CN104131005A - 一株高产酯酿酒酵母菌株及其启动子无缝***方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高产酯酿酒酵母菌株及其构建方法，所述高产酯酵母菌株通过将强启子PGK1p精确***亲本酵母菌株醇乙酰基转移酶基因(ATF1)ORF的5′端来获得，启动子的精确***通过融合PCR和酵母整合质粒YIplac211来实现。构建得到的高产酯酵母，在其他发酵性能不受影响的情况下，ATF1的mRNA表达量和醇乙酰基转移酶产量分别是出发菌株的40和5倍；玉米浓醪发酵4天，总酯产量是亲本的2.7倍，乙酸乙酯的产量是亲本菌株的3.1倍。本发明构建的酵母菌中基因组上无外源基因残留，因此可以安全的用于工业生产。

Description

一株高产酯酿酒酵母菌株及其启动子无缝***方法

技术领域：

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一株高产酯酿酒酵母菌株及其启动子无缝***方法。 

背景技术：

酯类物质作为白酒中含量最多的香气成分之一，具有水果的芳香和口味，赋予了白酒丰富的水果香气，在白酒的风格和质量方面起着重要的作用。我国名优白酒中以乙酸乙酯(果香和菠萝香)、己酸乙酯(甜蜜香、白兰地香和果香)、乳酸乙酯和丁酸乙酯(苹果香和果香)等乙酸酯为主，达总酯含量的80％以上。其中，乙酸乙酯是清香型，米香型，凤香型，老白干香型等白酒的主体香味成分。Nordstrom对酯类的形成进行过一系列的研究，证明酯主要是由醇酰基转移酶或者其它酯合成酶在酿酒酵母细胞内生物催化合成的。Yoshioka和Hashimoto研究证实，醇乙酰基转移酶(AATase)是乙酸乙酯、乙酸异戊酯等乙酸酯类合成的关键酶，Fujii等人对此酶进行了精制及测序工作，结果得到了三种不同的AATase：AATaseI、Lg-AATaseI和AATaseII，分别由ATF1、Lg-ATF1和ATF2编码。ATF1和ATF2在酿酒酵母和啤酒酵母中均存在，但Lg-ATF1只存在于啤酒酵母中。 

对于酯类的来源和调节，Lilly等在葡萄酒酵母中通过表达ATF1和ATF2基因，乙酸乙酯，乙酸异戊酯，乙酸苯乙酯和乙酸己酯的含量都相应增加。且ATF1基因的作用大于ATF2基因。其中，ATF1的过表达使得乙酸乙酯，乙酸异戊酯和乙酸苯乙酯的浓度分别增加了10倍，3.8-12倍和2-10倍。Verstrepen等通过对啤酒酵母的研究发现，ATF1和ATF2基因双缺失啤酒酵母菌株(atf1△atf2△)几乎没有乙酸异戊酯生成(≤野生啤酒酵母菌株的4％)。同时证实ATF1基因的作用大于ATF2基因。在我国，张翠英等通过在啤酒酵母和黄酒酵母中过表达ATF1，乙酸乙酯产量分别提高了11.5和20.9倍。对于通过提高编码醇酰基转移酶基因(ATF1)的表达来提高白酒中酯的含量的研究尚未报道。 

改变启动子强度是实现基因表达调控的重要途径。传统的启动子一步***法，***片段由标记基因和两端的侧翼序列组成，通过侧翼序列与***位点两测序列之间的同源重组实现启动子的***。由于标记基因不能重复使用和低的重组效率，一步***法的应用受到限制。重组酶介导的***由于高的效率被广泛用于基因敲除和启动子***，例如Cre/Loxp***等。通过转化筛选标记两侧带有重组酶位点的启动子***元件到酵母中，一步整合实现目的基因的***，然后转化一个编码重组酶的质粒，以实现抗性标记的去除。在工业酵母的改造中， 这个***具有很高的效率，但是其会留下外源序列(单一loxp位点)，并且在进行多基因操作时，留下的这些位点增大了发生染色体重排的可能性。融合PCR可以实现基因片段的无缝拼接，且不受有限的酶切位点选择的限制，从而避免了传统的质粒构建过程中重复的酶切和连接操作。强启动子PGK1p(酵母磷酸甘油激酶，phosphoglycerate kinase)是酿酒酵母中常用的组成型启动子。因此，本发明通过融合PCR介导的两步整合方法实现了PGK1p精确***到目的基因ATF1的5′端，质粒弹出后无任何外源基因残留，构建的自克隆高产酯酿酒酵母菌株可安全用于工业生产。同时融合PCR介导的两步整合方法可广泛应用于酵母及其他微生物启动子调控，促进了基因精确修饰的发展。 

