CN104031854A - 一株提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株及其构建方法 - Google Patents

Abstract

一株提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株及其构建方法，菌株分类命名为Saccharomyces cerevisiae YM-27，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2014206。本发明还提供了该菌株的构建方法以及浓醪发酵淀粉生产乙醇的方法。该菌株的构建方法是：将酿酒酵母转录激活因子Msn4基因置于组成型强启动子PGK下，构建重组整合表达质粒YPKR-Msn4，rDNA介导整合到受体菌酵母工业菌株Y49的染色体中，筛选得到酿酒酵母菌YM-27。本发明构建的酿酒酵母工程菌运用在木薯乙醇工业生产中，可克服浓醪发酵中后期酵母菌受高浓度乙醇抑制而发酵活力不足的问题，可应用于乙醇浓醪发酵，为木薯乙醇发酵工业带来明显的经济效益。

Description

一株提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一株提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法及其应用。以及该工程菌株在以木薯为原料浓醪发酵生产燃料乙醇中的应用。

背景技术

燃料乙醇目前被认为是最有可能大规模替代石油的液体燃料，市场潜力十分巨大，非粮乙醇的规模化商业开发将成为我国最有前途的新兴能源产业之一。目前我国生产乙醇的主要原料是以玉米等粮食作物为主，但是我国人口众多，存在“与民争粮”的问题。在纤维素转化为乙醇的技术成熟之前，未来燃料乙醇发展更多的应是依靠非粮原料。木薯具有产量高、耐贫瘠、耐干旱、耐酸性、抗逆性强等特性，其块根淀粉含量可达70％以上，有“淀粉之王”的美称，是生产燃料乙醇的首选低成本原料。广西的木薯种植面积和产量居全国首位，广西利用高产木薯作为原料生产燃料乙醇是世界首创。我国《可再生能源发展“十二五”规划》在政策上明确支持建设具备条件的木薯乙醇等非粮项目，因此木薯燃料乙醇具有长期的可行性。

浓醪发酵是燃料乙醇发酵工业发展的有效途径之一，其有以下优点：(1)提高单位体积和时间内发酵浓度，增加了发酵强度，提高乙醇产量和设备利用率。(2)醪液酒度的提高，能有效降低乙醇蒸馏蒸气的用量，从而降低了煤电的消耗。如将乙醇发酵的浓度由12％(v/v)提高至16％(v/v)，可节省蒸馏能耗25％左右。(3)节约工艺用水，并可减少乙醇蒸馏损失。(4)实现浓醪发酵可以减少企业污水处理负担。然而，与传统发酵相比，酿酒酵母在浓醪发酵过程中，面临着严峻的环境胁迫，在浓醪发酵过程中，酵母菌随着发酵液乙醇、乙醛等毒性物质浓度的升高，发酵速率逐渐下降，导致发酵周期延长，并使发酵终点乙醇浓度降低，残糖升高，可见发酵终点的乙醇浓度与酵母菌本身的耐乙醇性能有关。

近年来，国内已开始采用耐乙醇酵母进行工业化浓醪发酵生产乙醇，玉米原料乙醇发酵浓度可达13％(v/v)，木薯原料乙醇发酵浓度低于玉米且发酵效率不高。在高浓度乙醇发酵技术研究上，国内有关的科研机构已开展了相应的工作，其发酵菌株乙醇发酵浓度最高可达15％-16％(v/v)，但其发酵时间较长，发酵效率低于92％，同时其发酵底物大多为玉米和精制淀粉。乙醇浓醪发酵会引起糖浓度和乙醇浓度升高，导致酵母菌的生长受到抑制和乙醇发酵不彻底的现象，是制约木薯原料浓醪发酵的主要的关键因素之一。因此，提高工业乙醇酵母的逆境耐受性，是选育发酵生产燃料乙醇菌种的重要指标。利用代谢工程构建选育具有高抗逆性的工业酿酒酵母菌株是突破浓醪发酵瓶颈的关键所在，对于燃料乙醇的发酵生产，尤其是高浓度乙醇发酵具有重要意义。

发明内容

针对现有技术不足，提供一株提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法及其应用。能很好地在木薯浓醪乙醇发酵生产中应用。

本发明的技术方案是：提供的一株提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株，该菌株为YM-27，分类学名为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，于2014年5月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2014206，保藏地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学。

所述的提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：PCR克隆酿酒酵母转录激活因子Msn4基因，连接入rDNA介导的多拷贝整合表达载体YPKR，构建rDNA介导、PGK酵母强启动子的高拷贝整合表达质粒YPKR-Msn4，线性化酶切重组表达质粒，将其转化导入到受体酵母菌株Y49的染色体中，获得工程菌株YM-27。

