CN101955891A - 一种可改善啤酒起泡性能的啤酒酵母工程菌及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种啤酒酵母工程菌，出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，该酿酒酵母染色体上的PEP4基因部分或全部被重组序列替换而破环，所述的重组序列包括β-葡聚糖酶基因表达单元。本发明啤酒酵母工程菌通过将外源β-葡聚糖酶基因表达单元通过同源重组技术将工业酿酒酵母染色体上PEP4基因的部分序列或全部序列替换，蛋白酶A活性显著降低，而能稳定表达β-葡聚糖酶。该构建的啤酒酵母工程菌不仅遗传稳定性良好，而且具有优于出发菌株的啤酒酿造品质，啤酒泡沫稳定性和β-葡聚糖降解率提高，啤酒过滤速度改善，而且生理性能和生化特性并无明显差异。

Description

一种可改善啤酒起泡性能的啤酒酵母工程菌及制备方法

技术领域

本发明涉及啤酒酿造技术领域，尤其涉及一种可改善啤酒起泡性能的啤酒酵母工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

酵母分泌的蛋白酶以及对泡沫的负面影响已经引起国内外许多研究者的研究兴趣，尤其在国内纯生啤酒超高速发展的情况下，残留在啤酒中的蛋白酶A(PrA)的活性问题更引起人们重视。

纯生啤酒由于其口味、营养等方面的优点已越来越受到消费者的青睐，啤酒泡沫稳定性是衡量啤酒质量的重要指标，但是目前纯生啤酒在贮存过程中，存在泡沫稳定性下降等问题，原因主要是由于纯生啤酒中残留的酵母蛋白酶A对啤酒泡沫蛋白的降解作用所致。

目前主要通过调整发酵工艺来改善啤酒泡沫性能，这些手段包括使用糖蛋白含量高的小麦辅料；调整制麦、糖化、麦汁过滤与煮沸工艺；控制发酵温度与贮酒条件；适当添加泡沫稳定剂或添加酵母PrA抑制剂。采取这些手段所要求的工艺条件较复杂，而添加剂又存在安全隐患，不为消费者接受，因此都不能从根本上提高啤酒泡沫性能。

β-葡聚糖的消极影响也是影响啤酒品质的重要因素，虽然制麦过程中麦芽会形成专一性降解β-葡聚糖的内β-1，3-1，4-葡聚糖酶，但这种内源性β-葡聚糖酶热稳定性差，其最适温度为40-45℃，55℃时即开始失活，在糖化温度(65℃)下5min酶活性仅存1％。而且我国大麦与国外优质大麦相比，β-葡聚糖含量高且内源性β-葡聚糖酶水平低，β-葡聚糖的消极作用更明显。

目前啤酒生产工业中主要通过培育低β-葡聚糖的大麦品种以及添加耐高温的外源性β-葡聚糖酶来消除或降低β-葡聚糖的影响。但即使培育出低β-葡聚糖的大麦品种作原料，在啤酒酿造时也仍然要添加外源性β-葡聚糖酶，因此并没有从根本上简化啤酒生产的操作工艺。

发明内容

本发明提供了一种啤酒酵母工程菌，利用该菌株进行啤酒发酵解决了传统酵母发酵制得的啤酒残留蛋白酶A对啤酒泡沫性能和高含量β-葡聚糖对啤酒过滤和稳定性带来不利影响的问题。

一种啤酒酵母工程菌，出发菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，该酿酒酵母染色体上的PEP4基因部分或全部被重组序列替换而破环，所述的重组序列包括β-葡聚糖酶基因表达单元。

所述的β-葡聚糖酶基因表达单元由依次连接的3-磷酸甘油酸激酶基因启动子序列(PGK1_P，Gebank登录号CAA42329)、信息素α-因子分泌信号序列(MFα1_S，Gebank登录号AAA18405)、β-葡聚糖酶基因序列(bglS，SEQ ID NO.3)和乙醇脱氢酶基因终止子序列(ADH1_T，Gebank登录号CAY86205)组成。

