JPH0989895A - トランスフェリン−トランスフェリンレセプター・コンプレックス測定試薬および測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明の課題は、トランスフェリン−トランス
フェリンレセプター・コンプレックス（Ｔｆ−ＴｆＲコ
ンプレックス）を簡便な操作で測定しうる試薬と、測定
方法を提供することである。 【解決手段】本発明は、ＴｆＲに親和性のある物質を固
定した不溶性粒子で構成されるＴｆ−ＴｆＲコンプレッ
クス測定試薬、並びにこの試薬を用いたＴｆ−ＴｆＲコ
ンプレックスの測定方法である。親和性物質としては、
ＴｆＲやＴｆに対する抗体が有利である。 【効果】本発明は、操作性に優れた粒子凝集反応による
Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスの測定技術を提供する。本
発明によってＴｆＲの測定範囲が拡大し、試料を希釈す
ること無く広い濃度範囲を測定することができる。測定
範囲の拡大は、特に造血機能の診断マーカーとしてＴｆ
Ｒを測定する場合に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト体液中のトランス
フェリンレセプター（以下ＴｆＲと省略する）濃度に基
づいて各種疾病の診断に利用するための測定試薬と、こ
の試薬によるＴｆＲの測定方法に関する。ＴｆＲは各種
細胞の表層に存在し、鉄輸送蛋白トランスフェリン（以
下Ｔｆと省略する）と結合する役割を担っている。Ｔｆ
ＲとＴｆの親和性は約１０^-9と抗原抗体反応に匹敵する
ほど強く、そのうえ一般には血中のＴｆがＴｆＲの１０
³倍も多量に存在することから、血中においてはほとん
どのＴｆＲがＴｆと結合した型で存在する。血中ＴｆＲ
濃度は、癌や造血機能等の指標として有用であることが
知られている。

【０００２】

【従来の技術】体液中のＴｆＲを測定する方法として
は、癌診断を目的として標識免疫測定法を応用した報告
（特開昭６２−６１６９）があった。この報告で採用さ
れている酵素免疫測定法（以下ＥＩＡと省略する）に代
表される標識物質を利用した免疫測定法は、一般的には
感度を上げる場合に用いられる方法である。標識物質と
してしばしば用いられる物としては、¹²⁵Ｉのような放
射性同位元素や、ペルオキシダーゼ（以下ＰＯＤと省略
する）、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ
等の酵素が挙げられる。放射性同位元素を標識物質とし
て用いる免疫測定法をＲＩＡ法、酵素を標識物質として
用いる免疫測定法をＥＩＡ法と呼んでいる。ＲＩＡ法
は、標識物質として放射性同位元素を用いるために特別
な施設や装置を求められるので簡易であるとは言い難
い。またＥＩＡ法は、免疫反応の他に標識物質である酵
素を特定の基質に反応させる酵素反応のステップがある
ため、反応様式や試薬構成が複雑となる。またいずれの
方法においても、不均一系の反応原理を採用する限りは
結合相と遊離相との分離（Ｂ／Ｆ分離）が要求され、自
動化や迅速化の障害となりやすい。

【０００３】更にＲＩＡ法、ＥＩＡ法ともに測定の感度
を上げる方向で発達してきた経緯があるため、検体であ
る体液中に測定対象である物質が測定可能範囲の上限を
越えて多量に存在する場合には検体を希釈するステップ
が必要となる。ＴｆＲは血中に比較的高い濃度で存在す
るので、ＥＩＡ法のような標識法による測定技術ではし
ばしば検体の希釈を要求される。

【０００４】ところでＴｆＲは先に紹介した癌の診断マ
ーカーとしての用途の他に造血機能のマーカーとなるこ
とも指摘されている(Clin.Chem.41/7,1053-1064;199
5)。造血機能のマーカーとしてＴｆＲを測定するときに
は、癌マーカーとして測定する場合に比べてより高い水
準のＴｆＲ値を測定することが多くなる。そのためこれ
までに知られているような高い感度を追求した測定系で
はしばしば測定範囲を越える試料が出現することにな
り、希釈操作が要求される。つまりこれまでに報告され
ているＴｆＲの測定技術の測定濃度域は、実際に要求さ
れる濃度域をカバーできていないのである。したがって
造血機能障害を疑う患者の機能検査に用いることのでき
る簡便なＴｆＲ測定技術の提供が望まれている。また標
識法による測定技術においては、高い感度を得やすいよ
うに反応時間を長く取る場合が少なくない。このような
背景から、より簡便な操作で迅速な測定を実現するＴｆ
Ｒ測定技術の提供が待たれている。

