CN101880635A - 高β-葡聚糖含量的酿酒酵母突变菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高β-葡聚糖含量的酿酒酵母突变菌株(Saccharomycescerevisiae)FFLM2.0016。该突变菌株的保藏号为CGMCC No.3730，是由菌株Saccharomyces cerevisiae 2.0016(Y-8)经过搭载“实践8号”卫星空间诱变后，筛选出的高3-葡聚糖含量的突变菌株。该突变菌株的生物量、细胞壁厚度及β-葡聚糖含量均比诱变前菌株Saccharomyces cerevisiae 2.0016(Y-8)显著增加。

Description

高β-葡聚糖含量的酿酒酵母突变菌株及其应用

技术领域

本发明涉及酵母突变菌株及其应用，特别涉及高β-葡聚糖含量的酿酒酵母突变菌株及其应用。

背景技术

酵母属于单细胞真核微生物，细胞壁厚度约为0.1～0.3μm，占细胞干重的20％，其主要构成为葡聚糖35％～45％、甘露聚糖40％～45％、蛋白质5％～10％，另外还含有少量脂肪等物质。酵母β-葡聚糖属于结构多糖，位于细胞壁的最内层，和原生质体膜相连接，其主要生理功能是维持细胞壁的机械结构，保持细胞正常的生理形态。酵母β-葡聚糖具有显著的生理功效，研究发现其可以与特异的巨噬细胞受体结合以增强机体免疫活力，还可以通过激活巨噬细胞以起到抗肿瘤、抗菌和愈合伤口的功效。此外，酵母β-葡聚糖还具有良好的降低胆固醇和血脂的功效。酵母β-葡聚糖因其突出的功能活性而引起人们的关注，目前报道的提高酵母中β-葡聚糖含量的方法主要有培养基优化法、紫外照射法等。

空间诱变是利用返回式空间飞行器，将植物种子、微生物菌种等材料送入太空，利用太空特殊的环境条件，如微重力、空间辐射、超真空等，促使生物发生有益变异，从而培育出高产、优质新品种的方法。微生物空间诱变研究目前主要集中在空间诱变对微生物产酶活性、次级代谢产物以及菌肥活性的影响方面。有研究表明，空间诱变可使大肠杆菌、沙门氏菌和枯草杆菌的生长加快，生长延迟期缩短，对数生长期延长。此外，空间诱变能使嗜油细菌菌落生长率提高，并能使某些碳水化合物发酵，同化β-半乳糖。刘志恒等利用“90105”科学返回卫星，研究了24株微生物空间诱变条件下的生长与代谢性状，发现多数菌株能够存活，一些细菌和放线菌的生长速度加快、生物量增加。

发明内容

本发明的目的是提供高β-葡聚糖含量的酿酒酵母突变菌株。

本发明提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)突变菌株FFLM2.0016，其保藏号为CGMCC No.3730，于2010年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FFLM2.0016的细胞形态呈卵圆形，细胞长度2.5-3.8μm，宽度2.2-3.0μm，菌落颜色为乳白色，菌落形态为球形突起、表面光滑而光泽、不透明、奶油状，易挑起。繁殖方式为芽殖，具有完整的细胞核和线粒体等，细胞壁组成主要为葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质、几丁质等。有发酵能力，能够发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖，不能够发酵乳糖，该结果与菌种鉴定手册中酿酒酵母属酵母(Saccharomyce cerevisiae)发酵糖类结果一致。能够同化硫酸铵，但不能够同化硝酸钾，同化结果符合酿酒酵母对氮源的同化规律。酿酒酵母的生活史如下：子囊孢子在适宜条件下发芽产生单倍体营养细胞→单倍体营养细胞生长、出芽繁殖→两个性别不同的营养细胞结合，质配→核配成二倍体营养细胞→不断出芽繁殖。

所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FFLM2.0016可用于生产β-葡聚糖。具体可在YEPD培养基、32℃、初始pH为5的条件下培养酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)FFLM2.0016，以得到高产量的β-葡聚糖。