所述的重组序列包括来自质粒pUG6的卡拉霉素抗性基因序列(KanMX)。

所述的选用来自酿酒酵母的PGK1强启动子具有增强表达外源酶基因的特性，所选用的来自酿酒酵母的信息素α-因子分泌信号序列具有较好的引导外源酶基因在酵母细胞的分泌和表达的能力，而所选用的来自酿酒酵母的乙醇脱氢酶基因终止子序列具有优异的准确转录和翻译功能，上述的表达单元与酵母基因组的同源性可在一定程度上增加同源重组整合的机率，有助于PEP4基因的替换和β-葡聚糖酶基因的整合。而所采用的来自质粒PUG6的卡拉霉素抗性基因不仅具有作为筛选同源重组子的筛选标记，而且在分子重组酵母传代繁殖过程中具有自动丢失功能，以获得无抗性基因的分子重组酵母菌。

所述的蛋白酶A被替换序列是从第686个碱基到第1987个碱基的序列。

本发明将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)PRAD保藏在位于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2009年04月14日，保藏号为CGMCC No.3010。

上述保藏菌株的主要生理生化特征：细胞为椭圆形，短轴5～7微米，长轴7～9微米，短长轴之比为1∶1.2～1.3，细胞呈单个或成对排列，单个出芽为主，极少形成芽簇；菌落形态特征是菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐。生长最适pH为5.5。最适生长温度25-30℃。

本发明提供了一种上述啤酒酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤：在重组序列两端连接同源臂序列，转化到感受态出发菌株中进行同源重组得到。

连接重组序列上游的同源臂序列如SEQ NO.1所示。

连接重组序列下游的同源臂序列如SEQNO.2所示。

本发明又提供了上述啤酒酵母工程菌在制备纯生啤酒中的应用。

本发明啤酒酵母工程菌通过将外源枯草芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因表达单元通过同源重组技术将工业酿酒酵母染色体上PEP4基因的部分序列或全部序列替换，蛋白酶A活性显著降低，而能稳定表达β-葡聚糖酶。由于同源重组效率和亲缘性差异较大的外源基因在酿酒酵母中重组表达，因此给同源重组替换带来的是重组效率问题，而本发明设计的来自酿酒酵母的信号肽序列、强启动子序列和终止子序列可以高效实现外源β-葡聚糖酶基因序列在酿酒酵母中的重组表达。通过遗传稳定性和中试发酵试验证明，该构建的啤酒酵母工程菌不仅遗传稳定性良好，而且具有优于出发菌株的啤酒酿造品质，如啤酒泡沫稳定性提高，β-葡聚糖降解率提高，啤酒过滤速度改善，而且生理性能和生化特性并无明显差异。

附图说明

图1为片断PGK1_P、MFα1_S在质粒pUC18中的克隆，形成质粒pUC18-PM示意图；

图2为片断bglS、ADH1_T在质粒pUC18中的克隆，形成质粒pUC18-BT示意图；

图3为bglS基因表达单元PGK1_P-MFα1_S-bglS-ADH1_T的形成示意图；

图4为bglS基因表达单元与KanMX连接形成质粒pUC18-KPMBT示意图；

图5为重组质粒YEPlac181-KPMBT PCR的扩增鉴定凝胶电泳图谱；

图6为重组质粒YEPlac181-KPMBT的双酶切鉴定凝胶电泳图谱，泳道1为Sma I+EcoR I双酶切结果，泳道2为BamH I+EcoR I双酶切结果；

图7为PCR扩增到的用来转化并替换PEP4的片断的凝胶电泳图谱(3732bp，1-8为平行扩增)；

图8为重组酿酒酵母菌PRAD的PCR鉴定凝胶电泳图谱(1.PEP4-P1+KanMX-P2产物；2.bglS-P1+PEP4-P2产物；3.PEP4-P1+PEP4-P2产物)；

图9为重组酿酒酵母菌PRAD的遗传稳定性PCR检测凝胶电泳图谱，泳道1-4模板分别为重组酿酒酵母RPPD、WZ65以及第十代重组酿酒酵母PRAD。

具体实施方式

1、出发菌株

选用工业酿酒酵母WZ65(温州英博双鹿啤酒有限公司)作为出发菌株，经过刚果红-β-葡聚糖选择性平板检验和液体发酵监测，证明该酿酒酵母不表达β-葡聚糖酶活，同时该工业酵母经过染色体分离和孢子分离试验，证明其为二倍体。