【０００５】更に従来のＴｆＲ測定技術は、標準物質に
ついての問題も持っていた。つまり、ＴｆＲの精製物を
入手することはできるものの遊離した状態では安定性に
問題が有った。具体的には、精製ＴｆＲを放置しておく
と不溶性のアグリゲートもしくはオリゴマーの形成が観
察されるのである。精製ＴｆＲがアグリゲートを形成し
ていることはＧ３０００によるゲルろ過のパターンで確
認できる。またアグリゲートを解離させるために界面活
性剤処理すると、反応性が約２倍に上がるケースが有る
ことも確認した。このような不安定な標準物質に基づい
て得られた測定値の信頼性には限界が有る。加えて精製
ＴｆＲと血中に存在するＴｆ−ＴｆＲコンプレックスと
では同じ抗体に対する反応性に差の出ることがある。発
明者らの知見によれば、血清から精製したＴｆ−ＴｆＲ
コンプレックスは精製ＴｆＲに比べて４倍も高い反応性
を示した。たとえば今までの報告ではＴｆＲとして正常
値が約５０００ng/ml、また測定範囲として１０００〜
５００００ng/mlとある。しかしこれは用いた標準が組
織由来の精製ＴｆＲであるためその値の信頼性は低いと
言える。したがってＴｆＲの測定技術を一般に普及させ
るには、測定のための標準物質を安定な状態で流通させ
るための配慮が求められる。そのうえ先に述べたように
高い濃度域の測定を行うには、目的とする濃度域に応じ
た高濃度の標準が求められる。しかし従来はこのような
条件を満足する標準物質は提供されていなかった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は鉄と造血機
能との関連から、鉄輸送蛋白Ｔｆの受容体である体液中
のＴｆＲ濃度を測定することの意義が大きいと考えた。
そしてそのためには、より簡易に測定でき、しかも自動
化しやすい測定系と、より適切な測定濃度域を持つ試薬
が必要である。すなわち本発明は、従来のＴｆＲ測定技
術では試料の希釈を要求されるような高濃度域であって
も、低濃度域と同じ条件で測定可能な広い測定レンジを
実現する新しいＴｆＲの測定技術の提供を課題とするも
のである。更には、この新しい測定技術をサポートす
る、安定性と信頼性に優れる新規な標準物質を提供する
ことを課題としている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の課題は、ＴｆＲ
親和性物質を固定した不溶性粒子、またはＴｆＲ親和性
物質とＴｆ親和性物質とを個別にまたは混合して固定し
た不溶性粒子で構成されるＴｆ−ＴｆＲコンプレックス
測定試薬、ならびにこの試薬を用いた測定方法によって
解決される。

【０００８】本発明におけるＴｆＲ親和性物質の代表的
なものは、抗ＴｆＲ抗体や抗Ｔｆ−ＴｆＲコンプレック
ス抗体などの抗体である。またＴｆ−ＴｆＲコンプレッ
クスを測定対象としているので、抗Ｔｆ抗体も親和性物
質として挙げることができる。Ｔｆを介してＴｆＲと特
異的に結合すると考えられるためである。親和性物質と
して抗体を用いる場合は、充分抗体価の高い抗体を選び
さえすれば検体となる生体体液中に親和性の点で競合す
るものがなく有利である。抗体としては通常の方法によ
りマウス、ラット、家兎、山羊などを免疫して得たポリ
クローナル抗体を利用できる。もちろん、モノクローナ
ル抗体も使用できることは言うまでもない。ＴｆＲに対
する抗体は、これまでにいくつか報告されている。これ
ら公知の抗体は、ポリクローナル抗体であれ、モノクロ
ーナル抗体であれ、不溶性粒子に感作した状態でＴｆＲ
と反応して凝集しうる親和性と特異性を備えているもの
であれば本発明に利用することができる。

【０００９】中でもポリクローナル抗体は、次のような
背景から好ましい抗体として示すことができる。まず凝
集反応の反応原理から考えると、粒子に固定する親和性
物質と被検物質との結合部位の数が多いほうが一般的に
有利である。つまり結合部位が制限されるモノクローナ
ル抗体よりも多数の結合部位を認識するポリクローナル
抗体の方が有利となる。更にＴｆとコンプレックスを形
成したＴｆＲを測定するために、ＴｆＲ上のＴｆ結合部
位はＴｆにカバーされてしまっている。このようなコン
プレックスでは、Ｔｆ結合部位を認識する抗体はもはや
結合することができない。これらの理由からポリクロー
ナル抗体が好ましい抗体として挙げられるのである。