所述突变菌株，是由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)2.0016(Y-8)经过搭载“实践8号”卫星空间诱变后，筛选出的高β-葡聚糖含量的酿酒酵母突变菌株。该突变菌株的生物量、细胞壁厚度及β-葡聚糖含量均比诱变前菌株显著增加，分别增加了57.70％、73.2％和169.6％。该突变菌株的获得对生产β-葡聚糖具有重要的意义。

附图说明

图1为突变菌株FFLM2.0016的生长曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、高β-葡聚糖含量的酵母突变菌株的筛选及测定

一、筛选

1、空间诱变样品的培养、制备

从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)2.0016(Y-8)(该菌株由东北科学院大连分所筛选得到，CGMCC菌种保藏手册可以查到)，经YEPD培养基28℃、160r/min培养72h，收集、洗净、冷冻干燥。

2、“实践8号”卫星搭载过程

将冷冻管保存的冷冻干燥后的酵母菌体送入卫星装载舱。卫星于2006年9月9日15时升空，经过15d的绕地在轨运行，于2006年9月24日10时分返回地面。卫星运行的近地点高度为180km，远地点高度为469km，轨道倾角为63°。卫星运行期间回收舱内温度在20.72～7.21℃之间。

3、卫星搭载后返回样品的初筛

将搭载样品洗脱到10ml无菌水中，稀释至10^-4，取0.1ml涂布于YEPD平板上，28℃培养72h。选择生长良好的100个单菌落，每个菌落转接一支YEPD斜面作为原始菌株保藏。然后，每个菌株接一个摇瓶(100ml YEPD培养基)，28℃震荡培养72h，选出生物量较高的菌株20株。

4、卫星搭载后返回样品的复筛

将上述斜面保藏的生物量较高的菌株，选取3个不同部位菌体，接种于YEPD液体种子培养基中(50ml YEPD培养基)，12h后接于100ml YEPD液体发酵培养基、28℃震荡培养72h，选出生物量及β-葡聚糖含量高的菌株4株。此4株菌株再按照上述方法复筛，得到1株生物量及β-葡聚糖含量最高的菌株，记为FFLM2.0016。

该突变菌株细胞形态呈卵圆形，细胞长度为2.5-3.8μm，宽度2.2-3.0μm，菌落颜色为乳白色，菌落形态为球形突起、表面光滑而有光泽、不透明、奶油状，易挑起。繁殖方式为芽殖，具有完整的细胞核和线粒体等，细胞壁组成主要为葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质、几丁质等。有发酵能力，能够发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖，不能够发酵乳糖，该结果与菌种鉴定手册中酿酒酵母属酵母(Saccharomycecerevisiae)发酵糖类结果一致。能够同化硫酸铵，但不能够同化硝酸钾，同化结果符合酿酒酵母对氮源的同化规律。酿酒酵母的生活史如下：子囊孢子在适宜条件下发芽产生单倍体营养细胞→单倍体营养细胞生长、出芽繁殖→两个性别不同的营养细胞结合，质配→核配成二倍体营养细胞→不断出芽繁殖。

该突变菌株已于2010年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

二、测定

1、突变菌株FFLM2.0016的生物量、细胞壁厚度及β-葡聚糖含量测定

将诱变的出发菌株Saccharomyces cerevisiae 2.0016(Y-8)和突变菌株FFLM2.0016分别接种于50ml YEPD液体种子培养基中，28℃培养12h；然后取3ml种子培养液接种于100ml YEPD液体发酵培养基，28℃震荡培养72h。离心收集菌体，测定Saccharomyces cerevisiae 2.0016(Y-8)和突变菌株FFLM2.0016的生物量、细胞壁厚度及β-葡聚糖含量。