2、bglS同源重组表达质粒载体Yeplac181-KPMBT的构建及其酶切验证

2.1、同源重组各表达单元的克隆获得

(1)bglS基因的获得及其验证

提取枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)ZJF-1A5(Construction ofrecombinantindustrial Saccharomyces cerevisiae strain with bglS gene insertion into PEP4locus by homologous recombination.Journal of Zhejiang University Science B，2008，9(7)：527-535)的基因组为模板，设计下列引物：bgls-P₁：GGAAGCTTCGGCTCAAACAGGTGGATCGTTTTTTG，引入HindIII位；bgls-P₂：GGGGTACCGCATTATTTTTTTGTATAGCGCACCC，引入KpnI位点；PCR扩增该枯草芽孢杆菌中bglS基因，该菌株中的bglS基因总长度为729bp，如SEQ ID NO.3所示，其中前84bp为其信号肽编码序列，信号肽断裂位点发生在丙氨酸(28)处，本实施例删掉编码β-葡聚糖酶信号肽前26个氨基酸的78bp碱基，最终序列如SEQ ID NO.4所示，该序列也可人工合成。

PCR扩增β-葡聚糖酶基因序列，PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃45s，50℃45s，72℃1min，30循环；最后72℃延伸10min。1％的琼脂糖电泳显示扩增得到了650bp左右基因片断，与设计结果相符。

(2)PGK1_P的扩增及其获得

提取工业酿酒酵母WZ65基因组为模板，设计以下引物对：

PGK 1_P-P 1：CC/GGATCC/CATATG/CTTCAACTCAAGACGCACAG上游加BamH I和NdeI；

PGK 1_P-P2：GG/TCTAGA/TGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG下游加Xba I。

扩增PGK1_P，PCR条件为：94℃变性5min；94℃45s，50℃45s，72℃1min，30循环；最后72℃延伸10min。大小与预期结果相符(778bp)。

(3)MFα1_S的扩增及其获得

提取酿酒酵母WZ65基因组为模板，设计下列引物：

MFα1_S-P1：G/TCTAGA/AGAATGAGATTTCCTTC，引入XbaI位点；

MFαl _S-P2：GGCC/AAGCTT/CAGCCTCTCTTTTATC引入HindIII位点；

扩增MFα1_S片断，扩增条件为94℃变性5min；94℃45s，50℃45s，72℃30s，30循环；最后72℃延伸10min。大小为273bp，电泳结果显示跟设计相符。

(4)ADH1_T的扩增及其获得

以工业酿酒酵母WZ65的基因组为模板，设计引物对：

ADH1_T-P1：GG/GGTACC/GCGAATTTCTTATG，引入Kpn I位点；

ADH 1_T-P2：GG/GAATTC/GCATATCTACAATTGGG，引入EcoR I位点；

扩增ADH1_T终止子片断，条件为：94℃变性5min；94℃45s，50℃45s，72℃30sec，30循环；最后72℃延伸10min。电泳显示扩增得到250bp左右的基因片断，与理论值相符。

(5)KanMX的扩增及其获得

以质粒pUG6为模板，设计引物对：

KanMX-P1：GGGGATCCCAGCTGAAGCTTCGTACGC，引入酶切位点BamHI；

KanMX-P2：CCCCCGGGGCATAGGCCACTAGTGGATCTG，引入酶切位点Sma I。

扩增KanMX片断，条件为：94℃变性5min；94℃45s，58℃45s，72℃90s，30循环；最后72℃延伸10min。

2.2、同源重组表达单元的构建及其验证

以质粒pUC18为克隆载体，按照pUC18以及设计的引物上的酶切位点，将各片断分步双酶切后连接进行克隆，最终在pUC18上连接成bgls基因在酿酒酵母中的表达单元：PGK1_P-MFα1_S-bglS-ADH1_T。

每一次连接的程序为：

酶切10h后凝胶电泳回收；另一酶酶切10h后凝胶电泳回收；按载体∶片断＝1∶5连接过夜后转化大肠杆菌感受态；涂加氨苄的LB平板后37℃培养16h；挑取平板上生长出的菌落到5mL加氨苄的LB液体培养基，200rpm 37℃水浴振荡培养12h后提质粒；对提取的质粒进行琼脂糖电泳比对大小，然后进行PCR及双酶切鉴定。

(1)片断PGK1_P、MFα1_S在质粒pUC18中的克隆

如图1所示，用BamH I和Xba I分步酶切质粒pUC18和片断PGK1_P，连接形成质粒pUC 18-P；对质粒pUC 18-P以及MFα1_S进行Xba I和HindIII分步双酶切后连接形成质粒pUC18-PM。

(2)片断bglS、ADH1_T在质粒pUC18中的克隆

如图2所示，HindIII、Kpn I分步双酶切质粒pUC18和片断bglS，连接形成质粒pUC18-B；Kpn I、EcoR I分步双酶切质粒pUC18-B和终止子片断ADH1_T，连接形成质粒pUC18-BT。

(3)bglS基因表达单元PGK1_P-MFα1_S-bglS-ADH1_T的形成

如图3所示，Nde I、HindIII双切质粒pUC18-PM后回收小片断，跟Nde I、HindIII双切pUC18-BT后的大片断相连，形成质粒pUC18-PMBT1，质粒含方向一致的表达单元片断PGK1_P-MFα1_S-bglS-ADH1_T。

(4)bglS基因表达单元与KanMX的连接

以构建的重组质粒pUC18-PMBT1为模板，设计引物(EX-P1、EX-P2，分别位于重组质粒PUC18-PMBT1中的bglS基因表达单元的PGK1启动子上游和ADH1终止子下游)：

EX-P1：CCCCCGGGCTTCAACTCAAGACGCACAG，引入酶切位点Sma I；

EX-P2：GG/GAATTC/GCATATCTACAATTGGG，引入酶切位点EcoR I；

扩增上下游分别带有Sma I和EcoR I位点的bglS表达单元片断，经Sma I和EcoR I双酶切后与经同样双酶切的质粒pUC18连接，形成质粒pUC 18-PMBT。

以质粒pUG6为模板，设计引物：

KanMX-P1：GGGGATCCCAGCTGAAGCTTCGTACGC，引入酶切位点BamHI；

KanMX-P2：CCCCCGGGGCATAGGCCACTAGTGGATCTG，引入酶切位点Sma I，

扩增两端带有loxP位点的KanMX片断。经BamHI和Sma I双酶切后与同样双酶切(BamHI和SmaI)的质粒PUC18-PMBT相连，形成质粒pUC 18-KPMBT。

(5)bglS基因酿酒酵母表达载体的形成

将重组质粒pUC 18-KPMBT中的KanMX-PGK1_P-MFα1_S-bglS-ADH1_T片段用内切酶BamHI和EcoR I切下回收，然后与经同样双酶切的穿梭载体YEPlac181相连，形成bglS基因在酿酒酵母中的表达载体YEPlac181-KPMBT。

2.3重组表达质粒载体YEPlac181-KPMBT的PCR、酶切和酶表达验证

(1)PCR验证

以质粒YEPlac181-KPMBT为模板，分别用KanMX-P1+KanMX-P2、PGK1_P-P1+ADH1_T-P2、KanMX-P1+ADH1_T-P2进行PCR扩增KanMX、bglS表达单元、KanMX+bglS表达单元，结果如图5所示(理论值分别为1613、1976、3589bp)。

(2)双酶切验证

分别以Sma I+EcoR I、BamH I+EcoR I对重组质粒YEPlac181-KPMBT进行双酶切鉴定。酶切鉴定结果如图6所示，理论值分别为1976+7355bp，3589+5726bp，酶切鉴定结果与理论值相符。将构建好的重组质粒YEPlac181-KPMBT送上海生物工程技术有限公司测序，测序结果与设计一致。

(3)表达单元的转化及其酶活验证

提取重组质粒YEPlac181-KPMBT，转化酿酒酵母，然后涂布含200μg/mL的YEPD平板。60h后随机挑取生长出的酵母菌落进行保存，在原生长平板上缓慢倒入5mL琼脂-地衣多糖，30℃放置3h后染色，在酵母菌落的周围观察到明显的透明圈，随即挑取重组酵母菌在10mL YEPD培养基中200r/min、30℃培养24h，然后按1/100的接种量转接于100mL新的YEPD培养基中，相同条件培养，每隔8h取样测定酶活，培养的上清液为粗酶。结果显示，在转接后很长的一段时间内测不到酶活，测得的较明显的酶活是在转接后的36h开始，然后酶活迅速上升，60h时达到最高值最高，然后下降，72h后基本稳定。该步转化试验证明所构建的表达单元正确的表达了枯草芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因，并实现了正确的分泌表达，为下一步同源重组替换蛋白酶A基因提供了准确的表达单元。

3、同源重组表达单元替换酿酒酵母WZ65中PEP4基因构建获得酿酒酵母工程菌株PRAD及验证

3.1酿酒酵母PRAD的转化构建

以构建获得的同源重组质粒pUC18-KPMBT为模板，用a、b引物(见表1)进行PCR扩增，得到转化DNA片段。50μl反应体系中，加1μlpUC18-KPMBT，四种dNTP各200μM，引物各为0.2μM，1.2mM MgCl₂，10×PCR缓冲液5μl及2.5U的Taq DNA聚合酶。反应条件：94℃始变性5min；循环30个周期，每个周期为94℃变性40s，58℃退火1min，72℃延伸3min；最后72℃终延伸10min。

表1基因替换以及重组菌株检测中所采用的引物

PCR扩增产物经凝胶电泳显色如图7所示，PCR扩增到转化片断的大小为3679bp(3589bp为KanMX-PGK1_P-MFα1_S-bglS-ADH1_T，90bp为同源臂)。此片断的两端分别有与PEP4基因上下游同源的序列45bp(小写部分序列)，当此替换片断经电击转化进入酿酒酵母感受态细胞后，片段两端的PEP4同源区与PEP4基因发生重组而替换PEP4基因。所扩增的片段中包含KanMX表达盒，当扩增的片段与PEP4发生基因替换时，KanMX提供发生基因替换的菌株G418抗性。

扩增得到的PCR片断经乙醇沉淀，自然风干，溶解到少量无菌水中，取5μL片断电击转化酿酒酵母菌株WZ65感受态。转化后的菌体30℃孵育2h后于7000rpm离心3min，无菌水重悬后涂含200mg/L G418的YEPD平板。转化后的平板放置30℃培养箱60h、72h和84h后，在长出菌落平板上缓慢倒入0.5％的添加0.1％β-葡聚糖的琼脂，30℃放置3h后染色后的透明圈。

3.2重组酿酒酵母PRAD的验证

(a)重组菌的PCR扩增验证

用3对引物PEP4-P1+KanMX-P2、bglS-P1+PEP4-P2、PEP4-P1+PEP4-P2对有透明圈的且转移到新的平板上保存的重组菌株进行PCR鉴定。PEP4-P1引物位于PEP4基因上游266bp处，PEP4-P2引物位于PEP4基因下游321bp处，KanMX-P2引物位于转化片段中KanMX表达盒的下游，而bglS-P1引物为转化片段中bglS基因的上游引物。三组引物PCR扩增产物的理论值分别为：PEP4-P1+KanMX-P2为1914bp、bglS-P1+dPEP4-P2为1273bp、PEP4-P1+PEP4-P2为两条带1830bp和4166bp。

对2个筛选平板上得到的17个有透明圈的菌落进行PCR鉴定，其中有1株为整合位点正确且β-葡聚糖酶基因表达的酿酒酵母PRAD，扩增条带与理论值相同，其鉴定结果如图10所示。

将该菌株保藏于保藏在位于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2009年04月14日，保藏号为CGMCC No.3010。

(b)工程菌PRAD的遗传稳定性验证

对重组菌酿酒酵母RPPD第10代整合到染色体上PEP4位点的外源基因片段的稳定性进行PCR扩增鉴定，外源基因片段在酿酒酵母传代过程中表现出良好的遗传稳定性，传代过程中没有丢失。

分别以第一代酿酒酵母PRAD、工业酿酒酵母WZ65以及第十代酿酒酵母PRAD为模板，利用引物PEP4-PP1+KanMX-P2进行PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳，结果如图9所示，重组酿酒酵母PRAD的KanMX由于已丢失，只扩增到400bp的片段，而对照菌株WZ65没有产物。

以PGK1_P-P1+PEP4-P2为引物扩增整合到染色体上的bglS表达单元(理论值为2295bp)，在重组酿酒酵母PRAD以及出发菌株SC-βG(表达β-葡聚糖酶但未替换酿酒酵母蛋白酶A基因的菌株)中都能扩增到，而原始对照工业菌株没有产物。而以KanMX-P1+ADH1_T-P1为引物扩增KanMX上游到bglS表达单元的下游。以酿酒酵母PRAD基因组为模板扩增结果为2000bp大小的片段，理论值为2221bp，结果与理论值相符。而对照工业菌株WZ65中扩增不到产物。通过PCR扩增验证传代后整合到染色体上的外源基因片段没有丢失，外源基因稳定存在。

(c)工程菌PRAD的β-葡聚酶酶活检测验证

β-葡聚糖酶活检测方法：将0.8mL大麦β-葡聚糖溶液(30μg/mL)在40℃下预热10min，加入经过冷冻离心处理的发酵上清液(经过发酵培养48小时或72小时的发酵液经过10000r/min、4℃离心20分钟后，去掉细胞沉淀收集上清液)0.2mL，40℃反应30min，煮沸10min，冷却至室温。加1mL刚果红溶液(100μg/mL)，旋涡振荡后室温放置10min，测OD₅₄₀(Wood et al.，1988)。定义每毫升培养液中每小时使底物中大麦β-葡聚糖减少1μg的酶量为1个酶活力单位。

如表2所示，重组酿酒酵母PRAD第1代和第10代发酵过程中的在第3天的发酵液中都检测到较高β-葡聚糖酶活性。但是对照工业菌没有该酶表达。

表2重组菌与对照酵母菌β-葡聚糖酶活活性测定

(d)工程菌的低表达蛋白酶A活性验证

取25℃麦汁发酵放置20d后的发酵液，离心后上清作为粗酶液测蛋白酶A的活性。酶活测定方法：在酸性条件下，蛋白酶A水解酪蛋白，离心沉淀未水解的酪蛋白后用Lowry法测产生酪氨酸的量(郝欣等，2007；国标，SB/T 10317-1999；姜锡瑞，1999；王肇悦，2005)。

1％(w/v)酪蛋白(0.1M Gly-HCl配置，pH2.0)溶液1.9mL与0.1mL酶液(对照为2mLTCA和0.1mL酶液)于37℃保温30min，加10％三氯醋酸2mL(对照加1.9mL底物)继续置37℃下保温20min，取终止反应后的混合液2mL于14,000rpm下离心10min，上清用Lowry法测酪氨酸的含量：取1mL上清加5mL、0.4M Na₂CO₃振荡混匀，再加1mL Folin试剂，立刻振荡混匀。于40℃保温20min，测OD₆₆₀。1个酵母蛋白酶A活性单位定义为37℃、pH2.0条件下每min从底物中释放1μg酪氨酸需要的酶量。

对发酵后期酵母处于衰亡期大量裂解后的溶液中蛋白酶A活性进行测定，结果显示重组酿酒酵母PRAD中蛋白酶A的活性比出发菌株WZ65中低，主要由于蛋白酶A拷贝减少造成的，结果见表3。

表3重组菌PRAD与对照酵母菌WZ65蛋白酶A活性检测及其差异

4、工程菌株的发酵试验及发酵指标检测

对照工业酵母WZ65和酿酒酵母工程菌PRAD分别经过斜面活化后，首先接入10毫升的YPD液体中于28℃培养18小时，然后按照5％的接种量接种至70升的麦芽汁中(糖度为11°P)，10℃发酵培养12天，封罐，15天时转入0℃冷贮，第20天时进行过滤和罐装。比较2株酵母啤酒酿造中的常规生理指标，结果如表4所示。

表4重组酵母PRAD和对照工业酵母WZ65啤酒发酵生理指标比较

其中蛋白酶A活性在后期检测可以看出，酿酒酵母工程菌PRAD具有相当低的蛋白酶A活性残留，要远远低于对照酵母WZ65(超过50％)。

(1)啤酒过滤性检测

按照Esser报道(Attempt to critically evaluate methods of predicting beerfilterability.Brauwelt 1996，11，120-124.)的方法检测，结果如表5所示，工程酵母的啤酒过滤速度要远远优于对照酵母WZ65的啤酒过滤速度，工程酵母的降解率要远远大于对照酵母对β-葡聚糖降解分解。

表5啤酒过滤性能试验结果

(2)啤酒起泡性能检测

将不同温度下存放的啤酒均置于20℃水浴恒温30min后，用Hufman泡沫测定仪(NTBEM法)测泡持时间。工程菌PRAD酿制的啤酒泡持时间为278秒，比对照工业酵母WZ65酿制的啤酒泡沫泡持时间延长近80秒，说明工程酵母酿制的啤酒起泡性能优于对照工业酵母。

(3)各指标检测方法

双乙酰含量测定方法：啤酒中双乙酰含量采用国标法(GB4928-91)中使用的是EBC法即邻苯二胺(OPD)法。该法多年来在指导啤酒生产控制啤酒产品质量方面起到了非常重要的作用，是一种成熟的测定双乙酰含量的方法。

其操作过程为：将双乙酰蒸馏器装好，加热蒸汽发生瓶，通汽预热后，置25mL容量瓶于冷凝器下端，并放入冰水浴中；向100mL量筒中加1～2滴消泡剂，再注入未经除气且品温在5℃左右的酒样100mL，迅速加入已预热的蒸馏器内，用少量水冲洗带塞漏斗、盖塞，用水封口进行蒸馏，直至蒸馏液近25mL(蒸馏须在3min内完成)，取下容量瓶，用水定容至刻度，摇匀；分别取馏出液10.0mL于2支比色管中，在第1支管中加人0.5mL邻苯二胺溶液，第2支管中不加，摇匀放置于暗处。20～30min后，在第1支管中加入4mol/L的盐酸溶液2mL，在第2支管中加4mol/L的盐酸溶液2.5mL，摇匀。以第2支管中溶液作参比液，于335nm波长下用20mL比色皿测得第1支管溶液的吸光度。

将上述测得的样品吸光度带入公式：

双乙酰(L)＝A335×1.2

式中：A335——在335nm下，用20mm比色皿测定的吸光度；1.2——吸光度与双乙酰含量的换算系数；

啤酒总酸的试验方法：吸取50.00mL酒样于100mL烧杯中，置于40℃水浴中保温30min，并不时振摇，以除去残余的二氧化碳，然后冷却至室温。将事先用pH9.22标准缓冲溶液校准过的玻璃电极和甘汞电极插人样品杯中，在电磁搅拌器搅拌下用氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.0，记录氢氧化钠标准溶液的用量。计算公式为：

X＝2×c×V

式中：X-总酸的含量，即100mL样品消耗氢氧化钠标准溶液(c(NaOH)＝1mol/L〕的毫升数，mL/100mL；

c-氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；

V-消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；

2-换算成100mL酒样的系数。

酵母凝聚力试验：采用本斯试验法，称取1.0g经洗涤离心的酵母试样于刻度离心管中，用10mLpH4.5的醋酸缓冲液(5.1g水和硫酸钙加6.8g硫酸钠，4.05g冰醋酸于1L水中，pH 4.5)使酵母充分悬浮。置于20℃水浴中保持20min，将悬浮液连续摇动5min，使酵母重新悬浮、静置，10min时的沉淀量为本斯值。

发酵速率和发酵度测定方法：发酵过程中每24h测定失重，至日失重小于0.5g发酵结束，以日平均失重表示发酵速率。

外观发酵度测定：直接测定20℃时发酵液的比重，按下式计算外观发酵度。

Wa(％)＝(W-W2)×100/W

式中：W2发酵液外观浓度、Wa外观发酵度

真正发酵度测定(国标：GBT-4928-2001)按下式计算：

真正发酵度RDF＝100×(Y-Z)/Y×1/(1-0.005161×Z)

式中RDF-试样中的真正发酵度，％；

Y-试样的原麦汁浓度，^OP[％(m/m)]

Z-试样的真正浓度，^OP[％(m/m)]

0.005161-常数用于校正由于发酵中二氧化碳挥发和酵母吸收而造成质量损失。

工程酵母PRAD和工业对照酵母WZ65之间主要的发酵指标没有区别，这意味着酵母染色体上的整合和敲除并没有改变酵母的其它特性。

Claims (9)

1.一种啤酒酵母工程菌，出发菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，该酿酒酵母染色体上的PEP4基因部分或全部被重组序列替换而破环，其特征在于：所述的重组序列包括β-葡聚糖酶基因表达单元。

2.根据权利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于：所述的β-葡聚糖酶基因表达单元由依次连接的3-磷酸甘油酸激酶基因启动子序列、信息素α-因子分泌信号序列、β-葡聚糖酶基因序列和乙醇脱氢酶基因终止子序列组成。

3.根据权利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于：所述的重组序列包括卡拉霉素抗性基因序列。

4.根据权利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于：所述的PEP4基因被替换的部分为第686个碱基到第1987个碱基的序列。

5.根据权利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于：命名为酿酒酵母PRAD，保藏号为CGMCC No.3010。

6.权利要求1～5任一所述的啤酒酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤：在重组序列两端连接同源臂序列，转化到感受态出发菌株中进行同源重组得到。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：连接重组序列上游的同源臂序列如SEQ ID NO.1所示。

8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：连接重组序列下游的同源臂序列如SEQ ID NO.2所示。

9.权利要求1～5任一所述的啤酒酵母工程菌在制备纯生啤酒中的应用。

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