【００１０】より高い特異性を期待するとき、あるいは
免疫原としてのＴｆＲやＴｆの消費量を少なくしたいと
きには、抗体としてモノクローナル抗体を利用しても良
い。ただしモノクローナル抗体を利用するときには先に
述べたような事情を考慮して、より有利な結合親和性を
持つクローンを選択するべきである。たとえば、ＴｆＲ
のＴｆ結合部位を認識するような抗体は、Ｔｆによって
結合部位をブロックされてしまうので選択すべきではな
い。したがってモノクローナル抗体の結合部位として、
ＴｆＲのＴｆ結合部位以外に存在する抗原決定基、Ｔｆ
−ＴｆＲコンプレックスに特異的に存在する抗原決定
基、Ｔｆに特異的な抗原決定基等を利用するのが好まし
い。特にＴｆＲのＴｆ結合部位以外に存在する抗原決定
基とＴｆに特異的な抗原決定基とを認識するモノクロー
ナル抗体の組合せは、血液中でコンプレックスを形成し
ているＴｆＲを確実に測定することができる好ましい組
合せである。これらのモノクローナル抗体を固定した不
溶性粒子を混合するか、あるいはモノクローナル抗体の
混合物を不溶性粒子に固定することにより本発明による
試薬を得ることができる。抗Ｔｆモノクローナル抗体で
構成した本発明による試薬は、遊離のＴｆにも結合する
ものの架橋構造を構成できないので凝集反応にはつなが
らない。つまりＴｆ−ＴｆＲコンプレックスが存在する
時にだけ特異的に凝集を起こす高い精度を備えた試薬と
なることから、モノクローナル抗体の採用が有利となる
態様として示すことができる。またモノクローナル抗体
をポリクローナル抗体に組み合せて用いることも可能で
ある。

【００１１】Ｔｆに対するモノクローナル抗体を利用す
る場合、Ｔｆ−ＴｆＲに比較して血中に多量に存在する
遊離のＴｆがこのモノクローナル抗体に競合するので十
分な粒子凝集を期待できない場合が予想される。このよ
うな場合には、粒子に固定したものと同じＴｆに対する
モノクローナル抗体を粒子に固定しない状態で加え、そ
の共存下で反応させると良い。

【００１２】本発明に用いる抗体は、Ｆｃ部位を取り除
くことによって補体やリウマチ因子等による非特異反応
の影響を受けにくくすることができる。Ｆｃ部位を除去
する方法は、各種蛋白分解酵素を作用させる方法が公知
である。

【００１３】抗体以外の親和性物質としてはＴｆＲに対
するα−１アンチトリプシンなどが想定できる。これら
の親和性物質には、各々生体体液中に親和性の点でＴｆ
Ｒと競合する物質が存在するので、できるだけＴｆＲへ
の親和性の方が大きくなる条件のもとで反応させるのが
好ましい。あるいは競合物質との結合サイトをブロック
する方法も有効である。たとえばα−１アンチトリプシ
ンを利用する時には、トリプシンを結合した粒子を用意
しこれにトリプシンを介してα−１アンチトリプシンを
間接的に結合させると良い。この方法によって、α−１
アンチトリプシンのトリプシン結合サイトはブロックさ
れ、ＴｆＲとの結合活性が粒子上に存在する形となる。

【００１４】本発明に利用する不溶性粒子としては、動
物の赤血球、金属ゾル、ラテックス、ゼラチン、あるい
は顔料のような免疫学の分野で常用されているものが考
えられるが、これらに限られるものではない。中でもポ
リスチレン等の合成樹脂製ラテックス粒子は既に広く利
用されているので入手し易く安価であり、動物赤血球よ
りは質的に均一な点で有利である。ポリスチレンラテッ
クスとしては平均粒径０．０２−１．０μm、好ましく
は０．０４−０．６μmのものを示すことができる。

【００１５】本発明の親和性粒子を分散させる分散溶液
は、免疫反応に必要なｐＨを提供する緩衝液に分散剤、
界面活性剤、非特異反応を防ぐ物質、少量の防腐剤等を
添加して用いる。これらの添加物質や濃度の選択は固定
する親和性物質およびその量、不溶性粒子の種類などに
応じて適宜に調整する。たとえばゼラチンやウシ血清ア
ルブミンのような不活性蛋白質は、凝集反応の安定化や
非特異反応の防止に有効である。具体的には親和性物質
として抗体を固定したポリスチレンラテックスを分散さ
せるとき、リン酸緩衝液（以下ＰＢＳと省略する）やＨ
ＥＰＥＳのような中性域を与える緩衝液に、ＢＳＡや正
常動物血清等を加える。

