ES2776361T3 - Cepas de microorganismo para la producción de 2,3-butanodiol - Google Patents
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Abstract
Una levadura recombinante que tiene una actividad piruvato descarboxilasa reducida, en cuyo genoma se ha insertado: - uno o más ácidos nucleicos que codifican una acetolactato sintasa o ALS, - uno o más ácidos nucleicos que codifican una acetolactato descarboxilasa o ALD, - uno o más ácidos nucleicos que codifican una butanodiol deshidrogenasa o BDH, y - una o más copias de unos ácidos nucleicos que codifican una NADH oxidasa o NOXE, Codificando dicha uno o más copias de unos ácidos nucleicos una NADH oxidasa o NOXE que se selecciona del grupo que consiste en secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos 78%, preferiblemente al menos 80%, de identidad de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:23 que presenta la actividad biológica deseada, y Dicha actividad piruvato descarboxilasa se reduce mediante (i) alteración de al menos un gen que codifica una piruvato descarboxilasa insertando en dicho al menos un gen que codifica una piruvato descarboxilasa al menos un constructo de ADN exógeno, (ii) mutaciones en regiones reguladoras, (iii) mutaciones en un codón de partida, principalmente sustituyendo AUG por GUG, (iv) mutaciones en secuencias de codificación que alteran la actividad enzimática (v) mutaciones, inserciones o supresión en la secuencia de codificación que altera la estabilidad de la proteína y (vi) mutaciones que alteran la vida media de ARNm de piruvato descarboxilasa.
Description
DESCRIPCIÓN
Cepas de microorganismo para la producción de 2,3-butanodiol
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una levadura recombinante que tiene una actividad piruvato descarboxilasa reducida. La levadura recombinante se modifica para mejorar la producción de 2,3-butanodiol en comparación con la levadura no modificada. La invención también proporciona métodos para usar dicho microorganismo para producir 2,3-butanodiol.
Antecedentes
2-3-Butanodiol (2,3-BDO) es un compuesto químico base multi-funcional que puede usarse para producir otros compuestos químicos a granel y sintetizar productos diversos, tales como fármacos, cosméticos y disolventes industriales (Celinska y Grajek, 2009; Syu, 2001).
Más particularmente, 2,3-BDO pueden usarse en considerables aplicaciones industriales en mercados importantes, como se resume a continuación en la presente memoria.
Dos de las aplicaciones más interesantes de 2,3-BDO son la metiletilcetona (disolvente MEK) y el butadieno (BDE), un monómero principal en la fabricación de caucho sintético y neumáticos.
La síntesis química tradicional de 2,3-BDO se enfrenta al inconveniente de la deficiencia de petróleo y la contaminación ambiental, mientras que la fabricación de 2,3-BDO está actualmente creciendo aún a una velocidad anual de 4-7% (Jiayang et al., 2006).
Muchos compuestos químicos que podrían producirse solo mediante procesos químicos tradicionales en el pasado pueden ahora tener el potencial de generarse biológicamente, usando fuentes renovables (Danner y Braun, 1999; Hatti-Kaul et al., 2007). La producción microbiana de 2,3-BDO es uno de dichos ejemplos. El interés en este bioproceso ha aumentado notablemente porque 2,3-BDO tiene un gran número de aplicaciones industriales, como se menciona anteriormente, y la producción microbiana aliviará la dependencia del suministro de petróleo para la producción de compuestos químicos base (Celmska y Grajek, 2009; Wu et al., 2008). Saccharomyces cerevisiae es una base especialmente bien adaptada para dichos bioprocesos (Nielsen et al., 2013).
Sin embargo, en este momento, el 2,3-BDO producido mediante procesos microbianos es un compuesto raramente usado a escala industrial, debido a sus altos costes de producción notablemente unidos a pobre rendimiento de producción. La industria química usa de hecho preferentemente otros compuestos químicos C4, tal como 1,4-BDO y ácido succínico.
Con respecto a la producción microbiana de 2,3-BDO, la mayoría de estudios usaron bacterias, tales como Klebsiella pneumonía, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes y Paenibacillus polymyxa para producir 2,3-BDO (Cho et al., 2012; Han et al., 2013; Hassler et al., 2012; Jung et al., 2012). Aunque estas bacterias son capaces de producir 2,3-BDO con altos rendimientos y productividades, se clasifican sin embargo como bacterias patógenas de manera que la fermentación a gran escala sería difícil en términos de seguridad e industrialización (Celinska y Grajek, 2009).
La producción de 2,3-BDO mediante un microorganismo GRAS (es decir generalmente reconocido como seguro) sería por consiguiente deseable. La levadura, y más particularmente Saccharomyces cerevisiae, es un
microorganismo apropiado en este contexto. S. cerevisiae se conoce por producir 2,3-BDO de forma natural, pero el rendimiento y la productividad de la producción de 2,3-BDO son pobres. La producción de etanol es ciertamente la barrera más obvia para la producción eficiente de 2,3-BDO en S. cerevisiae porque el piruvato, un intermedio clave, se usa preferentemente para producir etanol más que 2,3-BDO.
Para minimizar la producción de etanol y maximizar la producción de 2,3-BDO, se ha utilizado un mutante deficiente en piruvato descarboxilasa (Pdc) para la producción de 2,3-BDO. Sin embargo, las cepas deficientes de Pdc tienen defectos potenciales para las fermentaciones industriales (Flikweert et al., FEMS Microbiology Letters 174, 199973 79).
Los documentos WO 2013/076144, WO 2011/040901 y US 2011/0124060 describe el microorganismo que no se da de forma natural que tiene una ruta de 2,3-BDO mejorada. Alterándose las rutas de producción de etanol y acetato, los documentos US 2011/0124060 y WO 2013/076144 describen que lleva a un estado redox desequilibrado a lo que la solución propuesta consiste en aumentar la actividad de una enzima dependiente de NADH y, posiblemente, la acumulación de NAD+.
El documento WO 2011/041426 describe una célula de levadura recombinante para la disponibilidad aumentada de piruvato y la represión de glucosa reducida permite la producción aumentada de producto partiendo de piruvato tal como 2,3-butananodiol. Sin embargo, la cepa no expresa una enzima dependiente de NADH de equilibrio redox específica.
En Soo-Jung Kim et al. (Bioresource Technology 146 (2013) 274-281) se construyó una cepa deficiente en Pdc y evolucionó para el cultivo en glucosa. La cepa deficiente en Pdc evolucionada se genotificó para identificar los cambios genéticos necesarios que permiten a la cepa deficiente en Pdc cultivarse en alta concentración de glucosa. Sin embargo, estas cepas crecen lentamente se comparan a cepas que han retenido alguna actividad pdc. Posteriormente, la ruta biosintética de 2,3-BDO a partir de Bacillus subtilis se introdujo en la cepa deficiente en Pdc evolucionada para producir 2,3-BDO a partir de glucosa de forma eficiente en S. cerevisiae. Esta cepa se presenta como que produce 96,2 g/L después de 244 h de cultivo, con un rendimiento de 2,3-BDO (0,28 g de 2,3-BDO/g de glucosa) y productividad volumétrica (0,39 g de 2,3-BDO/Lh-1). Sin embargo, este rendimiento de 2,3-BDO no parece apropiado para ser económicamente viable desde un punto de vista industrial.
Por lo tanto, por razones obvias, para mejorar la producción de 2,3-BDO a través de procesos microbianos, y más particularmente de la conversión de piruvato a 2,3-BDO, sigue estando un objetivo constante. Más particularmente, hay aún una necesidad de un microorganismo recombinante estable que tenga un rendimiento de producción mejorado de 2,3-butanodiol, en particular compatible con los requisitos de la industrialización.
Compendio
La presente invención se refiere a una levadura recombinante que tiene una actividad de piruvato descarboxilasa reducida, en cuyo genoma se ha insertado:
- uno o más ácidos nucleicos que codifican una acetolactato sintasa o ALS,
- uno o más ácidos nucleicos que codifican una acetolactato descarboxilasa o ALD,
- uno o más ácidos nucleicos que codifican una butanodiol deshidrogenasa o BDH, y
- una o más copias de unos ácidos nucleicos que codifican una NADH oxidasa o NOXE,
Seleccionándose dichas una o más copias de unos ácidos nucleicos que codifican una NADH oxidasa o NOXE del grupo que consiste en secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos 78%, preferiblemente al menos 80%, de identidad de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:23 que representa la actividad biológica deseada, y
Dicha actividad de piruvato descarboxilasa se reduce mediante (i) la alteración de al menos un gen que codifica una piruvato descarboxilasa insertando en dicho al menos un gen que codifica una piruvato descarboxilasa al menos un constructo de ADN exógeno, (ii) mutaciones en regiones reguladoras, (iii) mutaciones en un codón de partida, principalmente sustituyendo AUG por GUG, (iv) mutaciones en secuencias de codificación que alteran la actividad enzimática (v) mutaciones, inserciones o supresión en la secuencia de codificación que altera la estabilidad de la proteína y (vi) mutaciones que alteran la vida media del ARNm de la piruvato descarboxilasa.
Según una realización particular, la levadura recombinante según la presente descripción puede comprender uno o más constructos de ADN seleccionados en un grupo que comprende las siguientes fórmulas:
(I) 5’-[Gen 1]x1-3’ y 5’-[Gen 2]x2-3’ y 5’-[Gen 3]x3-3’ y 5’-[Gen 4]x4-3’,
(II) 5’-[Gen 1]x1-[Gen 2]x2-[Gen 3]xa-3’ y 5’-[Gen 4]x4-3’,
(III) 5’-[Gen 1]x i-[Gen 2]x2-3’ y 5’-[Gen 3]x3-[Gen 4]x4-3’,
(IV) 5’-[Gen 1]x i-[Gen 2]x2-[Gen 3]x3-[Gen 4]x4-3’, y
Una combinación de las mismas,
En las que:
- “Gen 1” significa un ácido nucleico seleccionado de un grupo que comprende ALS, ALD, BDH o NOXE;
- “Gen 2” significa un ácido nucleico seleccionado de un grupo que comprende ALS, ALD, BDH o NOXE pero diferente del gen 1;
- “Gen 3” significa un ácido nucleico seleccionado de un grupo que comprende ALS, ALD, BDH o NOXE pero diferente de los genes 1 y 2;
- “Gen 4” significa un ácido nucleico seleccionado de un grupo que comprende ALS, ALD, BDH o NOXE pero diferente de los genes 1 a 3;
- “ALS” es un ácido nucleico que codifica una acetolactato sintasa;
- “ALD” es un ácido nucleico que codifica una acetolactato descarboxilasa;
- “BDH” es un ácido nucleico que codifica una butanodiol deshidrogenasa;
- “NOXE” es un ácido nucleico que codifica una NADH oxidasa;
- cada uno de “x1”, “x2”, “x3” y “x4”, uno independientemente de los demás, representa un número entero que oscila de 0 a 50, preferiblemente de 0 a 20, lo más preferiblemente uno, y
Con tal que dicha levadura recombinante comprenda al menos un ácido nucleico que codifique para cada uno de ALS, ALD, BDH y NOXE.
Preferiblemente, cada uno entre “x1”, “x2”, “x3” y “x4”, independientemente los unos de los otros, representa un número entero que oscila de 0 a 10, más particularmente que oscila de 0 a 5, en particular que oscila de 0 a 3, y aún mejor representa un número entero igual a 1.
Según otra realización particular, la levadura recombinante según la presente descripción puede comprender al menos uno, preferiblemente al menos dos, constructo(s) de ADN de fórmula (II) mencionada anteriormente, idénticos o diferentes, en los que “Gen 4” significa un ácido nucleico que codifica NADH oxidasa.
Según aún otra realización particular, la levadura recombinante según la presente descripción puede comprender al menos uno, preferiblemente al menos dos, constructo(s) de ADN de fórmula (IIa), idénticos o diferentes, en los que cada fórmula (IIa) tiene la siguiente fórmula:
(IIa) 5’-[(prom5)y1-Gen 1-term5]x5-[prom1-Gen 1-term1]x1-[prom2-Gen 2-term2]x2-[prom3-Gen 3-(term3)z1]x3-3’ y 5’-[(prom4)y2-Gen 4-(term4)z2]x4-3’,
En la que:
- Gen 1, Gen 2, Gen 3, Gen 4, “x1 ”, “x2”, “x3” y “x4” son tal como se definen anteriormente;
- “x5” representa un número entero igual a 0 o 1;
- “y1”, “y2”, “z1” y “z2”, uno independientemente de los otros, representan un número entero igual a 0 o 1;
- cuando dicha levadura recombinante comprende al menos dos constructos de ADN de fórmula (IIa), entonces “x1” a “x5”, “y1”, “y2”, “z1” y “z2” pueden ser idénticos o diferentes;
- “prom 1” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica el gen 1; - “prom 2” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica el gen 2; - “prom 3” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica el gen 3; - “prom 4” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica el gen 4; - “prom 5” es una secuencia reguladora que controla la expresión del Gen 1, siendo dicha prom5 idéntica o diferente de prom1;
- “term l” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica el gen 1;
- “term2” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica el gen 2;
- “term3” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica el gen 3;
- “term4” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica el gen 4; y
- “term5” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión del Gen 1, siendo dicho term5 idéntico o diferente de term1.
Según otra realización particular, la levadura recombinante según la presente descripción puede comprender al menos uno, preferiblemente al menos dos, constructo(s) de ADN de fórmula (IIb), idénticos o diferentes, en los que cada fórmula (IIb) tiene la siguiente fórmula:
(IIb) 5’-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-term2]x2-[prom3-BDH-(term3)z1]x3-3’ y 5’-[(prom4)y2-NOXE-(term4)z2]x4-3’
En la que:
- ALS, ALD, BDH, NOXE, “x1”, “x2”, “x3”, “x4”, “x5”, “y1”, “y2”, “z1” y “z2” son tal como se definen anteriormente; - cuando dicha levadura recombinante comprende al menos dos constructos de ADN de fórmula (IIb), entonces “x1” a “x5”, “y1”, “y2”, “z1” y “z2” pueden ser idénticos o diferentes;
- “prom 1” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato sintasa;
- “prom 2” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato descarboxilasa;
- “prom 3” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica la butanodiol deshidrogenasa;
- “prom 4” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica la NADH oxidasa; - “prom 5” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato sintasa, siendo dicha prom5 idéntica o diferente de prom1;
- “term1” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato sintasa;
- “term2” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato descarboxilasa;
- “term3” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica la butanodiol deshidrogenasa;
- “term4” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica la NADH oxidasa; y
- “term5” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato sintasa, siendo dicha term5 idéntica o diferente de term1.
Según otra realización particular, la levadura recombinante según la presente descripción puede comprender al menos dos constructos de ADN de fórmula (II), (IIa) o (IIb), con tal que todas las copias de ácido nucleico de NOXE estén situadas en uno solo de al menos dos constructos de ADN de fórmula (II), (IIa) o (IIb).
Según otra realización particular, la levadura recombinante según la presente descripción puede comprender al menos dos, preferiblemente estrictamente dos, constructos de ADN de las siguientes fórmulas (IIc) y (IId):
(IIc) 5’-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-term2]x2-[prom3-BDH-(term3)z1]x3-3’ y 5’-[(prom4)y2-N0XE-(term4)z2]x6-3’; y
(IId) 5’-[(prom5)y i-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x i-[prom2-ALD-term2]x2-[prom3-BDH-(term3)z i]x3-3’ y 5’-[(prom4)y2-NOXE-(term4)z2]x7-3’; y
En las que:
- ALS, ALD, BDH, NOXE, “prom1”, “prom2”, “prom3”, “prom4”, “prom5”, “term1”, “term2”, “term3”, “term4”, “term5”, “x1 ”, “x2”, “x3”, “x5”, “y1 ”, “y2”, “z1” y “z2” son como se definen anteriormente;
- siendo “x1” a “x3” para cada fórmula (IIc) y (IId) idénticos o diferentes;
- siendo “x1” a “x3”, “x5”, “y1 ”, “y2”, “z1” y “z2” para cada fórmula (IIc) y (IId) idénticos o diferentes; y
- “x6” y “x7” representan números enteros que oscilan de 0 a 50, preferiblemente de 0 a 20, preferiblemente de 0 a 12, más particularmente de 2 a 5, preferiblemente de 3 a 4, y mejor aún igual a 3, con tal que solo uno entre “x6” y “x7” represente 0.
La presente invención también está relacionada con un uso de una levadura recombinante según la presente invención, para la producción de 2,3-butanodiol (BDO) y/o derivados directos del mismo.
En particular, dichos derivados directos de 2,3-butanodiol (BDO) pueden seleccionarse del grupo que consiste en butanodieno (BDE), metiletilcetona (MEK) o una mezcla de los mismos.
La presente invención también se refiere a un método para producir 2,3-butanodiol (BDO), comprendiendo dicho método las etapas de:
(a) cultivar una levadura recombinante según la presente invención en un medio de cultivo apropiado; y
(c) recuperar el 2,3-butanodiol (BDO).
Preferiblemente, el medio de cultivo dicho comprende una fuente de carbono, preferiblemente seleccionada de un grupo que comprende glucosa y sacarosa.
Descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la ruta metabólica en una cepa de levadura recombinante para así sustituir la producción de etanol a favor de 2,3-BDO.
Descripción detallada
Definiciones
Los términos 2,3-butanodiol, 2,3-BDO o BDO se usan de forma intercambiable en la presente descripción y se refieren a butano-2,3-diol, también denominado dimetilenglicol.
El término “microorganismo”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una levadura que no está modificada artificialmente. El microorganismo puede ser “dador” si proporciona elemento genético para integrarse en el microorganismo “aceptor” que expresará este elemento genético extraño o si se usa como herramienta para construcciones genéticas o expresiones de proteína. El microorganismo de la invención se elige entre levadura que expresa genes para la biosíntesis de 2,3-butanodiol.
El término “microorganismo recombinante” o “microorganismo modificado genéticamente” o “levadura recombinante” o “levadura modificada genéticamente”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una levadura modificada genéticamente o diseñada genéticamente. Esto significa, según el significado normal de estos términos, que el microorganismo de la invención no se encuentra en la naturaleza y se modifica o por introducción o por supresión o por modificación de elementos genéticos procedentes del microorganismo equivalente encontrado en la naturaleza. Puede también modificarse forzando el desarrollo y evolución de nuevas rutas metabólicas combinando la mutagénesis dirigida y la evolución bajo presión de selección específica (véase por ejemplo el documento WO 2004/076659).
Un microorganismo puede modificarse para expresar genes exógenos si estos genes se introducen en el microorganismo con todos los elementos que permiten su expresión en el microorganismo huésped. Un microorganismo puede modificarse para modular el nivel de expresión de un gen endógeno. La modificación o “transformación” del microorganismo, como la levadura, con ADN exógeno es una tarea rutinaria para los expertos en la técnica. En particular, una modificación genética de un microorganismo según la invención, más particularmente la(s) modificación(ones) genética(s) definida(s) en la presente memoria, puede(n) realizarse usando sistemas CRISPR-Cas, como se describe en DiCarlo et al. (Nucl. Acids Res., vol. 41, núm. 7, 2013:4336-4343).