发明内容：

本发明解决的技术问题之一是提供了一株高产酯酿酒酵母菌株。 

所述高产酯酵母菌株是将PGK1p启动子精确***到出发酵母菌株-酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315的醇乙酰基转移酶编码基因(ATF1)的5′端所得。 

所述ATF1基因其Gene ID为：854559，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示； 

所述启动子PGK1p其Gene ID为：850370，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。 

本发明所解决的另一个技术问题是提供一种高产酯酿酒酵母菌株启动子无缝***构建方法，包括如下步骤： 

(1)PCR获得突变ura3片段；将该片段导入出发酵母菌株中，获得缺陷型菌株； 

(2)以菌株CICC32315的基因组为模板，PCR分别扩增强启动子PGK1p，***位点上游和下游同源臂序列，并通过融合PCR将三个片段无缝连接，将融合片段克隆至酵母整合质粒上，获得整合过表达质粒； 

(3)在整合过表达质粒的上游同源臂序列中，选择单一酶切位点，将质粒酶切线性化； 

(4)将步骤(3)获得的线性质粒导入(1)中的缺陷型菌株，在不含尿嘧啶(uracil)的酵母合成培养基筛选，获得第一步整合重组的酵母突变株； 

(5)将步骤(4)中筛出的突变株经5-氟乳清酸(5-FOA)合成培养基平板反向筛选获得第二步整合重组的酵母突变株； 

(6)以菌株CICC32315的基因组为模板，PCR获得正常的URA3基因片段，将其导入到步骤(5)中二步整合重组的酵母突变株中，以回复突变的ura3标记基因，即得所述高产酯的酿酒酵母菌株。 

所述重组菌株可通过上述方法构建。各步骤所涉及具体操作方法参考现有文献报道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。 

本发明所述酿酒酵母菌株可应用于白酒生产中。 

本发明所述的酿酒酵母工程菌株，在其他发酵性能不受影响的情况下，mRNA表达量和醇乙酰基转移酶分别是出发菌株的40和5倍；玉米浓醪发酵4天，总酯含量是亲本菌株的2.7倍，乙酸乙酯的产量是亲本菌株的3.1倍。 

有益效果： 

1、本发明提供一种高产酯的酿酒酵母菌株，克服了普通酿酒酵母由于酯产量低引起的香味不协调的问题。 

2、本高产酯的酿酒酵母菌株是在保持优良发酵性能的前提下，醇乙酰基转移酶编码基因ATF1的表达量显著提高，为生产具有良好风味的白酒奠定了理论基础。具有重要的市场价值。促进了优良感官品质的白酒的生产，同时为研究乙酸乙酯对白酒风味协调性的影响奠定了基础。 

3、本发明提供的高效的启动子无缝***方法，避免了酵母传统基因启动子***过程中筛选标记残留的问题，满足自克隆的条件，可以安全的用于工业生产。并且本方法在基因精确修饰方面具有广阔的应用前景。 