所述的提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株在木薯乙醇浓醪发酵生产中的应用。

本发明所述的整合型表达质粒YPKR，是以酿酒酵母整合载体YIp5为骨架，在其中引入特定的rDNA片段及G418抗性基因，同时引入酿酒酵母PGK强启动子，构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体，以适用对酿酒酵母工业菌株的分子生物学操作，提高外源基因的稳定性和表达量。

本发明所述的受体酵母菌株Y49，由自行筛选的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y09tj(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号CGMCC NO.3476)诱变筛选获得。

本发明所述的提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株在木薯乙醇浓醪发酵生产中的应用，包括以下步骤：35g木薯粉，淀粉的终浓度为20～40％(W/W)，加水70mL搅拌，加入0.25％(W/W)的尿素，加入耐高温α-淀粉酶，使用量为向每克淀粉质原料中加入0.15KNU的耐高温α-淀粉酶，在震荡水浴锅85℃液化30min，降温至32℃后，按0.10～0.14亿个细胞/mL发酵液接种酿酒酵母发酵，同时加入糖化酶，使用量为向每克原料中加入0.14AGU的糖化酶，初始pH值调整为4.5，发酵温度为30～37℃，转速为90rpm，发酵时间为40～48h。

本发明的突出优点在于：所获得的酿酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)YM-27与受体酵母菌株Y49相比，具有较好的乙醇耐受性，在12％的乙醇胁迫下，最大OD₆₀₀生长值是受体酵母菌的1.97倍，在35％木薯淀粉乙醇发酵中，48h乙醇浓度达15.17％(V/V)，比一般工业酵母菌发酵周期短，酒度高，适合木薯浓醪乙醇发酵，提高了原料的利用率，降低了乙醇生产成本，能够为乙醇发酵工业带来显著的经济利益。

附图说明

图1为Msn4基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳。

图2为转化子的G418抗性表型。A，YPD平板；B，600ug/mLG418YPD平板；1，2，3酿酒酵母转化子；4，受体酵母。

图3为重组酵母工程菌株YM-27和受体酵母菌株Y49在12％乙醇胁迫下，在三角瓶培养不同时间测定的OD₆₀₀值。

具体实施方式

下列实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1

酿酒酵母整合表达载体的构建

构建质粒YP，以酿酒酵母整合载体YIp5为骨架，克隆酵母穿梭质粒pMA91的PGK基因，连接于Yip5的Hind III位点。

构建质粒YPK，以质粒pFA6akanMX4为模板，PCR扩增G418抗性基因KanMX，引物均引入SalI酶切位点，Kan-F(5'-ATTA GTCGACTCTGTTTAGCTTGCCTC-3')，Kan-R(5'-ACGCGTCGACTATCATCGATGAATTCGA-3')，连接于质粒YP。

构建质粒YPKR，以酿酒酵母总DNA为模板，PCR扩增rDNA基因，引物分别引入XmalII和BspMII酶切位点，rDNA-F(5'-ATCACGGCCGAACGAACGAGACCTTAACCT-3')，rDNA-R(5'-GCTGTCCGGAGGAACCTCTAATCATTGGCT-3')，连接于经XmalII和BspMII酶切双酶切的质粒YPK，得到酿酒酵母表达载体YPKR。酶切和连接反应参照Takara公司提供的酶的使用说明书，所述的质粒YIp5，pMA91，pFA6akanMX4通过惠赠获得。

实施例2

高耐受性重组酿酒酵母工程菌株的获得

1、关键转录激活因子Msn4基因的获得

根据已报道的关键转录因子Msn4的基因序列，设计上下游引物，添加Bgl II酶切位点序列AGATCT，进行Msn4基因的PCR扩增。引物序列为：

上游引物P1：5'-GCGCAGATCTATGCTAGTCTTCGGACCTAATAGT-3'

下游引物P2：5'-TTGCAGATCTTTAAAAATCACCGTGCTTTTTGT-3'

以酵母总DNA为模板，以P1、P2为引物进行PCR扩增。扩增体系：2×Mix12.5μL10×Polymerase Buffer5μL，引物P1、P2各20pmol，模板DNA0.3μg，Taq酶5.0U，H₂O补足至50μL。扩增条件：首次循环在95℃下预变性2min，如下反应30个循环包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min，。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，观察到一条约1.9kb的特异性条带，大小与预期一致，如图1所示。

2、重组表达质粒的构建

将PCR产物Msn4基因片段纯化后用Bgl II进行单酶切，与经同样酶切的质粒YPKR连接，转化感受态细胞DH5ɑ，挑取转化子进行菌体1％琼脂糖凝胶电泳，以空质粒为对照，选出滞后的转化子提质粒，质粒经PCR、酶切、测序鉴定，产物纯化、酶切、转化、质粒抽提等步骤均按常规方法进行，测序由上海生工完成，经测序正确的质粒命名为YPKR-Msn4。