【００１６】本発明は、前記Ｔｆ−ＴｆＲコンプレック
ス測定試薬によってＴｆ−ＴｆＲコンプレックスを測定
する方法をも提供する。本発明の試薬とＴｆ−ＴｆＲコ
ンプレックスとの反応は、凝集程度を観察することで追
跡可能である。凝集反応を観察する方法としては、肉眼
による方法および光学的装置により散乱光または透過光
の量の変化として計測する方法がある。一般的に、肉眼
で観察する方法は、検体を数段階の濃度に希釈しその各
々を観察することによってしか定量的な測定ができな
い。光学的方法においては適切な検量曲線を予めまたは
測定時に作成することにより検体の濃度を数段階取るこ
となく定量的測定ができるので、本発明の具現例として
はより好ましいものである。

【００１７】このときに血液材料に由来するＴｆ−Ｔｆ
Ｒコンプレックスを標準物質として用いると良い。細胞
から血中に遊離したＴｆＲは組織から抽出したＴｆＲと
は構造が違うことから、精製ＴｆＲを標準とする方法で
は反応性の違いのために正確な結果を期待できない可能
性が有る。実際、血中に遊離したＴｆＲは組織に存在す
る完全なＴｆＲに比べてＮ末端側の１００残基のアミノ
酸が欠損している。また血中ＴｆＲの大部分がＴｆとコ
ンプレックスとなっていることから考えて、血中ＴｆＲ
の値を得るにはＴｆ−ＴｆＲコンプレックスとして測定
すべきである。なお血中のＴｆとコンプレックスを形成
していない遊離のＴｆＲを測定するのであれば、フリー
のＴｆＲを標準として用いる。

【００１８】本発明のＴｆＲ測定試薬は従来に無い広い
濃度範囲の測定を実現する。この特徴によって、本発明
は大部分の血清試料を希釈操作無しで測定するＴｆ−Ｔ
ｆＲコンプレックス測定方法を提供する。なおここで言
う希釈操作を必要としない測定とは、低濃度試料と高濃
度試料とを同一の反応条件で測定可能であることを意味
する。つまり、測定可能な濃度範囲が狭い従来の測定方
法においては、高濃度試料の測定にあたっては低濃度試
料とは違う希釈条件が必要であった。一方本発明では、
たとえ高濃度試料であっても低濃度試料と同じ条件で測
定が可能となる。

【００１９】本発明によって得られたＴｆ−ＴｆＲコン
プレックスの測定値は、ＴｆＲ値に換算することも可能
である。ＴｆＲとＴｆとは１：１で結合するので両者の
モル比は１：１となる。血中のＴｆＲの大部分がＴｆと
結合した状態で存在していることから、Ｔｆ−ＴｆＲコ
ンプレックスの測定値に占めるＴｆＲの蛋白量の比をか
ければＴｆＲ値となる。この値は実施例で示すように４
７%であり、本発明による測定値に対して４７%をかけれ
ばＴｆＲ値に換算できるということである。

【００２０】本発明は、ＴｆＲ親和性物質を固定した不
溶性粒子で構成されるＴｆ−ＴｆＲコンプレックス測定
試薬によるＴｆ−ＴｆＲコンプレックスの測定に有用な
標準物質をも提案する。本発明が提供する標準物質と
は、Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスを含むＴｆ−ＴｆＲコ
ンプレックス測定用標準物質である。Ｔｆ−ＴｆＲコン
プレックスは、ＴｆＲ高値の血清を原料として精製する
ことができる。血中のＴｆ−ＴｆＲコンプレックスを測
定するのであれば、試薬との反応性を共通とするために
も標準物質も血中から精製したものを用いるのが有利で
ある。血清からＴｆ−ＴｆＲコンプレックスを精製する
には、血清の硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフィ
ー、免疫吸着クロマトグラフィー等の精製ステップによ
り容易に行うことができる。こうして精製したＴｆ−Ｔ
ｆＲコンプレックスは、適当な緩衝液に希釈するか、あ
るいはＴｆＲフリーとした血清に添加して濃度を検定し
標準物質とすることができる。本発明の標準物質は、造
血機能の診断をも可能とする広い濃度域にわたって標準
物質として利用できるよう１４０００〜７００００ng/m
l程度の高い濃度を備えたものが有用である。