附图说明：

图1为整合过表达质粒YIplac211-UPD的构建流程示意图 

图2质粒YIplac211-UPD与酵母基因组的两步整合重组流程示意图 

图3为发生第一步整合重组的菌株AY14-u3-Y的电泳验证图： 

泳道M为DNA maker； 

泳道1、2、3为使用YIP-UPD-F和YIP-UPD-R PCR验证结果，泳道1、2、3模板分别为AY14-u3、AY14-u3-Y和质粒YIP-UPD； 

泳道4、5、6为使用引物对YIP-UD-F和YIP-UD-R PCR验证结果，模板依次为AY14-u3、AY14-u3-Y和质粒YIP-UPD； 

图4为发生第二步整合重组的菌株AY14-u3-P的电泳验证图： 

泳道M为DNA maker； 

泳道1、2为使用引物对UD-F和UD-R的PCR验证结果，泳道1模板为AY14-u3，泳道2模板为AY14-u3-P； 

泳道3、4为使用引物对UP-F和UP-R的PCR验证结果，泳道3模板为AY14-u3，泳道4模板为AY14-u3-P； 

泳道5、6为使用引物对PD-F和PD-R的PCR验证结果，泳道5模板为AY14-u3，泳道6模板为AY14-u3-P； 

图5为出发菌株和突变株靶位置的测序结果比对图 

图6为菌株ATF1的mRNA表达量和醇乙酰基转移酶酶活 

图7为菌株酯的产量 

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。 

实施例1：高产酯酿酒酵母的构建 

本实例所用的出发菌株CICC32315。所述大肠杆菌DH5a购自Takara公司。所述YPD培养基为通用的完全培养基，所述酵母合成培养基(SD)成分为：2％葡萄糖、0.67％YNB、0.13％不含尿嘧啶的氨基酸混合物，固体培养基含2％进口琼脂粉。 

根据Genebank中的酵母基因组数据和整合质粒序列，设计了下述引物。 

表1.本实施例中所用到的引物 

注：小写字母表示酶切位点，下划线表示融合PCR所用引物的重叠序列。 

(1)带有缺陷ura3基因的酿酒酵母AY14-u3的构建 

PCR扩增突变ura3片段，经过试剂盒回收以后，将片段通过醋酸锂化学转化法导入到出发酿酒酵母CICC32315中，通过突变ura3与正常URA3之间的同源重组，实现出发菌株的URA3基因突变。转化后的菌悬液，涂布于补加了5-氟乳清酸(5-FOA)和尿嘧啶(uracil)酵母合成培养基(SD)平板上，30℃培养48 h，获得带有缺陷ura3基因的酿酒酵母AY14-u3。获得的突变株经过表型验证确定正确。 

(2)整合敲除质粒YIplac211-UPD的构建 

首先，以酿酒酵母CICC32315的基因组为模板，分别使用引物UF和UR通过PCR获得***位点上游1048bp的基因序列，PCR反应条件：95℃5 min；94℃40 s，54℃1 min，72℃140 s，30个循环；72℃10 min，产物命名为U； 

引物PF和PR扩增靶启动子序列(1479bp)，PCR反应条件：95℃5 min；94℃40 s，55℃1 min30s，72℃140 s，30个循环，72℃10 min，产物命名为P； 

引物DF和DR扩增***位点下游1046bp的基因序列，PCR反应条件：95℃5 min；94℃40 s，54℃1 min，72℃140 s，30个循环；72℃10 min，产物命名为D； 

然后，以U，P和D的混合物为模板，加入引物UF和DR进行融合PCR，获得无缝融合片段，融合PCR反应条件，首先，以纯化后的U，P和D的混合物为模板，不加入引物，50℃45s，72℃2 min，10个循环。PCR产物经过切胶回收(试剂盒)后作为融合PCR的模板，以UF和DR为引物，PCR反应条件：95℃5 min；94℃40 s，57℃1 min，72℃140 s， 30个循环；72℃10 min，经过切胶回收(试剂盒)后，用BamHI和KpnI双酶切，最后亚克隆到整合质粒YIplac211的相应酶切位点中，整合敲除质粒YIplac211-UPD构建成功，构建流程如图1所示。 

上述融合PCR法为本领域公知的采用具有互补末端的引物，形成具有重叠序列PCR产物，通过PCR产物重叠序列延伸，从而将任意DNA片段连接起来的方法，此技术不需要内切酶的消化和连接酶的处理，就可实现DNA片段的体外连接，这使得整合质粒经过两步整合重组后，酵母基因组不会残留外源酶切位点。 

(3)启动子PGK1p的无缝*** 

NruI酶切整合质粒YIplac211-UPD；用醋酸锂转化法将线性化的整合质粒YIplac211-UPD导入缺陷型酵母菌株AY14-u3中，经过两步整合重组后，得到组成型启动子PGK1p精确***到ATF15′端的酿酒酵母，两步整合重组过程如图2。 

第一步整合重组的发生，是由于导入的线性化质粒与酵母基因组的同源部分发生整合，从而将整个质粒带入基因组。转化后的菌悬液，涂布于不含尿嘧啶的酵母合成培养基平板上，30℃培养48 h，获得发生第一步整合重组的酵母菌株AY14-u3-Y。挑选所得到的单菌落，采用YIP-UPD-F和YIP-UPD-R，YIP-UD-F和YIP-UD-R为验证引物，进行菌落PCR筛选。PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果见图3。转化子与对照比较结果显示，线性化的质粒整合到目的位点。 