El término “gen endógeno” significa que el gen estaba presente en el microorganismo antes de cualquier modificación genética, en la cepa de tipo salvaje. Los genes endógenos pueden sobreexpresarse introduciendo
secuencias heterólogas además de, o para sustituir elementos reguladores endógenos, o introduciendo una o más copias suplementarias del gen en el cromosoma o un plásmido. Los genes endógenos también pueden modificarse para modular su expresión y/o actividad. Por ejemplo, las mutaciones pueden introducirse en la secuencia de codificación para modificar el producto génico o pueden introducirse secuencias heterólogas además de o para sustituir elementos reguladores endógenos. La modulación de un gen endógeno puede dar por resultado la sobre regulación y/o mejora de la actividad del producto génico, o de forma alternativa, la bajo-regulación y/o atenuación de la actividad del producto génico endógeno. Otra forma para mejorar la expresión de genes endógenos es introducir una o más copias suplementarias del gen en el cromosoma o un plásmido.
El término “gen exógeno” significa que el gen se introdujo en un microorganismo, por medios bien conocidos por el experto en la técnica, mientras que este gen no se da de forma natural en el microorganismo de tipo salvaje. El microorganismo puede expresar genes exógenos si estos genes se introducen en el microorganismo con todos los elementos que permiten su expresión en el microorganismo huésped. Transformar microorganismos con ADN exógeno es una tarea rutinaria para el experto en la técnica. Los genes exógenos pueden integrarse en el cromosoma huésped, o expresarse de forma extra-cromosómica a partir de plásmidos o vectores. Una variedad de plásmidos, que difieren con respecto a su origen de replicación y su número de copias en la célula, se conocen todos en la técnica. La secuencia de genes exógenos puede adaptarse para su expresión en el microorganismo huésped. De hecho, el experto en la técnica conoce la noción de sesgo en el uso de codones y como adaptar las secuencias nucleicas para un sesgo en el uso de codones particular sin modificar la proteína deducida.
El término “gen heterólogo” significa que el gen se deriva de una especie de microorganismo diferente del microorganismo receptor que lo expresa. Se refiere a un gen que no se da de forma natural en el microorganismo. En la presente solicitud, todos los genes se referencian con sus nombres comunes y con referencias a sus secuencias de ácido nucleico y, si surge el caso, a sus secuencias de aminoácido. Usando las referencias dadas en el número de acceso para genes conocidos, los expertos en la técnica son capaces de determinar los genes equivalentes en otros organismos, cepas bacterianas, levadura, hongos, mamíferos, plantas, etc. Este trabajo rutinario se hace ventajosamente usando secuencias de consenso que pueden determinarse llevando a cabo alineamientos de secuencia con genes derivados de otros microorganismos y diseñando sondas degeneradas para clonar el gen correspondiente en otro organismo.
El experto en la técnica conoce medios diferentes para modular, y en particular sobre-regular o bajo-regular, la expresión de genes endógenos. Por ejemplo, una forma para mejorar la expresión de genes endógenos es introducir una o más copias suplementarias del gen en el cromosoma o un plásmido.
Otra forma es sustituir el promotor endógeno de un gen con un promotor más fuerte. Estos promotores pueden ser homólogos o heterólogos. Los promotores homólogos conocidos para permitir un alto nivel de expresión en levadura son los seleccionados en el siguiente grupo: ADH1, GPDH, TEF1, HXT7 truncado, PFK1, FBA1, PGK1, TDH3, etc. Los promotores particularmente interesantes en la presente invención se definen posteriormente más en detalle. En la levadura, el constructo de expresión del ácido nucleico comprende preferiblemente secuencias reguladoras, tal como secuencias promotora y terminadora, que están unidas de forma operativa con la secuencia de ácido nucleico que codifica para cada uno de los genes considerados, y más particularmente para cada uno de las enzimas ALS, ALD, BDH y NOXE mencionadas anteriormente según la presente invención.
El constructo de expresión de ácido nucleico puede comprender además secuencias de reconocimiento de 5’ y/o 3’ y/o marcadores de selección.
El término “sobreexpresión” significa que la expresión de un gen o de una enzima se aumenta en comparación con el microorganismo no modificado. El aumento de la expresión de una enzima se obtiene aumentando la expresión de un gen que codifica dicha enzima. El aumento de la expresión de un gen puede realizarse mediante todas las técnicas conocidas por un experto en la técnica. A este respecto, puede citarse particularmente la implementación de un promotor fuerte corriente arriba del ácido nucleico previsto para sobreexpresarse o la introducción de varias copias de dicho ácido nucleico entre un promotor, especialmente un promotor fuerte, y un terminador.
La “actividad” de una enzima se usa de forma intercambiable con el término “función” y designa, en el contexto de la invención, la capacidad de una enzima para catalizar la reacción deseada.
Los términos “actividad reducida” o “actividad atenuada” de una enzima significan o una actividad catalítica específica reducida de la proteína obtenida por mutación en la secuencia de aminoácidos y/o concentraciones disminuidas de la proteína en la célula obtenida por mutación de la secuencia de ácido nucleico o por supresión del gen correspondiente similar.
El término “actividad mejorada” de una enzima designa o una actividad catalítica específica aumentada de la enzima, y/o una cantidad/disponibilidad aumentada de la enzima en la célula, obtenida por ejemplo por sobreexpresión del gen que codifica la enzima.
Los términos “que codifica” o “que cifra” se refiere al proceso por el que un polinucleótido, a través de los mecanismos de transcripción y traducción, produce una secuencia de aminoácidos.
El (los) gen(es) que codifica(n) la(s) enzima(s) considerada(s) en la presente invención puede(n) ser exógeno(s) o endógeno(s).
“Atenuación” de genes significa que los genes se expresan en una tasa inferior que en el microorganismo no modificado. La atenuación puede conseguirse por medios y métodos conocidos por el experto en la técnica y contiene supresión génica mediante recombinación homóloga, atenuación génica mediante inserción de un elemento externo en el gen o expresión génica bajo un promotor débil. El experto en la técnica conoce una variedad de promotores que muestran diferentes fortalezas y que promotor usar para una expresión genética débil.
Los métodos implementados en la presente invención necesitan preferiblemente el uso de uno o más constructos de integración cromosómica para la introducción estable de una secuencia de nucleótidos heteróloga en una posición específica en un cromosoma o para la alteración funcional de uno o más genes diana en una célula microbiana modificada genéticamente. En algunas realizaciones, la alteración del gen diana evita la expresión de la proteína funcional relacionada. En algunas realizaciones, la alteración del gen diana da por resultado la expresión de una proteína no funcional a partir del gen alterado.
Los parámetros de constructos de integración cromosómica que pueden variarse en la práctica de la presente invención incluyen, aunque no están limitados a, las longitudes de las secuencias homólogas; la secuencia de nucleótidos de las secuencias homólogas; la longitud de la secuencia de integración; la secuencia de nucleótidos de la secuencia de integración; y la secuencia de nucleótidos del sitio diana. En algunas realizaciones, un intervalo efectivo para la longitud de cada secuencia homóloga es 20 a 5.000 pares de bases, preferentemente 50 a 100 pares de bases. En realizaciones particulares, la longitud de cada secuencia homóloga es aproximadamente 50 pares de bases. Para más información en la longitud de la homología necesaria para el direccion amiento génico, véase D. Burke et al., Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000).
En algunas realizaciones, el (los) gen(es) de piruvato descarboxilasa alterado(s) en que el (los) constructo(s) de ADN mencionado(s) anteriormente pretende(n) insertarse puede(n) comprender ventajosamente uno o más marcador(es) seleccionable(s) útil(es) para la selección de células microbianas transformadas. Preferiblemente, dichos marcadores seleccionables están comprendidos en el (los) constructo(s) de ADN según la presente descripción.
En algunas realizaciones, el marcador seleccionable es un marcador de resistencia al antibiótico. Ejemplos ilustrativos de marcadores de resistencia al antibiótico incluyen, aunque no están limitados a, los productos génicos NATI, AUR1-C, HPH, DSDA, KAN<R> y SH BLE. El producto génico NATI de S. noursei confiere resistencia a la nourseotricina; el producto génico AUR1-C de Saccharomyces cerevisiae confiere resistencia a la Auerobasidina A (AbA); el producto génico HPH de Klebsiella pneumonia confiere resistencia a la Higromicina B; el producto génico DSDA de E. coli permite a las células cultivarse en placas con D-serina como la única fuente de nitrógeno; el gen KAN<R> del transposón Tn903 confiere resistencia a G418; y el producto génico SH BLE de Streptoalloteichus hindustanus confiere resistencia a la Zeocina (bleomicina).
En algunas realizaciones, el marcador de resistencia al antibiótico se elimina después de aislarse la célula microbiana modificada genéticamente de la invención. El experto en la técnica es capaz de elegir un marcador adecuado en el contexto genético específico.
En algunas realizaciones, el marcador seleccionable rescata una uxotrofía (p.ej., una auxotrofía nutricional) en la célula microbiana modificada genéticamente. En dichas realizaciones, una célula microbiana parental comprende una alteración funcional en uno o más productos génicos que funcionan en una ruta biosintética de aminoácidos o nucleótidos, tal como, por ejemplo, los productos génicos HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, MET 15, TRP1, ADE2 y URA3 en la levadura, que vuelve a la célula microbiana parental incapaz de crecer en el medio sin suplementación con uno o más nutrientes (fenotipo auxotrófico). El fenotipo auxotrófico puede entonces rescatarse transformando a la célula microbiana parental con una integración cromosómica que codifica una copia funcional del producto génico alterado (NB: la copia funcional del gen puede originarse a partir de especies parecidas, tal como Kluyveromyces, Candida, etc.) y la célula microbiana modificada genéticamente generada puede seleccionarse en base a la pérdida del fenotipo auxotrófico de la célula microbiana parental.
Para cada una de las secuencias de ácido nucleico que comprende una secuencia promotora, una secuencia de codificación (p.ej. una secuencia de codificación de una enzima), o una secuencia terminadora, se describen secuencias de referencia en la presente memoria. La presente descripción también incluye secuencias de ácido nucleico que tienen porcentajes específicos de identidad de ácido nucleico, con una secuencia de ácido nucleico de referencia.
Para cada una o las secuencias de aminoácidos de interés, se describen secuencias de referencia en la presente memoria. La presente descripción también incluye secuencias de aminoácidos (p.ej. secuencias de aminoácidos de
enzima), que tienen porcentajes específicos de identidad de aminoácidos, con una secuencia de aminoácidos de referencia.
Por razones obvias, en toda la presente descripción, una secuencia de ácido nucleico específica o una secuencia de aminoácidos específica que cumple con, respectivamente, la identidad de nucleótidos o aminoácidos considerada, debería llevar además a la obtención de una proteína (o enzima) que presenta la actividad biológica deseada. Como se usa en la presente memoria, el “porcentaje de identidad” entre dos secuencias de ácido nucleico o entre dos secuencias de aminoácidos se determina comparando ambas secuencias alineadas de forma óptima a través de una ventana de comparación.
La parte de la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en la ventana de comparación puede por consiguiente incluir adiciones o supresiones (por ejemplo “huecos”) en comparación con la secuencia de referencia (que no incluye estas adiciones o estas supresiones) para así obtener un alineamiento óptimo entre ambas secuencias.
El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones a las que una base nucleica idéntica, o un residuo de aminoácido idéntico, puede anotarse para ambas secuencias comparadas, dividiendo entonces el número de posiciones en que la identidad puede observarse entre ambas bases nucleicas, o entre ambos residuos de aminoácido, por el número total de posiciones en la ventana de comparación, después multiplicando el resultado por cien para obtener el porcentaje de identidad de nucleótidos entre la dos secuencias o el porcentaje de identidad de aminoácidos entre las dos secuencias.
La comparación del alineamiento óptimo de la secuencia puede efectuarse mediante un ordenador usando algoritmos conocidos.
Lo más preferiblemente, el porcentaje de identidad de secuencia se determina usando el software CLUSTAL W (versión 1.82) ajustándose los parámetros como sigue: (1) Modo CPU = ClustalW mp; (2) Alineamiento = “completo”; (3) formato de salida = “aln w/números”; (4) orden de salida = “alineado”; (5) alineamiento de color = “no”; (6) KTUP (tamaño de palabra) = “valor por defecto”; (7) longitud de la ventana = “valor por defecto”; (8) tipo de puntuación = “porcentaje”; (9) Topdiag = “valor por defecto”; (10) hueco de par = “valor por defecto”; (11) tipo de árbol filogenético/árbol = “ninguno”; (12) matriz = “valor por defecto”; (13) abertura de hueco = “valor por defecto”; (14) huecos finales = “valor por defecto”; (15) extensión del hueco = “valor por defecto”; (16) distancias del hueco = “valor por defecto” ; (17) tipo de árbol = “cladograma” y (18) distancias del gráfico de árbol = “ocultar”.
La “fermentación” o “cultivo” se realiza generalmente en fermentadores con un medio de cultivo apropiado adaptado al microorganismo que se cultiva, que contiene al menos una fuente simple de carbono, y si es necesario, cosustratos.
Los microorganismos descritos en la presente memoria pueden cultivarse en medios de fermentación para la producción de un producto a partir de piruvato. Para la máxima producción de 2,3-BDO, las cepas de microorganismo usadas como huéspedes de producción tienen preferiblemente una alta tasa de utilización de carbohidrato. Estas características pueden conferirse por mutagénesis y selección, ingeniería genética, o pueden ser naturales. Los medios de fermentación, o “medio de cultivo” para las actuales células puede contener al menos aproximadamente 10 g/L de glucosa. Los sustratos de carbono adicionales pueden incluir aunque no están limitados a monosacáridos tales como fructosa, manosa, xilosa y arabinosa; oligosacáridos tales como lactosa, maltosa, galactosa o sacarosa; polisacáridos tales como almidón o celulosa; o mezclas de los mismos y mezclas no purificadas de materias primas renovables tales como permeado de suero de queso licor de maíz fermentado, melaza de remolacha azucarera y malta de cebada. Otros sustratos de carbono pueden incluir glicerol.
Por tanto, se contempla que la fuente de carbono utilizada en la presente descripción puede incluir una amplia variedad de sustratos que contienen carbono y solo se limitarán por la elección del organismo.
Aunque se contempla que todos los sustratos de carbono mencionados anteriormente y mezclas de los mismos son adecuados en la presente invención, los sustratos de carbono preferidos son glucosa, fructosa y sacarosa, o mezclas de estos con azúcares C5 tales como xilosa y/o arabinosa para microorganismos modificados para usar azúcares C5, y más particularmente glucosa.
Un sustrato de carbono preferido es sacarosa.
Según una realización particular, un sustrato de carbono descrito en la presente descripción no consiste en xilosa. Además de una fuente de carbono apropiada, los medios de fermentación pueden contener minerales, sales, cofactores, tampones y otros componentes, adecuados, conocidos por los expertos en la técnica, adecuados para el crecimiento de los cultivos y promoción de la ruta enzimática necesaria para la producción del producto deseado. Además, pueden considerarse modificaciones genéticas adicionales adecuadas para el crecimiento de microorganismos recombinantes según la invención.
La presencia de ácidos débiles se conoce por ser una limitación para el crecimiento y están a menudo presentes en medios derivados de celulosa o melaza.
Modificaciones genéticas adicionales tales como la alteración del gen JEN1 (o nombre sistemático: YKL217W o número de acceso de proteína P36035 (UniProtKB swiss-Prot)) y/o la sobreexpresión del gen HAA-1 (nombre sistemático: YPR008W o número de acceso Q12753 (UniProtKB swiss-Prot)) lleva a mejorar la resistencia de las cepas a los ácidos débiles en el medio de cultivo implementado.
Jen 1 es una proteína de membrana responsable de importar lactato a la célula (Casal M, et al. (1999), J. Bacteriol., 181 (8):2620-3).
HAA-1 es un activador transcripcional que controla la expresión de las proteínas de estrés de membrana responsables de la resistencia a ácidos débiles. Su sobreexpresión mejora la resistencia de la levadura a ácidos acéticos (Tanaka et al. (2012) Appl Environ Microbiol., 78(22):8161-3).
La alteración del gen JEN1 y la sobreexpresión del gen HAA-1 pertenecen al conocimiento general de un experto en la técnica y pueden realizarse principalmente usando métodos presentados en la presente memoria.
En vista de la ecuación posterior de la presente memoria para la síntesis de 2,3-BDO en levadura, las condiciones a considerar en la presente invención son necesariamente condiciones aeróbicas.
El término “condiciones aeróbicas” se refiere a concentraciones de oxígeno en el medio de cultivo que son suficientes para que un microorganismo aeróbico o anaeróbico facultativo use di-oxígeno como un aceptor electrónico terminal.
“Condición microaeróbica” se refiere a un medio de cultivo en que la concentración de oxígeno es menor que la del aire, es decir, concentración de oxígeno hasta 6% de O2.
Un “medio de cultivo apropiado” designa un medio (p.ej. un medio líquido estéril) que comprende nutrientes esenciales o beneficiosos para el mantenimiento y/o crecimiento de la célula tales como fuentes de carbono o sustrato de carbono, fuentes de nitrógeno, por ejemplo, peptona, extractos de levadura, extractos de carne, extractos de malta, urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio y fosfato de amonio; fuentes de fósforo, por ejemplo, fosfato de monopotasio o fosfato de dipotasio; elementos traza (p.ej. sales metálicas), por ejemplo sales de magnesio, sales de cobalto y/o sales de manganeso; además de factores de crecimiento tales como aminoácidos, vitaminas, promotores del crecimiento y similares. El término “fuente de carbono” o “sustrato de carbono” o “fuente de carbono” según la presente invención indica cualquier fuente de carbono que puede usarse por los expertos en la técnica para soportar el crecimiento normal de un microorganismo, incluyendo hexosas (tal como glucosa, galactosa o lactosa), pentosas, monosacáridos, oligosacáridos, disacáridos (tales como sacarosa, celobiosa o maltosa), melaza, almidón o sus derivados, celulosa, hemicelulosas y combinaciones de los mismos. Levadura recombinante
Como se menciona anteriormente, la presente invención se refiere a una levadura recombinante que tiene una actividad reducida de piruvato descarboxilasa, en cuyo genoma se ha insertado:
- uno o más ácidos nucleicos que codifican una acetolactato sintasa o ALS,
- uno o más ácidos nucleicos que codifican una acetolactato descarboxilasa o ALD,
- uno o más ácidos nucleicos que codifican una butanodiol deshidrogenasa o BDH, y
- una o más copias de unos ácidos nucleicos que codifican una NADH oxidasa o NOXE,
Seleccionándose dichas una o más copias de unos ácidos nucleicos que codifican una NADH oxidasa o NOXE del grupo que consiste en secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos 78%, preferiblemente al menos 80%, de identidad de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:23 que presenta la actividad biológica deseada, y
Dicha actividad de piruvato descarboxilasa se reduce mediante (i) la alteración de al menos un gen que codifica una piruvato descarboxilasa insertando en dicho al menos un gen que codifica una piruvato descarboxilasa al menos un constructo de ADN exógeno, (ii) mutaciones en regiones reguladoras, (iii) mutaciones en un codón de partida, principalmente sustituyendo AUG por GUG, (iv) mutaciones en secuencias de codificación que alteran la actividad enzimática (v) mutaciones, inserciones o supresión en la secuencia de codificación que alteran la estabilidad de la proteína y (vi) mutaciones que alteran la vida media de ARNm de piruvato descarboxilasa.