【００２１】

【作用】本発明におけるＴｆＲ親和性物質を固定した不
溶性粒子は、Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスと結合してそ
の分析を可能とする。本発明は、従来ＴｆＲの測定に利
用されていた高感度を実現するための測定技術に換え
て、より簡便な操作で実施可能な粒子凝集反応を応用し
た点において新規である。粒子凝集反応の応用によっ
て、試料を希釈することなく低濃度域の測定と同じ条件
のもとで、高い濃度までを十分な精度で測定することが
可能となる。更に均一系反応である粒子凝集反応では、
標識による測定で要求されるＢ／Ｆ分離が不要となり自
動化が容易である。更に迅速化にも貢献するものであ
る。

【００２２】他方本発明の標準物質は、ＴｆＲをＴｆ−
ＴｆＲコンプレックスとしてとらえ、これを測定対象と
しうる広い濃度域をカバーする測定技術をサポートする
ものである。従来用いられていたＴｆＲを基礎とする標
準では血中に存在するＴｆ−ＴｆＲコンプレックスとは
異なる物質を標準としていたことになる。本発明の標準
物質は、従来の標準ではカバーすることが困難な高い濃
度域までを保証すると同時に、精製ＴｆＲの安定性の問
題を解決するものである。本発明によるＴｆ−ＴｆＲコ
ンプレックス測定技術によれば広い濃度範囲のＴｆＲを
測定することが可能である。そのため従来のような濃度
既知の血清を適当に希釈して標準とする方法では、測定
可能範囲の上限まで完全に測定値を保証することができ
ない。ＴｆＲ含有血清の他、精製ＴｆＲを希釈して標準
とする方法も考えられる。しかし本発明者らの知見によ
れば、公知の方法でたとえば胎盤等から精製したＴｆＲ
の測定値は血清のＴｆＲ測定値と必ずしも一致しないの
である。この理由の一つには先に述べたような構造的な
違いも挙げられる。つまり、公知の精製ＴｆＲでは信頼
できる標準物質とすることができないのである。このよ
うな背景から、本発明によって新たに提案された測定技
術をサポートする新規な標準物質が必要となるのであ
る。

【００２３】

【発明の効果】本発明は、操作性に優れた粒子凝集反応
によるＴｆ−ＴｆＲコンプレックスの測定を可能とす
る。本発明によってＴｆＲの測定範囲が拡大し、試料を
希釈すること無く広い濃度範囲を測定することができ
る。測定範囲の拡大は、特に造血機能の診断マーカーと
してＴｆ−ＴｆＲコンプレックスを測定する場合に有効
である。更に本発明によれば、標識技術を利用した高感
度測定法に比べて容易に迅速化、自動化を実現すること
ができる。また本発明は、新たに提案された測定技術の
広い濃度範囲をカバーする新規な標準物質をも提供す
る。以下に本発明の実施例を示す。

【００２４】また本発明の標準物質は、Ｔｆ−ＴｆＲ測
定値の信頼性を高める。まず従来の測定技術ではカバー
できなかった高濃度域の標準を提供しうる点で信頼性の
向上をもたらず。更に、Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスと
して提供したことによって保存中の安定性を改善し、結
果として信頼性の向上に貢献する。

【００２５】

【実施例】

１．試薬の調製 抗ＴｆＲ抗体の作成：公知の方法(J.Biol.Chem.,263,83
18-8325,1988)で胎盤から精製したヒトＴｆＲをフロイ
ントのコンプリート・アジュバントと等量混合し、充分
乳化した後、家兎フットパットに初回の免疫を行い、４
週毎に背部皮内に２回の追加免疫を行った。精製ヒトＴ
ｆＲとのオクテロニー法により抗体価の上昇を確認し
て、最終免疫後２週目に採血を行い抗血清を分離した。
抗血清をＤＥＡＥ−セルロース・イオン交換クロマトグ
ラフィーで精製し、そのＩｇＧ分画をもって抗ＴｆＲ抗
体とした。 本発明試薬の調製例：抗ＴｆＲ抗体をポリスチレンラテ
ックス（平均粒径０．１０４μm）と混和し３７℃１時
間反応させた。３，０００×Ｇ、１５分遠心によりラテ
ックス粒子を分離した後、１%ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝
液に懸濁して０.５%ラテックス乳液を得、本発明の測定
試薬とした。

【００２６】参考試薬の調製例：上記抗ＴｆＲ抗体をＰ
ＢＳ緩衝液で１０mg/lとし９６穴マイクロタイタープレ
ート（ヌンク社製）のウエルに０．１ml宛分注後、３７
℃１時間静置し、更にプレートを生理食塩液で洗浄後Ｂ
ＳＡによるブロック操作をほどこしてＥＬＩＳＡ用固相
プレートとした。また抗ＴｆＲ抗体を過ヨウ素酸架橋法
にてＰＯＤ標識し、ＥＬＩＳＡ用標識抗体とした。