经过筛选和鉴定的重组酵母菌株AY14-u3-Y，取一环接到5ml液体YPD培养基中，30℃下200rpm振荡24 h后，稀释10倍涂布于含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的酵母合成培养基平板上，30℃培养48 h，获得发生第二步整合重组的酵母菌株。如图2所示，第二步重组整合后，出现两种结果：一，如果上游同源序列(U)形成的重复序列之间发生整合，则酵母回复成出发菌株AY14-u3；二，如果下游同源序列(D)形成的重复序列之间整合，则中间的所有序列弹出，实现PGK1p的精确***，同时靶位置上不引入任何外源基因。挑选所得到的单菌落，采用UD-F和UD-R，UP-F和UP-R，PD-F和PD-R三对引物，进行菌落PCR，筛选出PGK1p精确***的转化子。PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果见图4。转化子与对照比较结果显示，启动子PGK1p***到ATF1的前面。 

(4)整合重组菌株AY14-u3-P突变ura3基因的回复 

同步骤(1)所述的方法，利用引物对URA3-F和URA3-R，扩增正常URA3基因片段，通过化学转化，以回复AY14-u3-P菌株突变的ura3基因，最终构建了不残留任何外源基因序列的启动子精确***菌株AY14-P。 

为了进一步验证启动子***位置的序列情况，提取菌株AY14-P的基因组，使用引物PS-F 和PX-R进行PCR扩增，获得1829bp的片段送于华大基因公司测序，结果如图5。敲除前后序列对比，可以确定PGK1p无缝***到ATF1的5′端构建成功。 

实施例2：高产酯酿酒酵母的发酵实验 

(1)高产酯酿酒酵母的发酵性能 

将单倍体亲本及其对应的重组菌株分别同时进行玉米浓醪发酵实验，发酵工艺路线：玉米粉→浸泡→液化→糖化→冷却→接菌→发酵→蒸酒→测定指标； 

工艺条件： 

浸泡条件：60～70℃，浸渍20 min；液化条件：85～90℃，加入耐高温α-淀粉酶，液化90 min； 

糖化条件：55～60℃，加入糖化酶，糖化20 min； 

配料：玉米粉60 g，水180 mL，耐高温α-淀粉酶2×10⁵ U/mL，30 μL，糖化酶200 U/mL，90μL，2.5×10³ U/mL酸性蛋白酶，1.2 mL；营养盐1 mL(MgSO₄150 g/L、KH₂PO₄75 g/L、尿素81 g/L，过滤，4℃保存)；接种量：7.5％，30℃，发酵4天； 

发酵4天后取100 mL醪液，加100 mL水，蒸出100 mL酒样； 

对酒样进行发酵性能指标测定，结果见表2。如结果所示，所述工程菌株与出发菌株的发酵性能(CO₂失重，酒度，残糖)基本一致，滴定法测得总酯的量达到1.46 g/L，是出发菌株的2.7倍。 

表2 菌株发酵性能比较 

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。 

(2)所述高产酯酿酒酵母ATF1的mRNA表达量和醇乙酰基转移酶酶活 

用RT-qPCR测定ATF1的mRNA表达量。使用Yeast RNAiso Kit酵母Total RNA提取试剂盒提取总RNA，采用TIANScript RT Kit(天根生化)荧光定量PCR试剂盒进行cDNA的合成，逆转录反应体系：Total RNA，1 μg；oligo dT(10 μM)，2 μl；dNTP(2.5 mM)，2 μl；RNase-free ddH2O补齐至14.5 μl；70℃，水浴5 min，后冰浴2 min；再加入：5×First-Strand Buffer，4 μl；RNasin(40 U/μl)，0.5 μl；TIANScript M-MLV(200 U/μl)，1 μl；继续反转录程序：42℃，50 min；95℃，5 min。Real-time PCR反应体系：SYBR FAST Qpcr Kit Mast er  Mix(2×)Universal，5 μl；Primer F(10 μM)，0.2 μl；Primer R(10μM)，0.2 μl；cDNA，1 μl；ROX校正染料，0.2 μl；H2O，补齐至10 μl。PCR反应条件：95℃3 min；95℃3 s，60℃120 s，30个循环；95℃15 s，60℃15 s，95℃15 s。 