Como se muestra en los ejemplos de la presente memoria, los inventores encontraron inesperadamente que la presencia de un ácido nucleico que codifica una NADH oxidasa, ventajosamente la presencia de una pluralidad de copias del mismo, en una levadura recombinante en que la actividad de piruvato descarboxilasa se ha reducido y en
que se ha integrado adicionalmente genes que permiten la expresión de las enzimas ALS, ALD y BDH necesarias para la síntesis de 2,3-BDO, no solo contribuye a estabilizar dicha levadura recombinante sino que también permite una mejora significativa del crecimiento de esta cepa, además del rendimiento de la producción de 2,3-BDO.
El uso de organismos de levadura positivos en Crabtree tal como saccharomyces cerevisiae, y especialmente de organismos de levadura recombinante tal como saccharomyces cerevisiae, para producir metabolitos de interés es ventajoso ya que, en contraste con las bacterias, las células de levadura tienen la capacidad de realizar la fermentación en presencia de oxígeno en presencia de suficiente cantidad de azúcar tal como glucosa o sacarosa. En contraste, las bacterias realizan la fermentación solo en condiciones anaeróbicas. Además, los organismos de levadura no están sujetos a infección vírica en contraste con bacteriófago para bacterias. Aún más, el cultivo de organismos de levadura raramente está sujetos a la contaminación por microorganismos no deseados tal como bacterias porque las células de levadura provocan la rápida acidificación de su entorno hasta pH 4, p.ej. el medio de cultivo que soporta su crecimiento. Aún más, las células de levadura no excretan un número de metabolitos indeseados tales como ácido láctico, cuya presencia en el medio de cultivo es un inconveniente actual para la posterior purificación de metabolito(s) de interés. Aún más, los organismos de levadura, que incluyen organismos de levadura recombinante, tienen una mayor estabilidad genética en comparación con las bacterias.
La ecuación para la síntesis de 2,3-BDO en levadura es:
Glucosa <C6H120 * ) Vi 02 -> 2,3-BDO <C4H10O2) 2x C 02 H30 <*)
[100 §3 [8 ,8 g] — * Í50 ,0 g] [48 ,8 g] [9 ,9 g]
(*) posible debido al hecho de que S. cerevisiae puede fermentar incluso en presencia de oxígeno.
En vista de la ecuación anterior, el rendimiento teórico máximo de 2,3-BDO sería 100 g para una entrada de 200 g de glucosa.
Como se muestra en los ejemplos en la presente memoria, el rendimiento efectivo de 2,3-BDO con levadura recombinante según la presente invención es muy cercano a este rendimiento teórico máximo. Según el conocimiento del inventor, dicho rendimiento no se ha obtenido nunca hasta ahora.
Por consiguiente, la producción con un alto rendimiento de 2,3-BDO se alcanza con éxito en una levadura recombinante según la invención, preparando el camino para la producción industrial de 2,3-BDO usando levadura. Sorprendentemente, como se muestra también en los ejemplos en la presente memoria, no se observa toxicidad del 2,3-BDO producido en las células de levadura, incluso a altas concentraciones de 2,3-BDO sintetizado. Lo que es más, el 2,3-BDO sintetizado se exporta totalmente fuera de las células, simplificando así sustancialmente el proceso de purificación.
La NADH oxidasa usada en la levadura recombinante según la presente invención es una enzima “dependiente de NADH” muy específica ya que no consume ningún aceptor carbonatado. Por esta razón, la NADH oxidasa seleccionada no interfiere directamente con el metabolismo carbonatado sino que rellena la reserva de NAD+ en la producción de agua.
A este respecto, la NADH oxidasa usada en la levadura recombinante según la presente invención difiere principalmente de la enzima “dependiente de NADH” descrita en los documentos de la técnica anterior mencionados anteriormente, y especialmente en los documentos US 2011/0124060 y WO 2013/076144.
Según ciertas realizaciones, la levadura recombinante puede comprender uno o más constructo(s) de ADN seleccionado(s) en un grupo que comprende las siguientes fórmulas:
(I) 5’-[Gen 1 ]x1-3’ y 5’-[Gen2]x2-3’ y 5’-[Gen 3]x3-3’ y 5’-[Gen 4]x4-3’,
(II) 5’-[Gen 1]x1-[Gen 2]x2-[Gen 3]xs-3’ y 5’-[Gen 4]x4-3’,
(III) 5’-[Gen 1]x1-[Gen 2]x2-3’ y 5’-[Gen 3]x3-[Gen 4]x4-3’,
(IV) 5’-[Gen 1]x1-[Gen 2]x2-[Gen 3]x3-[Gen 4]x4-3’, y
Una combinación de las mismas,
En las que:
- “Gen 1” significa un ácido nucleico seleccionado de un grupo que comprende ALS, ALD, BDH o NOXE;
- “Gen 2” significa un ácido nucleico seleccionado de un grupo que comprende ALS, ALD, BDH o NOXE pero diferente del gen 1;
- “Gen 3” significa un ácido nucleico seleccionado de un grupo que comprende ALS, ALD, BDH o NOXE pero diferente de los genes 1 y 2;
- “Gen 4” significa un ácido nucleico seleccionado de un grupo que comprende ALS, ALD, BDH o NOXE pero diferente de los genes 1 a 3;
- “ALS” es un ácido nucleico que codifica una acetolactato sintasa;
- “ALD” es un ácido nucleico que codifica una acetolactato descarboxilasa;
- “BDH” es un ácido nucleico que codifica una butanodiol deshidrogenasa;
- “NOXE” es un ácido nucleico que codifica una NADH oxidasa;
- cada uno de “x1”, “x2”, “x3” y “x4”, uno independientemente de los demás, representa un número entero que oscila de 0 a 50, preferiblemente de 0 a 20, y siempre que dicha levadura recombinante comprenda al menos un ácido nucleico que codifique para cada uno de ALS, ALD, BDH y NOXE.
Preferiblemente, cada uno entre “x1”, “x2”, “x3” y “x4”, independientemente los unos de los otros, representa un número entero que oscila de 0 a 10, más particularmente que oscila de 0 a 5, en particular oscila de 0 a 3, y aún mejor representa un número entero igual a 1.
Como se pretende en la presente memoria, cada uno de x1, x2, x3 y x4 puede tener un valor seleccionado en un grupo que comprende 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50.
En ciertas realizaciones en las que, en un constructo de ADN de fórmulas (I) a (IV) anteriores, uno o más de los números enteros “x1”, “x2”, “x3” y/o “x4”, uno independientemente de los demás, tiene un valor de dos o más, entonces cada una o más de las dos o más copias del gen correspondiente entre Gen 1, Gen 2, Gen 3 y/o Gen 4 relacionado pueden ser idénticas o diferentes. Varias secuencias distintas de ALS, ALD, BDH y NOXE se representan en la Tabla 1 en la presente memoria.
En realizaciones ilustrativas de un constructo de ADN seleccionado de entre aquellos de fórmulas (I) a (IV) anteriores, en donde “x1” es un número entero igual a 2 y el Gen 1 es un ácido nucleico que codifica una acetolactato sintasa (ALS), entonces las dos secuencias de codificación de ALS contenidas en el constructo de ADN dicho pueden ser idénticas o diferentes.
Por ejemplo, según esta realización particular, significa que la primera copia del ácido nucleico que codifica una acetolactato sintasa puede ser el ácido nucleico que codifica ALS.Bs y la segunda copia del ácido nucleico que codifica una acetolactato sintasa puede ser el ácido nucleico que codifica ALS.Pp.
En las realizaciones de una levadura recombinante según la presente descripción en las que la levadura recombinante dicha comprende al menos dos constructos de ADN seleccionados en el grupo que comprende los constructos de ADN de fórmulas (I) a (IV), cada constructo de ADN, y más particularmente cada uno de los genes entre Gen 1, Gen 2, Gen 3 y/o Gen 4 relacionados contenidos en él, pueden ser idénticos o diferentes.
En la presente memoria después se presentan algunas realizaciones ilustrativas de un constructo de ADN seleccionado en un grupo que comprende los constructos de ADN de fórmula (I), (II); (III) y (IV).
Levadura recombinante que comprende un constructo de ADN de fórmula (I):
(I) 5'-[ALS]2-3' y 5'-[ALD]2-3' y 5'-[BDH]2-3' y 5'-[NOXE]a -3',
Una levadura recombinante que comprende un constructo de ADN de fórmula (I) anterior tiene una actividad reducida de piruvato descarboxilasa, y posee los cuatro siguientes sub-constructos de ADN (i) y (iv) que se han introducido en el genoma del mismo:
(i) un sub-constructo de ADN que comprende dos ácidos nucleicos, idénticos o distintos uno del (de los) otro(s), codificando cada ácido nucleico ALS, introduciéndose dicho sub-constructo de ADN en una primera posición en el genoma de dicha levadura recombinante;
(ii) un sub-constructo de ADN que comprende dos ácidos nucleicos, idénticos o distintos uno del otro, codificando cada ácido nucleico ALD, introduciéndose dicho sub-constructo de ADN en una segunda posición en el genoma de dicha levadura recombinante, distinta de la posición en la que se han insertado los ácidos nucleicos que codifican ALS;
(iii) un sub-constructo de ADN que comprende dos ácidos nucleicos, idénticos o distintos uno del otro, codificando cada ácido nucleico BDH, introduciéndose dicho sub-constructo de ADN en una tercera posición en el genoma de dicha levadura recombinante, distinta de la primera y segunda posiciones en las que se han insertado los ácidos nucleicos que codifican ALS y los ácidos nucleicos que codifican ALD; y
(iv) un sub-constructo de ADN que comprende tres ácidos nucleicos, idénticos o distintos el (los) uno(s) del (de los) otro(s), codificando cada ácido nucleico NOXE, introduciéndose dicho sub-constructo de ADN en una cuarta posición en el genoma de dicha levadura recombinante, distinta de la primera, segunda y tercera posiciones en las que se han insertado los ácidos nucleicos que codifican ALS y los ácidos nucleicos que codifican ALD y BDH, respectivamente.
En algunas realizaciones, la actividad reducida de piruvato descarboxilasa necesaria de la levadura recombinante específica dicha puede obtenerse mediante inserción en al menos uno de los genes pdc de la levadura de la menos un sub-constructo de ADN (i) a (iv), o de forma alternativa, una combinación de los mismos.
Levadura recombinante que comprende un constructo de ADN de fórmula (II):
(II) 5'-[ALS]1-[ALD]1-[BDH]1-3' y 5'-[NOXE]3-3'
La levadura recombinante resultante tiene una actividad reducida de piruvato descarboxilasa, y tiene un genoma en el que se ha insertado los dos siguientes sub-constructos de ADN (A) y (B), a saber:
(A) un primer sub-constructo de ADN 5'-[ALS]1-[ALD]1-[BDH]1-3' introduciéndose dicho primer sub-constructo de ADN en una primera posición en el genoma de dicha levadura recombinante, y comprendiendo dicho primer subconstructo de ADN:
(i) un ácido nucleico que codifica ALS;
(ii) un ácido nucleico que codifica ALD; y
(iii) un ácido nucleico que codifica BDH;
(B) un segundo sub-constructo de ADN 5'-[NOXE]3-3', introduciéndose dicho sub-constructo de ADN en una segunda posición en el genoma de dicha levadura recombinante, distinta de la primera posición en la que el primer sub-constructo de ADN se ha insertado, y comprendiendo dicho segundo sub-constructo de ADN (iv) tres ácidos nucleicos, idénticos o distintos el (los) uno(s) del (de los) otro(s), codificando cada ácido nucleico NOXE.
En ciertas realizaciones, la actividad reducida de piruvato descarboxilasa de dicha levadura recombinante específica puede obtenerse mediante inserción en al menos uno de los genes pdc de levadura del primer sub-constructo de ADN.
Levadura recombinante que comprende dos constructos de ADN de fórmula (II):
(II-1) 5'-[ALS]1-[ALD]1-[BDH]1-3' y 5'-[NOXE]a-3', y
(II-2) 5'-[ALS]1-[ALD]1-[BDH]1-3' y 5'-[NOXE]0-3'.
La levadura recombinante resultante tiene una actividad reducida de piruvato descarboxilasa, y tiene un genoma en el que se ha insertado los tres siguientes sub-constructos de ADN (A), (B) y (C), a saber:
(A) un primer sub-constructo de ADN 5'-[ALS]1-[ALD]1-[BDH]1-3', introduciéndose dicho primer sub-constructo de ADN en una primera posición en el genoma de dicha levadura recombinante, y comprendiendo dicho primer subconstructo de ADN;
(i) un ácido nucleico que codifica ALS;
(ii) un ácido nucleico que codifica ALD; y
(iii) un ácido nucleico que codifica BDH;
(B) un segundo sub-constructo de ADN 5'-[ALS]1-[ALD]1-[BDH]1-3', introduciéndose dicho segundo sub-constructo de ADN en una segunda posición en el genoma de dicha levadura recombinante, y comprendiendo dicho segundo sub-constructo de ADN;
(i) un ácido nucleico que codifica ALS;
(ii) un ácido nucleico que codifica ALD; y
(iii) un ácido nucleico que codifica BDH;
y
(C) un tercer sub-constructo de ADN 5’-[NOXE]3-3’, introduciéndose dicho sub-constructo de ADN en una tercera posición en el genoma de dicha levadura recombinante, distinta de la primera posición en la que se ha insertado el primer sub-constructo de ADN, y distinta de la segunda posición en la que se ha insertado el segundo subconstructo de ADN y comprendiendo dicho tercer sub-constructo de ADN (iv) tres ácidos nucleicos, idénticos o distintos el (los) uno(s) del (de los) otro(s), codificando cada ácido nucleico NOXE.
En ciertas realizaciones, la actividad reducida de piruvato descarboxilasa necesaria de dicha levadura recombinante específica puede obtenerse por inserción en al menos uno de los genes pdc de levadura del primer sub-constructo de ADN y/o del segundo sub-constructo de ADN.
Levadura recombinante que comprende un constructo de ADN de fórmula (III):
(III) 5’-[ALS]2-[ALD]2-3’ y 5’-[BDH]2-[NOXE]3-3’,
Una levadura recombinante que comprende un constructo de ADN de fórmula (III) anterior tiene una actividad reducida de piruvato descarboxilasa, y posee un genoma en el que se han insertado los dos siguientes subconstructos de ADN (A) y (B), a saber:
(A) Un primer sub-constructo de ADN 5’-[ALS]i -[ALD]4-3’, introduciéndose dicho primer sub-constructo de ADN en una primera posición en el genoma de dicha levadura recombinante, y comprendiendo dicho primer sub-constructo de ADN;
(i) dos ácidos nucleicos, idénticos o distintos uno del otro, codificando cada ácido nucleico ALS; y
(ii) dos ácidos nucleicos, idénticos o distintos uno del otro, codificando cada ácido nucleico ALD;
(B) un segundo sub-constructo de ADN 5’-[BDH]3-[NOXE]3-3’, introduciéndose dicho sub-constructo de ADN en una segunda posición en el genoma de dicha levadura recombinante, distinta de la primera posición en la que el primer sub-constructo de ADN se ha insertado, y comprendiendo dicho segundo sub-constructo de ADN:
(iii) dos ácidos nucleicos, idénticos o distintos el uno del otro, codificando cada ácido nucleico BDH; y
(iv) tres ácidos nucleicos, idénticos o distintos el (los) uno(s) del (de los) otro(s), codificando cada ácido nucleico NOXE.
En ciertas realizaciones, la actividad reducida de piruvato descarboxilasa necesaria de dicha levadura recombinante específica puede obtenerse por inserción en al menos uno de los genes pdc de levadura del primer sub-constructo de ADN y/o del segundo sub-constructo de ADN.
Levadura recombinante que comprende un constructo de ADN de fórmula (IV):
(IV) 5’-[ALS]2-[ALD]2-[BDH]2-[NOXE]3-3’,
Una levadura recombinante que comprende un constructo de ADN de fórmula (IV) anterior tiene una actividad reducida de piruvato descarboxilasa y posee un genoma en el que se ha insertado un constructo de ADN situado en una posición deseada en el genoma de dicha levadura recombinante, comprendiendo dicho constructo de ADN; (i) dos ácidos nucleicos, idénticos o distintos el uno del otro, codificando cada ácido nucleico ALS;
(ii) dos ácidos nucleicos, idénticos o distintos el uno del otro, codificando cada ácido nucleico ALD;
(iii) dos ácidos nucleicos, idénticos o distintos el uno del otro, codificando cada ácido nucleico BDH; y
(iv) tres ácidos nucleicos, idénticos o distintos el (los) uno(s) del (de los) otro(s), codificando cada ácido nucleico NOXE.
En ciertas realizaciones, la actividad reducida de piruvato descarboxilasa necesaria de dicha levadura recombinante específica puede obtenerse por inserción de dicho constructo de ADN en al menos uno de los genes pdc de levadura.
Para cada una de estas cinco realizaciones ilustrativas anteriores de una levadura recombinante según la invención, y como se menciona anteriormente, cuando “x1” a “x4”, una independientemente de las demás, representa(n) un número entero que tiene un valor de dos o más, entonces:
- una copia de ALS en un único constructo de ADN puede ser idéntica a otra copia de ALS comprendida en el constructo de ADN dicho o puede ser idéntica a todas las demás copias de ALS contenidas en el constructo de ADN dicho, o de forma alternativa la copia dicha de ALS puede ser distinta de cada una de las demás copias de ALS contenidas en el constructo de ADN dicho.
- una copia de ALD en un único constructo de ADN puede ser idéntica a otra copia de ALD comprendida en el constructo de ADN dicho o puede ser idéntica a todas las demás copias de ALD contenidas en el constructo de ADN dicho, o alternativamente la copia dicha de ALD puede ser distinta de cada una de las demás copias de ALD contenidas en el constructo de ADN dicho.