生物量的测定方法如下：取发酵液5ml，4200r/min离心15min，收获菌体，蒸馏水洗至上清液苯酚硫酸法滴定呈无色，洗净的酵母菌体于80℃下干燥至恒重。

细胞壁厚度的测定方法如下：取发酵液5ml，4200r/min离心15min，收获菌体，蒸馏水洗5次，戊二醛固定过夜，乙醇脱水，冰点干燥，喷金后使用扫描电子显微镜(Hitachi SEM-2500)观察酵母细胞，随即选取细胞拍照，使用Photoshop软件测量照片中细胞壁尺寸，根据比例尺计算实际厚度。

β-葡聚糖含量测定方法如下：取发酵液5ml，4200r/min离心15min，收获菌体，蒸馏水洗至上清液苯酚硫酸法滴定呈无色，沉淀中加入0.5ml蒸馏水和0.5g直径在0.45-0.55mm的玻璃珠。采用涡流振荡方法破壁，每次20s循环4次，离心取沉淀，蒸馏水洗至上清液苯酚硫酸法滴定呈无色，得到细胞壁，细胞壁先用72％硫酸100μl在室温条件下预处理3h，然后稀释至1ml，使硫酸的最终浓度为4mol/L，在100℃条件下酸水解4h后用NaOH中和，GOPOD双酶法测定葡萄糖含量，乘以校正因子0.9即得β-葡聚糖含量。

三次重复实验的结果表明突变菌株FFLM2.0016的生物量为932±4.2mg/100ml发酵液、细胞壁厚度为183.1±1.7nm、β-葡聚糖含量为149.1±0.8mg/100ml发酵液；原始菌株Saccharomyces.cerevisiae 2.0016(Y-8)的生物量为591±12.7mg/100ml发酵液、细胞壁厚度为105.7±4.8nm、β-葡聚糖含量为55.3±0.9mg/100ml发酵液。所述突变菌株的β-葡聚糖占酵母细胞比重为16.00％，原始菌株Saccharomyces.cerevisiae 2.0016(Y-8)的β-葡聚糖占酵母细胞比重为9.36％。突变菌株FFLM2.0016的生物量、细胞壁厚度及β-葡聚糖含量均比诱变前菌株Saccharomyces cerevisiae 2.0016(Y-8)显著增加，分别增加了57.70％、73.2％和169.6％。经过连续15次转接，所述突变菌株的生物量、β-葡聚糖含量稳定，未出现回复突变状况。

2、突变菌株FFLM2.0016的生理特性测定

突变菌株FFLM2.0016生长曲线测定方法如下：先将突变菌株FFLM2.0016接种于YEPD液体种子培养基中，28℃培养12h，然后取3ml种子培养液接种于YEPD液体发酵培养基中。前24h内，每隔2h测定菌株生物量与β-葡聚糖含量；24h-48h内，每隔4h测定菌株生物量与β-葡聚糖含量；48h-96h内，每隔6h测定菌株生物量与β-葡聚糖含量；96h-120h内，每隔8h测定菌株生物量与β-葡聚糖含量。

由突变菌株FFLM2.0016生长曲线(图1)测定得出，接种后所述突变菌株未经延迟期便迅速进入对数生长期，60h后，酵母菌的生长和β-葡聚糖生成量均进入稳定期。

突变菌株FFLM2.0016培养条件优化方法如下：先将突变菌株FFLM2.0016接种于YEPD液体种子培养基中，28℃培养12h后接种于YEPD液体发酵培养基。基础培养条件为温度28℃、接种量3ml、起始pH值为4。按照实验设计的不同培养条件对基础培养条件做相应的改变，测定所得酵母生物量及β-葡聚糖含量。单因素实验设计如下：培养温度：26℃、28℃、30℃、32℃、34℃；接种量：1ml、2ml、3ml、4ml、5ml；起始pH值：3、4、5、6、7。在单因素实验结果的基础上，通过三因素、五水平正交实验得到该突变菌株FFLM2.0016的最佳培养条件为：温度32℃、pH值5、接种量5ml。

Claims (3)

1.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FFLM2.0016，其保藏号为CGMCCNo.3730。

2.权利要求1所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FFLM2.0016在制备β-葡聚糖中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)FFLM2.0016在32℃、pH为5的条件下进行培养。

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