【００２７】標準物質の調製：血清を４５〜７０%飽和
硫安で分画後、２０mMトリス塩酸（ｐＨ８．６）の緩衝
液で透析し、陰イオン交換カラム（Ｑ−セファロース、
ファルマシア社）にアプライした。０．５MのＮａＣｌ
を含む２０mMのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）でリニ
アグラジエントに溶出した。ＥＬＩＳＡによってＴｆＲ
濃度を追跡してＴｆＲに富む分画をプールし、抗Ｔｆ抗
体を固定化したアフィニティーカラムにかけた。カラム
はまず０．１MのＮａＣｌを含む５０mMのＨＥＰＥＳ緩
衝液（ｐＨ７．５）、次いで１００mMのＮａＣｌと１mM
の desferroxamine mesilateを含む５０mMのクエン酸緩
衝液（ｐＨ４．９）でこのカラムを洗浄してＴｆから鉄
を遊離させた。再び０．１MのＮａＣｌを含む５０mMの
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、３MのＫＣ
ｌを含む５０mMのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で鉄
の遊離によってＴｆとの結合性の低下したＴｆＲを溶出
した。アフィニティーカラムの溶出物は、過剰量の鉄飽
和Ｔｆと反応させて完全にＴｆ−ＴｆＲコンプレックス
を形成させ２０mMトリス塩酸（ｐＨ８．６）の緩衝液で
透析した後、さらにゲルろ過カラム及び陰イオン交換カ
ラム（リソース−Ｑ、ファルマシア社）を用いて、精製
Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスを得た。この方法によるコ
ンプレックスの収率は約５０%であった（２０００ng/ml
のＴｆ−ＴｆＲコンプレックスを含む血清２Lから約
２．０mgのＴｆ−ＴｆＲコンプレックスを回収）。

【００２８】精製物は、非還元状態でのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより分子量約８５kDaと６５kDaの２つのバンドが認
められた。還元状態では、Ｔｆは分子内ＳＳ結合がはず
れて見かけの分子量が大きくなるので、２つのバンドが
近接する。ＰＶＤＦ膜へブロッティング後それぞれの蛋
白についてアミノ酸配列分析を行ったところ、８５kDa
はＴｆＲの１０１番目からの配列と一致し、６５kDaは
ＴｆのＮ末端からの配列と一致することが確認できた。
ＴｆＲとＴｆの組成比率は、染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルのデンシトグラムからほぼ４７％対５３％であり、
アミノ酸残基数がＴｆＲが６６０、Ｔｆが７１９の比と
一致した。つまりモル比として１対１であったと考えら
れる。蛋白量にＴｆＲの濃度比（４７％）を乗じた値を
精製したコンプレックス中のＴｆＲ量として決定した。
なお精製Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスの蛋白量は、ＢＣ
Ａ蛋白定量法により決定した。この精製Ｔｆ−ＴｆＲコ
ンプレックスを１%のＢＳＡ、０．１%のＴｆを含むＰＢ
Ｓで希釈して１次標準として使用した。ＥＬＩＳＡでは
血清を適宜希釈したものの凍結乾燥品を、ラテックス凝
集法では、血清からＴｆ−ＴｆＲコンプレックスをイオ
ン交換カラムにより部分的に精製濃縮した物の凍結乾燥
品をそれぞれ１次標準で検定し、２次標準として用い
た。従って、この標準を用いた測定によって得られる濃
度値は、Ｔｆ−ＴｆＲコンプレックスの濃度である。

【００２９】２．本発明の測定試薬と参考試薬の検量線
比較：１で作成した本発明の測定試薬を用い試料液（検
量線の場合は標準希釈濃度液、一般測定の場合は検体
液）３０μl、と本試薬乳液３００μlを測定セルに分注
して混和し、２５秒後および３００秒後に散乱光（波長
６６０nm）を測定し散乱光の強度の差を求めた。標準希
釈液は部分精製ヒトＴｆ−ＴｆＲコンプレックスを１６
０００ng/mlより順次２倍希釈した５段階の各々を用い
て測定し検量曲線を作成した。測定には全自動免疫化学
分析装置ＬＸ−３０００（栄研化学・アナリテイカルイ
ンスツルメント社製、商品名）を用いた。