3、酿酒酵母转化子的筛选

在酿酒酵母进行电转化之前，对酿酒酵母受体菌进行了抗性筛选标记G418的敏感性测定，在G418浓度为275ug/mL的YPD平板上酵母已经被抑制而不能生长，因而在筛选转化子的时候可以用超过275ug/mL的G418浓度来筛选。

将构建好的重组表达质粒YPKR-Msn4进行限制性内切酶HpaI线性化后，用酚/氯仿抽提、乙醇沉淀。同时，制备酵母Y49感受态，取80μL感受态，加入10μL酶切产物，轻轻混匀后吸入电击杯冰浴10min后，1500V电击转化(同时转化空质粒YPKR作为阴性对照)。随即加入1mL1M山梨醇，30℃放置2h后，4500rpm，4℃，离心5min收集菌体，用YPD重悬菌体，于30℃预培养2h，快速离心收集菌体，用1M山梨醇适当稀释，均匀涂布在G418浓度为300μg/mL的YPD平板上，30℃培养2-3d，直至明显长出菌落。挑取转化子和受体酵母菌Y49转接至含600μg/mL G418的高抗性平板上，在30℃培养数天，所有被测转化子均表现出良好的G418抗性表型(如图2)，但受体酵母菌表现不能生长的状态。

分别挑取高抗性平板上的阳性单菌落接种至装液量20mL，含12％乙醇的YPD液体培养基的50mL的三角瓶中，30℃摇床培养12h以上，不同时间测量其OD₆₀₀值，进行转化子筛选。

4、菌株耐性试验

挑取耐性较高的转化子YM-27以及受体酵母菌单菌落，接种至5mLYPD液体培养基中，30℃培养过夜，以8％的接种量分别接种至12％乙醇的YPD液体培养基中，30℃，220rpm培养，每隔12h取样测量其OD₆₀₀值(如图3)。

实施例3

重组菌株木薯浓醪乙醇发酵试验。

种子培养基YPD：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，蒸馏水定容至1000mL。

所用酶类：耐高温淀粉酶：Liquozyme Supra，购自诺维信公司，标准酶活力为90KNU/g。糖化酶：Dextrozyme DX，购自诺维信公司，标准酶活500AGU/mL。

种子液准备：将重组菌株接种于YPD液体培养基中，30℃，220rpm/min培养12h～14h，使种子液的酵母菌细胞达到每毫升1.5亿以上，用于接种发酵。

发酵过程：取木薯粉35g，放入250mL三角瓶中，加自来水70mL，尿素添加量为0.25％(W/W)，加入0.15KNU/g木薯粉的耐高温α-淀粉酶，在85℃水浴震荡液化30min，降温至32℃，按8％的接种量接种发酵，同时加入0.14AGU/g木薯粉的糖化酶，用盐酸调pH值为4.5，在32℃，90rpm/min发酵48h后，气相测量乙醇浓度可达到15.17％(V/V)。

Claims (6)

1.一株提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，该菌株为YM-27，分类学名为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，于2014年5月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2014206。

2.如权利要求1所述的提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：PCR克隆酿酒酵母转录激活因子Msn4基因，连接入rDNA介导的多拷贝整合表达载体YPKR，构建rDNA介导、PGK酵母强启动子的高拷贝整合表达质粒YPKR-Msn4，线性化酶切重组表达质粒，将其转化导入到受体酵母菌株Y49的染色体中，获得工程菌株YM-27。

3.如权利要求2所述的提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述的整合表达载体YPKR，是以酿酒酵母整合载体YIp5为骨架，在其中引入特定的rDNA片段及G418抗性基因，同时引入酿酒酵母PGK强启动子，构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体，以适用对酿酒酵母工业菌株的分子生物学操作，提高外源基因的稳定性和表达量。

4.如权利要求2所述的提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述的受体酵母菌株Y49，由保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为CGMCC NO.3476自行筛选的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y09tj，诱变筛选获得。

5.如权利要求1或2所述的提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株在木薯乙醇浓醪发酵生产中的应用。

6.如权利要求5所述的提高对乙醇耐受性的酿酒酵母基因工程菌株在木薯乙醇浓醪发酵生产中的应用，其特征在于，包括以下步骤：取35g木薯粉，淀粉的终浓度为20～40％(W/W)，加水70mL搅拌，加入0.25％(W/W)的尿素，加入耐高温α-淀粉酶，使用量为向每克淀粉质原料中加入0.15KNU的耐高温α-淀粉酶，在震荡水浴锅85℃液化30min，降温至32℃后，按0.10～0.14亿个细胞/mL发酵液接种酿酒酵母发酵，同时加入糖化酶，使用量为向每克原料中加入0.14AGU的糖化酶，初始pH值调整为4.5，发酵温度为30～37℃，转速为90rpm，发酵时间为40～48h。