- una copia de BDH en un único constructo de ADN puede ser idéntica a otra copia de BDH comprendida en el constructo de ADN dicho o puede ser idéntica a todas las demás copias de BDH contenidas en el constructo de ADN dicho, o alternativamente la copia dicha de BDH puede ser distinta de cada una de las demás copias de BDH contenidas en el constructo de ADN dicho.
- una copia de NOXE en un único constructo de ADN puede ser idéntica a otra copia de NOXE comprendida en el constructo de ADN dicho o puede ser idéntica a todas las demás copias de NOXE contenidas en el constructo de ADN dicho, o alternativamente la copia dicha de NOXE puede ser distinta de cada una de las demás copias de NOXE contenidas en el constructo de ADN dicho.
Según ciertas realizaciones específicas, una levadura recombinante según la presente descripción puede comprender al menos uno, preferiblemente al menos dos, constructo(s) de ADN de la fórmula (II) mencionada anteriormente, en la que “Gen 4” significa un ácido nucleico que codifica una NADH oxidasa (NOXE).
Según estas realizaciones específicas, cada ácido nucleico entre Gen 1, Gen 2 y Gen 3 significa necesariamente un ácido nucleico seleccionado de un grupo que comprende ALS, ALD y BDH. En estas realizaciones, al menos una copia de las ALS, ALD y BDH insertadas está presente. En las realizaciones en las que solo un constructo de fórmula (II) se inserta en el genoma de levadura, entonces cada ácido nucleico entre Gen 1, Gen 2 y Gen 3 significa necesariamente un ácido nucleico seleccionado de un grupo que comprende ALS, ALD y BDH y una copia de cada una de ALS, ALD y BDH está presente. En las realizaciones en las que un conjunto de dos o más constructos de fórmula (II) se insertan en el genoma de levadura, entonces cada ácido nucleico entre Gen 1, Gen 2 y Gen 3 significa necesariamente un ácido nucleico seleccionado de un grupo que comprende ALS, ALD y BDH y al menos una copia de cada una de ALS, ALD y BDH está presente en el conjunto dicho de dos o más constructos de ADN de fórmula (II).
Además, cuando la levadura recombinante dicha según la invención comprende al menos dos constructos de ADN de la fórmula (II) anterior, entonces dichos constructos de ADN de la fórmula (II) mencionada anteriormente pueden ser idénticos o diferentes.
Según otra realización, una levadura recombinante según la presente descripción puede comprender al menos uno, preferiblemente al menos dos, constructo(s) de ADN de fórmula (IIa), idénticos o diferentes, en los que cada fórmula (IIa) tiene la siguiente fórmula:
(IIa) 5’-[(prom5)y1-Gen 1-term5]x5-[prom1-Gen 1-term1]x1-[prom2-Gen 2-term2]x2-[prom3-Gen 3-(term3)z1]x3-3’ y 5’-[(prom4)y2-Gen 4-(term4)z2]x4-3’
En la que:
- Gen 1, Gen 2, Gen 3 y Gen 4, “x1 ”, “x2”, “x3” y “x4” son como se definen anteriormente;
- “x5” representa un número entero igual a 0 o 1;
- “y1”, “y2”, “z1” y “z2”, uno independientemente de los otros, representan un número entero igual a 0 o 1;
- cuando dicha levadura recombinante comprende al menos dos constructo(s) de ADN de fórmula (IIa), entonces “x1” a “x5”, “y1”, “y2”, “z1” y “z2” pueden ser idénticos o diferentes;
- “prom 1” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica el gen 1; - “prom 2” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica el gen 2; - “prom 3” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica el gen 3; - “prom 4” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica el gen 4;
- “prom 5” es una secuencia reguladora que controla la expresión del Gen 1, siendo dicha prom5 idéntica o diferente de prom1;
- “term1” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica el gen 1;
- “term2” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica el gen 2;
- “term3” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica el gen 3;
- “term4” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica el gen 4; y
- “term5” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de Gen 1, siendo dicha term5 idéntica o diferente de term1.
Para una mejor claridad respecto a las características “x5” e “y1 ”, se presenta después en la presente memoria ejemplos para ilustrar más en detalle las realizaciones particulares relacionadas:
• Cuando “x5” es un número entero igual a 1 e “y1” representa un número entero igual a 0, entonces significa que el Gen 1 considerado está bajo el control del promotor del gen de la levadura recombinante en que el constructo de ADN considerado se ha insertado; o
• cuando “x5” es un número entero igual a 1 e “y1” representa un número entero igual a 1, entonces significa que el Gen 1 considerado está bajo el control del promotor “prom5”. A este respecto, la secuencia del promotor del gen endógeno, preferiblemente del gen pdc, en que el constructo de ADN está insertado se elimina, o al menos se interrumpe, además de la secuencia de su región de codificación relacionada.
Además, respecto a especialmente las características “y2” y “z2”, se presenta después en la presente memoria ejemplos para ilustrar más en detalle realizaciones particulares relacionadas (por supuesto, en estos ejemplos después en la presente memoria, “x4” representa un número entero igual a 1 o más):
• cuando “y2” es un número entero igual a 0, entonces significa que el Gen 4 considerado está bajo el control del promotor del gen de la levadura recombinante en que el constructo de ADN considerado se ha insertado; o
• cuando “y2” es un número entero igual a 1, entonces significa que el Gen 4 considerado está bajo el control del promotor “prom4”. A este respecto, la secuencia del promotor del gen endógeno en que el constructo de ADN está insertado se elimina, o al menos se interrumpe, además de la secuencia de su región de codificación relacionada. • cuando “z2” es un número entero igual a 0, entonces significa que el Gen 4 considerado está unido al terminador de transcripción del gen de la levadura recombinante en que el constructo de ADN considerado se ha insertado; o • cuando “z2” es un número entero igual a 1, entonces significa que el Gen 4 considerado está unido al terminador de transcripción “term4”. A este respecto, la secuencia del terminador de transcripción del gen endógeno en que el constructo de ADN está insertado se elimina, o al menos se interrumpe, además de la secuencia de su región de codificación relacionada.
• respecto a “z1” cuando está presente en las fórmulas descritas en la presente memoria, lo mencionado anteriormente respecto a “z2” aplica a mutatis mutandis.
Según otra realización, una levadura recombinante según la presente descripción puede comprender al menos uno, preferiblemente al menos dos, constructo(s) de ADN de la siguiente fórmula (IIb):
(IIb) 5’-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-term2]x2-[prom3-BDH-(term3)z1]x3-3’ y 5’-[(prom4)y2-NOXE-(term4)z2]x4-3’
En la que:
- ALS, ALD, BDH, NOXE, “x1”, “x2”, “x3”, “x4”, “x5”, “y1”, “y2”, “z1” y “z2” son como se definen anteriormente;
- cuando dicha levadura recombinante comprende al menos dos constructo(s) de ADN de fórmula (IIb), entonces “x1” a “x5”, “y1”, “y2”, “z1” y “z2” pueden ser idénticos o diferentes;
- “prom 1” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato sintasa;
- “prom 2” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato descarboxilasa;
- “prom 3” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica la butanodiol deshidrogenasa;
- “prom 4” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica la NADH oxidasa; - “prom 5” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato sintasa, siendo dicha prom5 idéntica o diferente de prom1;
- “term1” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato sintasa;
- “term2” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato descarboxilasa;
- “term3” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica la butanodiol deshidrogenasa;
- “term4” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica la NADH oxidasa; y
- “term5” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato sintasa, siendo dicha term5 idéntica o diferente de term1.
Según otra realización preferida, una levadura recombinante según la invención puede comprender al menos dos constructos de ADN de fórmula (II), (IIa) o (IIb), con tal que todas las copias del ácido nucleico de NOXE estén situadas en uno solo de al menos dos constructos de ADN de fórmula (II), (IIa) o (IIb).
Según otra realización, una levadura recombinante según la presente descripción puede comprender al menos dos, preferiblemente estrictamente dos, constructos de ADN de las siguientes fórmulas (IIc) y (IId):
(llc) 5’-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-term2]x2-[prom3-BDH-(term3)z1]x3-3’ y 5’-[(prom4)y2-NOXE-(term4)z2]x6-3’; y
(lld) 5’-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-term2]x2-[prom3-BDH-(term3)z1]x3-3’ y 5’-[(prom4)y2-NoXE-(term4)z2]x7-3’;
En las que:
- ALS, ALD, BDH, NOXE, “prom1”, “prom2”, “prom3”, “prom4”, “prom5”, “term1”, “term2”, “term3”, “term4” y “term5”, “x1”, “x2”, “x3”, “x5”, “y1”, “y2”, “z1” y “z2” son como se definen anteriormente; y
- “x1” a “x3”, “x5”, “y1”, “y2”, “z1” y “z2” para cada una de las fórmulas (IIc) y (IId) que son idénticas o diferente; y - “x6” y “x7” representan números enteros que oscilan de 0 a 50, preferiblemente de 0 a 20, preferiblemente de 0 a 12, más particularmente de 2 a 5, preferiblemente de 3 a 4, y mejor aún igual a 3, con tal que solo uno entre “x6” y “x7” representa 0.
Ventajosamente, el primer gen 1 en 5’ en un constructo de ADN de fórmulas (I) a (IV), preferiblemente un gen representado por un ácido nucleico que codifica ALS, está bajo el control del promotor del gen de la levadura recombinante en que el constructo de ADN considerado se ha insertado.
Más particularmente, significa que, para un constructo de ADN de fórmula (IIa), (IIb), (IIc) o (IId), “x5” representa ventajosamente un número entero igual a 1 e “y1” representa un número entero igual a 0.
En vista de la complejidad de los constructos de ADN y sub-constructos de ADN mencionados anteriormente según la presente invención, se enfatiza que:
• respecto a un constructo de ADN de la invención, cuando “x1”, “x2”, “x3” y/o “x4” representa(n) un número entero mayor que o igual a 2, entonces:
o cada copia para un ácido nucleico relacionado entre Gen 1, Gen 2, Gen 3 y/o Gen 4 puede ser idéntica o diferente; y/o
o el promotor y/o terminador para cada copia para un ácido nucleico relacionado entre Gen 1, Gen 2, Gen 3 y/o Gen 4 puede ser idéntico o diferente;
• cuando una levadura recombinante comprende al menos dos constructos de ADN, dichos al menos dos constructos de ADN pueden ser idénticos o diferentes respecto a:
(i) su fórmula general en que un constructo de ADN puede caracterizarse mediante una fórmula seleccionada entre el grupo que comprende las fórmulas (I) a (IV);
(ii) el valor de “x1” a “x7”, “y1”, “y2”, “z1” y/o “z2” ;
(iii) la naturaleza del promotor respecto al mismo gen;
(iv) la naturaleza del terminador respecto al mismo gen; y/o
(v) la naturaleza del mismo gen en sí mismo en que ALS, ALD, BDH y NOXE pueden derivar de organismos que pertenecen a diferentes géneros, como principalmente se representa posteriormente en la Tabla 1.
Los métodos implementados para realizar un constructo de ADN tal como se define anteriormente pertenecen al conocimiento general del hombre de la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede referirse ventajosamente al método descrito en Shao et al. (Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, núm. 2: e16) y Shao et al. (Methods in Enzymology, 2012 Elsevier Inc., Vol. 517:203, finalmente con solo una variación menor, y se desarrolla más particularmente en los ejemplos posteriores en la presente memoria.
Actividad reducida de piruvato descarboxilasa
La actividad de piruvato descarboxilasa endógena en levadura convierte el piruvato a aceltaldehído, que se convierte después a etanol o a aceti-CoA por medio de acetato.
Como se menciona anteriormente, la presente descripción describe una levadura recombinante que tiene actividad reducida de piruvato descarboxilasa, en cuyo genoma se ha insertado un constructo de ADN específico.
Como se describe en la presente memoria, la actividad de piruvato descarboxilasa de una levadura recombinante según la invención se reduce mediante (i) la alteración de al menos un gen que codifica una piruvato descarboxilasa insertando en dicho al menos un gen que codifica una piruvato descarboxilasa al menos un constructo de ADN exógeno, (ii) mutaciones en regiones reguladoras, (iii) mutaciones en un codón de inicio, principalmente sustituyendo AUG por GUG, y (iv) mutaciones en secuencias de codificación que alteran la actividad enzimática, (v) mutaciones, inserciones o supresión en la secuencia de codificación que alteran la estabilidad de la proteína y (vi) mutaciones que alteran la vida media del ARNm de piruvato descarboxilasa.
Respecto a la primera opción (i), el constructo de ADN implementado para alterar un gen pdc considerado puede ser un constructo de ADN exógeno diferente de los constructos de ADN según la invención como se describe anteriormente, un constructo de ADN según la invención, o una combinación de los mismos.
Además, como se menciona anteriormente, los constructos de ADN según la invención de fórmula (I), (II) y (III) están compuestos cada uno de dos o más sub-constructos de ADN.
Por lo tanto, según una variante particular de la realización, la actividad de piruvato descarboxilasa de una levadura recombinante según la presente descripción puede reducirse alterando al menos un gen que codifica una piruvato descarboxilasa insertando en dicho gen solo al menos un sub-constructo de ADN de al menos un constructo de ADN según la invención de la fórmula (I), (II) y (III).
Preferiblemente, la actividad de piruvato descarboxilasa endógena puede reducirse por alteración de al menos un gen pdc.
De hecho, las levaduras pueden tener uno o más genes que codifican piruvato descarboxilasa. Por ejemplo, hay un gen que codifica piruvato descarboxilasa en Kluyveromyces lactis, mientras que hay tres isozimas de piruvato descarboxilasa codificadas por los genes PDC1, PCD5 y PDC6 en Saccharomyces cerevisiae, además de un gen regulador de piruvato descarboxilasa PDC2.
Preferiblemente, y como se define después en la presente memoria, una levadura recombinante según la presente descripción puede ser un género Saccharomyces recombinante, y preferiblemente una especie Saccharomyces cerevisiae recombinante.
Por consiguiente, la levadura recombinante pertenece preferiblemente al género Saccharomyces, y preferiblemente a la especie Saccharomyces cerevisiae.
A este respecto, y según una primera variante, la actividad de piruvato descarboxilasa puede reducirse por alteración de al menos un gen pdc, preferiblemente de al menos dos genes pdc, y más particularmente de solo dos genes pdc.
Además, el (los) gen(es) pdc alterado(s) puede(n) seleccionarse del grupo que consiste en pdc1, pdc5, pdc6 y una mezcla de los mismos, y preferiblemente de pdc1 y pdc6.
Preferiblemente, cuando la levadura recombinante pertenece al género Saccharomyces, entonces la actividad de piruvato descarboxilasa puede reducirse por alteración de al menos dos genes pdc, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en pdc1, pdc5, pdc6 y una combinación de los mismos, y más particularmente del grupo que consiste en pdc1 y pdc6.
De hecho, la interrupción de los tres genes pdc en el género Saccharomyces, preferiblemente, la especie Saccharomyces cerevisiae, reduce dramáticamente el crecimiento de la cepa, volviéndola incompatible con cualquier aplicación industrial.
Según una variante particular, en el género Saccharomyces, preferiblemente la especie Saccharomyces cerevisiae, solo los genes pdc1 y pdc6 se alteran y la expresión de pdc5 se atenúa.
El método implementado para atenuar la expresión de un gen específico pertenece al conocimiento general del hombre de la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede hacer referencia de forma ventajosa a cualquier método que se conoce bien en la técnica.
Ventajosamente, para atenuar la expresión de pdc5, su transcripción puede ponerse bajo el control de un promotor débil, tal como principalmente RPLA1, URA3, MET25, HIS3, TRP1, GAP1, n Up57 o TFC1, y preferiblemente RPLA1 (= secuencia SEQ ID N°37).
Un método implementado para medir el nivel de actividad de una piruvato descarboxilasa pertenece al conocimiento general del hombre de la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede hacer referencia ventajosamente al método descrito en Wang et al. (Biochemistry, 2001,40:1755-1763).
Acetolactato sintasa
La enzima acetolactato sintasa (ALS) (también conocida como acetohidroxiácido sintasa (AHAS), aacetohidroxiácido sintetasa, a-acetohidroxiácido sintasa, a-acetolactato sintasa, a-acetolactato sintetasa, acetohidroxiácido sintetasa, acetohidroxiácido sintasa, acetolactato piruvato-liasa (carboxilante), acetoláctico sintetasa) es una proteína que cataliza la primera etapa en la síntesis de los aminoácidos de cadena ramificada (valina, leucina e isoleucina).
ALS es una enzima implicada específicamente en la reacción química que implica la conversión de dos moléculas de piruvato a una molécula de acetolactato y dióxido de carbono. La reacción usa pirofosfato de tiamina para unir las dos moléculas de piruvato.
Un método implementado para medir el nivel de actividad de una acetolactato sintasa pertenece al conocimiento general del hombre de la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede hacer referencia ventajosamente al método descrito en Poulsen et al. (Eur. J. Biochem. 185, 1989: 433-439).
La acetolactato sintasa preferida en la presente invención se conoce por el número EC 2.2.1.6.
Según una realización preferida, el (los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una acetolactato sintasa o ALS puede(n) ser ácido(s) nucleico(s) seleccionado(s) preferiblemente de un grupo que comprende Bacillus subtilis, Nicotiana tabacum, Paenibacillus polymyxa, y una mezcla de los mismos, y preferiblemente Nicotiana tabacum y Paenibacillus polymyxa.
Según una realización aún preferida, el (los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una acetolactato sintasa puede(n) ser ácido(s) nucleico(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 65%, preferiblemente al menos 80%, de identidad de ácido nucleico con las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO:1,3 y 5.
Como se describe en la presente memoria, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 65% de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia incluye secuencias de ácido nucleico que tienen al menos 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,
85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de nucleótidos con la secuencia de ácido nucleico de referencia dicha.
Como se describe en la presente memoria, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 80% de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia incluye secuencias de ácido nucleico que tienen al menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de nucleótidos con la secuencia de ácido nucleico de referencia dicha.
Según otra realización particular, el (los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una acetolactato sintasa puede(n) ser ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 65%, preferiblemente al menos 80%, de identidad con secuencias SEQ ID NO:2, 5 y 6.
Como se describe en la presente memoria, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 65% de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia incluye secuencias de aminoácidos que tienen al menos 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de referencia dicha.
Como se describe en la presente memoria, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia incluye secuencias de aminoácidos que tienen al menos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de referencia dicha.
Como se menciona anteriormente, el nivel de expresión de ALS en la presente invención se regula mediante al menos un promotor y al menos un terminador, tal como se define después en la presente memoria más en detalle, que están presentes en la posición 5’ y 3’ respectivamente de la secuencia de ácido nucleico que codifica la ALS. Acetolactato descarboxilasa
La enzima acetolactato descarboxilasa (ALD) (también conocida como a-acetolactato descarboxilasa, (S)-2-hidroxi-2-metil-3-oxobutanoato carboxi-liasa, (S)-2-hidroxi-2-metil-3-oxobutanoato carboxi-liasa [(R)-2-acetoin-formadora] o (S)-2-hidroxi-2-metil-3-oxobutanoato carboxi-liasa [(3R)-3-hidroxibutan-2-ona-formadora]) pertenece a la familia de las liasas, específicamente las carboxi-liasas, que escinden los enlaces carbono-carbono y participa en el metabolismo del butanoato y el metabolismo del ácido dibásico c5-ramificado.