【００３０】対照として、１で作成した参考試薬による
ＥＬＩＳＡ法の検量線を作成した。測定は固相プレート
にウエル当たり１００μlの試料液を分注し３７℃で１
時間反応後０．１%のＴｗｅｅｎ２０加ＰＢＳで洗浄、
標識抗体を１００μlを加え３７℃３０分反応させ洗
浄、ＴＭＢ（テトラメチルベンチジン）で発色させ波長
４５０nmでの吸光度を測定、という操作によって行っ
た。標準希釈濃度液はＴｆ−ＴｆＲコンプレックス値既
知の血清を７８．０ng/mlより順次２倍希釈した５段階
の各々を用いて測定し検量曲線を作成した。この標準物
質の濃度は、予備的に行った実験で確認した実用的な精
度で測定が可能な濃度範囲に基づいて設定したものであ
る。結果は図１および図２に示した。本発明の測定試薬
では測定範囲が５００〜１６０００ng/mlである（図
１）のに対し、参考例ＥＬＩＳＡ法（図２）では２．４
４〜７８．０ng/mlである。つまりＥＬＩＳＡ法で本発
明の測定試薬と同じ測定範囲を得るには試料を予め２０
０倍に希釈する必要があることが確認された。

【００３１】３．本発明によるラテックス凝集法とＥＬ
ＩＳＡ法の相関：様々な濃度のＴｆ−ＴｆＲコンプレッ
クス値を持つ血清検体８０検体を１で調製した本発明に
よるラテックス凝集反応試薬と、参考試薬であるＥＬＩ
ＳＡ試薬により測定し測定値の相関を調査した。ＥＬＩ
ＳＡ法では直接測定できない高値検体は適宜希釈して測
定した。結果は図３に示すとおりである。本発明による
測定値とＥＬＩＳＡによる測定値とは良好な相関を示し
高精度な測定が可能なことが確認された。

【００３２】４．本発明の測定試薬による測定例：２に
示した本発明の測定試薬により、健常者１５名、鉄欠乏
性貧血症患者１０名、安定期透析患者１５名、鉄欠乏を
伴う透析患者１０名、多血症患者２名、腎移植患者２名
の血清についてＴｆ−ＴｆＲコンプレックス値を測定し
た。結果は表１に示した。鉄欠乏性貧血症、多血症等の
患者血清中のＴｆＲ値は異常に高く、本発明によるＴｆ
Ｒの測定が造血機能の診断マーカーとして有用なことが
確認された。このような高い値は、ＥＬＩＳＡ法の測定
可能範囲を越えている。

【００３３】

【表１】

【００３４】４．本発明の測定試薬による測定例 ＴｆＲのＴｆ結合部位以外を認識するモノクローナル抗
体と、Ｔｆを認識するモノクローナルにより本発明の測
定試薬を構成した。特開昭６２−６１６９に記載された
方法にしたがって前記モノクローナル抗体を調製し、こ
れをそれぞれ不溶性粒子に固定した後に混合した。具体
的な操作は次のとおりである。１で用いたのと同じ精製
ＴｆＲをフロイントのコンプリート・アジュバントと等
量混合しＢａｌｂ／ｃマウスの皮下に免疫した。２週間
おきに免疫をくり返し、４回の免疫の後に５０μgのＴ
ｆＲを腹腔内に免疫した。最終免疫の３日後に抗体価の
上昇していることを確認して脾臓を摘出し、常法(Harad
a.NらProc.Natl.Acad.Sci. USA 84:4581-4585,1987)に
よってマウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８．６５
３と細胞融合させた。

【００３５】ハイブリドーマは精製ＴｆＲを抗原とする
イムノブロッティングアッセイによって、まずＴｆＲに
特異的な抗体についてスクリーニングした。ＴｆＲを認
識するモノクローナル抗体を産生するクローンは、更に
ＴｆＲとＴｆを用いたインヒビションアッセイによりス
クリーニングしてＴｆ結合部位以外の部分に存在する抗
原決定基を認識するモノクローナル抗体を産生するもの
をセレクションした。こうしてＴｆＲのＴｆ結合部位以
外を認識するモノクローナル抗体を得た。一方Ｔｆを認
識するモノクローナル抗体については、免疫原をＴｆと
すること、またスクリーニングを単にＴｆについて行う
こと以外はほぼ同じ操作によって得た。

【００３６】こうして得た２種類のモノクローナル抗体
（ＩｇＧ、０．１１mg/ml）をそれぞれ粒径０．１０４
μmのポリスチレンラテックスに３７℃で１時間物理吸
着させた。ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄後、１%のＢＳＡを
含むＨＥＰＥＳ緩衝液に粒子濃度０．５%となるように
等量分散させてモノクローナル抗体で構成された本発明
の試薬とした。

