表达单元的PCR扩增片段。
具体实施方式
下面结合说明书附图及实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中所述啤酒酵母为购自安琪酵母股份有限公司的安琪啤酒高活性干酵母，货号：80000005；质粒pUG6购自EUROSCARF公司，内切酶KpnⅠ、BamHⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ和连接酶均购自大连宝生物生物工程有限公司，反应条件参见上述产品的使用说明书。
实施例1
带有强启动子的IAH1基因表达单元的构建
表达单元构建过程中各片段的克隆在质粒pUC18中进行。每一步克隆的流程为：PCR扩增待克隆片段——用每一步骤所指定的内切酶进行片段及质粒的双酶切——双酶切后片段及质粒的连接——连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞——涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板——37℃培养16h后进行克隆子鉴定。
1、PGK1基因启动子片段的克隆
设计用于扩增酿酒酵母自身PGK1基因启动子的引物：
P1：CC/GGTACC/CTTCAACTCAAGACGCACAG(SEQ ID NO.1所示)，引入KpnⅠ(酶切位点为两斜线之间区域，下同)；
P2：GG/GGATCC/TGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG(SEQ ID NO.2所示)下游加BamHⅠ。
以安琪啤酒高活性干酵母的DNA为模板进行PCR扩增，条件为：94℃预变性3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，30循环；最后72℃延伸7min。
得到基因PGK1的启动子PGK1P(如图1所示)，然后用内切酶KpnⅠ和BamHⅠ双酶切启动子PGK1P和质粒pUC18，再用连接酶连接，连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板后，37℃培养16h，挑取阳性菌株，得到质粒pUC18-P。
2、IAH1基因片段的克隆
设计用于扩增IAH1基因片段的引物：
I1：GCC/GGATCC/ATGGATTACGAGAAGTTTCT(SEQ ID NO.3所示)，引入BamHⅠ位点；
I2：GCC/CCCGGG/TCAAGACATTATGTTACATC(SEQ ID NO.4所示)，引入SmaⅠ位点。
以安琪啤酒高活性干酵母的DNA为模板进行PCR扩增，条件为：94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，30循环；最后72℃延伸7min。
得到IAH1基因片段(如图1所示)，然后用内切酶BamHⅠ和SmaⅠ双酶切IAH1基因片段和质粒pUC18-P，再用连接酶连接，连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板后，37℃培养16h，挑取阳性菌株，得到质粒pUC18-PI。
3、ADH1基因终止子的克隆
设计用于扩增ADH1基因终止子片段的引物：
T1：GG/CCCGGG/GCGAATTTCTTATG(SEQ ID NO.5所示)，引入SmaⅠ位点，
T2：GG/GAATTC/GCATATCTACAATTGGG(SEQ ID NO.6所示)，引入EcoRⅠ位点
安琪啤酒高活性干酵母的DNA为模板进行PCR扩增，条件为：94℃预变性3min；94 ℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，30循环；最后72℃延伸7min。
得到ADH1基因的终止子片段(如图1所示)，然后用内切酶SmaⅠ和EcoRⅠ双酶切ADH1基因的终止子片段和质粒pUC18-PI，再用连接酶连接，连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板后，37℃培养16h，挑取阳性菌株，得到质粒pUC18-PIT。
4、KanMX抗性基因的克隆
设计用于扩增KanMX片段的引物：
K1：GG/GTCGAC/CAGCTGAAGCTTCGTACGC(SEQ ID NO.7所示)，引入SalⅠ位点；
K2：CC/GGTACC/GCATAGGCCACTAGTGGATCTG(SEQ ID NO.8所示)，引入KpnⅠ位点。
以质粒pUG6为模板进行PCR扩增，条件为：94℃预变性3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 75s，30循环；最后72℃延伸7min。
得到KanMX基因片段(图2)，然后用内切酶SalⅠ和KpnⅠ双酶切KanMX基因片段和质粒质粒pUC18-PIT，再用连接酶连接，连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板后，37℃培养16h，挑取阳性菌株，得到质粒pUC18-KPIT(鉴定结果如图3所示)。
5、KanMX-PGK1P-IAH1基因-ADH1T在酵母整合载体YIP-5中的克隆
将步骤(4)制得的质粒pUC18-KPIT和酵母整合载体YIP-5分别用内切酶SalⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，然后用连接酶连接，连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板后，37℃培养16h，挑取阳性菌株，得到载体YIP-KPIT(鉴定结果如图4所示)。
实施例2
1、酿酒酵母菌株AU2的构建
将实施例1制得的载体YIP-KPIT电击转化酿酒酵母感受态细胞，电击转化条件：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω；时间5msec，转化的酿酒酵母细胞涂布筛选平板，28℃培养72h后进行克隆子鉴定，即得酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2。筛选平板的组分如下：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂，500μg/mL G418，余量水。
克隆子鉴定采用如下步骤：