采用底物反应法测定各菌株所产醇乙酰基转移酶的活力。在10 mL离心管内加入一定量的鲜酵母菌体、1.0 mL Tris-HCl、20 μL乙醇(色谱醇)和20 μL 10 mg/mL乙酰辅酶A，混匀后用封口膜将离心管密封，并放入25℃转速150 r/min摇床内进行反应。待反应一定时间后(一般为2～6 h)，12000 r/min离心5 min，取上清液用气相色谱测反应产物乙酸乙酯的生成量。醇乙酰基转移酶活力定义：在25℃下，1 g酿酒酵母菌体1 h催化乙醇和乙酰辅酶A生成乙酸乙酯的量(μmol)。 

所述高产酯酿酒酵母ATF1的mRNA表达量和醇乙酰基转移酶酶活见图6。ATF1的mRNA表达量和醇乙酰基转移酶产量分别是出发菌株的40和5倍。 

(3)气相色谱法测定酯和醇的产量 

气相色谱仪：Agilent 7890C；色谱柱：白酒专用柱，AT.LZP-930，230℃，50 m×320 μm×1μm；检测器：FID检测器，检测器温度：200℃；载气：高纯氮，流速5 mL/min；检测条件：程序升温，50℃保持8 min，5℃/min升到120℃,保持8 min；进样口温度：200℃；进样量：1.0 μL；分流方式：分流，分流比为5：1；结果如图7，乙酸异丁酯和乙酸异戊酯的产量没有显著增加，乙酸乙酯的产量是亲本菌株的3.1倍。 

Claims (8)

1.一种无缝***启动子的方法，是通过融合PCR介导的两步整合法实现的，其特征在于，包括如下步骤：

(1)PCR获得突变ura3片段；将该片段导入出发菌株中，获得缺陷型菌株；

(2)PCR分别扩增强启动子序列，***位点上游和下游同源臂序列，并通过融合PCR将三个片段无缝连接，将融合片段克隆至酵母整合质粒上，获得整合过表达质粒；

(3)在整合过表达质粒的上游或下游同源臂序列中，选择单一酶切位点，将质粒酶切线性化；

(4)将步骤(3)获得的线性质粒导入(1)中的缺陷型菌株，在不含尿嘧啶的酵母合成培养基筛选，获得第一步整合重组的突变株；

(5)将步骤(4)中筛出的突变株经5-氟乳清酸合成培养基反向筛选获得第二步整合重组的突变株；

(6)PCR获得正常的URA3基因片段，将其导入到步骤(5)中二步整合重组的突变株中，以回复突变的ura3标记基因。

2.一株由权利要求1所述的无缝***启动子的方法构建的高产酯的酿酒酵母菌株，是在酵母出发菌株中将强启动子PGK1p精确***醇乙酰基转移酶基因ATF1的5′端获得，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315。

3.如权利要求2所述的一株高产酯的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述ATF1基因其Gene ID为：854559，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；所述强启动子PGK1p其Gene ID为：850370，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

4.如权利要求2所述的一株高产酯的酿酒酵母菌株，其特征在于，菌株构建方法具体如下：

(1)PCR获得突变ura3片段；将该片段导入出发酵母菌株中，获得缺陷型菌株；

(2)以菌株CICC32315的基因组为模板，PCR分别扩增强启动子PGK1p，***位点上游和下游同源臂序列，并通过融合PCR将三个片段无缝连接，将融合片段克隆至酵母整合质粒上，获得整合过表达质粒；所述上游同源臂序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，下游同源臂序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；

(3)在整合过表达质粒的上游同源臂序列中，选择单一酶切位点，将质粒酶切线性化；

(4)将步骤(3)获得的线性质粒导入(1)中的缺陷型菌株，在不含尿嘧啶的酵母合成培养基筛选，获得第一步整合重组的酵母突变株；

(5)将步骤(4)中筛出的突变株经5-氟乳清酸合成培养基反向筛选获得第二步整合重组的酵母突变株；

(6)以菌株CICC32315的基因组为模板，PCR获得正常的URA3基因片段，将其导入到步骤(5)中二步整合重组的酵母突变株中，以回复突变的ura3标记基因，即得所述高产酯的酿酒酵母菌株。

5.如权利要求4所述的一株高产酯的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酵母整合质粒为YIplac211质粒。

6.如权利要求4所述的一株高产酯的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述单一酶切位点为NruΙ。

7.如权利要求4所述的一株高产酯的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述线性质粒导入缺陷型菌株的方法为醋酸锂转化法。

8.如权利要求2所述的高产酯酿酒酵母菌株在白酒生产中的应用。