【００３７】モノクローナル抗体で構成された本発明に
よる試薬は、２と同じ操作によって精製Ｔｆ−ＴｆＲコ
ンプレックスと反応させた時、光学測定が可能な凝集を
定量的に生じることを確認した。この凝集は精製したＴ
ｆやＴｆＲでは観察できず、Ｔｆ−ＴｆＲコンプレック
スに特異的であることが明らかであった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の測定試薬を用い、免疫学的ラテックス
凝集反応法によって得られた標準曲線。図中、縦軸は６
６０nmにおける散乱光強度の変化量（ＤＬＳＥ）を、横
軸はＴｆ−ＴｆＲコンプレックス濃度（ng/ml）を示
す。

【図２】参考試薬を用いＥＬＩＳＡ法によって得られた
標準曲線。図中、縦軸は４５０nmにおける吸光度を、横
軸はＴｆ−ＴｆＲコンプレックス濃度（ng/ml）を示
す。

【図３】本発明によるラテックス凝集反応試薬（ＬＡ
法)による測定値（ng/ml、横軸）、ＥＬＩＳＡ試薬によ
る測定値（ng/ml、縦軸）の相関を示すグラフ。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】トランスフェリンレセプター親和性物質を
   固定した不溶性粒子で構成されるトランスフェリン−ト
   ランスフェリンレセプター・コンプレックス測定試薬
2. 【請求項２】トランスフェリンレセプター親和性物質が
   抗体である請求項１のトランスフェリン−トランスフェ
   リンレセプター・コンプレックス測定試薬
3. 【請求項３】抗体が、抗トランスフェリンレセプター抗
   体、および抗トランスフェリン−トランスフェリンレセ
   プター・コンプレックス抗体から選択される請求項２の
   トランスフェリン−トランスフェリンレセプター・コン
   プレックス測定試薬
4. 【請求項４】抗体がポリクローナル抗体である請求項３
   のトランスフェリン−トランスフェリンレセプター・コ
   ンプレックス測定試薬
5. 【請求項５】不溶性粒子がラテックス粒子である請求項
   １のトランスフェリン−トランスフェリンレセプター・
   コンプレックス測定試薬
6. 【請求項６】更にトランスフェリン親和性物質を固定し
   た不溶性粒子を含む請求項１のトランスフェリン−トラ
   ンスフェリンレセプター・コンプレックス測定試薬
7. 【請求項７】トランスフェリン親和性物質をトランスフ
   ェリンレセプター親和性物質とともに固定した不溶性粒
   子を含む請求項１のトランスフェリン−トランスフェリ
   ンレセプター・コンプレックス測定試薬
8. 【請求項８】トランスフェリン親和性物質が、トランス
   フェリンに対するモノクローナル抗体である請求項６ま
   たは７のトランスフェリン−トランスフェリンレセプタ
   ー・コンプレックス測定試薬
9. 【請求項９】トランスフェリンレセプター親和性物質を
   固定した不溶性粒子をトランスフェリン−トランスフェ
   リンレセプター・コンプレックスと反応させ、不溶性粒
   子の凝集を指標としてヒト体液中のトランスフェリン−
   トランスフェリンレセプター・コンプレックスを測定す
   る方法
10. 【請求項１０】不溶性粒子の凝集を光学測定を利用して
    追跡する請求項９のヒト体液中のトランスフェリン−ト
    ランスフェリンレセプター・コンプレックスを測定する
    方法
11. 【請求項１１】試料として希釈しない血清を利用する請
    求項９−１０のトランスフェリン−トランスフェリンレ
    セプター・コンプレックスを測定する方法
12. 【請求項１２】標準物質としてトランスフェリン−トラ
    ンスフェリンレセプター・コンプレックスを利用するト
    ランスフェリン−トランスフェリンレセプター・コンプ
    レックスを測定する方法
13. 【請求項１３】トランスフェリンレセプター親和性物質
    を固定した不溶性粒子をトランスフェリンレセプターと
    反応させ、不溶性粒子の凝集を指標としてヒト体液中の
    トランスフェリンレセプターを測定する方法であって、
    標準物質としてトランスフェリンとコンプレックスを形
    成していないトランスフェリンレセプターを用いる測定
    方法
14. 【請求項１４】トランスフェリン−トランスフェリンレ
    セプター・コンプレックスを含む、トランスフェリン−
    トランスフェリンレセプター・コンプレックスを測定す
    るための標準物質
15. 【請求項１５】トランスフェリン−トランスフェリンレ
    セプター・コンプレックスが血清から精製したものであ
    る請求項１４の標準物質
16. 【請求項１６】トランスフェリン−トランスフェリンレ
    セプター・コンプレックスを少なくとも１４０００ng/m
    l含む請求項１４の標準物質