ALD es una enzima implicada específicamente en la reacción química que implica la conversión de una molécula aacetolactato a una molécula de acetoína y dióxido de carbono.
Un método implementado para medir el nivel de actividad de una acetolactato descarboxilasa pertenece al conocimiento general del hombre de la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede hacer referencia ventajosamente al método descrito en Dulieu et al. (Enzyme and Microbial Technology 25, 1999: 537-542).
La acetolactato descarboxilasa preferida en la presente invención se conoce por el número EC 4.1.1.5.
Según una realización preferida, el (los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una acetolactato descarboxilasa o ALD puede(n) ser ácido(s) nucleico(s) seleccionado(s) del grupo que comprende Brevibacillus brevis, Enterobacter aerogenes, Lactococcus lactis y una mezcla de los mismos, y preferiblemente Brevibacillus brevis y Enterobacter aerogenes.
Según una realización aún preferida, el (los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una acetolactato descarboxilasa o ALD puede(n) ser ácido(s) nucleico(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 36%, preferiblemente al menos 80%, de identidad del ácido nucleico con las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO: 7, 9 y 11.
Como se describe en la presente memoria, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 36% de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia incluye secuencias de ácido nucleico que tienen al menos 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de nucleótidos con la secuencia de ácido nucleico de referencia dicha.
Según otra realización particular, el (los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una acetolactato descarboxilasa puede(n) ser ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 36%, preferiblemente al menos 80% de identidad con secuencias s Eq ID NO:8, 10 y 12.
Como se describe en la presente memoria, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 36% de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia incluye secuencias de aminoácidos que tienen al menos 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de referencia dicha.
Como se menciona anteriormente, el nivel de expresión de ALD en la presente invención está regulado por al menos un promotor y al menos un terminador, tal como se define después en la presente memoria más en detalle, que están presentes respectivamente en la posición 5’ y 3’ de la secuencia de ácido nucleico que codifica la ALD.
Butanodiol deshidrogenasa
La enzima butanodiol deshidrogenasa (BDH) (también conocida como (R,R)-butanodiol deshidrogenasa, (R)-2,3-butanodiol deshidrogenasa, (R)-diacetil reductasa, 1-amino-2-propanol deshidrogenasa, 1-amino-2-propanol oxidorreductasa, 2,3-butanodiol deshidrogenasa, aminopropanol oxidorreductasa, butilenglicol deshidrogenasa, butilenglicol deshidrogenasa, D-(-)-butanodiol deshidrogenasa, D-1-amino-2-propanol deshidrogenasa, D-1-amino-2-propanol:NAD(2) oxidorreductasa, D-aminopropanol deshidrogenasa, D-butanodiol deshidrogenasa, diacetil (acetoin) reductasa) pertenece a la familia de oxidorreductasas, específicamente aquellas que actúan en el grupo CH-OH del dador con NAD+ o NADP+ como aceptor.
BDH es una enzima implicada específicamente en la reacción química que implica la conversión de una molécula de acetoína usando NADH+ y H+ a una molécula de butano-2,3-diol y NAD+.
Un método implementado para medir el nivel de actividad de una butanodiol deshidrogenasa pertenece al conocimiento general del hombre de la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede hacer referencia ventajosamente al protocolo descrito en Gao et al. (2012), Journal of basic microbiology 52, 1-9. En particular, la actividad de BDH se monitoriza después de la aparición de NADH a través de la absorbancia a 340 nm.
La butanodiol deshidrogenasa preferida en la presente invención se conoce por el número EC 1.1.1.4.
Según una realización preferida, el (los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una butanodiol deshidrogenasa o BDH puede(n) ser ácido(s) nucleico(s) seleccionado(s) del grupo que comprende Enterobacter aerogenes, Paenibacillos polymyxa, Klebsiella oxycota, Saccharomyces cerevisiae y una mezcla de los mismos, y preferiblemente Enterobacter aerogenes y Saccharomyces cerevisiae.
Más particularmente, cuando el (los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una butanodiol deshidrogenasa es un ácido nucleico seleccionado de Saccharomyces cerevisiae, significa que hay una sobreexpresión del ácido nucleico que codifica la butanodiol deshidrogenasa endógena.
Según otra realización preferida, el (los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una butanodiol deshidrogenasa puede(n) ser ácido(s) nucleico(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 63%, preferiblemente al menos 80% de identidad con secuencias SEQ ID NO:13, 15, 17 y 19.
Como se describe en la presente memoria, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 63% de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia incluye secuencias de ácido nucleico que tienen al menos 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de nucleótidos con la secuencia de ácido nucleico de referencia dicha.
Según otra realización particular, el (los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una butanodiol deshidrogenasa puede(n) ser ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 63%, preferiblemente al menos 80% de identidad de ácido nucleico con las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO:14, 16, 18 y 20.
Como se describe en la presente memoria, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 63% de identidad de aminoácidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia incluye secuencias de aminoácidos que tienen al menos 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de referencia dicha.
Según una realización particular, cuando el (los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) la butanodiol deshidrogenasa es/son ácido(s) nucleico(s) seleccionado(s) del grupo que comprende Enterobacter aerogenes, Paenibacillus polymyxa, Klebsiella oxycota y una mezcla de los mismos, entonces el gen que codifica la butanodiol deshidrogenasa endógena se desconecta.
Como se menciona anteriormente, el nivel de expresión de BDH en la presente invención está regulado por al menos un promotor y al menos un terminador, tal como se define después en la presente memoria en detalle, que están presentes respectivamente en la posición 5’ y 3’ de la secuencia de ácido nucleico que codifica la BDH.
NADH oxidasa
La inactivación o reducción de actividad de al menos un gen pdc inactiva o reduce la ruta de fermentación de etanol en la levadura. En consecuencia, esto induce un estado redox desequilibrado que está solo parcialmente atenuado por la expresión de BDH. De hecho, la ruta de glucosa a 2 piruvato genera 2 equivalentes de NADH, mientras que la transformación de 2 piruvatos a butanodiol recicla solo 1 NADH en NAD+ (véase la figura 1).
Los inventores encontraron que una enzima NADH oxidasa (también denominada en la presente descripción NOXE oxidasa o NOXE) formadora de agua bacteriana, en un nivel de expresión específico, puede no solo permitir equilibrar el estado redox que permite mejorar la estabilidad de esta cepa sino también permite mejorar el crecimiento de esta cepa y mejorar adicionalmente el rendimiento de 2,3-BDO.
Una NADH oxidasa formadora de agua bacteriana es una enzima que cataliza la siguiente reacción:
2 NADH 1/2 O2 ^ 2NAD+ H2O
Las NADH oxidasas formadoras de agua preferidas en la presente invención se conocen por el número EC 1.6.3.1 y 1.6.99.3 (también conocida como NAD(P)H oxidasa (H(2)O(2)-formadora), oxidasa dual, NAD(P)H oxidasa, ThOX, THOX2, NADPH oxidasa tiroidea, tiroides oxidasa tiroides oxidasa 2 para EC 1.6.3.1 y NADH deshidrogenasa, dinucleótido Beta-NADH deshidrogenasa, citocromo c reductasa, diaforasa, dihidrocodeshidrogenasa I deshidrogenasa, dihidronicotinamida adenina dinucleótido deshidrogenasa, difosfopirinasa, DPNH diaforasa, NADH diaforasa, NADH hidrogenasa, NADH oxidorreductasa, NADH-menadiona oxidorreductasa, NADH:citocromo c oxidorreductasa, nucleótido de difosfopiridina reducida diaforasa, deshidrogenasa tipo 1, deshidrogenasa tipo I para EC 1.6.99.3).
Una NADH oxidasa formadora de agua que puede considerarse en la presente invención se describe particularmente en el documento WO 2006/134277.
Un método implementado para medir el nivel de actividad de una NADH oxidasa según la invención pertenece al conocimiento general del hombre de la técnica.
A este respecto, el experto en la técnica puede hacer referencia ventajosamente al método descrito en López DE FELIPE et al. (International Daily Journal, 2001, vol. 11:37-44 (ISSN 0958-6946)).
Según una realización preferida, el (los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una NADH oxidasa o NOXE puede(n) ser ácido(s) nucleico(s) seleccionado(s) del grupo que comprende Streptococcus pneumoniae, Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis, Lactobacillus brevis y una mezcla de los mismos, y preferiblemente Streptococcus pneumoniae.
Según otra realización, el (los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una NADH oxidasa puede(n) ser ácido(s) nucleico(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 78%, preferiblemente al menos 80% de identidad de ácido nucleico con las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO:21,23, 25 y 27.
Como se describe en la presente memoria, una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 78% de identidad de nucleótidos con una secuencia de ácido nucleico de referencia incluye secuencias de ácido nucleico que tienen al menos 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de nucleótidos con la secuencia de ácido nucleico de referencia dicha.
Según otra realización particular, el (los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una NADH oxidasa puede(n) ser ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 78%, preferiblemente al menos 80% de identidad con secuencias SEQ ID NO:22, 24, 26 y 28.
Como se describe en la presente memoria, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 78% de identidad de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia que incluye secuencias de aminoácidos que tienen al menos 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de referencia dicha.
Como se menciona anteriormente, el nivel de expresión de NADH oxidasa en la presente invención está regulado por al menos un promotor y al menos un terminador, tal como se define después en la presente memoria más en detalle, que están presentes respectivamente en la posición 5’ y 3’ de la secuencia de ácido nucleico que codifica la NADH oxidasa.
Además, los efectos técnicos ventajosos mencionados anteriormente están unidos al nivel de expresión de dicha NADH oxidasa. De hecho, y como surge de los ejemplos posteriores en la presente memoria, no solo la mera presencia de una NADH oxidasa es importante sino que el nivel de la expresión de NADH oxidasa tiene también una extrema importancia en la producción de 2,3-BDO.
Como se menciona anteriormente, una levadura recombinante según la invención tiene una actividad reducida de piruvato descarboxilasa, y en cuyo genoma se ha insertado, principalmente, una o más copias de un ácido nucleico que codifica una NADH oxidasa o NOXE.
A este respecto, una levadura recombinante según la invención puede comprender principalmente de 1 a 20 copias de un ácido nucleico que codifica una NADH oxidasa.
Preferiblemente, una levadura recombinante según la invención puede comprender de 1 a 12, en particular de 2 a 5, preferiblemente de 3 a 4, y mejor aún igual a 3, copias de un ácido nucleico que codifica una NADH oxidasa.
Según una realización particular, el (los) constructo(s) de ADN de fórmulas (I) a (IV) que comprende(n) al menos el (los) gen(es) NOXE puede(n) insertarse en el gen URA3 endógeno de dicha levadura recombinante.
En vista de lo anterior, cada uno de los ácidos nucleicos que codifican acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, butanodiol deshidrogenasa y NADH oxidasa está bajo el control de un promotor y de un terminador para así evitar la regulación indeseada, principalmente tal como se define después en la presente memoria.
Promotor
Por razones obvias, cada uno de los ácidos nucleicos que codifican la acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, butanodiol deshidrogenasa y la NADH oxidasa está bajo el control de un promotor, idéntico o diferente.
Dichos promotores, idénticos o diferentes, que permiten la sobreexpresión constitutiva de un gen dado, pueden encontrarse en la bibliografía (Velculescu et al. (1997) Cell 88, 243-251).
Los promotores más particularmente interesantes en la presente invención pueden seleccionarse del grupo que comprende:
• pADH1 del gen que codifica para la alcohol deshidrogenasa (gen ADH1 = Secuencia SEQ ID N°32),
• pTDH3 del gen que codifica para la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gen TDH3 = secuencia SEQ ID NO°39),
• pTEF2.K1 del gen que codifica para el factor de alargamiento traduccional EF-1 alfa (gen TEF2 = secuencia SEQ ID N°30),
• pGPM1 del gen que codifica para la glicerato fosfomutasa (gen GPM1 = secuencia SEQ ID N°33),
• pPDC1 del gen que codifica para la piruvato descarboxilasa (gen PDC1 = secuencia SEQ ID N°35),
• pENO2 del gen que codifica para enolasa II (gen ENO2 = secuencia SEQ D NO°29),
• pTEF3 del gen que codifica para la subunidad gamma del factor de alargamiento traduccional eEF1 B (gen TEF3 = secuencia SEQ ID N°31),
• pFBA1 del gen que codifica para la fructosa 1,6-bisfosfato aldolasa II (gen FBA1 = secuencia SEQ ID N°34), • pPGK1 del gen que codifica para la 3-fosfoglicerato quinasa (gen PGK1 = secuencia SEQ ID N°36),
• pPYK1 del gen que codifica para la piruvato quinasa (gen PYK1 = secuencia SEQ ID NO°49),
• pTP11 del gen que codifica para la triosa fosfato isomerasa (gen TPI1 = secuencia SEQ ID N°50), o
• pTEF1 del gen que codifica para el factor de alargamiento traduccional EF-1 alfa (gen TEF1 = secuencia SEQ ID N°38).
Además, también pueden usarse promotores homólogos de otras levaduras estrechamente relacionadas como promotores forman otra levadura forman el género Saccharomyces, o levadura de otro género tal como Candida, Debaryomyces, Pichia o Kluyveromyces.
Los promotores sintéticos como se describen en Blazeck y Alper (2013) Biotechnol. J. 8 46-58 también pueden usarse.
Más particularmente, dichos promotores, idénticos o diferentes, pueden caracterizarse preferiblemente por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 80% de identidad de ácido nucleico con las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO:29 a 39, 49 y 50.
Terminador
Por razones obvias, cada uno de los ácidos nucleicos que codifican acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, butanodiol deshidrogenasa y NADH oxidasa está unido a un terminador de transcripción (que puede denominarse también “terminador” en la presente memoria), idéntico o diferente.
Dichos terminadores de transcripción, idénticos o diferentes, pueden encontrarse en la bibliografía de Yamanishi et al., (2013) ACS synthetic biology 2, 337-347.
Los terminadores más particularmente interesantes en la presente invención pueden seleccionarse del grupo que comprende:
• tTPI1 del gen que codifica para la triosa fosfato isomerasa (gen TPI1 = secuencia SEQ ID N°44),
• tMET25 del gen que codifica para la O-acetil homoserina-O-acetilserina sulfhidrilasa (gen Met25 = Secuencia SEQ ID N°45),
• tADH1 del gen que codifica para la alcohol deshidrogenasa (gen ADH1 = secuencia SEQ ID N°43),
• tENO2 del gen que codifica para enolasa II (gen ENO2 = secuencia SEQ ID N°46),
• tTDH2 del gen que codifica para gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, isozima 2 (gen TDH2 = secuencia SEQ ID N°40),
• tPGK1 del gen que codifica para la 3-fosfoglicerato quinasa (gen PGK1 = secuencia SEQ ID N°48),
• tCYC1 (= secuencia SEQ ID N°41),
• tMET3 (= secuencia SEQ ID N°47),
• tTDH3 (= secuencia SEQ ID N°42), y
• tDIT1 (= secuencia SEQ ID N°51).
Más particularmente, dicho terminador, idéntico o diferente, puede caracterizarse preferiblemente por una secuencia de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 80% de identidad con las secuencias SEQ ID NO:40 a 48 y 51.
Según una realización particular, cada uno de los ácidos nucleicos que codifican acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, butanodiol deshidrogenasa, y NADH oxidasa está bajo el control de un terminador de transcripción, idéntico o diferente, caracterizándose dichos terminadores de transcripción por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 80% de identidad de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:40 a 48.
Levadura recombinante
Generalmente, la levadura puede crecer rápidamente y puede cultivarse a mayor densidad en comparación con bacterias, y no necesita un medio aséptico en la configuración industrial. Además, las células de levadura pueden separarse más fácilmente del medio de cultivo en comparación con las células bacterianas, simplificando en gran medida el proceso para la extracción y purificación de producto.
Preferentemente, la levadura de la presente descripción puede seleccionarse entre el género Saccharomyces, Candida Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus o Malassezia.
Más preferentemente, la levadura puede ser levadura Crabtree positiva de género de Saccharomyces, Dekkera, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora, Zigosaccharomyces o Brettanomycces.
Más preferentemente, la levadura puede ser de las especies Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus o Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotolerens, Torulaspora globosa, Torulaspora glabrata.
Como se menciona anteriormente, una levadura recombinante según la presente descripción tiene una actividad piruvato descarboxilasa que se reduce mediante la inserción de al menos un(os) constructo(s) de ADN seleccionado(s) del grupo que comprende las fórmulas (I) a (IV), y preferiblemente de al menos uno de dicho(s) constructo(s) de ADN que comprende(n) solo al menos un(os) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) ALS, ALD y/o BDH.
Según otra realización, la levadura recombinante puede ser una Saccharomyces cerevisiae recombinante y la actividad piruvato descarboxilasa se reduce por alteración de solo dos genes pdc.
Más preferiblemente, el (los) gen(es) pdc alterado(s) puede(n) seleccionarse del grupo que consiste en pdc1, pdc5, pdc6 y una mezcla de los mismos, y preferiblemente de pdc1 y pdc6.
Los métodos implementados para insertar un constructo de ADN específico en un gen, y más particularmente un gen piruvato descarboxilasa, pertenecen al conocimiento general de un experto en la técnica. Un método relacionado se describe en más detalle en los ejemplos posteriores en la presente memoria.
Realizaciones más preferidas
Ventajosamente, los ácidos nucleicos que codifican enzimas descritas en la presente descripción se eligen ventajosamente entre ALS.Bs, ALS.Pp, ALD.Ll, ALD.Ea, BDH.Ea, BDH.Sc, NOXE.Spn, NOXE.L1 y una mezcla de los mismos.
Según una realización preferida, una levadura recombinante según la presente descripción puede caracterizarse en que pertenece al género Saccharomyces, en particular la especie Saccharomyces cerevisiae, en donde la actividad de piruvato descarboxilasa endógena se reduce por alteración de al menos dos de los genes pdc, en particular por alteración de los genes pdc1 y pdc6, en los que:
- uno de los genes pdc, preferiblemente el gen pdc 1, se altera por inserción de un constructo de ADN de la fórmula (IIe) posterior:
5’-[(prom5)y1-ALS.Bs-term5]x5-[prom1-ALS.Bs-term1]x1-[prom2-ALD.Ll-term2]x2-[prom3-BDH.Ea-(term3)z1]x3-3’ (IIe), y - el al menos otro gen pdc, distinto del gen pdc alterado mencionado anteriormente, y preferiblemente el gen pdc 6, se altera por inserción de un constructo de ADN de la fórmula (IIf’) posterior:
5’-[(prom5)y1-ALS.Pp-term5]x5-[prom1-ALS.Pp-term1]x1-[prom2-ALD.Ea-term2]x2-[prom3-BDH.Sc-(term3)z1]x3-3’ (IIf’), Y en el que el constructo de ADN de la siguiente fórmula
5’-[(prom4)y2-NOXE.Spn-(term4)z2]x4-3’ (IIf’’),
Se inserta en el gen URA3,
En el que:
- prom1, prom2, prom3, prom4, prom5, term1, term2, term3, term4, term5, “y1”, “y2”, “z1” y “z2” son tal como se definen anteriormente y ALS.Bs, ALS.Pp, ALD.Ll, ALD.Ea, BDH.Ea, BDH.Sc y NOXE.Spn, NOXE.L1 son tal como se define posteriormente en la Tabla 1,
- cada uno de “x1”, “x2” y “x3”, independientemente los unos de los otros, representa un número entero que oscila de 0 a 50, preferiblemente de 0 a 20, preferiblemente de 0 a 10, más particularmente de 0 a 3, y en particular igual a 1; - “x4” representa un número entero que oscila de 0 a 50, preferiblemente de 0 a 20, preferiblemente de 0 a 12, más particularmente de 2 a 5, preferiblemente de 3 a 4, y mejor aún igual a 3,
Con tal que dicha levadura recombinante comprenda al menos un ácido nucleico que codifique para cada ALS, ALD, BDH y NOXE, y más particularmente con tal que cada constructo de ADN de fórmula (IIe) y (IIf’) comprenda cada uno al menos un ácido nucleico que codifica para cada ALS, ALD y BDH.
En vista de lo anterior, y aunque se describe de forma implícita, se especifica que, entre cada una de las fórmulas (IIe) y (IIf’):
- “x1 ” a “x3”, “x5”, “y1 ”, “y2”, “z1 ” y “z2”, y/o
- el promotor y/o terminador para cada copia de ácido nucleico para un gen considerado,
Pueden ser idénticos o diferentes.
Según una realización preferida particular, una levadura recombinante según la presente descripción puede caracterizarse en que pertenece al género Saccharomyces, en particular la especie Saccharomyces cerevisiae, en la que la actividad piruvato descarboxilasa endógena se reduce por alteración de al menos dos de los genes pdc, en particular por alteración de los genes pdc 1 y pdc 6, en los que:
- uno de los genes pdc, preferiblemente el gen pdc 1, se altera por inserción de un constructo de ADN de la fórmula (IIg) posterior:
5'-[ALS.Bs-tTDH2]1-[pENO2-ALD.Ll-tCYC1]1-[pTEF3-BDH.Ea-tTDH3]1-3' (IIg),
- el al menos otro gen pdc, distinto del gen pdc alterado mencionado anteriormente, y preferiblemente el gen pdc 6, se altera por inserción de un constructo de ADN de la fórmula (IIh') posterior:
5'-[pADH1-ALS.Pp-tDPI1]1-[pTDH3-ALD.Ea-tMET25]1-[pGMP1-BDH.Sc-tENO2]1-3'
Y en el que el constructo de ADN de la siguiente fórmula (IIh''):
5'-[pENO2-NOXE.Spn-tPGK1]-3' (IIh'')
Se inserta en el gen URA3,
En el que:
- el gen “ALS.Bs” del constructo de ADN de fórmula (IIg) está bajo el control del promotor del gen pdc en que dicho constructo de ADN de fórmula (IIg) se inserta,
- pENO2, pTEF3, pADH1, pTDH3, pGMP1, tTDH2, tCYC1, tTDH3, tDPI1, tMET25, tENO2 y tPGK1 son como se definen en la presente descripción y más particularmente en el listado de secuencias posterior,
- ALS.Bs, ALS.Pp, ALD.Ll, ALD.Ea, BDH.Ea, BDH.Sc y NOXE.Spn, NOXE.L1 son como se definen en la tabla 1 posterior y el modo particularmente en el listado de secuencias posterior.
Optimización de la producción de 2,3-butanodiol
Según una realización particular, la levadura recombinante según la presente descripción puede modificarse adicionalmente para optimizar la producción de 2,3-butanodiol.
Uso de fuentes alternativas de azúcar:
El uso directo de una fuente alternativa de azúcar tal como almidón necesita además la sobreexpresión en la levadura de la a-amilasa y glucoamilasa exógenas (Buscke et al. Biosource technology 2013).
Importación de azúcar - Mejora de la importación de azúcar C5:
La importación de pentosas mediante el microorganismo recombinante es un grave problema para el proceso industrial ya que los azúcares C5 son constituyentes principales de la biomasa lignocelulósica hidrolizada. Las cepas nativas de S. cerevisiae, como muchos otros tipos de levadura, son incapaces de utilizar la xilosa o la arabinosa como sustratos de fermentación (Hahn-Hagerdal et al., 2007; Jin et al., 2004). De forma interesante, es capaz de absorber xilosa incluso aunque el azúcar no sea un sustrato natural (Hamacher et al., 2002).
GAL2, HXT1, HXT2, HXT4, HXT5 y HXT7 de S. cerevisiae catalizan la absorción de xilosa porque tienen una amplia especificidad de sustrato (Hamacher et al., 2002; Saloheimo et al., 2007; Sedlak y Ho 2004). Sin embargo, su afinidad por la xilosa es mucho menor que por la glucosa y la absorción de xilosa por los transportadores está fuertemente inhibida por la glucosa (Saloheimo et al., 2007).
Se necesitan varios cambios para obtener una cepa capaz de crecer y consumir xilosa y/o arabinosa. Estas diferentes modificaciones son una parte de la invención.
Sobreexpresión de transportadores de xilosa heterólogos:
Para mejorar la absorción de xilosa y arabinosa, la cepa productora de 2,3-BDO recombinante tiene que modificarse para expresar genes heterólogos que codifican para los transportadores de xilosa o arabinosa. Por ejemplo, los genes GXF1, SUT1 y AT5g59250 de Candida intermedia, Pichia stipitis y Arabidopsis thaliana, respectivamente, se sobreexpresan para mejorar la utilización de xilosa por la levadura (Runquist et al., 2010).
Sobreexpresión de rutas implicadas en el metabolismo de xilosa y arabinosa:
Las cepas de levadura son capaces de absorber xilosa incluso aunque el azúcar no sea un sustrato natural. Incluso aunque los genes para la asimilación de xilosa estén presentes en S. cerevisiae no se expresan a un nivel suficiente
para permitir una asimilación de azúcar significativa. Por consiguiente, las modificaciones genéticas son necesarias para mejorar la asimilación de azúcares de pentosa. Todas las enzimas que permiten la transformación de xilosa o arabinosa a xilitol necesitan mejorarse además de las enzimas que convierten el xilitol en xilulosa, y la xilulosa en xilulosa-5-fosfato. Cualquiera de los dos, los genes homólogos de las rutas de xilosa y arabinosa tienen que sobreexpresarse o los genes heterólogos de las bacterias tienen que sobreexpresarse.
En una realización de la presente descripción, la absorción de xilosa y su asimilación por la cepa se mejoran sobreexpresando por ejemplo:
1) los genes XYL1 o GRE3 que codifican la aldolasa reductasa de P. stipitis y S. cerevisiae, respectivamente, asociados a la sobreexpresión de XYL2 que codifica la xilitol deshidrogenasa de P. stipitis, combinado con la sobreexpresión de los genes XKS1 o XYL3 que codifican la xiluloquinasa de S. cerevisiae y P. stipitis, respectivamente,
2) el gen xylA que codifica una xilosa isomerasa de bacterias o Piromyces asociado a la sobreexpresión de genes XKS1 o XYL3 que codifican la xiluloquinasa de S. cerevisiae y P. stipitis, respectivamente.
En otra realización, la absorción de arabinosa y su asimilación por la cepa se mejoran sobreexpresando por ejemplo: 1) los genes homólogos XYL1 o GRE3 que codifican la aldolasa reductasa de P. stipitis y S. cerevisiae, respectivamente, asociados a ladl que codifica la L-arabinitol 4-hidrogenasa e Ixrl que codifica una L-xilulosa reductasa de Trichoderma reesei, en combinación con la sobreexpresión de XYL2 que codifica la xilitol deshidrogenasa de P. stipitis, y además la sobreexpresión de los genes XKS1 o XYL3 que codifican la xiluloquinasa de S. cerevisiae y P. stipitis, respectivamente,
2) genes heterólogos araA y araB que codifican la arabinosa isomerasa y ribulosa quinasa bacterianas.
Optimización de la ruta de la pentosa fosfato:
Esto puede hacerse sobreexpresando al menos un gen que pertenece a la ruta de pentosa fosfato no oxidativa; TALI, TKL1, RKL1 y RPE1 de la cepa de levadura.
Optimización de la disponibilidad de cofactores NADPH necesarios para las enzimas implicadas en el metabolismo de los azúcares C5.
Esto se consigue expresando las transhidrogenasas de E. coli en la cepa de levadura. Los genes udhA y o pntAB de E. coli se sobreexpresarán en la cepa productora.
Impedimento del consumo de glucosa hacia la síntesis de glicerol:
Esto puede hacerse alterando el gen GPD1 que codifica la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa EC 1.1.1.8 (GPDH). La presente invención según esta realización es interesante particularmente en vista del rendimiento en 2,3-BDO a pesar del hecho de que la alteración del gen GPD1 lleva a eliminar una actividad enzimática que consume NADH en favor de NAD. Para compensar el desequilibrio redox así generado, la cepa alterada en GPD1 puede necesitar la expresión adicional de NOXE.
Según una realización particular, una cepa recombinante según la presente descripción es tal que no comprende ninguna modificación genética que tenga el efecto de reducir la represión de glucosa, como se describe en el documento WO 2011/041426 o Kim et al. (Bioresource Technology, vol. 146, 2013:274).
Según una realización particular, una cepa recombinante según la presente descripción es tal que no comprende ninguna modificación genética para permitir la expresión de cualquier ruta de asimilación de xilosa, como se describe en Kim et al. (Journal of Biotechnology, 2014).
Condiciones de cultivo
La presente invención también se refiere al uso de una levadura recombinante tal como se define anteriormente, para la producción de 2,3-butanodiol (BDO) y/o derivados directos del mismo, en particular seleccionándose dichos derivados directos de 2,3-butanodiol (BDO) del grupo que consiste en butano-dieno (BDE), metil-etil-cetona (MEK) o una mezcla de los mismos.
La presente descripción describe además un método de producción de 2,3-butanodiol (BDO) que comprende las siguientes etapas:
- proporcionar un microorganismo recombinante como se describe anteriormente, cultivando el microorganismo recombinante en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono, y
- recuperar el 2,3-butanodiol.
Típicamente, los microorganismos de la invención se cultivan a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20°C a aproximadamente 37°C, preferiblemente a una temperatura que oscila de 27 a 34°C, en un medio de cultivo apropiado.
Cuando la levadura recombinante según la invención pertenece a la especie S. cerevisiae, la temperatura puede oscilar ventajosamente de 27 a 34°C, en un medio de cultivo apropiado.
Los medios de crecimiento adecuados para la levadura son medios comunes preparados comercialmente tales como caldo que incluye base de nitrógeno de levadura, sulfato de amonio, y dextrosa como la fuente de carbono/energía) o medio YPD, una mezcla de peptona, extracto de levadura, y dextrosa en proporciones óptimas para el máximo crecimiento. También puede usarse otros medios de crecimiento definidos o sintéticos y el medio apropiado para el crecimiento del microorganismo particular se conocerá por un experto en la técnica de la microbiología o ciencia de la fermentación.
El término “medio de cultivo apropiado” se define anteriormente.
Ejemplos de medios de cultivo conocidos para una levadura recombinante según la presente descripción se conocen por el experto en la técnica, y se presentan en la siguiente publicación D. Burke et al., Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000).
Los intervalos de pH adecuados para la fermentación pueden estar entre pH 3,0 a pH 7,5, donde pH 4,5 a pH 6,5 se prefiere como la condición inicial.
Las fermentaciones pueden realizarse bajo condiciones aeróbicas o condiciones micro-aeróbicas.
La cantidad de producto en el medio de fermentación puede determinarse usando un número de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o cromatografía de gases (GC).
El proceso presente puede emplear un método de fermentación en lotes. Una fermentación en lotes clásica es un sistema cerrado donde la composición del medio se ajusta al comienzo de la fermentación y no se somete a alteraciones artificiales durante la fermentación. Por consiguiente, al comienzo de la fermentación, el medio se inocula con el organismo u organismos deseados, y se permite que la fermentación se dé sin añadir nada al sistema. Típicamente, sin embargo, una fermentación “en lotes” es un lote con respecto a la adición de la fuente de carbono y se hacen a menudo intentos de controlar factores tales como temperatura, pH y concentración de oxígeno. En los sistemas en lotes, las composiciones de metabolito y biomasa del sistema cambian constantemente hasta el momento en que la fermentación se para. En los cultivos en lotes las células progresan a través de una fase de latencia estática a una fase logarítmica de alto crecimiento y finalmente a una fase estacionaria donde la velocidad de crecimiento se disminuye o se detiene. Si no se tratan, las células en la fase estacionaria morirán con el tiempo. Las células en fase logarítmica generalmente son responsables de la mayor parte de la producción de producto final o intermedio.
Un sistema por lotes con alimentación puede usarse también en la presente invención. Un sistema por lotes con alimentación es similar a un sistema por lotes típico con la excepción que el sustrato fuente de carbono se añade en incrementos según progresa la fermentación. Los sistemas por lotes con alimentación son útiles cuando la represión del catabolito (p.ej. represión de la glucosa) es apta para inhibir el metabolismo de las células y donde es deseable tener cantidades limitadas de sustrato en los medios. La medida de la concentración de sustrato real en los sistemas por lotes con alimentación es difícil y por tanto se estima en base a los cambios de factores medibles tales como pH, oxígeno disuelto y la presión parcial de gases de desecho tal como CO2.
Las fermentaciones son comunes y bien conocidas en la técnica y pueden encontrarse ejemplos en Sunderland et al., (1992), incorporados en la presente memoria por referencia. Aunque la presente invención se realiza en modo de lotes se contempla que el método sería adaptable a la fermentación continua.
La fermentación continua es un sistema abierto donde un medio de fermentación definido se añade de forma continua a un biorreactor y una cantidad igual de medio acondicionado se elimina de forma simultánea para el procesado. La fermentación continua generalmente mantiene los cultivos a una alta densidad constante donde las células están principalmente en crecimiento en fase logarítmica.
La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afectan al crecimiento celular o concentración de producto final. Por ejemplo, un método mantendrá un nutriente limitante tal como la fuente de carbono o nivel de nitrógeno a una tasa fija y permitirá que todos los demás parámetros varíen. En otros sistemas un número de factores que afectan al crecimiento pueden alterarse de forma continua mientras que la concentración celular, medida por la turbidez del medio, se mantiene constante. Los sistemas continuos tratan de mantener las condiciones de crecimiento en estado estacionario y por consiguiente la pérdida celular debido al medio que se extrae debe equilibrarse frente a la tasa de crecimiento celular en la fermentación. Los métodos de modulación de nutrientes y factores de crecimiento para procesos de fermentación continua además de técnicas para maximizar la velocidad de formación de producto se conocen bien en la técnica de la microbiología industrial.
Se contempla que la presente invención pueda ponerse en práctica usando procesos en lotes, en lotes con alimentación o continuos, y que cualquier modo conocido de fermentación sería adecuado. Adicionalmente, se contempla que las células puedan inmovilizarse en un sustrato como catalizadores de células completas y someterse a condiciones de fermentación para la producción.
Purificación de 2,3-butanodiol
Según un aspecto específico de la invención, la producción fermentativa de 2,3-butanodiol comprende una etapa de aislamiento del 2,3-butanodiol del medio de cultivo. La recuperación del 2,3-butanodiol del medio de cultivo es una tarea rutinaria para un experto en la técnica. Puede conseguirse mediante un número de técnicas bien conocidas en la técnica que incluyen aunque no están limitadas a destilación, extracción por arrastre de gas, pervaporación o extracción líquida. El experto en el campo sabe cómo adaptar los parámetros de cada técnica dependiendo de las características del material a separar.
La levadura como modelo de microorganismo en la presente descripción se ha mantenido en que el 2,3-BDO sintetizado se exporta totalmente fuera de las células, simplificando el proceso de purificación.
El 2,3-BDO sintetizado puede recogerse por destilación. La destilación puede implicar un componente opcional diferente del medio de cultivo para facilitar el aislamiento de 2,3-butanodiol formando azeótropo y principalmente con agua. Este componente opcional es un disolvente orgánico tal como ciclohexano, pentano, butanol, benceno, tolueno, tricloroetileno, octano, dietiléter o una mezcla de los mismos.
La extracción por arrastre de gas se consigue con un gas de extracción por arrastre elegido entre helio, argón, dióxido de carbono, hidrógeno, nitrógeno o mezcla de los mismos.
La extracción líquida se consigue con disolvente orgánico como la fase hidrófoba tal como pentano, hexano, heptano, dodecano.
Las condiciones de purificación pueden adaptarse específicamente a la transformación corriente abajo de 2,3-BDO a metiletilcetona y/o 1,3-butadieno, que incluye mantener varios co-productos en el 2,3-BDO parcialmente purificado. A lo largo de la descripción, incluyendo las reivindicaciones, la expresión “que comprende un” debería entenderse como que es sinónimo con “que comprende al menos uno”, a menos que se especifique otra cosa.
Además, la expresión “fórmulas (I) a (IV), según el contexto considerado y a menos que hay indicaciones contrarias, significa un constructo de ADN de fórmulas (I), (II), (III) y (IV) aunque también (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (Mf’), (IIf’’), (IIg), (IIh’) y/o (IIh’’).
Los términos “entre... y...” y “que oscila de... a...” deberían entenderse como que son inclusivos de los límites, a menos que se especifique otra cosa.
Los ejemplos y figuras que siguen se presentan por medio de ilustración y sin limitación implícita de la invención. Ejemplos
a) Protocolo para fabricar una cepa de Saccharomyces cerevisiae recombinante según la invención
Todas las cepas de Saccharomyces cerevisiae recombinantes implementadas a continuación se construyeron a partir de la cepa estándar W303 (Thomas y Rothstein (1989), Cell. 56, 619-630) usando el procedimiento de genética molecular de levadura estándar (Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000) por D. Burke, D. Dawson, T. Stearns C S h L Press).
En estas cepas, la actividad de piruvato descarboxilasa se reduce por alteración de al menos uno de los genes pdc (pdc1, pdc5, pdc6) o por sustitución de su promotor de transcripción similar mediante un promotor débil.
En las cepas más eficientes, solo se suprimieron pdc1 y pdc6.
Una variedad de enzimas exógenas se expresó en las cepas de Saccharomyces cerevisiae recombinantes consideradas. Se eligieron según sus parámetros enzimáticos de Michaelis Menten cuando estaban disponibles (véase la tabla 1 posterior en la presente memoria). Alta kcat para alta eficiencia, y variedad de Km para cubrir diferente concentración en el sustrato. Las enzimas Paenibacillus polymyxa se eligieron porque este organismo es un productor de 2,3-BDO natural.
La nomenclatura de los genes en relación con las enzimas exógenas implementadas acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, butanodiol deshidrogenasa y NADH oxidasa formadora de agua se presenta en la Tabla 1 posterior.
Estos genes se designan por el acrónimo de la enzima seguido por el acrónimo del organismo de origen como sigue:
Tabla 1
Además, para una mejor comprensión de los siguientes genotipos:
- ade2, his3, leu2, trp1 y ura3 son genes marcadores de auxotrofía.
- las letras minúsculas significan que el gen considerado está inactivo, las letras mayúsculas reflejan un gen activo. - “ ::”: después de un nombre de gen significa que el gen se interrumpe por lo que sigue (si se inserta más de un gen, se anotan en corchetes []). La interrupción del gen es simultánea con una supresión completa de la secuencia de codificación pero conserva el promotor. En consecuencia el gen seguido por “::” está inactivo y se anota en minúsculas. Si no se especifica la transcripción del gen insertado se controla por el promotor del gen alterado.
- “gen.Kl” significa que el gen se origina a partir de Kluyveromyces lactis.
- Los promotores de transcripción que permiten la sobreexpresión constitutiva de un gen dado se encuentran en la bibliografía (Velculescu et al. (1997) Cell 88, 243-251). Los promotores usados en la presente memoria se designan por “p” seguidos por su nombre de gen parecido. Su respectivo número de secuencia también se menciona posteriormente.
- Los terminadores de transcripción se sitúan también después de cada gen. Para evitar la regulación indeseada los promotores y terminadores que enmarcan un gen insertado no se tomaron del mismo gen original. Los terminadores usados en la presente memoria se designan por “t” seguido por su nombre de gen parecido. Su respectivo número de secuencia también se menciona posteriormente.
Una agrupación de genes mencionados anteriormente se integró en la levadura recombinante de una vez usando la capacidad de la levadura de recombinar de forma eficiente los extremos de ADN libres que tienen la homología de secuencia.
La levadura recombinante se obtuvo según métodos publicados disponibles para el hombre de la técnica. En particular, puede seguirse el método descrito en Shao et al. (Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, núm. 2:e16) y Shao et al. (Methods in Enzimology, 2012 Elsevier Inc., Vol. 517:203), finalmente solo con una variación menor. Más particularmente, las secuencias de codificación a clonar se sintetizaron de forma artificial. Para secuencias heterólogas (no levadura), las secuencias nucleicas se modificaron para obtener una secuencia de codificación sinónima usando el uso del codón de la levadura. Usando la enzima de restricción y tecnología de clonación clásica, cada secuencia sintética se clonó entre un promotor de transcripción y un terminador de transcripción. Cada secuencia promotora está precedida por una secuencia de 50 a 200 nucleótidos homóloga a la secuencia del terminador del gen corriente arriba. De forma similar, el terminador de cada gen (un gen que comprende el promotorsecuencia de codificación-terminador) está seguida por secuencias homólogas al gen que sigue inmediatamente. Así cada una de las unidades a integrar tiene una superposición de 50-200 nucleótidos tanto con la unidad corriente arriba como con la unidad corriente abajo. Para la primera unidad, el promotor está precedido por 50-200 nucleótidos homólogos al nucleótido de cromosoma de levadura para la posición en que se integrará. De forma similar, para la última unidad, el terminador está seguido por 50-200 nucleótidos homólogos al nucleótido del cromosoma de la levadura para la posición en que se integrará.
Cada unidad se amplifica por PCR después a partir de constructos de plásmidos, dando la unidad X de ADN lineal que tiene secuencias superpuestas. Uno de estos genes es un marcador auxotrófico, para seleccionarse para el suceso de recombinación. Todos los fragmentos lineales se transforman en la levadura a la vez, y la levadura recombinante se selecciona para la auxotrofía relacionada con el marcador usado. La integridad de la secuencia se verifica entonces por PCR y secuenciación.
b) Respecto a las enzimas ALS y ALD
Las enzimas ALS y ALD no se evaluaron individualmente, sino en pares (ALS ALD) a través del rendimiento de acetoína. Tres ALD y ALS exógenas se eligieron según sus parámetros cinéticos: ALS.Nt, ALS.Pp, ALS.Bs y ALD.Bb, ALD.LI, ALD.Ea (véase anteriormente).
Ocho de las nueve posibles combinaciones de ALS y ALD se insertaron conjuntamente en el cromosoma de una cepa de levadura ura3 detrás de los promotores y seguido por un terminador.
La inserción de estos dos genes altera el gen pdc1. El gen marcador URA3 se inserta simultáneamente para seleccionar el transformante. La combinación ALS/ALD se insertó en la cepa YA747, concretamente un derivado de W303 que tiene el siguiente genotipo:
YA747: MAT-a, ade2, bdh1 ::TRP1.KI, his3, leu2, pdc1 ::HIS5.Sp, pdc6::LEU2.KI, trp1, ura3.
Las siguientes cepas se construyeron:
YA768: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.KI, his3, leu2, pdc1 ::[ALS.Bs-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, URA3.KI], pdc6::LEU2.KI, trp1, ura3
NB: en este caso, el gen “ALS.Bs” está bajo el control del promotor natural de pdc1, concretamente el promotor pPDC1.
YA769: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.KI, his3, leu2, pdc1 ::[ALS.Nt-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, URA3.KI], pdc6::LEU2.KI, trp1, ura3
YA770: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.KI, his3, leu2, pdc1 ::[ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, URA3.KI], pdc6::LUE2.KI, trp1, ura3
YA771: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.KI, his3, leu2, pdc1 ::[ALS.Nt-tTPI1, pTDH3-ALD.Bb-tMET25, URA3.KI], pdc6::LEU2.KI, trp1, ura3
YA772: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.KI, his3, leu2, pdc1 ::[ALS.Nt-tTPI1, pTDH3-ALD.Ll-tMET25, URA3.KI], pdc6::LEU2.KI, trp1, ura3
YA773: MAT-a, ade2, bdh1 ::TRP1 :KI, his3, leu2, pdc1 ::[ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Ll-tMET25, URA3.KI], pdc6::LEU2.KI, trp1, ura3
YA810: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.KI, his3, leu2, pdc1 ::[ALS.Bs-tTPI1, pTDH3-ALD.Bb-tMET25, URA3.KI], pdc6::LEU2.KI, trp1, ura3
YA811: MAT-a, ade2, bdh1::TRP1.KI, his3, leu2, pdc1 ::[ALS.Pp-tTPI1, pTDH3-ALD.Bb-tMET25, URA3.KI], pdce6::LEU2.KI, trp1, ura3
Todas estas cepas se cultivaron durante 24 horas en 8% de glucosa YPA (Extracto de levadura al 1%, Bacto peptona al 2%, adenina 0,1 mM, glucosa al 8%). Se cosecharon y se determinó el contenido de acetoína, etanol y 2,3-BDO según métodos estándar con especificidad adaptada en Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76670-679.
Para algunas cepas, se ensayaron varios clones, el último número después de la “-“ es el número de clon. Notar que como la enzima bdh endógena se altera, no se produce 2,3-BDO.
La producción de etanol, acetoína y 2,3-BDO se monitorizan después de los métodos estándar y Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76670-679.
Resultados
La tabla 2 posterior presenta la producción de acetoína de las cepas probadas mencionadas anteriormente.
Tabla 2
A partir de estos resultados, puede concluirse que, tomadas de forma separada, las mejores enzimas para mejorar la producción de acetoína son ALS Pp, ALS Nt, ALD Ea y ALD Bb que ciertamente parece que es la enzima más eficiente. La mayoría de las combinaciones de parejas de ALS y ALD se han ensayado en cepas que también sobreexpresan BDH. Estas cepas se clasificaron primero en su crecimiento en glucosa. Después dos de las cepas de crecimiento más rápido se ensayaron para la producción de butanodiol, concretamente:
YA538-5C: MAT-a, his3, leu2, pdc1 ::[ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll-tCYC1, pTEF3-BDH.Ea-tTDH3, URA3.KI], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-Tdpi1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pTEF2.KI-TRP1.Sc-tADH1, pGMP1 -BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3
YA919-19: MAT-a, his3, leu2, pdc1::[ALD.Bb-tPGK1, pTEF3-BDH.Ea-tTDH3, pENO2-ALS.Nt-tCYC1, LEU2.KI], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1, pTDH3-ALD.Ea-Tmet25, pTEF2.KI-TRP1.Sc-tADH1, pGMP1 -BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3
Ambos clones se cultivaron durante 48 horas en glucosa YPA al 16% en un matraz con deflectores de 250 ml bajo agitación vigorosa a 28°C. Las muestras se cosecharon a las 24 h, 32 h y 48 h. El contenido en etanol, acetoína y butanodiol en el lisato se ensayó, según los mismos protocolos como se referencia anteriormente.
Resultados
La tabla 3 posterior presenta estos contenidos de etanol, acetoína y 2,3-BDO en 16% de glucosa YPA.
Tabla 3
A partir de estos resultados, se concluye que la sobreexpresión de dos ALS y dos ALD aumenta significativamente la producción de 2,3-BDO (y por lo tanto de forma transitoria de acetoína) cuando se compara con solo un ALS y un ALD (véanse los resultados en la tabla 3 frente a la tabla 2).
La mejor combinación es ALS.Bs, ALS.Pp, ALD.Bb y ALD.Ea, aunque ALS.Bs y ALD.Bb no soportan una fuerte producción de acetoína por ellas mismas.
c) Determinación de las enzimas BDH más eficientes
Cuatro enzimas exógenas se sobreexpresaron usando el promotor pTEF1 en una cepa de levadura en que la enzima BDH1 endógena se ha inactivado. La actividad BDH presente en los diferentes lisatos celulares se ensayó y se compara con la actividad endógena.
La actividad BDH se monitoriza después de la aparición de NADH a través de la absorbancia a 340 nm, siguiendo el protocolo descrito en Gao et al. (2012) Journal of basic microbiology 52, 1-9.
Resultados
La tabla 4 posterior presenta la actividad BDH
Tabla 4
Las enzimas de Saccharomyces cerevisiae (Sc) y de Enterobacter aerogenes (Ea) parecen por consiguiente eficientes.
d) el efecto técnico ventajoso de la enzima NOXE en el rendimiento de 2,3-BDO
Tres copias de pENO2-NOXE.Spn-tPGK1 se insertaron en la cepa mencionada anteriormente YA538-5C, dando por consiguiente la cepa YA724-2. Las dos cepas se compararon por su respectiva producción de 2,3-BDO:
YA538-5C: MAT-a, his3, leu2, pdc1 ::[ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.LI-tCYC1, pTEF3-BDH.Ea-tTDH3, URA3.KI], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pTEF2.KI-TRP1.Sc-tADH1, pGMP1 -BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3
YA724-2: MAT-a, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.LI-tCYC1, pTEF3-BDH.Ea-tTDH3, LEU2.KI], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pTEF2.KI-TRP1.Sc-tADH1, pGMP1 -BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Spn-URA3KI-tPGK1]x3
YA538-5C y YA724-2 se cultivaron en glucosa YPA 24%. Se tomaron alícuotas a lo largo del cultivo, y se ensayaron los contenidos de etanol, acetoína y BDO y glucosa en el cultivo según el procedimiento estándar.
El contenido de etanol, acetoína y butanodiol se ensayaron según los mismos protocolos como se referencia anteriormente.
El consumo de glucosa se monitoriza también después de métodos estándar y Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76670-679.
Resultados
Los resultados se presentan en las tablas 5a y 5b posteriores.
Tabla 5a
* ND: No detectado.
Tabla 5b
* ND: No detectado
Estos resultados muestran que la sobreexpresión de NOXE lleva a una acumulación más rápida de 2,3-BDO que sin NOXE. Un cultivo largo lleva a una oxidación de 2,3-BDO de vuelta a la acetoína.
Los genes NOXE de diferente origen donde se insertan en la cepa YA388-1C, que tiene el siguiente genotipo: MAT a, his3, leu2, pdc1::HIS5.Sp, pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pTEF2.KI-TRP1.Sc-tADH1, pGMP1 -BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3
YA679-8, YA679-6 e YA679-4 contiene 1,2 y 12 copias de pENO2-NOXE.LI-tPGK1 respectivamente.
YA680-2, YA680-3, YA724-2 y YA721-2D contiene 1,2, 3 y 4 copias de pENO2-NOXE.Spn-tPGK1 respectivamente. La actividad NOXE en lisato de levadura se determinó según López de Felipe y Hungenholtz (2001) International Diary Journal 11,37-44.
Resultados
Los resultados se presentan en la tabla 6 posterior.
Tabla 6
Todos los genes NOXE presentan una interesante actividad NOXE. Sin embargo, NOXE.Spn parece más activa que NOXE.Ll.
Para optimizar la producción de 2,3-BDO, los genes NOXE de diverso origen y en diferentes números de copia se expresaron en YA538-5C.
Por consiguiente, se obtuvieron las siguientes cepas recombinantes.
YA719-2: MAT-a, his3, leu2, pdc1 ::[ALS-Bs-tTDH2, pENO2-ALD.LI-tCYC1, pTEF3-BDH.Ea-tTDH3, LEU2.KI], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pTEF2.KI-TRP1.Sc-tADH1, pGMP1 -BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.LI-tPGK1 -URA3]x12
YA721-2D: MAT-a, his3, leu2, pdc1 ::[ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.LI-tCYC1, pTEF3-BDH.Ea-tTDH3, LEU2.KI], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pTEF2.KI-TRP1.Sc-tADH1, pGMP1 -BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Spn-tPGK1-URA3]x4
YA724-2: MAT-a, his3, leu2, pdc1 ::[ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll-tCYC1, pTEF3-BDH.Ea-tTDH3, LEU2.KI], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pTEF2.KI-TRP1.Sc-tADH1, pGMP1 -BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Spn-tpGK1-URA3KI]x3
Estas cepas se cultivaron en 1,5 L de glucosa YPA al 30% en un fermentador de 3 L a 30°C bajo agitación (800 rpm) una oxigenación constante se mantuvo burbujeando 0,5 L/min-1 de aire. Se tomaron alícuotas a 24, 32, 48, 56 h, el contenido de etanol y 2,3-BDO y glucosa en el medio se determinó según métodos estándar y Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76670-679.
Resultados
Se presentan resultados en las tablas 7a, 7b y 7c posteriores.
Tabla 7a
Tabla 7b
Tabla 7c
En conclusión, el nivel de la expresión NOXE tiene una importancia extrema en la producción de 2,3-BDO. YA724-2 que expresa menos NOXE que las dos otras cepas, alcanza un óptimo. La otra cepa que expresa mayores niveles de NOXE, no acumulan tanto 2,3-BDO. Hay que darse cuenta de que 135,5 g de 2,3-BDO representa el 90% del rendimiento teórico óptimo (150 g) cuando se parte de 300 g de glucosa.
e) Cepa recombinante prototrófica por inserción de gen HIS3
La cepa YA724-2 descrita anteriormente se volvió prototrófica por inserción del gen HIS3.
La cepa recombinante resultante se denomina YA1044, y tiene el siguiente genotipo:
YA1044-4: MAT-a, his3::HIS3, leu2, pdc1 ::[ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll-tCYC1, pTEF3-BDH.Ea-tTDH3, LEU2.KI], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pTEF2.KI-TRP1.Sc-tADH1, pGMP1 -BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Spn-tPGK1-URA3KI]x3
Esta cepa se ensayó entonces para la producción de 2,3-BDO en 30% de glucosa YPA bajo la misma condición que se describe anteriormente.
La producción de etanol, acetoína y 2,3-BDO y el consumo de glucosa se monitorizan siguiendo métodos estándar y Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76670-679.
Resultados
Los resultados se presentaron en la tabla 8 posterior.
Tabla 8
Esta cepa produce como mucho 147,9 g de 2,3-BDO (98% del rendimiento teórico partiendo de 300 g de glucosa). Esta cepa también produce 2,3-BDO de forma eficiente en el 30% de sacarosa YPA (de otra forma las mismas condiciones que anteriormente).
Los resultados se presentan en la tabla 9 posterior.
Tabla 9
Esta cepa también produce 2,3-BDO de forma eficiente en un medio de maíz fermentado
f) Atenuación del pdc5
Una levadura recombinante según YA1044-4 tal como se menciona anteriormente pero que difiere en que el gen pdc5 se atenúa más se ha preparado. La levadura recombinante resultante se denomina YA1245-1.
YA1245-1: pdc1 ::[ALS.Bs-ALD.Ll-BDH.Ea-LEU2.KI], pdc5::[HIS5.Sp, pRPLA1-PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Spn-URA3]x3
Esta cepa se ensayó después para la producción de 2,3-BDO en 30% de glucosa CSL (licor de maíz fermentado) bajo la misma condición que se describe anteriormente.
La producción de etanol, acetoína y 2,3-BDO y consumo de glucosa se monitoriza siguiendo métodos estándar y Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76670-679.
Resultados
Los resultados se presentan en la tabla 10 posterior.
Tabla 10
____ ___
La cepa también produce 2,3-BDO de forma eficiente en 30% de glucosa YPA (de otra forma las mismas condiciones que anteriormente).
Los resultados se presentan en la tabla 11 posterior.
Tabla 11
g) Modificaciones genéticas adicionales
Los ejemplos posteriores en la presente memoria parten de la levadura recombinante mencionada anteriormente YA1245-1, concretamente:
YA1245-1: MAT-a, his3, pdc1::[ALS.Bs-tTDH2, pENO2-ALD.Ll-tCYC1, pTEF3-BDH.Ea-tTDH3-LEU2.KI], pdc5::[HIS5.Sp-RS-pRPLA1-PDC5], pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1, pTDH3-ALD.Ea-tMET25, pTEF2kl-TRP1.SctADH1, pGMP1 -BDH.Sc-tENO2], trp1, ura3::[pENO2-NOXE.Sp-tPGK1, URA3]x3
Esta cepa se cultivó en 1,5 L de sacarosa YPA al 35% en un termentador de 3 L a 30°C bajo agitación (800 rpm) una oxigenación constante se mantuvo burbujeando 0,5 L/min-1 de aire. Se tomaron alícuotas a 24, 32 y 48 h, de contenido de etanol, acetoína y 2,3-BDO en el medio se determinó según métodos estándar y Gonzales et al. (2010), Applied and environmental Microbiology 76670-679.
Los resultados se presentan en la tabla 12 posterior.
Tabla 12
Este rendimiento en 2,3-BDO es el 96,6% del rendimiento máximo teórico.
Estos resultados confirman por consiguiente la capacidad de una cepa recombinante según la invención para crecer y también para producir de forma eficiente 2,3-BDO en sacarosa.
Dos cepas adicionales YA1898-3 e YA1950-1, derivadas de la cepa recombinante presentada anteriormente YA1245-1, se realizaron.
La cepa YA1898-3 difiere de la cepa YA1245-1 en que el gen LEU2.KI se ha escindido.
El gen LEU2.KI se refiere a las secuencias SEQ ID N° 55 y 56.
YA1898-3: Mat-a, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea], pdc5::[HIS5-Sp-RS-pRPLA1-PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3
La cepa YA1953-1 difiere de la cepa YA1245-1 en que los genes LEU2.KI e HIS5 se han escindido.
YA1953-1: Mat-a, his3, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea], pdc5::[RS-pRPLA1-PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.S-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3
g)1) Mejora de resistencia a los ácidos débiles en el medio de cultivo
Se sabe que la presencia de ácidos débiles es una limitación para el crecimiento cuando las cepas se cultivan en medio derivado de celulosa o melaza. En las siguientes cepas, que se derivan de la cepa mencionada anteriormente YA1898-3 o YA1950-1, una o dos modificaciones se han insertado para intentar mejorar la resistencia de las cepas a los ácidos débiles en el medio. Las modificaciones consisten en la alteración del gen Jen1 o la sobreexpresión del gen HAA-1.
La secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos del gen HAA-1 están relacionadas con las secuencias SEQ ID N° 53 y 54 respectivamente.
En YA1950-1, jen1 se ha alterado por LEU2.KI.
YA1950-1: Mat-a, his3, jen1::LEU2.KI-RS, leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea], pdc5::[HIS5.Sp-RS-pRPLA1-PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3
En las siguientes cepas YA1955-11, YA1997-2B e YA2036-1, HAA1 se sobreexpresa usando diferentes terminadores. A este respecto, el terminador tDIT 1 se refiere a la secuencia SEQ ID N° 51.
YA1955-11: Mat-a, his3, leu2::[LEU2.KI-pTDH3-HAA1 -tDIT 1 ], pdc1 ::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea], pdc5::[HIS5.SppRPLA1 -PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3
YA1997-2B: Mat-a, his3, leu2::[LEU2.KI-pTDH3-HAA1 -tDIT 1 ], pdc1 ::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea], pdc5::[HIS5.SppRPLA1 -PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD-Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3
YA2036-1: Mat-a, his3, leu2::[LEU2.KI-pTDH3-HAA1-tTDH3], pdc1 ::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea], pdc5::[HIS5.SppRPLA1 -PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3.
En las siguientes cepas YA2007-2 e YA2008-13, HAA-1 se ha insertado en jlp1 (gen de sulfonato dioxigenasa) y SAM3 (gen de s-adenosil permeasa) respectivamente:
YA2007-2: Mat-a, his3, jlp1 ::[LEU2.KI-pTDH3-HAA1-tDIT1], leu2, pdc1 ::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea-], pdc5::[HIS5.SppRPLA1 -PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3
YA2008-13: Mat-a, his3, sam3::[LEU2.KI-pTDH3-HAA1-tDIT1], leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea], pdc5::[HIS5.Sp-pRPLA1 -PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3 En las siguientes cepas YA2188-2A, YA2208-1C e YA2208-3C, HAA1 se ha insertado en Jen1 que por lo tanto se inactiva:
YA2188-2A: Mat-a, his3, jen1 ::[LEU2.KI-pTDH3-HAA1 -tTDH3], leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea], pdc5::[HIS5.Sp-pRPLA1-PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3 YA2208-1C: Mat-a, his3, jen1 ::[LEU2.KI-pTDH3-HAA1 -tTDH3], leu2, pdc1 ::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea], pdc5::[HIS5.Sp-pRPLA1-PDC5], pdc6::[ALS-Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3 g)2) Impedimento del consumo de glucosa hacia la síntesis de glicerol
En la siguiente cepa YA2153-1 e YA2153-11, derivada de la cepa anterior YA1898-3, el gen de glicerolfosfato deshidrogenasa gdp1 se ha inactivado por alteración para evitar el consumo de glucosa hacia la síntesis de glicerol: YA2153-1: Mat-a, gdp1 ::LEU2.KI-RS, his3, leu2, pdc1 ::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea], pdc5::[HIS5.Sp-pRPLA1 -PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3
g)3) Alteración adicional de una pluralidad de genes
Las siguientes cepas tienen los mismos promotores y terminadores que la cepa definida anteriormente YA-1245 excepto que se mencione otra cosa. Una pluralidad de los genes se ha alterado usando LoxP, que es un corto que tiene la secuencia SEQ ID N°52.
DA385: MAT-a/MAT-a, his3/his3, leu2/leu2, pdc1 ::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea-LEU2.KI]/pdc1 ::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea-LEU2.KI], pdc5::[HIS5.Sp-RS-pRPLA1-PDC5]/pdc5::HIS5.Sp, pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc]/pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1/trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3/ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3 DA411: MAT-a/MAT-a, ade2/ade2, his3/his3, leu2/leu2, pdc1::loxP/pdc1::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea-LEU2.KI], pdc5::loxP/pdc5::[HIS5.Sp-pRPLA1-PDC5], pdc6::loxP/pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1/trp1, ura3/ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3
DA426: MAT-a/MAT-a, ADE2/ade2, his3/his3, leu2/leu2, pdc1 ::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea-LEU2.KI]/pdc1 ::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea-LEU2.KI], pdc5::[HIS5.Sp-pRPLA1-PDC5]/pdc5::URA3.KI, pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc]/pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-b Dh .Sc], trp1/trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3/ura3
DA510: MAT-a/MAT-a, his3/his3, JEN1/jen1::[LEU2.KI-RS-pTDH3-HAA1-tTDH3], leu2/leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea]/pdc1 ::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea], pdc5::[HIS5.Sp-pRPLA1 -PDC5]/pdc5::[HIS5.Sp-RS-pRPLA1 -PDC5], pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc]/pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1/trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3/ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3
DA511: MAT-a/MAT-a, his3/his3, JEN1/jen1::[LEU2.KI-RS-pTDH3-HAA1-tTDH3], leu2/leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea]/pdc1 ::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea-LEU2.KI], pdc5::[HIS5.Sp-RS-pRPLA1-PDC5]/pdc5::HIS5.Sp, pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc]/pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1/trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3/ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3
DA512: MAT-a/MAT-a, his3/his3, JEN1/jen1::[LEU2.KI-RS-pTDH3-HAA1-tTDH3], leu2/leu2, pdc1::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea]/pdc1 ::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea-LEU2.KI], pdc5::[HIS5.Sp-RS-pRPLA1 -PDC5]/pdc5::URA3.KI, pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc]/pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1/trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3/ura3
DA540: MAT-a/MAT-a, his3/his3, jen1 ::[LEU2.KI-RS-pTDH3-HAA1-tTDH3]/jen1 ::[LEU2.KI-RS-pTDH3-HAA1-tTDH3], leu2/leu2, pdc1 ::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea]/pdc1 ::[ALS.Bs-ALD.LI-BDH.Ea-LEU2.KI], pdc5::[HIS5.Sp-RS-pRPLA1-PDC5]/pdc5::URA3.KI, pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc]/pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-TRP1.Sc-BDH.Sc], trp1/trp1, ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3/ura3::[NOXE.Sp-URA3]x3
Conclusión
Todas las cepas descritas en el punto actual g) se han probado para la producción de 2,3 BDO; producen la cantidad equivalente que la cepa recombinante mencionada anteriormente YA1245.
Algunas de las cepas mencionadas anteriormente presentaron además efectos técnicos ventajosos en que llevan a una reducción de la síntesis de glicerol o una resistencia mejorada a los ácidos débiles en el medio de cultivo.
Claims (16)
1. Una levadura recombinante que tiene una actividad piruvato descarboxilasa reducida, en cuyo genoma se ha insertado:
- uno o más ácidos nucleicos que codifican una acetolactato sintasa o ALS,
- uno o más ácidos nucleicos que codifican una acetolactato descarboxilasa o ALD,
- uno o más ácidos nucleicos que codifican una butanodiol deshidrogenasa o BDH, y
- una o más copias de unos ácidos nucleicos que codifican una NADH oxidasa o NOXE,
Codificando dicha uno o más copias de unos ácidos nucleicos una NADH oxidasa o NOXE que se selecciona del grupo que consiste en secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos 78%, preferiblemente al menos 80%, de identidad de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO:23 que presenta la actividad biológica deseada, y
Dicha actividad piruvato descarboxilasa se reduce mediante (i) alteración de al menos un gen que codifica una piruvato descarboxilasa insertando en dicho al menos un gen que codifica una piruvato descarboxilasa al menos un constructo de ADN exógeno, (ii) mutaciones en regiones reguladoras, (iii) mutaciones en un codón de partida, principalmente sustituyendo AUG por GUG, (iv) mutaciones en secuencias de codificación que alteran la actividad enzimática (v) mutaciones, inserciones o supresión en la secuencia de codificación que altera la estabilidad de la proteína y (vi) mutaciones que alteran la vida media de ARNm de piruvato descarboxilasa.
2. La levadura recombinante según la reivindicación 1, en donde la levadura recombinante dicha comprende uno o más constructos de ADN seleccionados en un grupo que comprende las siguientes fórmulas:
(I) 5’-[Gen 1 ]x1-3’ y 5’-[Gen 2]x2-3’ y 5’-[Gen 3]x3-3’ y 5’-[Gen 4]x4-3’,
(II) 5’-[Gen 1]x1-[Gen 2]x2-[Gen 3]xa-3’ y 5’-[Gen 4]x4-3’,
(III) 5’-[Gen 1]x1-[Gen 2]x2-3’ y 5’-[Gen 3]x3-[Gen 4]x4-3’,
(IV) 5’-[Gen 1]x1-[Gen 2]x2-[Gen 3]x3-[Gen 4]x4-3’, y
Una combinación de las mismas,
En las que:
- “Gen 1” significa un ácido nucleico seleccionado de un grupo que comprende ALS, ALD, BDH o NOXE;
- “Gen 2” significa un ácido nucleico seleccionado de un grupo que comprende ALS, ALD, BDH o NOXE pero diferente del gen 1;
- “Gen 3” significa un ácido nucleico seleccionado de un grupo que comprende ALS, ALD, BDH o NOXE pero diferentes de los genes 1 y 2;
- “Gen 4” significa un ácido nucleico seleccionado de un grupo que comprende ALS, ALD, BDH o NOXE pero diferente de los genes 1 a 3;
- “ALS” es un ácido nucleico que codifica una acetolactato sintasa;
- “ALD” es un ácido nucleico que codifica una acetolactato descarboxilasa;
- “BDH” es un ácido nucleico que codifica una butanodiol deshidrogenasa;
- “NOXE” es un ácido nucleico que codifica una NADH oxidasa;
- cada uno de “x1”, “x2”, “x3” y “x4”, uno independientemente de los otros, representa un número entero que oscila de 0 a 50, preferiblemente de 0 a 20, y lo más preferiblemente uno, y
Con tal que dicha levadura recombinante comprenda al menos un ácido nucleico que codifica para cada uno de ALS, ALD, BDH y NOXE.
3. La levadura recombinante según la reivindicación 2, en la que la levadura recombinante dicha comprende al menos un constructo de ADN de fórmula (II), en la que “Gen 4” significa un ácido nucleico que codifica NADH oxidasa.
4. La levadura recombinante según la reivindicación 2 o 3, en la que la levadura recombinante dicha comprende al menos uno, preferiblemente al menos dos, constructo(s) de ADN de fórmula (IIa), idénticos o diferentes, en los que cada fórmula (IIa) tiene la siguiente fórmula:
(lla) 5’-[(prom5)y1-Gen 1-term5]x5-[prom1-Gen 1-term1]x1-[prom2-Gen 2-term2]x2-[prom3-Gen 3-(term3)z1]x3-3’ y 5’-[(prom4)y2-Gen 4-(term4)z2]x4-3’
En la que:
- Gen 1, Gen 2, Gen 3 y Gen 4 son como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, y “x1”, “x2”, “x3” y “x4” son como se definen en la reivindicación 2;
- “x5” representa un número entero igual a 0 o 1;
- “y1”, “y2”, “z1” y “z2”, uno independientemente de los otros, representan un número entero igual a 0 o 1;
- cuando dicha levadura recombinante comprende al menos dos constructos de ADN de fórmula (IIa), entonces “x1” a “x5”, “y1”, “y2”, “z1” y “z2” pueden ser idénticos o diferentes;
- “prom 1 ” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica el gen 1;
- “prom 2” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica el gen 2;
- “prom 3” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica el gen 3;
- “prom 4” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica el gen 4;
- “prom5” es una secuencia reguladora que controla la expresión del Gen 1, siendo dicho prom5 idéntico o diferente de prom1;
- “term1” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica el gen 1;
- “term2” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica el gen 2;
- “term3” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica el gen 3;
- “term4” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica el gen 4; y
- “term5” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión del Gen 1, siendo dicho term5 idéntico o diferente de term1.
5. La levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en la que la levadura recombinante dicha comprende al menos uno, preferiblemente al menos dos, constructo(s) de ADN de fórmula (IIb), idénticos o diferentes, en los que cada fórmula (IIb) tiene la siguiente fórmula:
(llb) 5’-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-term2]x2-[prom3-BDH-(term3)z1]x3-3’ y 5’-[(prom4)y2-NoXE-(term4)z2]x4-3’
En la que:
- ALS, ALD, BDH y NOXE son como se definen en cualquiera de las reivindicaciones anteriores; “x1”, “x2”, “x3” y “x4” son como se definen en la reivindicación 2; y “x5” e “y1”, “y2”, “z1” y “z2” son como se definen en la reivindicación 4;
- cuando dicha levadura recombinante comprende al menos dos constructos de ADN de fórmula (IIb), entonces “x1” a “x5”, “y1”, “y2”, “z1” y “z2” pueden ser idénticos o diferentes;
- “prom 1” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato sintasa;
- “prom 2” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato descarboxilasa;
- “prom 3” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica la butanodiol deshidrogenasa;
- “prom 4” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica la NADH oxidasa; - “prom5” es una secuencia reguladora que controla la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato sintasa, siendo dicha prom5 idéntica o diferente de prom1;
- “term1” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato sintasa;
- “term2” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato descarboxilasa;
- “term3” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica la butanodiol deshidrogenasa;
- “term4” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica la NADH oxidasa; y
- “term5” es una secuencia terminadora de la transcripción que termina la expresión de la secuencia que codifica la acetolactato sintasa, siendo dicho term5 idéntico o diferente del term1.
6. La levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en la que la levadura recombinante comprende al menos dos constructos de ADN de fórmula (II), (IIa) o (IIb), con tal que todas las copias del ácido nucleico de NOXE estén situadas en uno solo de los al menos dos constructos de ADN de fórmula (II), (IIa) o (IIb).
7. La levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en la que la levadura recombinante dicha comprende al menos dos, preferiblemente estrictamente dos, constructos de a Dn de las siguientes fórmulas (IIc) y (IId):
(llc) 5’-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-term2]x2-[prom3-BDH-(term3)z1]x3-3’ y 5’-[(prom4)y2-NOXE-(term4)z2]x6-3’; y
(lld) 5’-[(prom5)y1-ALS-term5]x5-[prom1-ALS-term1]x1-[prom2-ALD-term2]x2-[prom3-BDH-(term3)z1]x3-3’ y 5’-[(prom4)y2-NoXE-(term4)z2]x7-3’;
En las que:
- ALS, ALD, BDH y NOXE son como se definen en cualquiera de las reivindicaciones anteriores; “prom1”, “prom2”, “prom3”, “prom4”, “prom5”, “term1”, “term2”, “term3”, “term4” y “term5” son como se definen en las reivindicaciones 4 a 5; “x1”, “x2” y “x3” son como se definen en la reivindicación 2; y “x5”, “y1”, “y2”, “z1” y “z2” son como se definen en la reivindicación 4;
- “x1” a “x3”, “x5”, “y1”, “y2”, “z1” y “z2” que son para cada una de las fórmulas (IIc) y (IId) idénticos o diferentes; y - “x6” y “x7” representa números enteros que oscilan de 0 a 50, preferiblemente 0 a 20, preferiblemente de 0 a 12, más particularmente de 2 a 5, preferiblemente de 3 a 4, y mejor aún igual a 3, con tal que uno entre “x6” y “x7” represente 0.
8. La levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el (los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) la acetolactato sintasa o ALS es/son ácido(s) nucleico(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 65%, preferiblemente al menos 80%, de identidad de ácido nucleico con las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO:1,3 y 5.
9. La levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el (los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) la acetolactato descarboxilasa o ALD es/son ácido(s) nucleico(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 36%, preferiblemente al menos 80%, de identidad de ácido nucleico con las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO:7, 9 y 11.
10. La levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el (los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) la butanodiol deshidrogenasa o BDH es/son ácido(s) nucleico(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 63%, preferiblemente al menos 80% de identidad de ácido nucleico con las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO: 13, 15, 17 y 19.
11. La levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que cada uno de los ácidos nucleicos que codifican acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, butanodiol deshidrogenasa, y NADH oxidasa está bajo el control de un promotor, idéntico o diferente, caracterizándose dichos promotores por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 80% de identidad de ácido nucleico con las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO:29 a 39, 49 y 50.
12. La levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que cada uno de los ácidos nucleicos que codifican acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, butanodiol deshidrogenasa, y NADH oxidasa está bajo el control de un terminador de transcripción, idéntico o diferente, caracterizándose dichos terminadores de transcripción por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en secuencias que tienen al menos 80% de identidad de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:40 a 48.
13. La levadura recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una o más copias de unos ácidos nucleicos que codifican una NADH oxidasa o NOXE seleccionada del grupo que comprende Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis, Lactobacillus brevis, y una mezcla de los mismos.
14. El uso de una levadura recombinante como se define según las reivindicaciones 1 a 13, para la producción de 2.3- butanodiol (BDO) y/o derivados directos del mismo, seleccionándose en particular dichos derivados directos de 2.3- butanodiol (BDO) del grupo que consiste en butanodieno (BDE), metiletilcetona (MEK) o una mezcla de los mismos.
15. El método para producir 2,3-butanodiol (BDO), comprendiendo dicho método las etapas de:
(a) cultivar una levadura recombinante tal como se define según las reivindicaciones 1 a 13 en un medio de cultivo apropiado; y
(c) recuperar el 2,3-butanodiol (BDO).
16. El método según la reivindicación anterior, en el que el medio de cultivo dicho comprende una fuente de carbono, preferiblemente seleccionada en un grupo que comprende glucosa y sacarosa.
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