用引物P1：CC/GGTACC/CTTCAACTCAAGACGCACAG
和I2：GCC/CCCGGG/TCAAGACATTATGTTACATC
以及I1：GCC/GGATCC/ATGGATTACGAGAAGTTTCT
和T2：GG/GAATTC/GCATATCTACAATTGGG
分别进行PCR扩增来验证整合到酿酒酵母细胞染色体上的IAH1基因表达单元(PGK1P-IAH1-ADH1T)的完整性。
并用引物P1：CC/GGTACC/CTTCAACTCAAGACGCACAG
和T2：GG/GAATTC/GCATATCTACAATTGGG
来扩增完整的IAH1表达单元片段并进行测序，来验证整合到酿酒酵母基因组DNA上的IAH1基因表达单元的正确性(如图5所示)。PCR扩增条件同实施例1。
将测序结果与设计的IAH1基因表达单元的序列进行比对，完全相符的则说明菌株构建正确，得到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2。
2、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2稳定性检测
将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2在YEPD斜面上进行传代培养，培养3d后转接至一新的斜面，传代20次后进行检测，结果表明，整合到染色体上的IAH1基因的表达单元稳定，不发生基因丢失现象(如图6所示)。
实施例3
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2啤酒酿造小试实验
分别接种安琪啤酒高活性干酵母以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2至
至装有5ml麦芽汁的试管，28℃培养箱内培养2d，转入装有50ml麦芽汁的250ml三角瓶，25℃培养2d后转入装有650mL麦芽汁的1L三角瓶中，20℃发酵6天，然后于2℃冰箱中放置4天，气相色谱检测受体菌以及转化子所酿啤酒中酯类的浓度。结果表明，受体菌与转化子所酿啤酒中的酯类浓度有较大差异，转化子所酿啤酒水果风味突出。结果见附表1。
附表1 受体菌与转化子啤酒酿造小试实验中所酿啤酒的酯类浓度对比
Claims (8)
1.一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2，该菌株2010年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号：CGMCC NO.4355。
2.权利要求1所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2的构建方法，步骤如下：
(1)以啤酒酵母的DNA为模板进行PCR扩增，引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，得到基因PGK1的启动子PGK1P，然后用内切酶KpnⅠ和BamHⅠ双酶切启动子PGK1P和质粒pUC18，再用连接酶连接后，得到质粒pUC18-P；
(2)以啤酒酵母的DNA为模板进行PCR扩增，引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，得到IAH1基因片段，然后用内切酶BamHⅠ和SmaⅠ双酶切IAH1基因片段和步骤(1)制得的质粒pUC18-P，再用连接酶连接后，得到质粒pUC18-PI；
(3)以啤酒酵母的DNA为模板进行PCR扩增，引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，得到ADH1基因的终止子片段，然后用内切酶SmaⅠ和EcoRⅠ双酶切ADH1基因的终止子片段和步骤(2)制得的质粒pUC18-PI，再用连接酶连接后，得到质粒pUC18-PIT；
(4)以质粒pUG6为模板进行PCR扩增，引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，得到KanMX基因片段，然后用内切酶SalⅠ和KpnⅠ双酶切KanMX基因片段和步骤(3)制得的质粒pUC18-PIT，再用连接酶连接后，得到质粒pUC18-KPIT；
(5)将步骤(4)制得的质粒pUC18-KPIT和酵母整合载体YIP-5分别用内切酶SalⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，然后用连接酶连接，得到载体YIP-KPIT；
(6)将步骤(5)制得的载体YIP-KPIT电击转化酿酒酵母感受态细胞，转化的酿酒酵母细胞涂布筛选平板，28℃培养72h后进行克隆子鉴定，选取阳性菌株，即得酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2；
所述啤酒酵母购自安琪酵母股份有限公司，商品名称：安琪啤酒高活性干酵母，货号：80000005。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，30循环；最后72℃延伸7min。
4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，30循环；最后72℃延伸7min。
5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，30循环；最后72℃延伸7min。
6.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃30s，58℃30s，72℃75s，30循环；最后72℃延伸7min。
7.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中筛选平板组分如下：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂，500μg/mL G418，余量水。
8.权利要求1所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AU2在啤酒酿造中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121017 Termination date: 20141124 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |